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PRACTICA N 7

IDENTIFICACIN BIOQUMICA DE BACTERIAS GRAM NEGATIVAS


OBJETIVOS

Conocer los procedimientos de identificacin bioqumica de las principales bacterias gram negativas.

Interpretar los resultados de las pruebas bioqumicas y correlacionarlas con las diferentes especies de
bacterias gram negativas.
INTRODUCCIN

Las bacterias gram negativos pueden presentarse como bacilos o cocos siendo los primeros los ms
abundantes tanto del hombre como de los animales. Varios de estos microorganismos pertenecen a la flora
intestinal normal y otros estn asociados a infecciones entericas y a otros procesos infecciosos
(especialmente cuando estas bacterias invaden otros rganos o sistemas)

Es posible que las infecciones procedan de un reservorio animal, de un portador sano, o de la diseminacin
endgena de la bacteria en un sujeto susceptible, pudindose ver afectados casi cualquier rgano del
cuerpo.

Familia de Bacilos Entericos:

Esta familia, Enterobacteriaceae, incluye a varios patgenos que causan sndromes diarreicos. Un gran
nmero de ensayos han sido desarrollados de manera de identificar rpidamente al patgeno, para que
posteriormente el mdico, con base al reporte, indique el tratamiento adecuado, o para que los
epidemilogos puedan localizar la fuente de la infeccin. Dentro de los bacilos gram negativos las
enterobacterias son responsables del 30 al 35% de todas las septicemias, ms del 70% de todas las
infecciones del tracto urinario y muchas infecciones intestinales.

Dentro de las especies de enterobacterias que son los agentes etiolgicos de infecciones entricas,
tenemos: Salmonella, Shigella y Escherichia coli. Estas pueden producir cuadros diarreicos e infeccin
sistmica que son procesos infecciosos que se diseminan generalmente por va sangunea o linftica.

Medios de aislamiento primario

Son medios selectivos porque permiten el desarrollo de algunas bacterias e inhiben el desarrollo de otros.
Esta capacidad puede ser moderada (como en EMB y McConkey), alta (como en SS, desoxicolato y citrato)
o completamente especfica (sulfato de bismuto y verde brillante).

Algunos de los medios selectivos contienen lactosa y un indicador de pH, lo que permite desde un principio
tener colonias aisladas de bacterias fermentadoras como Escherichia coli y no fermentadoras de la lactosa
(como Salmonella y Shigella).
Medios diferenciales (pruebas bioqumicas)

Son aquellos en los que se ponen de manifiesto las propiedades metablicas de los microorganismos frente
a diferentes substratos. Existen medios que permiten observar una, dos o ms caractersticas metablicas
de la bacteria inoculada. Entre los ms utilizados estn:
TSI (Agar hierro triple azcar): Medio slido que contiene glucosa, sacarosa, lactosa, hierro y un indicador
de pH. Con este medio se puede conocer la capacidad de la bacteria para fermentar los carbohidratos.
Tambin se detecta la produccin de H2S, as como de gas. El tubo se siembra por picadura y en estra, por
lo que se debe observar tanto el fondo como la superficie del medio.
LIA (Agar hierro lisina): Medio slido que contiene lisina, sales de fierro, glucosa y un indicador de pH. Con
este medio se determina la descarboxilacin y desaminacin oxidativa de la lisina, la produccin de H2S y la
fermentacin de la glucosa. Se siembra igual que el TSI, por picadura y estra.
MIO (Movilidad indol ornitina): Es una medio semislido. Contiene ornitina, triptfano y glucosa. Las
reacciones que se pueden presentar en el son: movilidad de la bacteria, descarboxilacin de la ornitina,
produccin de indol a partir del triptfano y fermentacin de la glucosa. Se siembra por picadura con asa
recta.
CITRATO DE SIMMONS: Medio slido que contiene citrato de sodio, compuesto que puede ser utilizado
como nica fuente de carbono, por algunas bacterias. Se siembra por picadura y estra.

Jos Huapaya Yaya, Martha Flrez Flores

Existen ms pruebas bioqumicas que pueden utilizarse como complemento a las ya descritas, como son:
rojo de metilo, Voges Proskawer, hidrlisis de la urea. Utilizacin del malonato, entre otras; todas ellas
ayudan a determinar la especie del microorganismo aislado. Sin embargo, en ocasiones a pesar de recurrir a
diversas pruebas metablicas, no se consigue la identificacin, siendo necesario recurrir a reacciones
inmunolgicas para llegar al diagnstico definitivo.

BACTERIAS PIGENAS GRAM NEGATIVAS

Otro grupo menos abundantes en especies pero de gran importancia clnica son las bacterias pigenas gram
negativas, estos pueden ser cocos o cocobacilos y las enfermedades que producen por lo general incluyen
la acumulacin de abundantes cantidades de pus y afectan frecuentemente el aparato genital o respiratorio.
Dichas enfermedades comprenden uretritis purulenta (gonococos), meningitis, neumona, bronquitis,
sinusitis, otitis media, conjuntivitis, epiglotitis, etc.

Las bacterias pigenas gram negativas patgenas en humanos son: Neisseria, Haemphilus, Bordetella,
Moraxella.

Las bacterias del gnero Neisseria son diplococos Gram negativos inmviles, cuyos lados adyacentes son
aplanados o ligeramente cncavos. Solo dos especies de este gnero son patgenas exclusivamente de
humanos: N. gonorroheae o gonococo, agente causal de una enfermedad de transmisin sexual, la
gonorrea y la N. meningitidis e meningococo productos comensales para el hombre y que habitan
principalmente el tracto respiratorio superior. Espordicamente se pueden comportar como patgenos
oportunistas N. sicca, N.mucosa, etc.

El diagnstico definitivo de una infeccin gonoccica se hace por el aislamiento en cultivo de N.gonorroheae.
Para el diagnstico de la gonococia, el lugar de toma de la muestra depender de la edad, sexo y de las
caractersticas de la infeccin.

La tincin de Gram es el mtodo de eleccin para el examen directo de las muestras. Son oxidasa positiva.
Para los cultivos, el medio debe ser de preparacin reciente, bien hidratado y precalentados. Se utilizan
medios selectivos como Thayer- Martn modificado. Se debe utilizar un medio no selectivo ya que algunas
cepas pueden inhibirse por los antimicrobianos contenidos en los medios selectivos. Debe estar adems en
una atmsfera que contenga de 3 a 5% de CO2.

El diagnostico de la infeccin meningoccica, se hace con el aislamiento de N. meningitidis a partir de LCR,


sangre, liquido sinovial, pleural o pericardio. Las ms utilizadas son las dos primeras

Con la coloracin Gram se observan como diplococos gram negativos, crecen en los medios de cultivo
enriquecidos y su crecimiento se favorece con una atmsfera de CO 2 . Son oxidasa positivo y fermentan los
carbohidratos.

MATERIALES

Placas con EMB sembradas con cepas problema


Placas con medio de MacConkey, EMB y SS
Tubos con medio TSI, Citrato, LIA, UREA, MIO (sin sembrar y sembrado con cepa problema)
Asas bacteriolgicas
Reactivo de Kovacs
Laminas fijadas con frotis de Liquido cefalorraqudeo con coloracin gram.
Microscopio
Aceite de inmersin.
Placas de cultivo con agar chocolate.

METODOLOGA
Enterobacterias :

En las prcticas se harn los trabajos de laboratorio que nos permitirn observar las caractersticas del
cultivo y con ello su identificacin:

A partir de uno de los tubos problema, tomar con el asa bacteriolgica previamente esterilizada una muestra
y sembrar por estras en los medios EMB y SS. Incubar a 37 C por 24 hrs.

