XII CONGRESO NACIONAL DE CIENCIA

Y TECNOLOGIA DE ALIMENTOS

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Jueves 27 y Viernes 28 de Mayo de 2010

Guanajuato, Gto.

AISLAMIENTO DE BACTERIAS LCTICAS Y LEVADURAS DE QUESO DE

PORO ARTESANAL
Jimnez-Vera R a,*, Gonzlez-Corts N a , Magaa-Contreras A a
Lizcano-Cruz A a,* y Cabrera-Prez E a
a

Universidad Jurez Autnoma de Tabasco, Divisin Acadmica Multidisciplinaria de los

Ros, Carretera Tenosique-Estapilla km 1, Colonia Solidaridad, C.P. 86901, Tenosique,
Tabasco, Mxico.
* Correo electrnico: roman.jimenez@damr.ujat.mx.

RESUMEN:
Durante el proceso de maduracin de los alimentos, la flora microbiana juega un papel importante.
En pases desarrollados, se han preservado cepas autctonas procedentes de alimentos
fermentados, las cuales han mantenido sus propiedades tecnolgicas. En el queso de poro se ha
reportado la presencia de bacterias lcticas y levaduras en alta concentracin, sin embargo, dichas
cepas no han sido aisladas e identificadas. El objetivo de este trabajo fue aislar bacterias cido
lcticas y levaduras nativas del queso de poro elaborado con leche cruda, con la finalidad de
utilizarlas como cultivos iniciadores en la produccin de quesos de leche pasteurizada. Las cepas
de bacterias cido lcticas fueron aisladas utilizando agar leche incubado a 37C durante 24 h en
anaerobiosis y las levaduras, en agar papa dextrosa incubado a 37C druante 72 h en condiciones
aerobias. A las colonias seleccionadas se les realiz prueba de catalasa y tincin de Gram. Se
aislaron e identificaron diez cepas cidolcticas, de las cuales, cinco fueron descartadas por
presentar caractersticas atpicas, as como 20 cepas de levaduras. Las cepas seleccionadas se
conservaron en el agar correspondiente en tubo inclinado mantenidas en refrigeracin.

ABSTRACT:
During the maturation process of food, microflora plays an important role. In developed countries,
have been preserved native strains from fermented foods, which have maintained their
technological properties. Pore cheese has been reported the presence of lactic acid bacteria and
yeast in high concentrations, however, such strains have been isolated and identified. The aim of
this study was to isolate lactic acid bacteria and yeast pore native cheese made from raw milk, in
order to use as starter cultures in the production of pasteurized milk cheeses. The lactic acid
bacteria strains were isolated using milk agar incubated at 37C for 24 h under anaerobic conditions
and yeast, in potato dextrose agar incubated at 37C for 72 h under aerobic conditions. A selected
colonies were tested for catalase and Gram. Were isolated and identified ten lactic acid strains, of
which five were dismissed by presenting atypical features, as well as 20 strains of yeast. The
selected strains were conserved in the corresponding agar inclined tube kept under refrigeration.

Palabras clave:
queso de poro, bacterias lcticas, levaduras.

INTRODUCCIN:
El queso de poro, tambin conocido como queso Balancn, se ha producido en el
municipio de Balancn, Tabasco, Mxico, desde hace ms de 50 aos.
Tradicionalmente, se ha elaborado de manera artesanal a partir de leche cruda.
Una etapa importante en su proceso de elaboracin es la acidificacin de la leche
con suero de la produccin del da anterior, se realiza la cuajada y se prensa. El
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producto final se obtiene mediante un proceso de maduracin de siete das,

