UNIVERSIDAD NACIONAL TORIBIO RODRIGUEZ DE MENDOZA

FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL Y FORESTAL

ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE INGENIERIA AMBIENTAL

PRACTICA N 06
DETERMINACION DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES POR LA
TECNICA MS PROBABLE
I.

INTRODUCCIN

Reconociendo que la necesidad de consumo alimentos es esencial (salud de calidad), el control

de su calidad bacteriolgica, desde el punto de vista sanitario, constituye un hecho de vital
importancia, debido a que un nmero importante de enfermedades son transmitidas a travs
del agua que ha sido contaminada con materia fecal (lquido elemento fundamental para el
produccin de bienes y servicios). Lo que en casos extremos puede originar brotes epidmicos.
Debido a que un gran nmero de enfermedades son transmitidas por va fecal-oral utilizando
como vehculo los alimentos y el agua, es necesario contar con microorganismos que funcione
como indicador de contaminacin fecal. Estos deben de ser constantes, abundantes y
exclusivos de la materia fecal, deben tener una sobrevivencia similar a la de los patgenos
intestinales y debe de ser capaces de desarrollarse extraintestinalmente.
An el agua que se observa clara puede estar contaminada con microorganismos
enteropatgenos que normalmente habitan en el intestino del hombre y de otros animales de
sangre caliente.
El grupo coliforme es constante, abundante y casi exclusivo de la materia fecal, sin embargo,
las caractersticas de sobrevivencia y la capacidad para multiplicarse fuera del intestino tambin
se observan en aguas potables, por lo que el grupo coliforme se utiliza como indicador de
contaminacin fecal en agua; conforme mayor sea el nmero de coliformes en agua, mayor
ser la probabilidad de estar frente a una contaminacin reciente.
Los microorganismos

coliformes constituyen un grupo heterogneo

con

hbitat

primordialmente intestinal para la mayora de las especies que involucra. El grupo de bacterias
coliformes totales comprende todos los bacilos Gramnegativos aerobios o anaerobios
facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con produccin de gas en un lapso
mximo de 48 h. a 35C 1C. Este grupo est conformado por 4 gneros principalmente:
Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y Klebsiella.

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Todos ellos pueden ingresar al agua cuando sta entra en contacto con la materia fecal. De esta
manera, parecera que la bsqueda de estos microorganismos constituira la medida ms
acertada para decidir si el agua es apta o no para el consumo humano.
El grupo de coliformes fecales, est constituido por bacterias Gram-negativas capaces de
fermentar la lactosa con produccin de gas a las 48 h. de incubacin a 44.5 0.1C. Este
grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la ms prominente es Escherichia coli. La
demostracin y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse mediante el empleo de
medios de cultivo lquidos y slidos con caractersticas selectivas y diferenciales.
De este modo es necesario enfocar el problema desde otro punto de vista. Si los organismos
enteropatgenos residen en el intestino, bastar con demostrar que el agua est contaminada
con materia fecal para determinar que la fuente de abastecimiento puede ser transportadora de
enfermedades intestinales.
Con esta base, sin demostrar necesariamente la presencia directa de organismos
enteropatgenos, se puede hacer un anlisis microbiolgico para poner de manifiesto algunos
microorganismos que constituyen un indicador de contaminacin fecal. Las cualidades ideales
de un microorganismo indicador de este tipo de contaminacin son:
Presencia constante en materia fecal
Exclusividad en la materia fecal
Abundancia en la materia fecal
Incapacidad de reproduccin en el agua
Supervivencia semejante a la de los organismos enteropatgenos.
FUNDAMENTO
La determinacin de microorganismos coliformes totales por el mtodo del Nmero ms
Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la
lactosa con produccin de cido y gas al incubarlos a 35C 1C durante 48 h., utilizando un
medio de cultivo que contenga sales biliares. Esta determinacin consta de dos fases, la fase
presuntiva y la fase confirmativa.
En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el cual
permite la recuperacin de los microorganismos daados que se encuentren presentes en la
muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la fase
confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es
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selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las
sales biliares como el verde brillante. La determinacin del nmero ms probable de
microorganismos coliformes fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba
presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir
gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5 0.1C por un periodo de 24 a 48 h.
La bsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo
EC, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales
(Agar Mac Conkey, Agar eosina azul de metileno) y posteriormente realizando las pruebas
bioqumicas bsicas (IMViC) a las colonias tpicas.
II.