Transcurrido el tiempo de incubacin, observar la morfologa de las colonias de las placas sembradas
(MacConkey, EMB y SS).

Jos Huapaya Yaya, Martha Flrez Flores

Seleccionar una colonia y realizar cultivos en los tubos de TSI, Citrato, LIA, y MIO esto se hace por puntura
en los medio y luego en estras en la parte de inclinacin, como los indicara el profesor en cada medio.
Llevar a incubar a 37 C por 18 a 24 hrs.
Hacer la lectura de pruebas bioqumicas. Interpretar y realizar la identificacin del microorganismo
proporcionado utilizando las tablas adjuntas.

Interpretacin bioqumica
TSI

Fermentacin de glucosa: en la picadura (fondo del tubo) el medio vira a amarillo. Es una reaccin dbil.

Fermentacin de sacarosa: en todo el tubo el medio cambia a amarillo, principalmente en el fondo, donde
intensifica el calor debido a la reaccin de la glucosa.

Fermentacin de lactosa: en la superficie el medio vira a amarillo.

Debido a la fermentacin puede haber produccin de gas, lo que se manifiesta por la presencia de burbujas
en el medio.
Produccin de cido sulfhdrico (H2S): por degradacin enzimtica de aminocidos que contienen azufre,
originan un precipitado de color negro. La produccin de SH2 tiene lugar en ambiente cido, de ah que el
precipitado negro se concentre en el fondo del tubo, donde se generan cidos a partir de la glucosa. As, un
fondo negro indica que existe acidez en el fondo del tubo, aunque el color amarillo se haya enmascarado
con el precipitado negro.
LIA

Descarboxilacin de la lisina: el medio se alcaliniza y se observa lila o ligeramente morado en la superficie.

Fermentacin de la glucosa: en el fondo del tubo el medio vira a amarillo.

Desaminacin de la lisina: vira a color rojizo en la superficie del medio. Es caracterstico en Proteus y
Providencia.

Produccin de H2S: precipitado de color negro (por el mecanismo citado anteriormente).


CITRATO DE SIMMONS

Utilizacin del citrato como fuente de carbono: el medio vira a color azul.
UREA

Los microorganismos que hidrolizan la urea hacen que el medio de cultivo tome color fucsia, debido a la
alcalinizacin del mismo por produccin de amonio a partir de la urea, que se pone de manifiesto por un
viraje del indicador de pH (rojo de fenol)..
MIO

Motilidad: La baja concentracin de agar de este medio permite que las bacterias se desplacen si son
mviles. Por ello, observando si el crecimiento est slo en la picadura o se extiende a los lados de ella, se
puede determinar si el microorganismo es inmvil o mvil.

Indol: La aparicin, transcurridos unos segundos, de un anillo de color rojo en la interfase entre el reactivo y
el cultivo indica la presencia de indol y, por tanto, la prueba se considera positiva. El indol es capaz de
reaccionar con el grupo aldehdo del reactivo originando un complejo de color rojo.

Produccin de H2S: precipitado de color negro (por el mecanismo citado anteriormente).


MENINGOCOCOS :

Observar las placas con medios para meningococos

Observar la morfologa de las bacterias en las laminas fijadas

RESULTADOS

Realizar la lectura e identificacin de los microorganismos, observar y anotar los resultados.

Jos Huapaya Yaya, Martha Flrez Flores

DIFERENCIALES
SIN SEMBRAR

TSI

LIA

Citrato de
Simons

SIM

UREA

Klebsiella sp.
Diferenciales
Reacciones
observan

TSI

LIA

Citrato de
Simons

SIM

UREA

TSI

LIA

Citrato de
Simons

SIM

UREA

se

Lectura

Proteus sp.
Diferenciales
Reacciones
observan

se

Lectura

Jos Huapaya Yaya, Martha Flrez Flores

Diferenciales
Reacciones
observan

TSI

LIA

Citrato de
Simons

SIM

UREA

TSI

LIA

Citrato de
Simons

SIM

UREA

se

Lectura

Salmonella sp.

Diferenciales
Reacciones
observan

se

Lectura

Shigella sp

Jos Huapaya Yaya, Martha Flrez Flores

Escherichia coli

Diferenciales
Reacciones
observan

TSI
se

Lectura

Jos Huapaya Yaya, Martha Flrez Flores

LIA

Citrato de
Simons

SIM

UREA

Jos Huapaya Yaya, Martha Flrez Flores

PSEUDOMONA

Las especies pertenecientes al gnero Pseudomonas son ubicuos, se encuentran en la


tierra, materia orgnica en descomposicin, en la vegetacin, en el agua. Tambin podemos
encontrar estos microorganismos en el ambiente hospitalario, en lugares hmedos, como
comida, baos, respiradores. No forman parte de la flora normal del ser humano con
excepcin de los pacientes hospitalizados y en pacientes ambulatorios inmunodeprimidos.
Debido a las sencillas necesidades de crecimiento y a la versatilidad nutricional , se logra su
amplia distribucin ambiental, siendo capaces de utilizar un gran nmero de compuestos
orgnicos como fuentes de carbono y nitrgeno.
Son bacilos Gram negativos mviles rectos o ligeramente curvos, que son aerobios
estrictos, la mayora de las cepas son mviles por medio de uno o ms flagelos polares;
utilizan glucosa y otros hidratos de carbono de manera oxidativa; y suelen ser citocromo
oxidasa positivos
El gnero Pseudomonasse divide en cuatro grupos : Grupo fluorescente, Grupo
Stutzeri, Grupo Alcalgenes y Grupo con pigmento amarillo.
Grupo fluorescente : Pertenecen a este grupo las especies : Pseudomonaaeruginosa,
Pseudomonafluorescens y Pseudomonaputida , las cuales se caracterizan por la produccin
de un pigmento pioverdina hidrosoluble que da fluorescencia blanca a verde azulada bajo
luz ultravioleta de longitud de onda larga (400 nm). Slo una especie,
Pseudomonaaeruginosa , produce el pigmento hidrosoluble azul llamado piocianina.
Pseudomonaaeruginosa produce un aspecto caracterstico cuando crece en una placa de
agar sangre , se pueden observar grandes colonias grises y presenta beta hemlisis. Las
colonias tienen un aspecto de piel de caimn y con brillo metlico.
La exudacin de pus azulado, con olor similar a las uvas , por la produccin de piocianina es
caracterstico en las heridas infectadas por este microorganismo. La piocianina es un
antibitico que puede permitir que la Pseudomonaaeruginosa exista en la naturaleza,
tambin puede desempear un papel en la nutricin , al funcionar como una forma de
adquirir fosfatos inorgnicos.
Se
puede realizar una identificacin rpida de Pseudomonaaeruginosa si se observan las
siguientes caractersticas : morfologa tpica de las colonias, produccin de pigmentos
difusibles, olor a fruta y positividad en la prueba de oxidasa.
CARACTERSTICAS DEL GRUPO FLUORESCENTE:
PRUEBA
PIOVERDINA
PIOCIANINA

Pseudomonaaeruginos
a
+
+

Jos Huapaya Yaya, Martha Flrez Flores

Pseudomonafluorescen
s
+
-

Pseudomonaputid
a
+
-

PRACTICA N 8
IDENTIFICACIN Y AISLAMIENTO DE MICOBACTERIUM
Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS ANAEROBIAS:
1.- AISLAMIENTO DE BACTERIAS ANAEROBIAS:
OBJETIVOS

Conocer las condiciones y exigencias para el cultivo de bacterias anaerobias.


INTRODUCCIN

Los organismos que carecen de sistemas respiratorios no pueden utilizar el oxgeno como aceptor terminal
de electrones. Tales organismos se llaman anaerobios, pero existen dos clases de anaerobios: los
anaerobios aerotolerantes, que pueden tolerar el oxgeno y crecer en su presencia, an cuando no pueden
utilizarlo, y los anaerobios estrictos (u obligados) que mueren en presencia del oxgeno.