despus de los cuales puede conservarse sin refrigeracin. Sin embargo, este
proceso sin medidas sanitarias, conlleva a problemas legales, debido a que la
Norma Oficial Mexicana NOM-121-SSA1-1994, exige que la leche sea
pasteurizada para la elaboracin de quesos (Acosta, 2009).
Por otra parte, est demostrado que la pasteurizacin de la leche permite obtener
quesos con mejores propiedades higinicas, ya que este proceso destruye la
mayora de los microorganismos patgenos y alterantes del queso. Sin embargo,
es necesario mantener una microflora acidificante que sea la responsable de
impartir caractersticas tpicas del queso que se requiere fabricar. Los
consumidores aprecian los quesos artesanales por sus singulares caractersticas
de sabor y aroma, que son atribuidas a la actividad metablica de la microbiota
autctona presente en la leche cruda (Scott, 1991).
La utilizacin de fermentos lcticos comerciales ayuda a llevar a cabo el proceso
de acidificacin que se da en los quesos. Aunque estos fermentos pueden resolver
el problema sanitario, tambin ocasiona una prdida gradual de las cepas
autctonas (Gonzlez et al., 2003). En pases desarrollados, se han preservado
cepas autctonas con buenas propiedades tecnolgicas. Estos cultivos han sido
empleados como cultivos iniciadores para producir yogur y queso (Holzapfel,
2002). Sin embargo, en nuestra regin existen varios productos artesanales para
los cuales no se utilizan cultivos iniciadores, ni comerciales, ni autctonos. Este
trabajo tiene como objetivo obtener cepas de bacterias cido lcticas del queso de
poro elaborado con leche no pasteurizada con la finalidad de utilizarlas como
cultivos iniciadores en la produccin de quesos de leche pasteurizada.
METODOLOGA:
Quesos de poro. Fueron adquiridos en puntos de venta de la ciudad de
Tenosique, Tabasco, Mxico, provenientes de la produccin regional. Se
transportaron al laboratorio a temperatura ambiente y los anlisis se realizaron el
mismo da de la compra. Se utilizaron quesos de poro de la produccin comercial
de las fbricas de quesos San Marquito, El tigre y Usumacinta.
Cuantificacin. La concentracin de grupos bacterianos se cuantific por el
mtodo de cultivo en superficie. Se prepararon diluciones hasta 10-8. Se
inocularon 10 l de cada dilucin en la superficie del agar correspondiente; para el
recuento de UFC/g se multiplic el total de colonias de la dilucin mayor por 100 y
por el inverso de la dilucin (Corona y Jimnez, 2004). El Cuadro 1 muestra los
medios de cultivo y las condiciones para la cuantificacin de los grupos
bacterianos indicadores en queso de poro.
Aislamiento. Se realiz una dilucin 1:10: se pes 1.0 g de muestra y se disolvi
en 9 ml de solucin salina fisiolgica estril. Mediante un asa de cultivo se inocul
una alcuota y se estri mediante la tcnica del pentgono en agar leche
preparado en el laboratorio de acuerdo a la formulacin de Difco (5.0 g/l de
peptona de casena, 2.5 g/l de extracto de levaduras, 1.0 g/l de glucosa, 1.0 g/l de
leche en polvo y 12.5 g/l de agar) y agar papa dextrosa (Bioxon). Las cajas de
Petri se incubaron en anaerobiosis (Rosenblat & Stewart, 1985) a 37C durante 24
h. Se realizaron resiembras hasta obtener cepas puras.

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Identificacin. Se realizaron observaciones al microscopio de preparaciones de

frotis teidos con Gram para determinar la caracterstica Gram positiva de
bacterias cido lcticas. A dichas cepas tambin se le realiz la prueba de la
catalasa, la cual es positiva para este tipo de bacterias.
Cuadro 1. Condiciones de cultivo de los grupos bacterianos indicadores de calidad
en quesos.
Bacterias
Coliformes totales
Staphylococcus
aureus
Hongos
Levaduras
Bacterias lcticas

Medios de cultivo

Condiciones
incubacin
Agar de bilis y rojo Aerobia, 37C
violeta
Agar de sal y manitol
Aerobia, 37C
Agar papa dextrosa
Aerobia, 20C
Agar papa dextrosa
Aerobia, 37C
Agar de Man Rogosa Anaerobia, 37C
y Sharpe

de Tiempo
de
incubacin
24 h
24 h
5 das
24 h
48 h

RESULTADOS Y DISCUSIN
En la Figura 1 se muestra el crecimiento de grupos bacterianos durante el proceso
de maduracin del queso de poro en tres fbricas artesanales.

