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Extraccin de cidos Nucleicos

Qu es la extraccin?
Proceso de separacin de una sustancia que se encuentra mezclada
dentro de un compuesto u organismo.

Extraccin de cidos nucleicos


Proceso de liberacin del material
gentico contenido dentro de una
clula.
Los cidos nucleicos son liberados o
separados de los componentes
celulares as como de protenas que
contienen las clulas.

Extraccin de ADN
El ADN puede ser obtenido de virtualmente cualquier clula o material biolgico
que las contenga
Clulas eucarioticas

Clulas procariticas

Virus

Extraccin de ADN

ADN cromosmico
ADN plasmdico

Plsmidos
E. coli
Cromosoma

Electron micrograph of DNA from a lysed E. coli cell

Plsmidos
Molculas de ADN separadas del ADN cromosmico
Auto-replicacin

Tipos de Plsmidos bacterianos


Plsmidos Fertilidad (F): Facilitador de la conjugacin bacteriana.

Plsmidos de Resistencia (R): Contienen genes de resistencia a drogas o


antibiticos u otras toxinas.

Bacterias que llevan un plsmido con el


gen neomycin phosphotransferase es
capaz de sobrevivir en presencia del
antibitico kanamicina

Extraccin de ADN

Extraccin de ADN
Qumico
Lisis celular

Enzimticos

Proteinase K
Lysozyme

Mecnicos

Freezing
Sonication
Grinding

Solventes
Orgnicos

Remocin de
proteinas

Precipitacin
del ADN

SDS, sarcosyl
CTAB

Phenol
chloroform

Salt

Sodium chloride
Sodium acetate

Captura del ADN

Membrane
Beads

Alcoholes

Ethanol
Iso-propanol

Lisis Celular.
Preparacin del extracto celular
Estructura celular debe ser destruidas para liberar el ADN.

Mtodos Fsicos

Fuerza mecnica rompe la


pared y membrana celular.

Mtodos Qumicos

Atacan la pared celular y la


membrana celular
Pared celular = lisosima, EDTA o
ambos
Membrana celular = detergentes
(SDS, CTAB)

Lisis Celular
Ruptura de la pared celular

Lisozima: digiere los polisacridos componentes


estructurales de la pared celular
EDTA (ethylenediamine tetraacetate) se une a los
iones de magnesio esenciales para preservar la
estructura de la clula e inhibe enzimas que podran
degradar el ADN

Ruptura de la membrana celular

Sodium dodecyl sulphate (SDS): es un detergenteel cual remueve las molculas lipdicas

Como afectan los detergentes a las membranas celulares?

Las membranas celulares estn formadas por una


bicapa de fosfolpidos, la estructura similar de las
molculas de los detergentes conduce a la formacin
de complejos lo que conduce a su disociacin

Lisis celular con buffer SDS/NaOH


Addicion del buffer causa que la solucin se torne viscosa
1. Sodium dodecyl sulfate

Disuelve las membranas

Se une y desnaturaliza las proteinas

2. NaOH
Desnaturaliza el ADN
Debido a que los plsmidos estm
superenrollados ambas cadenas de ADN
se mantienen juntas despues de la
desnaturalizacin

Neutralizacin NaOH con solucin de acetato de potasio


Mezclando con esta solucin causa la formacin de un precipitado
blanquinoso.
1. Solucin de Acetato de Potasio
Neutraliza NaOH (re-naturaliza el plsmido de ADN)
Convierte el SDS soluble a PDS insoluble.

sodium dodecyl sulfate (SDS)


(H2O sol. = 10%)

potassium dodecyl sulfate (PDS)


(H2O sol. < 0.02%)

Centrifugacin remueve
restos
celulares
insolubles

Extraccin del Plsmido

Extraccin de ADN
2.- Purificacin

Se base en la eliminacin enzimtica de las


protenas celulares
Adicin de Proteinasa K
Fnol:Cloroformo:alcohol Isoamlico (25:24:1)

ADN
Protenas
disueltas
Lpidos

Separacin por centrifugacin

2.- Purificacin

Extraccin de ADN
3.- Precipitacin:

El ADN se precipita con etanol fro o isopropanol en


presencia de sales
Centrifugacin

Adicin de etanol o
de isopropanol

Separacin por
centrifugacin

ADN

3.- Precipitacin:

Extraccin de ADN
4.-

Conservacin:

El ADN se conserva a 4C o -20C en TE


Refrigeracin a 4C o -20C

ADN
+

T.E.

Tris

EDTA

Electroforesis
Materiales:
Balanza
Agarosa

Fiola
Probeta

TAE
1X

Pipeta
Microonda

Puntas de depsito

Electroforesis
Montaje

del molde:

Fondo del
molde

Localizacin y alineamiento
de las peinetas

Localizacin de las
paredes del molde

Electroforesis
Pesar la agarosa

Mezclar el TAE 1X con la


agarosa

Medir el TAE 1 X

Agarosa

Polisacrido

T.A.E

Tris
cido Actico
EDTA

Electroforesis

Calentar hasta que


la agarosa se
disuelva
completamente

Guantes

Dejar enfriar
algunos
minutos

Aadir el
bromuro de
etidio

Electroforesis
6

Cubeta de
electroforesis

Colocar en la cubeta y esperar


que el gel se polimerice
Mezclar el ADN con
el tampn de
depsito

(Azul de
Bromofenol)
Muestra

Sacar con cuidado


las paredes y les
peinetas del molde

8
Colocar con cuidado
Las muestras en los pozos

Electroforesis

Cerrar la cubeta de
electroforesis y encender el
generador

Electroforesis

Electroforesis
10

Despus de algunos minutos, colocar el


gel sobre un trans-iluminador y
observar los resultados

ADN genmico
ADN plasmidico

Conformaciones de los Plsmidos de ADN


Nicked Open Circular
(slowest)
Linear
Relaxed Circular
Supercoiled Denatured
Supercoiled (fastest)