La razn por la que los anaerobios estrictos son destruidos por el oxgeno, es probablemente por que son
incapaces de eliminar algn producto txico derivado del metabolismo del oxgeno. Cuando se reduce el
oxgeno, se producen algunos elementos txicos tales como el perxido de hidrgeno (H2O2), superxido
(O2-) y radicales hidroxilo (OH-). Muchos anaerobios estrictos son ricos en enzimas flavnicas, que
reaccionan espontneamente con el oxgeno para dar estos productos txicos. Por el contrario, los aerobios
poseen enzimas que descomponen los productos txicos; tales enzimas no estn presentes en los
anaerobios.

Como ocurre con los aerobios, algunos de ellos pudieron tolerar la presencia de O 2 y de substancias
oxidantes, pero en la mayora de los casos, el O2 se comporta como un gas txico que provocaba la
oxidacin de ciertos radicales libres altamente agresivos imposibles de neutralizar. Fusobacterium,
Prevotella y Porphyromonas no sobreviven ms de 10 a 30 minutos de exposicin al aire. Actinomyces,
Propionibacterium, Bacteroides y algunos Clostridium, son relativamente aerotolerantes.

RECOLECCION Y TRANSPORTE DE MUESTRAS CLNICAS :

Las muestras clnicas deben ser obtenidas del sitio infectado usando procedimientos que garanticen el
mantenimiento de una atmsfera carente de oxgeno y eviten contaminacin con flora endgena. En general
el procedimiento recomendado es aspiracin con aguja del material purulento o por biopsia despus de
desinfeccin apropiada.

Estas muestras deben ser procesadas en el laboratorio lo ms rpido posible, manteniendo en todo
momento su estado libre de oxgeno. La obtencin de muestras son aceptables solo en casos de incluir un
medio de transporte apropiado para anaerobios y sean sembradas antes de 30 minutos de obtenida la
muestra. Las muestras para cultivos anaerbicos nunca deben ser refrigeradas.

La aspiracin directa con aguja es el mejor mtodo de obtener una muestra representativa para cultivo. Los
especimenes obtenidos de los lquidos normalmente estriles tales como sangre, lquido cefalorraqudeo o
peritoneal, se recogen despus de la descontaminacin cuidadosa de la piel.

Los dispositivos del transporte contienen generalmente ambiente libre de oxgeno proporcionados por una
mezcla del bixido de carbono, hidrgeno, nitrgeno, ms un indicador aerobio de la condicin. Los
especimenes se deben poner en un transportador anaerobio cuanto antes. Los especimenes se inoculan en
un frasco anaerobio del transporte o una jeringuilla con aguja. Despus de que se expelan todas las
burbujas de aire, el extremo de la aguja se debe insertar en un tapn de caucho estril, ya que el aire puede
difundirse gradualmente a travs de la pared plstica de la jeringuilla.

A pesar de que las bacterias aerobias y anaerobias son indistinguibles por la tincin, el frotis directo
proporciona informacin preliminar importante con respecto a tipos de organismos presentes, sugiere
terapia inicial apropiada y sirve como control de calidad. Estos anaerobios pueden mostrar un patrn
morfolgico tpico que puede ser reconocido por un microscopista experimentado. Se recomienda
especialmente el frotis directo por Gram de la muestra para ayudar a evaluar el cultivo posterior.

Jos Huapaya Yaya, Martha Flrez Flores

Examen directo de los materiales clnicos:


El anlisis macroscpico de las muestras es importante para establecer la presencia de anaerobios, datos
orientadores sern el hallazgo de un olor ftido, el aspecto purulento de muestras lquidas as como el
hallazgo de tejido necrtico y gas. En los portaobjetos preparados para la tincin de Gram, es ms til la
fijacin con metanol que el calor; se deben observar caractersticas celulares y el fondo del frotis y en la
tincin de Gram , observar la forma, tamao, disposicin de las bacterias y registrar el nmero de
microorganismos presentes . Observar caractersticas morfolgicas distintivas como : presencia de esporas,
ramificaciones, filamentos con corpsculos esfricos, formas granulares. La tincin de Gram permite
determinar caractersticas celulares, las tinciones de Wright y Giemsa a veces pueden revelar informacin
adicional. Las tinciones de naranja de acridina son las ms tiles para detectar bacterias en hemocultivos,
lquido cefalorraqudeo, lquido pleural, lquido articular y exudados.

Procesamiento de las muestras


Las muestras para cultivos anaerobios pueden procesarse en la mesa de trabajo comn con incubacin en
jarras o bolsas para anaerobiosis o en una cmara anaerobia.
Jarras para anaerobiosis : el sistema que ms se utiliza para crear una atmsfera anaerobia es la jarra
para anaerobiosis; para lo cual se utiliza una jarra plstica transparente ( disponible en el comercio) con una
tapa que se cierra para hacerla hermtica. Las condiciones de anaerobiosis pueden obtenerse mediante el
uso de un sobre que se adquiere en el comercio, generador de hidrgeno y CO2, que se activa con el
agregado de agua o con la humedad proveniente de las placas de agar. La anaerobiosis se alcanza luego
de 1 a 2 horas.
Bolsas plsticas anaerobias : Es una bolsa de plstico transparente , de varios tamaos, con capacidad
para una a tres placas de Petri de 100 mm de dimetro, un generador de gas H2-CO2 que produce una
atmsfera cuando se le agrega agua, partculas de catalizador de paladio fro y resazurina como indicador.
La bolsa se sella con calor luego de la activacin del generador para permitir el mantenimiento de las
condiciones anaerobias.

Incubacin de los cultivos


En la mayora de los casos, la temperatura adecuada es de 35 a 37C, para el aislamiento primario de
bacterias anaerobias a partir de muestras clnicas. Las placas inoculadas en las mesas de trabajo y
colocadas en las jarras de anaerobiosis deben incubarse al menos 48 horas y reincubarse por otros 2 a 4
das para permitir que los microorganismos de crecimiento lento formen colonias; algunos anaerobios como
ciertas especies de Actinomyces y Eubacterium, crecen ms lentamente y las colonias no pueden detectarse
si las jarras se abren antes. Si las jarras se abren pronto, algunos de los microorganismos de crecimiento
lento pueden morir debido a la exposicin de oxgeno. Debe evitarse la exposicin prolongada de las placas
recin inoculadas al aire ambiental, ciertos anaerobios encontrados en muestras clnicas como
Peptostreptococcus anaerobius , pueden no crecer o mostrar un retraso prolongado en el desarrollo cuando
las placas recin inoculadas se mantienen en el aire ambiental.

Jos Huapaya Yaya, Martha Flrez Flores

MATERIALES
Laminas con frotis de bacterias anaerobias
Caldo tioglicolato con bacterias anaerbias

METODOLOGIA

Observacion macro y microscopica de las muestras anaerpbicas

Jos Huapaya Yaya, Martha Flrez Flores

2. IDENTIFICACIN Y AISLAMIENTO DE MICOBACTERIUM


OBJETIVOS

Conocer los riesgos y precauciones durante el procesamiento de muestra con micobacterias.

Conocer el procesamiento de las muestras para el estudio de micobacterias


INTRODUCCIN

La tuberculosis es una enfermedad infecto-contagiosa producida por Mycobacterium tuberculosis y


Mycobacterium bovis, que estn estrechamente relacionados por sus caractersticas bacteriolgicas y
similitud en su ADN, siendo la especie ms frecuentemente aislada M.tuberculosis. Las fuentes de infeccin
son a partir de los esputos secos del suelo y la leche contaminada y el mecanismo de transmisin se da a
travs de las vas respiratorias.

