Opapeldoxidontriconainibioprpulsodoreflexodesobressaltoacstico

GREGRIO,Erico* D.C OLIVEIRA,Felipe S.R* CHAGAS,Gustavo H.F*CARMO,Jorge L*.LUZ,Marcus V*

SALUM,C**
*AlunosdeBachareladoemCinciaeTecnologiapelaUniversidadeFederaldoABC(UFABC)
**Professora adjunta da Universidade Federal do ABC (UFABC), junto ao Centro de Matemtica,
ComputaoeCognio(CMCC).

RESUMO: A esquizofrenia, uma severa doena neuropsiquitrica, caracterizada por um

conjuntodesintomasconsequnciadedistrbiosemvariadossistemasdeneurotransmissores
que acabam afetando a memria, cognio, ateno e tambm no funcionamento intelectual
geral do esquizofrnico. Dficits cognitivos do organismo afetado podem ser observados a
partir de mtodos como o teste de inibio prpulso, alm de poderemser manipulados em
laboratrio atravs de drogasque so capazes deaumentaraneurotransmissodedopamina,
substncia responsvel pelos sintomas que caracterizam a esquizofrenia. O metilfenidato
um psicoestimulante capaz de bloquear a recaptao da dopamina, a qual tem sua
concentrao sinptica aumentada e consequente produo diminuda. Assim, a dopamina
consegue ser removida da fenda sinptica devido homeostasia, equilibrando o sistema. O
estudo presente tem como objetivo investigar os efeitos da interao do xido ntrico (NO) na
liberao dedopamina da fenda sinptica emindviduosesquizofrnicos.Foipossvelsimulara
alta concentrao dopaminrgica, caracterstica de indivduos esquizofrnicos, graas
utilizao dometilfenidato,queatuabloqueandoarecaptaodedopamina.Parainibirasintase
de NO, foi utilizado a LNOARG. Utilizouse o teste de inibio prpulso (IPP) queconsiste
em apresentar um estmulo sonoro de baixa intensidade (variaes de 81dB,73dB e 69dB),
antes de um estmulo de alta intensidade (100dB) para examinar a resposta de sobressalto.
Esteestudofoirealizadoinvivoeanalisouseoreflexodesobressaltodegruposderatos

PalavrasChaves:metilfenidato,esquizofrenia,dopamina,prpulso,xidontrico(NO).
ABSTRACT: The Schizophrenia, a severe neuropsychiatric disorder, is characterized by a
group of symptoms due to disorders in some neurotransmission systems that affect memory,
cognition, attention, and also the general intellectual functioning of the schizophrenic. Cognitive
deficits of the affected organism may be described by methods suchasprepulseinhibitiontest,
and also, they can be manipulated in labs with drugs that are able to increase the dopamine
neurotransmission. That substance is responsible for the schizophrenia symptoms. The
methylphenidate is a psychostimulant which can block the dopamine reuptake therefore, the
synaptic concentration ofdopamine is increased andconsequently,itsproductionisdecreased.
So, the dopamine can be removed of the synaptic cleft due to the homeostasis, balancing the
system. The presentwork aims at investigating the effects of nitric oxide (NO) in the dopamine
release from the synaptic cleft into schizophrenics. It was possible to simulate the high
dopamine concentration, a affected samples feature, thanks to the methylphenidate, which
blocks the dopamine reuptake. It was used LNOARG to inhibit the NO synthesis. It was used
the prepulse inhibition test that was to present a stimulating lowintensitysound (81dB,73dB
and 69dB) before the high intensity one (100dB ) to examine the startle response. This study

wasaccomplishedinvivoandstartleresponsesofratsgroupswereanalyzed.

