AO DE LA INVERSION PARA EL DESARROLLO RURAL Y LA SEGURIDAD

ALIMENTARIA

UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA

FACULTAD DE INGENIERA INDUSTRIAL
Escuela Profesional de Ingeniera Agroindustrial

PRACTICA DE LABORATORIO N 02
TEMA
MICROBIANO
CURSO

DOCENTE

ALUMNOS

CICLO

MEDICION DE CRECIMIENTO

BIOTECNOLOGIA
JORGE BERMEJO BENITES
ANCAJIMA CHERO JOSE
CRISANTO CARDOZA YANCARLO
ELERA ERAZO JORDIN
LOPEZ RAMIREZ EDGAR
QUILLILLI AZURIN ALEX
GUERRA GALDO LEO
BALLONA SHEYLA
I- 2013

PIURA PERU
2010
PRACTICA N 02

MEDICION DE CRECIMIENTO MICROBIANO

I.- INTRODUCCION:
La cintica de crecimiento microbiano constituye una de las operaciones ms utilizadas
por la ingeniera alimentaria y la biotecnologa, por lo tanto, es menester conocer los
diferentes mecanismos de crecimiento, as como, la forma de cuantificacin de los
mismos, sus formas de aplicacin, las ventajas y desventajas de los diferentes mtodos,
y sobre todo el monto econmico de cada uno de ellos. Por tanto, el siguiente
documento trata de proporcionar una informacin general acerca de los diferentes
mecanismos de reproduccin bacteriana, as como de dar una idea acerca de la
utilizacin de los mismos, sus caractersticas, especificaciones, y un anlisis de las
ventajas y desventajas de cada uno de ellos.
Podemos definir el crecimiento de cualquier sistema biolgico como el incremento
ordenado de todos los elementos componentes de ese sistema, lo cual implica un
aumento de la masa celular que eventualmente conduce a la multiplicacin celular. En
organismos pluricelulares dicha multiplicacin se traduce en un aumento del tamao del
individuo, mientras que en unicelulares que se dividen por fisin o por gemacin, lo que
ocurre es un aumento de la poblacin. En los microorganismos cenocticos (en los que
la duplicacin del genoma no se acompaa de divisin celular) el crecimiento se traduce
en aumento de tamao de la colonia cenoctica. El crecimiento bacteriano podemos
estudiarlo desde dos puntos de vista: a escala individual y escala poblacional.
Objetivo General:
Conocer los distintos mtodos directos e indirectos utilizados para determinar el
crecimiento bacteriano.
Objetivo especfico:
Determinar el nmero de levaduras viables en la preparacin de inculos para
bebidas alcohlicas y durante el proceso de fermentacin.

II.- FUNDAMENTO TEORICO

II.1.- METODOS DIRECTOS
Los mtodos directos se basan en la medida de la evolucin del nmero de clulas vivas
(tcnicas de plaqueo) o del nmero de partculas (tcnicas microscpicas y de
contadores de partculas).
a)

Cuantificacin del nmero de clulas

Se trata de conocer el nmero total de microorganismos presentes en el alimento. Este

nmero no guarda relacin con el de microorganismos patgenos por lo que no puede
usarse como ndice de su presencia y slo debe considerarse un indicador de las
caractersticas higinicas generales del alimento.
Dependiendo de las caractersticas del medio utilizado (medio rico, medio limitado en
nutrientes para medida de la flora no lctica de alimentos fermentados) y de las
condiciones de incubacin (mesofilos, psicrfilos) los microorganismos analizados
sern miembros de poblaciones diferentes. En general se investiga la presencia de
microorganismos aerobios o aerotolerantes (anaerobios facultativos); aunque, en ciertas
situaciones (alimentos envasados al vaco), puede ser de inters hacer recuentos de
anaerobios totales.

b)

Contaje de clulas viables:

Es una tcnica comn, rpida y barata que utiliza un equipamiento fcilmente

disponible en un laboratorio de microbiologa. Para estos recuentos se utilizan
generalmente cmaras de recuentos, aunque tambin pueden realizarse a partir de
muestras filtradas en membranas y transparentizadas o teidas con colorantes
fluorescentes (Naranja de acridina).
La mayor dificultad del recuento en cmara es obtener reproductibilidad en el llenado
de la cmara con lquido. Otra dificultad es la adsorcin de las clulas en las superficies
del vidrio, incluyendo pipetas.
Esta adsorcin es crtica en el proceso de dilucin de la muestra y se minimiza al
realizar las diluciones en medios de alta fuerza inica (solucin fisiolgica o medios
mnimos sin fuente de carbono).
Las cmaras ms utilizadas son las de Hawksley, Petroff-Hausser y la de Neubauer.
La primera tiene la ventaja que puede ser utilizada con objetivos de inmersin, aunque
la mayora de los recuentos se realizan con objetivos secos.