Las muestras necesarias para el aislamiento de M.tuberculosis son muy variadas, dependiendo de la
localizacin de la lesin: esputos, aspirados bronquiales, orinas, LCR, biopsias, contenido gstrico, heces
etc. Si no se puede procesar el mismo da ser necesario guardarlas a 4 C de temperatura (refrigeradora)
para impedir la proliferacin de la flora secundaria. Para manipular las muestras y sobretodo los pasajes a
otros medios de cultivos, es importante hacerlos en la cabina de seguridad.

Las micobacterias son microorganismos de forma bacilar que se caracterizan por contener un elevado
porcentaje de lpidos, por lo que para su coloracin se emplea la tincin de Ziehl-Neelsen (coloracin cido
resistente). En los medios de cultivos desarrollan con lentitud y exigen que los medios sean altamente
nutritivos.

El que no se pueda observar bacilos en una extensin no quiere decir necesariamente que no los haya,
pues se considera que debe haber unos 10 000 bacilos por mL de muestra para que la microscopa no
resulte positiva con una probabilidad del 50 por 100 bacilos por mL, aproximadamente. Es frecuente obtener
cultivos positivos a partir de muestras cuya baciloscopa fue negativa.

En los medios de cultivo desarrollan con lentitud y exigen que los medios sean altamente nutritivos. Dentro
de los medios de cultivo ms conocidos tenemos el de Lowenstein-Jensen. La temperatura ptima de
crecimiento es de 37 C. Se revisaran diariamente hasta un total de 60 das, pasados los cuales si no hay
crecimiento se consideran negativos.

LECTURA

Los bacilos aparecern como bastoncillos delgados, ligeramente curvos, teidos de rojo, aislados, en
parejas o en grupos sobre un fondo azul claro.

Es aconsejable seguir una pauta uniforme de observacin, leyendo de izquierda a derecha del extendido un
mnimo de 100 campos tiles, equivalentes a 5 minutos. Los campos en que no aparezcan dichos elementos
no deben contabilizarse en la lectura. Se recomienda la siguiente escala semicuantitativa:
RESULTADO

(+)

INTERPRETACIN
No se encuentran BAAR en 100 campos microscpicos
observado
Menos de un BAAR por campo en 100 campos
observados (de 10-99 BAAR)

(++)

Uno a 10 BAAR por campo, en 50 campos observados

(-)

(+++)
BAAR: Bacilo cido alcohol resistente

Mas de 10 BAAR por campo en 20 campos observados

Si en un frotis se encuentran de 1 a 9 bacilos en 100 campos observados, observar 100 campos ms. Si
persistiese el resultado, realizar otro extendido de la misma muestra e informar lo encontrado y solicitar
nueva muestra.

Jos Huapaya Yaya, Martha Flrez Flores

TINCIN DE ZIEHL-NEELSEN
Fundamento

Las bacterias cido - alcohol resistentes son aquellas que una vez teidas
no son decoloradas por el alcohol - cido. Esta propiedad est relacionada
con la existencia en la pared celular, de sustancias lipoides como la cera
D, que ante la accin disolvente del fenol contenido en la fucsina cida en
presencia de calor, permite la penetracin del colorante primario.

El enfriamiento de los compuestos mencionados impide que el colorante


sea eliminado por la accin del decolorante.
Material

Muestras de esputo inactivadas (autoclavadas) de pacientes Bk positivos.

Frotis fijos de Mycobacterium tuberculosis a partir de esputos

Tubos con medios de cultivo Lowenstein-Jensen mostrando colonias de


micobacterias

Equipos de coloracin para tincin de Ziehl-Neelsen

Mecheros

Portaobjetos 26 x 76 mm

Microscopios
METODOLOGA
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Realizar un extendido del esputo en una lamina portaobjeto limpia y sin ralladuras.
Dejar secar a temperatura ambiente antes de la tincin.
Cubrir con solucin de fucsina de Ziehl y calentar hasta la emisin de vapores durante 3 minutos, cuidando
que el colorante no hierva ni se seque.
Dejar enfriar, decolorar con la mezcla de alcohol- cido, hasta que no escurra colorante; lavar con agua
corriente.
Cubrir con azul de metileno durante 3 minutos; lavar con agua corriente y dejar secar.
Agregar una gota de aceite de inmersin y observar al microscopio con el lente de mayor aumento

Las bacterias cido - alcohol resistentes se tien de color rojo. Todos los elementos no cido - alcohol
resistentes se observan de color azul.

1. Cubrir con fucsina


bsica fenicada

Jos Huapaya Yaya, Martha Flrez Flores

2. Calentar suavemente con


ayuda del hisopo (5 minutos)

4. Cubrir con solucin


decolorante (3 minutos)

3. Enjuagar con
abundante agua

5. Enjuagar con
abundante agua

6. Cubrir con Azul de


metileno (1 minuto)

7. Enjuagar con
abundante agua

Jos Huapaya Yaya, Martha Flrez Flores

PRACTICA N 9
CULTIVO DE MUESTRAS CLNICAS
OBJETIVOS
Conocer el procedimiento para el cultivo de una muestra clnica.

Identificar los microorganismos mas frecuentes causantes de patologas clnicas

Conocer las condiciones para una adecuada toma de muestra de para el cultivo de muestras clnicas
CULTIVO DE ORINA (UROCULTIVO)

La infeccin del tracto urinario (ITU), se define como la presencia y multiplicacin de microorganismos en el
tracto urinario con invasin de tejidos adyacentes. La presencia de leucocitos en orina, indica respuesta
inflamatoria del Tracto urinario, la mayora de las veces debido a invasin tisular por bacterias. Por lo
general la piuria esta presente en las ITU, lo que se considera un criterio diagnstico de ITU.

La mayora de la ITU, son causadas por bacilos Gram negativos de las enterobacterias, siendo Escherichia
coli y Klebsiella sp., los ms frecuentemente aislados, en infecciones no complicadas. Tambin puede ser
causa de ITU otros bacilos Gram negativos como Proteus sp., Enterobacter sp. y Pseudomonas aeruginosa
sobre todo en pacientes sometidos a instrumentacin, portadores de catteres urinarios, con anomalas
anatmicas o funcionales del tracto urinario y en pacientes hospitalizados.

Entre las bacterias Gram positivos pueden estar Staphylococcus epidermidis y Enterococcus sp. En la
mayora de las ITU, se recupera un nico microorganismo en la orina. La presencia de ms de una especie
bacteriana puede deberse a contaminacin de la muestra o en pacientes con infecciones complicadas como
por ejemplo litiasis, abscesos renales o sondaje prolongado.

El diagnstico definitivo de las ITU se hace mediante el cultivo de la orina (urocultivo). Hay que tener en
cuenta que por cuidadosa que sea la tcnica de toma de la muestra (salvo puncin suprapbica), es difcil
excluir la contaminacin de la orina con bacterias del tramo distal de la uretra lo que puede ser causa de
interpretaciones erradas.

La orina de miccin media es la ms recomendada para el urocultivo. En mujeres es necesario el lavado de


los genitales externos. En el hombre tambin retraer la piel del prepucio. La primera parte de la miccin,
casi siempre est contaminada con flora bacteriana uretral, esa es la razn por la que debe descartarse. La
miccin media se debe recoger en un envase estril. Es recomendable obtener la primera orina de la
maana, donde se encuentra mayor nmero de bacterias.

El cultivo de orina se realizar para identificar y cuantificar el nmero de bacterias presentes por mL de
orina, lo que se expresa en unidades formadoras de colonias por mL (UFC). La muestra de orina debe
enviarse al laboratorio en el plazo ms corto posible, puesto que la orina es un buen medio de cultivo para
muchas bacterias y la multiplicacin de los grmenes entre el momento de la toma de muestra y el cultivo
alterar los resultados.