Keywords:Methylphenidate,schizophrenia,dopamine,prepulse,nitricoxide(NO).
INTRODUO:
A inibio prpulso (IPP) a reduo de uma resposta involuntria (reflexo) a um
determinado estmulo acstico (pulso), quando este precedido por um estmulo de menor
intensidade (prpulso). (Yoneyama et al, 2011). A principal caracterstica do reflexo, frente ao
pulso, contrao de msculos da face e do corpo. A IPP uma ferramenta til que permite
aos cientistas proporem modelos que se utilizam deste conhecimento, para o estudo de
diversas desordens psiquitricas, sendo uma delas, a esquizofrenia. A esquizofrenia uma
doena neuropsiquitrica muito grave, caracterizada por duas famlias de sintomas, os
sintomaspositivosenegativos(Carlson,2001apudCrow1980Andreasen,1995).
Dficts cognitivos, alucinaes e delrios, constituem o grupo dos sintomas positivos. A
ausncia de habilidades motoras e de comportamentos comuns caracteriza os sintomas
negativos. Diversas so as hipteses estudadas para explicarafisiopatologiadaesquizofrenia,
entretanto, a mais aceita a hiptese farmacolgica ligada atividade hiperestimulada de
neurnios dopaminrgicos presente na via mesolmbica, com origemnareategmentalventral
(VTA)edestinoaoncleoacumbenseamgdala(Carlson,2001).
A hiptese dopaminrgica sugere que existe uma relao entre a atividade dos
neurnios dopaminrgicos da via mesolmbica e os sintomas positivos da esquizofrenia. As
evidncias que contribuem para esta hiptese residem nos antagonistas dopaminrgicos, tais
como o haloperidol e a clorpromazina utilizados no tratamento da esquizofrenia. Tais
antagonistasatuambloqueandoosreceptoresdedopamina.
O xido ntrico umneurotransmissor atpico, caracterizado por ser um gs e no ser
armazenado em vesculas sinpticas (Salum et al,2006). Estudos recentes sugerem que o
xido ntrico (NO) atua como agonista dopaminrgico, ao passo que, sua sntese pode estar
relacionada concentrao de dopamina na fenda sinptica, no sistema lmbico. A sntese do
xido ntrico (NO) se deve presena da enzima NO sintase, desta forma, a inibio desta
enzima, resulta na inibio da sntese de NO. Um antagonista nitrrgico conhecido a
Lnitroarginina(LNOARG)queatuainibindoaaodaNOsintase.
A inibio prpulso serve como evidncia experimental para os nveis dopaminrgicos.
As evidncias se baseiam nofiltro atencional e no reflexo de sobressalto frente a um estmulo
sonoro. Estudos in vivo, com indivduos esquizofrnicos,sugeremqueofiltroatencionaldestes
indivduos se encontra severamente prejudicado, e assim a resposta involuntria (reflexo de
sobressalto) a um determinado estmulo fraco (prpulso) dada na mesma intensidade da
resposta ao estmulo forte (pulso), demonstrando assim, a incapacidade de discernir a
relevncia de um estmulo. Emindivduossadiosoreflexo desobressaltoatenuadoquandoo
pulsoapresentadoprecedidodeumprpulso.

OBJETIVO
Tal trabalho tem como objetivo estudar os efeitos do xido ntrico (NO) na liberao de

dopamina(DA) da fenda sinptica em indviduos esquizofrnicos atravs dousodoantagonista

da enzima produtora de NO, o LNOARG para assim, tentar encontrar uma alternativa para
possveis aplicaes e estudos futuros que possam encontrar uma melhor maneira de tratara
esquizofrenia.
MATERIAISEMTODOS:
Animais
Foram utilizados ratos machos da espcie Wistar (UniversidadeFederaldoABC,Santo
Andr, Brasil) pesando entre 180220 g. Os ratos foram mantidos sob condies ambientais
controladas. A luminosidade foi controlada no ciclo de 12horasdeclaro/escuro,iniciandoses
6:00 am. A temperatura tambm foi controlada em cerca de 23C(1C). Todos os
experimentos foram aprovados pelo Comit de tica em Pesquisa com Animaisda UFABC e
da Sociedade Brasileira de Neurocincias e Comportamento e foram feitos todos os esforos
paraminimizarosofrimentoanimal.
Drogas
Metilfenidato(Ritalina,Novartis).LNitroarginina(LNOARG,Sigma).
Asdrogasforaminjetadasviaintraperitoneal.
Solues
Soluosalina(NaCl0,9%)
ProcedimentoExperimental
Tratamento
Os ratos foram mantidos no laboratrio cerca de 1 dia antes do procedimento
experimental. Estesratos foram divididosaleatoriamenteem4grupos.Cadaratorecebeuduas
injees, a primeira aplicada 1 hora antes do teste ser feito e a segunda, meia hora antes. O
nome dos grupos, se refere na ordem de cada injeo. Grupo01: salina+ salina(1ml/kg por
ml). Grupo 02: salina (1ml/kg por ml) + metilfenidato (2mg/kg por ml). Grupo 03LNOARG
(40mg/kg por ml) + Salina (1ml/kg por ml). Grupo 04: LNOARG (0,3mg/kg por ml) +
metilfenidato (0,3mg/kg por ml). O teste iniciado cerca de 30 minutos aps a aplicao da
segundainjeo.
Todasasdrogasforaminjetadasviaintraperitoneal.