OBJETIVOS

Determinar la presencia de coliformes totales y fecales en muestra de jugo de fruta.

Conocer y aplicar la tcnica del nmero ms probable para coliformes.
III.

MATERIALES

micropipetas

tiosulfato de sodio al 3%)

Asa bacteriolgica

Horno de incubacin a 37 C

Horno de incubacin a 44.5 C

tubos de ensayo

campanas Durham

Gradilla

Mechero

Caldo Verde Brillante Bilis Lactosa (VBBL)

Placas Petri con medio de

Jugo

Agua estril

Microscopio

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IV.

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PROCEDIMIENTO ( ESQUEMAS)

A. Primera etapa o prueba presuntiva

Vaciar la muestra de jugo en un recipiente
Con la ayuda de la micropipetas coger 1 ml 0 1000l de jugo y depositar en el tubo de
10-1 que contiene 9ml de SSFE.
Luego del tubo de 10-1 coger 1ml y vaciar en el tobo de 10 -2, y del tubo de 10-2 al tubo
10-3 .
De cada tubo depositar un mililitro de dilucin en dos tubos de caldo brila
respectivamente
Incubar los tobos a 37 C x 24 h.
Lectura

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B. Segunda Etapa o prueba confirmativa de coliformes totales

En caso el experimento contenga gas se realiza lo siguiente
Realiza la resiembra
Se escoge el tubo que contenga mayor cantidad de gas
Con ese tubo, con la ayuda de una aza bacteriologa en anillo se realiza la siembra en
dos tubos, en un tubo que contenga caldo brila y el oro que contenga caldo peptonado
Incuba el tubo de caldo brila a 45 C x 24 h
Incuba el segundo tubo a 37 C x 24 h

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C. Tercera Etapa o prueba confirmativa de coliformes fecales

Si existe todava presencia de gas, estamos hablando de coliformes termotolerantes
Al caldo peptonado se le agrega dos gotas de reactivo de kovacs.
Realizar la prueba de indol
Lectura

V.

RESULTADOS
DILUCIONES
10-1
T
U
B
O

Total

10-2

10-3

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En nuestro caso la prueba sali negativa porque no hubo presencia de gas en ninguno de los
tobos que contenan caldo brila en la primera etapa o prueba de presuntiva, por el cual nos
quedemos all y no realicemos las etapas restantes.
No existi presencia de coliformes totales y fecales en nuestro experimento.
VI.

CONCLUSIONES

Esta prctica nos sirvi para determinar la presencia de coliformes totales o fecales en
una muestra de frota y tambin en conocer y aplicar la tcnica del nmero ms
probable para estos indicadores como son los coliformes.
La presencia de diversos microorganismos patgenos en alimentos de consumo
frecuente sugiere que la calidad sanitaria de estos realmente representa un riesgo para la
salud pblica. Deben introducirse mejoras en el procesamiento, transporte y
almacenamiento de los mismos de manera que no representen un riesgo para la salud.
Por otro lado, es evidente la necesidad de realizar un control sanitario estricto y
constante que pueda asegurar la inocuidad de los alimentos que consume nuestra
poblacin (el papel fundamental microbiologa).
Esto slo podr lograrse al integrar la educacin con la cooperacin de los ciudadanos,
de los organismos pblicos y de los mismos comerciantes. Tambin es deseable la
implementacin de programas de Anlisis de Riesgos y Puntos Crticos de Control
(HACCP), como un esfuerzo para minimizar el riesgo de enfermedad que representa el
consumo de ciertos alimentos.
VII.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

CCAYAC-M-004 (2006) Estimacin de la densidad microbiana por la tcnica del

nmero ms probable, deteccin de coliformes totales, cliformes fecales y Escherichia
coli por el nmero ms probable
Food and Drug Administration (2003) Bacteriological Analytical Manual. 9th ed.
Arlington, VA: AOAC.
Madigan, M T y Martinko, J M., Brock, Biology of Microorganisms, 11a ed. 2006, pp
935-936

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