Es recomendable que en todas las muestras de orina para urocultivo, se haga un examen microscpico
cuantitativo para determinar el nmero de leucocitos por milmetro cbico.

MATERIALES

Frasco estril x 100 mL

Asas de platino (calibrada 0,01 mL)

Pipetas graduadas x 1 mL estriles

Placas con Agar McConkey, EMB.

Laminas, laminillas.

Equipos de coloracin para tincin de Gram

Centrifuga y microscopio
METODOLOGA

Evitar que se contamine la muestra utilizando equipos estriles (frascos, pipetas, placas Petri, tubos de
prueba estriles).
1. Examen Directo:
Centrifugar aproximadamente 10 mL de orina por 3 min a 3000 r.p.m y luego decantar el sobrenadante y
sedimento observar al microscopio a lente de 40x.
Jos Huapaya Yaya, Martha Flrez Flores

2. Cultivo

Con el asa de platino calibrada (0,01 mL), previa agitacin de la muestra, tomar una asada de orina y
sembrar por estra en agar McConkey, previamente dividida en cuatro cuadrantes, empezando las estras
por el primero y sin esterilizar el asa continuar la siembra en el II, III y IV cuadrantes.

Rotular la placa con nombre y grupo e incubar 24 horas a 37 C


RESULTADOS

Hacer la lectura de las placas y a partir de una colonia bien aislada realizar las pruebas bioqumicas para la
diferenciacin bioqumica.
Realizar el contaje de colonias para realizar el recuento total de UFC/ml.
UROCULTIVO

Orina:

Sedimento urinario:

AGAR SANGRE

Mac Conckey: Cultivo a las 24 hrs


Rec.Colonias:

Pruebas Bioqumicas

TSI

Lectura de las pruebas


bioqumicas

Jos Huapaya Yaya, Martha Flrez Flores

CIT

LIA SIM

UREA

ANTIBIOGRAM

CULTIVO DE HECES (COPROCULTIVO)

La diarrea puede definirse como el proceso que va acompaado de eliminacin frecuente de heces,
disminucin de su consistencia o ambas cosas. El diagnstico etiolgico de este padecimiento, se realiza
mediante el cultivo de los microorganismos presentes en la materia fecal. A este procedimiento se le
denomina coprocultivo y con l se logran, primero el aislamiento y posteriormente la identificacin de las
bacterias presentes en heces.

Las bacterias causantes de diarreas frecuentemente son: Salmonella, Shigella y Escherichia coli
enteropatgenas. En la actualidad se han descrito otras bacterias tambin asociadas con cuadros
diarreicos, como: Campylobacter sp., Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae, Staphylococcus aureus y
Clostridium difficile.

Para realizar con xito este mtodo se requiere que la muestra se colecte en el curso de la enfermedad.,
antes de instituir el tratamiento, y que se deposite en una frasco limpio y estril, procurando no mezclarla
con la orina. Las muestras de heces se procesarn para cultivo dentro de las 4-6 horas siguientes a su
emisin. Si esto no es posible, es conveniente su conservacin en un medio de transporte adecuado
mantenindose en refrigerador hasta su siembra

MUESTRAS INACEPTABLES.

Muestras no conservadas de ms de 4-6 horas.

Muestras mltiples en el mismo da.

Muestra contaminadas con orina.


METODOLOGIA
1. Examen directo.
El examen microscpico directo de las heces permite la observacin de polimorfonucleares, que sugiere
infeccin por un patgeno invasivo.
1.1. Examen en fresco y/o tincin con Azul de metileno de Loeffler.
1.2. Tincin de Gram: permite observar polimorfonucleares y flora predominante.
2. Inoculacin.
El coprocultivo se realiza a partir de las heces recin emitidas de preferencia.
Sembrar en los medios para diferenciar los bacilos entricos fermentadores de la lactosa (L+) de los no
fermentadores (L-), al tiempo que se inhibe el crecimiento de flora Gram positiva aerobia.
-- Agar MacConkey, Eosina Azul de Metileno.
Usar Agar XLD (Xilosa-Lisina-Desoxicolato), SS. (Salmonella Shigella) para inhibir el crecimiento de la
mayora de las Enterobacteriaceae mientras se permite el crecimiento de Salmonella spp y Shigella spp.
Utilizar el medio Selenito F (medio lquido) para suprimir el crecimiento de la flora normal durante las horas
iniciales de incubacin. Se resiembran en medio slido a partir de las 6 horas. Este medio sirve
asintomticos.
En el caso que se sospeche de Vibrio spp: Agua de Peptona alcalina (medio enriquecido) a partir de 6 horas,
subcultivar en TCBS (Tiosulfalfato Citrato Bilis Sacarosa) o de Campylobacter spp Medio Camp.

RESULTADOS

Realizar la lectura de los medios de cultivo y las colonias sospechosas realizar las pruebas bioqumicas
para diferenciar las especies de enterobacterias
COPROCULTIVO

Jos Huapaya Yaya, Martha Flrez Flores

Agar Salmonella Shigella (SS)

Sin Sembrar

Cultivo a las 24 hrs

Pruebas Bioqumicas

TSI

CIT

LIA

SIM

Lectura de las pruebas bioqumicas

CULTIVO DE SANGRE (HEMOCULTIVO y MIELOCULTIVO)

La deteccin de microorganismos viables en muestras de sangre tiene una gran importancia diagnstica.
Cuando bacterias u hongos se multiplican a una razn que supera la capacidad del sistema
reticuloendotelial de remover stas del torrente sanguneo, se produce bacteremia o fungemia. Bacteremia
persistente o crnica ocurre cuando no se ha podido localizar el foco, o cuando no se ha podido drenar o
tratar adecuadamente el foco de la infeccin.

La entrada directa de bacterias al torrente sanguneo ocurre en infecciones intravasculares como:


endocarditis, fstulas arteriovenosas, aneurismas micticas, flebitis supurativas, catteres intravenosos
infectados, y catteres arteriales permanentes. Es importante comprender las circunstancias en que puede
ocurrir una bacteremia para planificar los mtodos de diagnostico y la interpretacin de los resultados. Las
fuentes de bacteremia son: sistema genitourinario 25%; tracto respiratorio 20%; abscesos 10%; heridas
quirrgicas 5%; otros sitios conocidos 10%; y sitios desconocidos 25%

Siempre que exista una razn para sospechar una bacteriemia se debe practicar el cultivo de la sangre
(perifrica o medular). Ya que en muchas ocasiones solo se puede establecer el diagnstico por este
procedimiento. El aislamiento de un microorganismo en los hemocultivos es transcendente porque
establece el diagnstico etiolgico de la bacteriemia y permite elegir el tratamiento ms eficaz.

Sepsis agudas, osteomielitis, meningitis, neumona, pielonefritis: el hemocultivo en estos casos debe
considerarse un procedimiento de urgencia. Bacteriemias continuas de origen intravascular como
endocarditis, infecciones asociadas a catteres, de origen desconocido, con sospecha de fungemia e
inmunodeprimidos: se puede tomar en cualquier momento.

Bacteriemias intermitentes: lo ideal es realizarla cuando el paciente tiene escalofros o poco despus, o
durante el pico febril. Entre el 14 al 25 % de los enfermos hospitalizados tienen sospecha de bacteriemia y
en un 14% de los casos el hemocultivo establece el diagnstico lo que repercute en la curacin de los
pacientes considerablemente.