TestedeInibioPrpulso
O nvel de IPP em cadaanimalfoideterminadoexpressandoaamplitudedosobressalto
prpulso+pulsocomoumpercentualdeacordocomaseguintefrmula:

O incio do teste se deucomaambientaodorato,durante5minutos,perodonoqual,

o rato foi expostoao rudo de fundo. Depois detalperodo,osratosforamsubmetidosaoteste,
com 10 pulsos sozinhos, com intervalo de 30s entre eles, para a construo da curva de
calibrao do experimento. Aps isso,osratosforamsubmetidosaotestedeinibioprpulso
de sobressalto acstico. O teste consistiu em 60 ensaios, apresentados com umintervalo de
30 s entre cada estmulo, divididos aleatoriamente em 3 categorias: 20 apresentaes de
pulsos sozinho (100dB), prpulso sozinho (81dB) e prpulso (81dB) seguido de pulso

(100dB), com um intervalo de 80 ms entre prpulso e pulso.O testedeinibioprpulsode

sobressalto acstico foi repetido duas vezes, com as mesmas condies de intervalos
temporais e nmeros de apresentaes, porm, variandose a intensidade acstica do
prpulso. A primeira repetio do teste utilizouse um prpulso com 73 dB e a segunda
repetiodotestefoifeitautilizandoseumprpulsode69dB.
Alm disso, foi feito o teste de reflexo de sobressalto. Ambos os testes foram
conduzidos simultaneamente por dois sistemasdesobressaltoidnticos(MedAssociates,Inc.,
USA), os quais foram usados para gravar a amplitude da resposta do sobressalto (ASR) no
teste de PPI. Cada sistema consistiaemumajaulafeita deumarededemetaisestabilizadores
(16.55.17.6 cm) suspensa por uma estrutura de PVC, a qual estava presa a plataforma de
resposta por quatro parafusosserrilhados. Cada jaula foi alojada em umlocal com iluminao
reduzida e uma cmara ventilada de madeira compensada prova de som (646040cm). O
piso da jaula consiste de seis barras de 3,0mm dimetro feitas de ao inoxidvel espaadas
1,5 mm entre si. Os estmulos acsticos foram providos por um alto falante localizadoa10cm
atrs da jaula feita da rede de metal. A reao ao sobressaltodos ratos gera uma presso na
plataforma de resposta, e sinais analgicos foram amplificados, digitalizados e analisados por
um software (Prepulse Inhibition Startle Pro Software,verso 4.10, Med Associates, Inc.)
executado em um computador IBMPCcom interface compatvelcomaparelhodesobressalto.
O conjunto de interfacedo computador tambm controlava a entrega dos estmulos acsticos
[intensity, interstimulus interval(ISI), etc.]. As jaulas foram calibradas antes do teste para
comprovar a sensibilidade igualde ambas as plataformas de resposta durante a realizao do
teste. O sinal acstico contnuo provia um ruido branco de fundo nonvel de 55dB. O sinal era
interrompido pela apresentao do estmulo, um pulso sozinho, o qual consistia em um ruido
branco a 100dBcom aumento/queda de5mse duraode50ms,eaintensidadedoprpulso
foi configurada a 81 dB de tom puro, freqncia de 3000Hz e uma durao de 20 ms, exceto
pelo experimento 1, o qual a intensidade dos estmulosprpulsovariouentre69dBe 73dB.Os
testesocorreramentre07:00e17:00horas.
Os dados coletados foram submetidos ao tratamento estatstico, realizandose a anlise de
varinciaANOVA.
RESULTADOS:
A porcentagem de inibio prpulso (% IPP) revelouse maior (54%) no grupo que
recebeu a injeo de LNOARG, quando este comparado ao grupo que recebeu a
administrao de metilfenidato, resultando em uma porcentagem de 16% de IPP, sugerindo
assim, que o NO pode estar relacionado com a esquizofrenia, aumentando os nveis de
dopamina nafenda sinptica. Alm disso, a porcentagem negativa de IPPnoexperimento com
prpulso(69dB)seguidodopulso,sugereapropagaodepossveiserrosexperimentais.