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Figura 1. Crecimiento bacteriano en queso de poro durante el proceso de maduracin.

Se obtuvieron tendencias similares en el crecimiento bacteriano de las tres

empresas. Los grupos de Staphylococcus aureus y coliformes disminuyeron su
concentracin durante el proceso de maduracin de siete das. La concentracin
de bacterias lcticas se mantuvo constante durante el periodo de maduracin,
presentando la mayor concentracin bacteriana de los grupos evaluados. La
disminucin de la concentracin de S. aureus y coliformes puede estar relacionada
con la presencia de inhibidores bacterianos. Las bacterias lcticas, adems de
cido lctico, producen sustancias capaces de inhibir el crecimiento de otras
bacterias, entre estas sustancias se encuentran las bacteriocinas y el perxido de
hidrgeno.
En la actualidad, se ha identificado un gran nmero de bacteriocinas, las cuales
han mostrado un amplio campo de accin antimicrobiano. El campo de accin de
estas bacteriocinas ha sido estudiado en productos donde hay uso de bacterias
lcticas en los procesos de produccin (Cintas et al, 2001). Algunas de las
bacteriocinas son producidas durante procesos de fermentacin. A pesar de que la
principal causa de preservacin de un producto fermentado es la reduccin de pH
por la formacin de cidos, las bacteriocinas juegan un papel importante como
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factor de preservacin de los productos fermentados, al evidenciar su accin ante

bacterias tanto Gram positivas como Gram negativas (Rojas y Vargas, 2008). En
el proceso de maduracin del queso de poro se pone de manifiesto este hecho, al
disminuir la concentracin de S. aureus como microorganismos Gram positivo y
coliformes, Gram negativos.
Por otra parte, tambin se han aislado cepas de bacterias lcticas productoras de
perxido de hidrgeno. El perxido de hidrgeno, tambin conocido como agua
oxigenada (H2O2) es un antisptico general, su mecanismo de accin se debe a la
liberacin de oxgeno que destruye los microorganismos (ngeles-Lpez et al,
2001). Para mejorar la calidad microbiolgica del queso de poro mediante el
manejo adecuado de la maduracin, en futuros trabajos se recomienda analizar la
presencia de estos compuestos inhibidores en estos quesos.
En el Cuadro 2 se muestra la concentracin bacteriana de grupos indicadores al
final del periodo de maduracin en quesos de tres fbricas. Se observa que
Staphylococcus aureus se encuentra dentro de los lmites permitidos. Tanto las
bacterias coliformes como las levaduras se encontraron por arriba de los valores
establecidos por la Norma en los primeros das del proceso de maduracin. La
presencia de elevados niveles de levaduras en este queso se relaciona con los
altos niveles de acidez presentados, ya que tanto las bacterias lcticas como las
levaduras pueden resistir el medio cido. En contraste, se ha reportado (Jordano,
1984; Gauthier, 2002) que los coliformes son sensibles a la acidez. Con slo
mantener el queso a temperatura ambiente en el sptimo da de maduracin, se
logr disminuir la concentracin de bacterias coliformes. Este fenmeno es de
gran importancia en la seguridad alimentaria, ya que las principales bacterias
patgenas del ser humano se encuentran dentro de este grupo. La disminucin de
los coliformes se ha asociado a la disminucin del pH en los productos
fermentados. Se ha demostrado que las bacterias patgenas reaccionan de
manera diferente a las bacterias cido lcticas, en relacin a las variaciones de pH
(Gauthier, 2002). Lo anterior hace difcil que las patgenas puedan sobrevivir,
haciendo a los alimentos madurados ms seguros para su consumo.
Cuadro 2. Carga microbiana en quesos madurados durante siete das.
Grupo bacteriano
Log ufc/g
Lcticas totales
Staphylococcus aureus
Coliformes totales
Mesfilos aerobios
Levaduras
NR = No reportado.