INDICACIONES:
Fiebre alta, aunque en neonatos y ancianos la bacteriemia puede cursar con hipotermia y deterioro
general, shock no explicado, infecciones localizadas, leucopenia, leucocitosis o trombopenias no
relacionadas con procesos hematolgicos.
Siempre se deben realizar un mnimo de 2 hemocultivos
Jos Huapaya Yaya, Martha Flrez Flores

NUNCA DEBE REFRIGERARSE ANTES DE SU ENVO, PODR CONSERVARSE EN ESTUFA

CULTIVO DE SECRECIONES
EXUDADOS VAGINALES (EXOCERVICALES)

La mucosa vaginal tiene una flora microbiana normal, cuyo conocimiento y consideracin debe tenerse en
cuenta a la hora del estudio microbiolgico de infecciones vaginales. Se pueden considerar tres situaciones:
Saber cuando se altera el equilibrio de esta flora colonizante.
Bsqueda de agentes exgenos, transmitidos normalmente por va sexual.
Deteccin de portadoras de determinados microorganismos.
La mayora de las situaciones clnicas que pueden ser objeto de estudios microbiolgicos para el
aislamiento visualizacin del agente etiolgico son:
1. Vulvovaginitis: cuyos agentes etiolgicos ms frecuentes son Candida spp (principalmente C.albicans),
Trichomonas vaginalis y Virus herpes simple. Asimismo la presencia de un cultivo puro de otros
microorganismos observados en una tincin de Gram con leucocitos puede tener significacin.
2. Vaginosis: estado caracterizado, desde el punto de vista microbiolgico, por la ausencia o franca
disminucin de Lactobacillus spp y abundante flora mixta compuesta por Gardnerella vaginalis, anaerobios
(Mobiluncus, Bacteroides, Cocos anaerobios...) y Mycoplasma hominis.
3. Infeccin gonoccica: La endocervicitis gonoccica aunque cursa con leucorrea, el exudado vaginal no
es la muestra adecuada para su diagnstico siendo recomendable la obtencin de un exudado
endocervical.

TIPOS DE ESTUDIOS MICROBIOLGICOS

Cultivo bacteriano.
Cultivo de levaduras.
Despistaje de Streptococcus agalactiae.
Cultivo de virus Herpes simple (puesto que requiere toma de muestra y medio de transporte y cultivos
especiales solo se har por peticin expresa del clnico y su protocolo de cultivo e identificacin se recoger
en otro captulo).

TOMA DE MUESTRAS

No debe usarse antisptico previo a la toma de la muestra. Si se utiliza espculo, lubricar con agua caliente.
Es recomendable tomar dos hisopados. Se introduce un hisopo estril en la vagina y se recoge la muestra
de la zona de mayor exudado, y en su defecto, del fondo del saco vaginal posterior. Se introduce el hisopo
en medio de transporte.
El envo de la muestra al laboratorio debe ser inmediato siempre que sea posible. Cuando no pueda
procesarse en el momento se mantendr en frigorfico o a temperatura ambiente. Nunca refrigerar si existe
sospecha de infeccin gonoccica. Tiempo mximo de procesamiento con medio de transporte: 24h.

PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA

1.
2.
-

Uno de los hisopos se emplear para el examen microscpico y el otro para el cultivo.
Examen microscpico: es el nico mtodo aceptado para el diagnstico microbiolgico de la vaginosis
bacteriana. Se har una extensin del hisopo en portaobjetos y tincin de Gram.
Cultivo: Pueden establecerse distintas combinaciones de medios en funcin de la orientacin diagnstica:
Agar sangre en atmsfera de CO2., agar Chocolate en atmsfera de CO2., Mc Conkey, Thayer Martin en
atmsfera de CO2.. medio para Gardnerella en atmsfera de CO 2., Sabouraud con antibitico u otro medio
para Candida, caldo para cultivo de Trichomona vaginalis.

EXAMEN DE LA MUESTRA
1.

Examen microscpico: En el exudado vaginal normal se observar flora regional con predominio de
morfotipo Lactobacillus sp y clulas epiteliales.
- La presencia de leucocitos.
- La presencia de levaduras o pseudohifas.
- La presencia nica o abundante de cualquier otro microorganismo.
- El exudado caracterstico de la VAGINOSIS BACTERIANA:
a) Presencia de Clulas clue (clulas epiteliales recubiertas de bacilos o cocobacilos Gram variables.)
b) Ausencia o escasos Leucocitos.
c) Flora mixta alterada (Ver Criterios de Nugent en tabla 1).

Tabla 1: Interpretacin de VAGINOSIS BACTERIANA mediante tincin de Gram


Jos Huapaya Yaya, Martha Flrez Flores

Lactobacillus
4 (+)

Puntuacin
0

CBGV(1)
4 (+)

Puntuacin
4

BGNC(2)
3-4 (+)

Puntuacin
2

3 (+)
2 (+)
1 (+)

1
2
3

3 (+)
2 (+)
1 (+)

3
2
1

1-2 (+)
0

1
0

INTERPRETACIN
Cuantificacin:
4 (+) = > 30 org/campo(3)
3 (+) = 6-30 org/campo
2 (+) = 1-5 org/campo
1 (+) = < 1 org/campo
0 = ningn org/campo
Interpretacin Puntuacin
De 0 a 3: No vaginosis bacteriana
De 4 a 6: flora vaginal alterada
De 7 a 10: VAGINOSIS
BACTERIANA

(1): Cocobacilos Gram-variables (morfotipo Gardnerella/Bacteroides).


(2): Bacilos Gram negativos curvados (morfotipo Mobiluncus).
(3): Campo de mximo aumento (inmersin).
2.

Examen en medios de cultivo: Examinar todos los medios a las 18-24 horas. .
Agar sangre (S.pyogenes), Agar Chocolate (Neisseria y Haemphillus), Thayer Martin (Neisseria) Medio
Gardnerella (Gardnerella vaginalis), Sabouraud (levaduras)

SECRECION URETRAL

La uretritis es el sndrome ms comn dentro de las Enfermedades de Transmisin Sexual (ETS) aunque
muestra un claro descenso en las ltimas dcadas en relacin con otras ETS., tanto en Espaa (ver tabla 1)
como en otros pases desarrollados. Atendiendo a su etiologa se clasifican en uretritis gonoccica y no
gonoccicas (UNG), siendo estas ltimas las ms frecuentes en pases desarrollados.

N. gonorrhoeae es responsable en nuestro medio de menos del 25% de todos los episodios de uretritis. Los
restantes estn causados por C. trachomatis, por Ureaplasma urealyticum y por un nmero variable de
otros potenciales patgenos en los que la asociacin causa-efecto con la uretritis est menos aclarada . La
asociacin de ms de un patgeno como causa de la uretritis es ms que anecdtica y la ms frecuente de
ellas es la asociacin de C. trachomatis y N. gonorrhoeae. Un dato significativo es la presencia de T.
vaginalis como nico agente encontrado hasta en un 4% de las uretritis no gonoccicas. Cuadros de
uretritis pueden estar causados por la presencia de condilomas intrauretrales.

La gonorrea usualmente se desarrolla a los 2 6 das tras la exposicin, en tanto que la UNG es variable,
desde 1 a 5 semanas. Tanto las uretritis gonoccicas como no gonoccicas producen supuracin uretral,
disuria y picor

El diagnstico de uretritis se establece si al menos se dan dos de los siguientes supuestos:


1. Sntomas: historia de secrecin uretral y/o disuria.
2. Examen clnico: presencia de secrecin uretral purulenta, mucopurulenta o blanquecina
3. Demostracin (tincin de Gram) de > de 5 leucocitos polimorfonucleares por campo de 1000 aumentos
en el examen directo de la secrecin uretral.

Los pacientes con sntomas de uretritis, sin secrecin uretral visible, deben ser examinados, pidindoles
que no orinen en las 4-8 horas previas a la toma de muestras. Se obtienen los 5-10 primeros ml de orina y
tras centrifugacin a 400 rpm se examinan al microscopio de 400 aumentos. La presencia de > de 15
leucocitos polimorfonucleares por campo confirma el diagnstico de uretritis.