Grfico1%deInibioprpulsoobtidaconformeainjeodasdrogas

*indicadiferenasignificativadosgruposSalSaleLNOMetil(Duncan,P<0,05)

Tabela01ResultadosObtidos
Primeirainjeo
segundainjeo

Pulso

Prpulso+pulso(81)

Prpulso+pulso(73)

Prpulso+pulso(69)

SalinaSalina

996

464

556

578

Salinametilfenidato

692

575

610

641

LNOArgSalina

893

507

621

683

LNOARGMetilfenidato

847

448

599

597

Grfico2%dereflexodesobressaltoobtidaconformeainjeodasdrogas

DISCUSSO:
A anlise de Varincia ANOVA revelou no teste de inibio prpulso diferenas
significativas entre os sujeitos dos grupos salinasalina e LNOARGmetil, pois o teste Duncan
revelou p<0.05. Como o metilfenidato atua como agonista dopaminrgico, os resultados
significativamente baixos na porcentagem de inibio prpulso (% IPP) eram previstos pela
literatura, em decorrncia do alto nvel de concetrao dopaminrgica na fenda sinptica
(Carlson,2001). Os sujeitos que receberam as injees de LNOARGMetilfenidato
apresentaram diferena significativa (p = 0,01) entre o grupo SalinaSalina, mostrando que
houve recuperao na resposta de prpulso, sugerindo assim que houve reduo no nvel de
dopaminaeconsequentementeatenuaodeumdossintomasdaesquizofrenia. Arazopara
a possvel recuperao da inibio prpulso nestes sujeitos se deve ao papel inibitrio do
LNOARG sobre a NO sintase, de modoque ocorre a reduo nos nveis de xido ntrico (NO)
na fenda sinptica. Como o NO atua como modulador da dopamina (Salum et al,2006), a
reduo de seus nveis de concentrao apontam que ocorre uma retroalimentao com os
nveis de dopamina, isto , a concentrao de dopamina responsivaconcentraodeNOe
deste modo, a inibio da sntese de NO sugere uma nova teraputicapara o tratamento dos
sintomasdaesquizofrenia.
No teste de sobressalto no foram observadas diferenas estatisticamente
significativas entre os sujeitos, revelando de modo geral, que as3 variaes apresentadas de
prpulso+pulso diferiramse da apresentao dopulso sozinho. A respostadossujeitosforam
maiores quando o pulsofoi apresentado sozinho doquequandofoiprecedidodasvariaesde
prpulso.Esteresultadotambmeraprevistopelaliteratura(Yoneyamaetal,2011)
Os dados experimentais coletados durante a execuo do experimentosugeremqueo
LNOARG pode ser utilizado como aalternativa parcial para a reduodo sintoma de dficit no
filtro atencional emindivduos esquizofrnicos, pois, houve significativarecuperaodainibio

prpulso nossujeitosquereceberamainjeodemetilfenidatoprecedidadeLNOARG.Porm,
em virtude da baixa significncia nos resultados do reflexo de sobressalto so necessrios
maisestudosrelacionadosparaainvestigaodascausasdesteefeito.
AGRADECIMENTOS
Ns agradecemos UFABC pelo suporte tcnico. Tambm gostaramos de agradecer
FAPESP,CNPqeCAPESpeloapoioaestapesquisa.
Almdisso,agradecemosaprofessoraCristianeSalumporterfornecidoosdadosdopresente
trabalho.
REFERNCIAS
Carlson Fisiologia do Comportamento 20021 Edio BrasileiraEditora ManoleSoPaulo,
Brasil.
Salum,C. . F. S. Guimares . M. L. Brando Dopamine and nitric oxide interaction on the
modulation of prepulse inhibition of the acoustic startle response in the Wistar
ratPsychopharmacology2006P133141
Salum,C.,Issy,A.C,DelBelEADopamina,xidoNtricoesuasInteraesemModelos parao
EstudodaEsquizofreniaPsicologia:ReflexoeCrtica.2008P186194