San
Marquito

El tigre

Usumacinta

NOM-121SSA1

8.70 0.34
1.93 0.57

6.60 0.37
2.87 0.00

8.80 0.12
2.00 0.20

NR
3.00

3.20 0.42
5.40 1.34
6.75 0.32

4.60 0.28
6.78 0.49
6.60 0.34

2.86 0.54
6.15 0.24
6.33 0.41

2.00
NR
2.70

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El Cuadro 3 muestra la calidad microbiana de quesos frescos producidos en otras

regiones del mundo. Se observa que la concentracin de todos los grupos
microbianos indicadores se encuentran por arriba de los valores permitidos por la
norma oficial mexicana para este tipo de quesos. En los quesos de poro
analizados en este trabajo, la concentracin de S. aureus se encontr dentro de
los valores permitidos por la NOM-121-SSA1-1994. Estos resultados sugieren la
posibilidad de emplear el proceso de maduracin del queso de poro como una
herramienta para mejorar su calidad sanitaria. La calidad microbiolgica del queso
es importante ya que est compuesto principalmente por protena y grasa, lo que
lo convierte en un sustrato nutritivo para el desarrollo de microorganismos;
adems, es un alimento que se consume sin cocimiento posterior, en donde el
manejo tiene implicaciones importantes en la calidad sanitaria (Daz-Rivero y
Gonzlez, 2001).
Cuadro 3. Microbiologa de otros quesos frescos.

Grupo bacteriano
Log ufc/g

Queso
fresco1

Quesillo2

Queso
blanco3

NOM-121SSA1

NR
Lactobacillus spp.
5.20
NR
NR
3.00
S. aureus
5.49
3.47
5.18
2.00
Coliformes totales
2.97
4.04
3.00
NR
Coliformes fecales
2.92
NR
1.00
NR
Mesfilos aerobios
5.85
8.47
NR
2.70
Levaduras
NR
NR
5.00
Fuente: 1Delgado y Torres, 2003. 2Garcs et al, 2005. 3Daz-Rivero y Gonzlez, 2001.
NR = No reportado.

La Figura 2 muestra el incremento en la acidez del queso de poro durante los siete
das de maduracin a temperatura ambiente. Despus de siete das de
maduracin a temperatura ambiente, en los quesos de las tres fbricas se obtuvo
un incremento en la acidez. Este aumento en la acidez se explica por la accin de
microorganismos cido-lcticos que utilizan los nutrientes presentes en el queso
como fuente de carbono para producir cidos orgnicos, como ctrico, actico y
lctico (Raimbault, 1998). Por otra parte, se ha encontrado que la acidez es un
factor esencial en la conservacin de alimentos. En los alimentos con alta acidez
los microorganismos patgenos presentan pocas posibilidades de sobrevivir
(Steinkraus, 2002). Esto hace que los alimentos cidos sean seguros para ser
consumidos, ya que adems, pueden mejorar la flora microbiana benfica
compuesta principalmente por Lactobacillus y Bifidobacterium (Bengmark 2000).

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3

cido lctico (%)

2.5
2
1.5
1
0.5
0
0

3
4
Tiempo (d)

San Marquito

El tigre

Usumacinta

Figura 2. Contenido de acidez en queso de poro durante el proceso de

maduracin.
En el yogurt, la concentracin de bacterias lcticas debe ser como mnimo Log
6.30 ufc/g (NMX-F444-1983) y en los quesos analizados se encontr durante los
siete das concentraciones por arriba de lo que exige la norma para yogurt, lo que
convierte a estos quesos en una buena fuente de bacterias lcticas. Sin embargo,
an es necesario implementar estrategias para disminuir la concentracin de
coliformes a valores permitidos por la Norma.
Es difcil clasificar todos los tipos de quesos existentes, ya que existen zonas de
solapamiento, normalmente se identifican las siguientes clases: quesos frescos no
madurados, como el queso Mozarella, queso de pasta blanda, como el
Camenbert, queso de pasta firme, como el Manchego, queso de pasta dura, como
el Parmesano, quesos procesados o fundidos (Hernndez y Daz, 2002). Aunque
el proceso de elaboracin del queso de poro requiere de siete das a temperatura
ambiente, este queso se clasifica como queso fresco ya que el periodo para
quesos madurados es de cerca de 40 das (Scott, 1991). En el Cuadro 3 se
compara la acidez del queso de poro con otros quesos similares. La acidez del
queso de poro fue mayor que en otros quesos similares. El queso blanco duro tipo
llanero es uno de los productos lcteos bsicos en la dieta del venezolano, el cual
es madurado durante diez das. Al igual que el queso de poro, es elaborado a
partir de leche cruda siguiendo esquemas artesanales empricos, no
estandarizados, lo que, aunado a la pobre calidad sanitaria, distribucin y
comercializacin no sujeta a controles, almacenamiento sin refrigeracin o
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refrigeracin no controlada, lo convierten en un potencial vehculo para la