Fig. Cmara de recuento de Petroff-Hausser

Fig. Cmara de recuento de Neubauer

Limitaciones:
Es muy tedioso, no es prctico para un gran nmero de muestras.
No es muy sensible, se necesitan al menos 106 bacterias/mL para que sean observadas
al microscopio.
No distinguen clulas vivas de muertas.
c) Contaje en placa
En muchos casos conviene contar las clulas vivas, y esto en laboratorio se suele hacer
mediante el recuento de viables. (Una clula se define como viable cuando, colocada en
un medio adecuado, es capaz de dividirse y dar descendencia). El mtodo habitual de
lograr esto es sembrar pequeas alcuotas de diluciones adecuadas de un cultivo original
sobre placas de Petri con medio slido (con agar). Cada clula viable dar origen a una
colonia visible despus del tiempo adecuado de incubacin. Contando las colonias
visibles, teniendo en cuenta la dilucin de la que proceden y el volumen de alcuota
utilizado, es fcil deducir el nmero de clulas viables en la suspensin original.
Precauciones:
o Para minimizar los errores estadsticos de muestreo, se recomienda sembrar 5 placas
de cada dilucin.
o Hay que usar pipetas nuevas en cada dilucin
o Contar las placas donde existan entre 30 y 300 colonias.
Como no podemos garantizar que cada colonia no proceda de ms de un individuo (y
esto es especialmente cierto para bacterias que forman agrupaciones de 2 o ms clulas),
el recuento se refiere no a clulas viables reales sino a unidades formadoras de colonias
(UFC). Por lo tanto, una UFC corresponde, como mnimo, a una bacteria, pero sobre
todo en bacterias con agrupaciones, la medida por siembra en placa infravalora el
nmero real de individuos, porque cada UFC puede corresponder a dos o ms
individuos que estaban juntos al ser sembrados en placa.

II.2.- METODOS INDIRECTOS

Los mtodos indirectos se basan en la medida de algn parmetro del cultivo que nos
permite deducir informacin sobre la evolucin del nmero de microorganismos.
a) Determinacin del peso hmedo
Se obtiene a partir de una muestra en suspensin que es pesada luego de la separacin
de las clulas por filtracin o centrifugacin. Es una tcnica til para grandes volmenes
de muestra. La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio
intercelular y contribuye al peso total de la masa. La cantidad de lquido retenida puede
ser importante, por ejemplo, un pellet de clulas bacterianas muy empaquetadas puede
contener un espacio intercelular que aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la
forma y deformacin celular. Para corregir el peso hmedo se determina la cantidad de
lquido que queda retenida en el espacio intercelular luego de una centrifugacin, para
ello se utilizan soluciones de polmeros no inicos (como el Dextran) que pueden
ingresar en el espacio intercelular pero no pueden atravesar las paredes bacterianas.
Inconvenientes: grandes errores, debido al lquido intercelular retenido, cuya cuanta
depende a su vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa, intensidad del
empaquetamiento, etc.

b) Determinacin del peso seco

El peso seco (contenido de slidos) de las clulas bacterianas que se encuentran en una
suspensin se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105C hasta peso
constante. Esta tcnica es til para grandes volmenes de muestra, debido a que
diferencias del orden de los miligramos representan el peso de un gran nmero de
bacterias. La desventaja de este mtodo es que componentes voltiles de la clula
pueden perderse por el secado y puede existir alguna degradacin. Tambin la muestra
seca puede recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una
humedad relativa alta.
El aumento de volumen con la humedad tiene un lmite. Este va creciendo hasta que la
clula alcanza un porcentaje de humedad que corresponde al punto de saturacin de la
pared celular, aproximadamente del 30 % para todas las especies en clculos tcnicos. A
partir de ste valor el volumen permanece constante, ya que el agua que penetra en el
volumen de las clulas no produce hinchamiento de la pared celular. Por lo tanto, el
valor del 30 % es un valor para utilizarlo prcticamente, si bien cada especie tiene su
punto de saturacin de la pared celular.
Inconvenientes: mtodo tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastantes errores: es
difcil pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio. 1
mg de peso seco equivale a unas 5x109 bacterias.
III.- MATERIALES:
-