Los sntomas de la uretritis gonoccica pueden permanecer hasta ms de 7 das, por ello la uretritis
postgonoccica se suele diagnosticar despus de transcurrido este periodo. En el examen con tincin de
Gram la presencia de diplococos Gram negativos (DGN) intracelulares, establece el diagnstico de uretritis
gonoccica. La presencia de clulas inflamatorias en el exudado uretral en ausencia de diplococos
gramnegativos y cultivo negativo para N. gonorrhoeae establece el diagnstico de UNG.

El xito del diagnstico microbiolgico de la uretritis gonoccica depende en gran medida de la correcta
obtencin, transporte y procesamiento de muestras. En cada muestra deben emplearse dos torundas, una
para el cultivo y otra para la extensin del exudado uretral para realizar la tincin de Gram. Las muestras
para cultivo debern inocularse en medios selectivos, (Thayer- Martin modificado, Martin-Lewis ) e
incubarse de modo inmediato a 35 -37 C durante 72 horas en una atmsfera de 3-10% de CO 2 y humedad.
Cuando esto no sea posible, es necesario inocular las muestras en medio de transporte (Stuart o Amies).

Jos Huapaya Yaya, Martha Flrez Flores


1.

2.

Examen microscpico: En la secrecin uretral se debe observar presencia de clulas y bacteria


especialmente diplococos gram negativos intra y extracelulares.
Evaluar: La presencia de leucocitos Polimorfonucleares.
Examen en medios de cultivo: Examinar todos los medios a las 18-24 horas. Si no hay crecimiento de
patgenos, incubar hasta las 48 h, . El Thayer Martn se incubarn, si es negativo, hasta 72 horas.
Agar sangre: (Streptococcus pyogenes o S.pneumoniae), Agar Chocolate (Haemophilus sp). Thayer Martin
(gonococo).
Pruebas bioqumicas: A todas las colonias sospechosas realizar pruebas bioqumicas Ejm. Prueba de
oxidasa y fermentacin de carbohidratos para el caso de Neisseria

METODOLOGIA

Observar las lminas previamente fijadas y coloreada

Jos Huapaya Yaya, Martha Flrez Flores

GLOSARIO

Colonia, crecimiento visible de microorganismos,


en general en un medio slido y derivado de la
multiplicacin de un solo tipo de organismo.

Aerobio, microorganismo que requiere del oxigeno


para su desarrollo.

Cromognico, que produce pigmento.

Aerognico, que produce gas (CO2 y H2).

Cultivo, crecimiento de microorganismos.

Agar, polisacrido extracto de un alga roja que se


utiliza como agente solidificante en medios de
cultivo biolgicos.

Cultivo mixto, crecimiento de dos


microorganismos en el mismo medio.

Aguja de inoculacin, pieza de platino fijado a un


mango de metal que se utiliza para efectuar la
estriacin de un medio bacteriano o para recoger
colonias para su transferencia.
Aislamiento, mtodo para obtener bacterias en
cultivo puro, por medio de subcultivos de colonias
discretas, utilizando diferentes tipos de medio.
Anaerobio, microorganismo que slo puede
desarrollar en ausencia total o parcial de oxigeno.
Anerognico, que no produce gas (CO2 y H2)
Antibitico, sustancia qumica producida por un
microorganismo y que tienen la capacidad de
inhibir el desarrollo de otros organismos vivos
sensibles.
Antimicrobiano, agente biolgico o qumico que
inhibe el crecimiento de microorganismos.
Antisuero, suero que contiene anticuerpos para
antgenos especficos

ms

Cultivo puro, cultivo que contiene un crecimiento


bacteriano especfico de una sola especie de
microorganismo
Disentera, inflamacin del intestino, caracterizada
por dolor abdominal, tenesmo, y diarrea don sangre
y moco en las heces.
Entricas, relacionado al tracto intestinal.
Enterotoxina, toxina que produce cambios
patolgicos en el tubo digestivo, ejemplo toxina de
clera
Esterilizacin, proceso qumico o fsico o qumico,
utilizado para eliminar todos los microorganismos.
Extendido, preparado sobre un portaobjeto de una
capa muy delgada de material para su examen con
el microscopio.
Haloflico, microorganismo que puede tolerar una
alta concentracin de sales, por lo general hasta un
10%.

Bactericida, sustancia o agente qumico que


resulta letal para las bacterias, es irreversible.

Hemlisis, presencia de una zona de eritrocitos


hemolisados alrededor de una colonia cultivada en
una placa de agar sangre.

Bacteriemia, presencia de bacterias en el torrente


sanguneo, acompaa a estados spticos y
tambin no infecciosos.

Incubacin, mantenimiento de cultivos bacterianos


en condiciones favorables para su crecimiento,
especialmente temperatura.

Bacteriosttico, sustancia o agente qumico que


inhibe el crecimiento bacteriano, es reversible.

Indicador, sustancia que hace visible el final de


una reaccin. Compuesto que cambia de color con
las variaciones del pH de una solucin o medio.

Bacteriuria, presencia de bacterias en la orina;


puede presentarse en estados clnicos y
subclnicos.

Infeccin, presencia de microbios vivos en tejidos.

Caldo, medio de cultivo lquido para bacterias


heterotrficas, compuesto por elementos nutritivos
esenciales.
Cepa bacteriana, cultivo puro de bacterias
formada por los descendientes de un solo
aislamiento.
Coliforme, bacilos gramnegativos aerbicos y
anaerbicos facultativos, que no forman esporas y
fermentan la lactosa con formacin de gas.6

Jos Huapaya Yaya, Martha Flrez Flores

Infecciones asintomticas, infecciones sin


sntomas clnicos; si los microorganismos se van
eliminando, tales infecciones tambin representan
un estado de portador.
Inhibicin, disminucin o suspensin de la funcin
como
prevencin
del
crecimiento
o
la
multiplicacin. El crecimiento es inhibido por el
agregado de sustancias qumicas como los
colorantes y los antibiticos a un medio de cultivo.
Inoculacin, introduccin de un microorganismo o
inoculo, en un organismo animal o en un medio de
cultivo.

Inoculo, material que contienen el microorganismo


que va a ser introducido o transferido a un medio
de cultivo.
Latente, aparentemente inactivo.
Medio de cultivo, mezcla de sustancias nutritivas
en una forma slida, semislida o lquida, que llena
los requerimientos para el crecimiento y
reproduccin de los microorganismos.
Nutriente, material o sustancia que puede ser
utilizado como fuente de alimento.
Periodo de incubacin, es el tiempo entre el
momento de la inoculacin y el crecimiento visible
de bacterias en medios artificiales.
Puncin, cultivo en el cual los microorganismos
son inoculados con una asa de inoculacin en la
parte superior del medio para permitir el posible
crecimiento anaerbico.
Quimioterpico, compuesto qumico sinttico que
acta en forma bactericida o bacteriosttica sobre
los microorganismos, inhibiendo funciones vitales.
Resistente, que soporta la accin o efecto a algo.
Sensible, susceptible a la accin o efecto a algo.
Septicemia, presencia de microbios en la sangre,
relacionada con una infeccin o sepsis.
Subcultivo, transplante
derivadas de otro cultivo.

de

bacterias

viables

Tiempo de generacin, es el tiempo que demora


una bacteria en dividirse o lo que es lo mismo, una
poblacin bacteriana en multiplicarse. Depende de
la especie bacteriana y las condiciones
nutricionales y ambientales.
Vector, agente animado o inanimado que lleva a un
microorganismo patgeno de un husped enfermo
a uno sano, causndole infeccin.
Virulencia, poder patgeno relativo de diferentes
cepas de microorganismos dentro de una especie.
Zoonosis, enfermedades de animales transmitidas
al hombre.