transmisin de importantes patgenos (Citti et al 1999). Aunque la elaboracin es
similar, el queso tipo llanero presenta valores de acidez muy por debajo del queso
de poro. Uno de los quesos que present valores de acidez cercanos a los del
queso de poro fue el queso crema adicionado con probiticos (Ramos et al, 2005),
por lo que se sugiere realizar estudios posteriores para analizar el potencial
probitico de las cepas contenidas en el queso de poro.
Cuadro 3. Comparacin de la acidez del queso de poro con otros quesos.
Queso
Blanco duro tipo llanero
Mozarella
Cotija
Crema
Crema con probitico
De poro San Marquito
De poro El tigre
De poro Usumacinta

Acidez
(% de ac. lctico)
0.61 0.32
0.40 0.80
0.70 0.07
0.82
1.04
2.30 0.18
1.98 0.21
2.02 0.14

Referencia
Citti et al, 1999
Hernndez y Daz, 2002
Morales et al, 2003
Ramos et al, 2005
Ramos et al, 2005

Como parte del proceso inicial en la elaboracin del queso de poro se agrega
suero del da anterior, lo que permite agregar a la leche un inculo con alta
concentracin de bacterias lcticas. Se ha reportado que las bacterias lcticas son
una opcin para inhibir el crecimiento de la flora patgena (Steinkraus 2002). La
produccin de cido lctico por este tipo de microorganismos ha demostrado
poseer efectos de conservacin. El uso de cultivos microbianos protectores se
est revelando como una opcin de futuro para la conservacin de alimentos
crudos o moderadamente procesados. Estudios recientes han evidenciado que
algunos microorganismos compiten por el alimento y el espacio con patgenos, de
modo que limitan enormemente su capacidad para alterar los alimentos (Lunden et
al, 2003). Las propiedades antimicrobianas de algunos tipos de bacterias han
centrado el inters de multitud de investigadores en los ltimos aos. Como
resultado, han surgido diversas estrategias de biocontrol para su aplicacin en
alimentos (Guerrero y Taylor, 1994)
El principio de accin de la bioconservacin es relativamente sencillo. En una
primera fase los microorganismos de biocontrol compiten por los nutrientes y el
espacio con los pocos patgenos, de forma que al crecer en el alimento se
produce la eliminacin de estos microorganismos indeseables. Al mismo tiempo,
algunos microorganismos tienen la capacidad para producir sustancias
antimicrobianas, como es el caso de muchas bacterias lcticas, aspecto que limita
la capacidad del patgeno para multiplicarse y alterar el alimento. Como
consecuencia, los patgenos, adems de haber inhibido su crecimiento, tambin
ven mermada su presencia en trminos cuantitativos. Aunque pudieran
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encontrarse colonias de patgenos, los modelos experimentales han evidenciado