1.5 litros de suero leche

Cmara de Neubauer

1 bombilla acutica

Microscopio

Cocina elctrica

Pipeta volumtrica

Azul de metileno

IV.- PROCEDIMIENTO:
IV.1.- Contaje de clulas viables
Homogenizar el suero de leche y luego Pasteurizarlo a 90C por 2 minutos.
Enfriarlo hasta una temperatura de 40 C con agua fra
Verter el suero de leche al biorreactor
En un vaso precipitado tomar 10-20ml de suero de leche del reactor en
funcionamiento.
Aspirar el suero de leche con la pipeta para glbulos blancos hasta la marca
0.5 y limpiar cualquier exceso con algodn o papel filtro.
Llenar la pipeta con la solucin de azul de metileno hasta la marca 11. La
dilucin es de 1/20. Todos estos pasos de diluir y medir deben ser realizados
con el mximo de exactitud. Taponar con los dedos, los extremos de la pipeta
y mezclar el contenido muy cuidadosamente.
Descartar las primeras gotas del suero de leche antes de llenar la cmara que
debe estar perfectamente limpia y seca.
Poner en contacto una gota, en el borde del cubreobjetos que se ha colocado
sobre la cmara de manera que el lquido difunda por debajo, llenando la
cmara.
Colocar la cmara bajo el microscopio y localizar el campo con pequeo
aumento, pasando despus a un mayor aumento (40X). Contar las clulas en
los 4 cuadrados de 1mm2 de las esquinas y luego sumarlos.
Repetir todo el procedimiento despus de 24 horas de incubacin y
determinar el incremento del nmero de bacterias.
Calcular el nmero promedio de bacterias.
Las dimensiones de la cmara y el grado de dilucin, constituyen las bases del
clculo. Como las bacterias se han contado en cuatro mm cuadrados, la altura de la
cmara es de 0.1 mm, el grado de dilucin es 1/20; para el clculo del nmero de
bacterias/mm3 se efectuar la siguiente operacin:
(N/4)(20x10)
Donde

N: nmero de bacterias contadas en los 4 mm2.

Observaciones:
Las observaciones en el microscopio fueron las siguientes a 40X:
PRIMER CONTEO: (viernes 9:00 am)

35

52

47

31

43

49

45

38

38

36

27

49

31

34

52

54

3er Cuadrante

(2276/4)

2do Cuadrante

4to Cuadrante

31

45

63

55

33

39

58

38

44

34

54

57

49

47

48

32

(20x10)=113800 bacterias/mm3

1er Cuadrante

SEGUNDO CONTEO: (Lunes 10:00 am)

- - - - - - - -

2083

2071

(8279/4)

(20x10)= 413 950 bacterias/mm3

- - -

2065

2060

TERCER CONTEO (Martes 9:10 am)

2524

2465
-

(9991/4)

(20x10) = 499550 bacterias/mm3

2492

2510

V.- DISCUSION
Transcurrieron algo ms de 73 horas para realizar el conteo de clulas luego de
la primera anotacin, notndose en la segunda toma de resultados que la
poblacin de bacterias se triplico.
VI.- CONCLUSIONES
Se pudo conocer que el clculo del nmero de clulas que existen en una
suspensin se puede llevar a cabo mediante el recuento celular (microscopa,
nmero de colonias), masa celular (peso seco, peso hmedo) Todos estos
mtodos se clasifican en dos apartados: mtodos directos y mtodos indirectos.
El peso seco (contenido de slidos) de las clulas bacterianas que se encuentran
en una suspensin se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105C
hasta peso constante. Esta tcnica es til para grandes volmenes de muestra,
debido a que diferencias del orden de los miligramos representan el peso de un
gran nmero de bacterias. La desventaja de este mtodo es que componentes
voltiles de la clula pueden perderse por el secado y puede existir alguna
degradacin.
El crecimiento de una poblacin bacteriana puede ser entendido desde diferentes
perspectivas y de acuerdo a stas se puede llegar a determinar la medida del
crecimiento mediante diversas metodologas.

VI.- RECOMENDACIONES
El recuento debe hacerse tan pronto como sea posible despus de realizada la
dilucin y si esto no es posible, debe agitarse nuevamente antes del recuento ya
que las bacterias tienden a decantar dentro de la pipeta.
La cmara de Neubauer debe estar completamente limpia, seca y sin ninguna
alteracin en la estructura que pueda afectar nuestros resultados.
VII.- BIBLIOGRAFA
http://www.biol.unlp.edu.ar/alimentos/ASIGNFERMEN.htm
http://www.uib.es/depart/dba/microcore/

VII.-

ANEXOS

Pasteurizado de la muestra (suero de leche)

Reactor en funcionamiento, de
donde se tomar la muestra

Toma de muestra para llevar a la

cmara de Neubauer