que estaran en un nmero tan bajo que no seran capaces de dar lugar a una
infeccin alimentara. En el caso de inocular o emplear microorganismos
competidores, el efecto de inhibicin se produce de una forma natural, por lo que
no es necesario el lavado posterior. Asimismo, si las condiciones de conservacin
no son las adecuadas se producira una multiplicacin del microorganismo
inoculado, con la consiguiente alteracin del producto. La alteracin actuara como
un mecanismo de alerta para evitar el consumo del producto. Si la alerta es eficaz,
el riesgo de brotes de toxiinfeccin alimentara se vera minimizado (Guerrero y
Taylor, 1994).
Las bacterias lcticas son generalmente reconocidas como GRAS, por su siglas
en ingls (Generally recognized as safe) y tiene un papel importante en la
preservacin y fermentacin de alimentos, adems de mejorar la calidad higinica
en alimentos por inhibir la flora competitiva la cual incluye patgenos (Cintas et al,
2001). Se aislaron diez cepas puras mediante cultivo y subcultivos en agar leche,
de las cuales, ocho cepas fueron identificadas como catalasa positivas y seis
como Gram positivas; el 50% present forma de cocos y el 50%, de bacilos. En el
Cuadro 4 se muestran las caractersticas de las bacterias aisladas.
Cuadro 4. Caractersticas de bacterias lcticas aisladas de queso de poro.
Bacterias

Catalasa

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

+
+
+
+
+
+
+
+

Tincin
Gram
+
+
+
+
+
+

de Coco
+
+
+
+
+
-

Bacilo
+
+
+
+
+

La seleccin de las bacterias lcticas se bas en la presencia de la enzima

catalasa y la coloracin Gram. Las bacterias 7 y 8 se descartaron como bacterias
lcticas debido a que la prueba de catalasa result negativa. La presencia de la
enzima catalasa es una caracterstica que identifica a las bacterias lcticas, esta
enzima les permite resistir ciertas concentraciones de perxido de hidrgeno que
pueden resultar txicas para otras especies. El perxido de hidrgeno es un
metabolito que se forma como un producto oxidativo terminal de la
descomposicin aerbica de los azcares. Si el perxido de hidrgeno se acumula
en la clula es txico para las bacterias y provoca su muerte; sin embargo, la
enzima catalasa tiene la capacidad de descomponer el perxido de hidrgeno en
agua y oxgeno (Rodrgez et al., 2005).
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La coloracin de Gram fue otro de los factores para identificar a las bacterias
lcticas. Se basa en la capacidad de algunas bacterias de teirse por colorantes
como el cristal violeta y yodo. Al ser tratadas con alcohol acetona, las bacterias
que mantienen el complejo son Gram positivas. Las que pierden el complejo son
Gram negativas y para visualizarlas se agrega un contracolor como safranina. Las
bacterias lcticas al ser teidas adquieren la coloracin Gram positivas, por lo que
debido a la coloracin Gram negativa que presentaron las bacterias 1, 5, 6 y 7,
fueron descartadas.
En cuanto a la forma, la mitad de las bacterias aisladas present forma de coco y
la otra mitad, de bacilo, estos resultados concuerdan con los obtenidos por Surez
(2008), para un queso artesanal madurado durante diez das, en donde el 42%
correspondi a lactobacilos y el 40% a lactococos.
Las bacterias aisladas que fueron identificadas como lcticas fueron la 2, 3, 4, 9 y
10, como se muestra en el Cuadro 1, ya que presentaron las dos caractersticas:
catalasa positiva y Gram positivas; tres presentaron forma de bacilos y dos, de
cocos. Para su conservacin se resembraron en agar leche en tubo inclinado y se
mantuvieron en refrigeracin. Estas cepas sern evaluadas para la produccin de
quesos de poro elaborados con leche pasteurizada. Este proceso ha sido
empleado con xito en quesos ahumados artesanales producidos en Venezuela,
donde se aislaron e identificaron cepas de Leuconostoc sp. y Lactobacillus sp. las
cuales proporcionaron a los quesos pasteurizados, el sabor y aroma de los quesos
elaborados con leche cruda (Alvarado et al., 2007).
Se aislaron veinte cepas de levaduras, las cuales han sido conservadas en agar
papa dextrosa para futura clasificacin y efecto en el sabor y olor del queso de
poro pasteurzado.
CONCLUSIONES
La conservacin de cepas nativas permitir mantener cepas bacterianas que
proporcionan las caractersticas sensoriales que identifican al queso de poro, as
como mejorar su calidad sanitaria.
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