Jos Huapaya Yaya, Martha Flrez Flores

PRACTICA N 10
DIAGNSTICO MICOLGICO
OBJETIVOS

Conocer las tcnicas para la toma de muestra en el diagnstico micolgico.

Identificar los productos patolgicos de donde se pueden aislar los agentes etiolgicos de las micosis
humanas.

Conocer las caractersticas de los exmenes directos, como de los cultivos de hongos.

INTRODUCCIN

La mayora de los hongos tienen un hbitat saproftico presentan una variedad de morfologa, desde las
levaduras hasta los hongos filamentosos. Los hay comestibles, de inters para la industria alimentaria,
qumica o farmacutica y los venenosos. Del gran nmero de especies estudiadas hasta la fecha (ms de
250,000) muy pocas son capaces de colonizar al ser humano inmunocompetente, produciendo en stos
casos las enfermedades denominadas micosis.

Los hongos que producen micosis en el ser humano se encuentran en dos estados morfolgicos bsicos:
levaduras y mohos.

Levadura
Puede definirse como un hongo unicelular, redondo u ovalado que se reproduce por gemacin o fisin
binaria. Una levadura tambin puede ser el estadio morfolgico en el ciclo biolgico de una especie
filamentosa se denomina a esto dimorfismo.
Mohos
Son hongos multicelulares cuya estructura filamentosa se forma por el crecimiento continuo a partir de una
espora. El elemento tubular que emerge se denomina hifa, el que sigue creciendo y ramificndose llegando
a formar un conjunto entrelazado al que se denomina micelio o talo. Parte de las hifas se introduce en el
sustrato y forman el micelio vegetativo y las que se proyectan hacia el exterior constituye el micelio areo
muchas levaduras, en determinadas circunstancias y dependiendo de la especie, pueden producir
pseudohifas.

El micelio areo muestra macroscpicamente diferentes caractersticas, lo cual contribuye a la identificacin


primaria; pueden ser algodonoso, velloso, arrugado, polvoriento, cerebriforme, pigmentado o no, etc. En el
se producen los elementos de propagacin, las esporas y los conidios. Los micelios tienen la capacidad de
germinar en nuevo sustrato y as producir un nuevo elemento. Este conjunto de caractersticas observadas
sobre el medio de cultivo se denomina colonia.

Los hongos como clulas eucariticas poseen ncleo, nucleolo, retculo endoplasmtico, ribosomas,
mitocondrias, vacuolas, cuerpos lipdicos y otras inclusiones. Rodeando el citoplasma existe una membrana
y una pared celular con caracterstica muy definidas. Se multiplican a travs de estructuras que puede ser
asexuales o sexuales previa fusin del protoplasma y ncleo de clulas distintas. Tambin lo hacen
mediante crecimiento vegetativo expansivo como ocurre de rutina en el laboratorio con levaduras o
fragmentos de micelio.

Como en otras enfermedades infecciosas, las micosis se diagnostican en el laboratorio siguiendo el


esquema clsico: examen directo, cultivos e inmunodiagnstico.

EXAMEN DIRECTO

El examen microscpico de la muestra patolgica; escamas de piel, pelos, fragmentos de uas, exudado
purulento, LCR o biopsias, permite observar las caractersticas hifas, esporas, levaduras, etc.

Se hace una preparacin en lmina portaobjetos con una gota de KOH al 10%. Para la cpsula de
Cryptococcus neoformans (LCR), se adiciona una gota de tinta china para visualizar la cpsula. En los
exudados purulentos se recomienda realizar una tincin con Gram, Giemsa y tambin Wright. Si se trata de
cortes histolgicos hacer una preparacin con hematoxilina y eosina.

CULTIVOS

El medio ms utilizado en micologa mdica es el descrito por Sabouraud. A ste medio base se le aade
una cantidad superior de glucosas (40 x 100), denominndose as agar glucosado de Sabouraud (SGA), al
cual posteriormente se le han adicionado antibiticos con el fin de evitar la contaminacin bacteriana y ciclo
eximida (actidiona) para inhibir los hongos saprofitos.

Jos Huapaya Yaya, Martha Flrez Flores

La incubacin en micologa mdica es siempre en aerobiosis, oscilando el tiempo desde 2-3 das para
levaduras y especies saprofitas. La temperatura de incubacin es 32 C; los dermatofitos y otros causantes
de micosis cutneas a 25 a 30 grados centgrados (temperatura ambiental).

El producto patolgico y la tcnica de toma de muestra se elegir de acuerdo con el tipo de micosis por
investigar.

MATERIALES

Tubos de prueba conteniendo agar glucosado de Sabouraud (SGA)


Cultivos de especies ambientales: Penicillium, Alternaria, Aspergillus, Hormondendrum
Frasco con KOH al 10%, Mango de Kolle

Microscopio
METODOLOGA
Observar macroscpicamente y realizar preparaciones con azul de lactofenol para su observacin
microscpica.
RESULTADOS

Observar al microscopio (10X y 40X) las muestras directas.

Jos Huapaya Yaya, Martha Flrez Flores

OBSERVACION MICROSCOPICA DE HONGOS AMBIENTALES

Hongo ambiental y oportunista


Aspergillus spp.

Hongo ambiental
Penicillium sp
Jos Huapaya aya, Martha Flrez Flores

Jos Huapaya aya, Martha Flrez Flores

PRACTICA N 11
DIAGNSTICO DE LAS MICOSIS SUPERFICIALES Y CUTNEAS
OBJETIVOS
Describir las caractersticas de las colonias de hongos causantes de las micosis superficiales y cutneas en
cultivos con agar glucosado de Sabouraud y microscpicamente.
INTRODUCCIN
La colonizacin e invasin en mayor o menor grado de una especie fngica se denomina micosis. Dentro
de las micosis superficiales se incluyen las causadas por hongos que colonizan la superficie queratinizada
de la piel o pelo. Varios son los agentes etiolgicos que pueden colonizar la piel.

Las infecciones cutneas incluyen una variedad de procesos en los que se encuentran afectados piel y
anexos (pelo y uas). La infeccin puede estar limitado a la capa cornea o llegar a los estratos ms
profundos, sin invasin linftica. Producidos por los hongos denominados dermatofitos y las enfermedades
por ellos producidas dermatofitosis. La dermatomicosis incluye a cualquier proceso mictico de la piel y el
de dermatofitosis se reserva para los producidos por los hongos dermatofitos.

MICOSIS SUPERFICIALES
Piedra negra
Se caracteriza por la presencia de mdulos en la porcin extrafolicular del pelo, ptreos y de color negro. El
agente causal es Piedra hortae.
Piedra blanca
Muestra mdulos blanco-grisceos, que son masas agrupadas de hifas y pueden encontrarse en la parte
distal o central de pelo axilar, pubiano y crural. Agente causal Trichosporum cutaneum o T.beigelii.
Tia negra
Es una infeccin superficial del estrato corneo de la piel debido a la colonizacin Hortaea werneckii. Se
caracteriza por la presencia de manchas negro-marronceas, no descamativas e indoloras; frecuente en
palmas, dedos y plantas que en otro lugar de la piel.
Pitiriasis versicolor
Caracteriza lesiones furfurceas a veces papulomatosas o eritematosas confluentes con pigmento variable
(hipo o hiperpigmentadas). Tiene como agente causal a Malassezia furfur, se localiza preferente en el
tronco, sobre todo hombres y espalda. Al examen microscpico detectan los grupos de levaduras con las
hifas.
MICOSIS CUTNEAS
Dermatomicosis
Micosis producida por Candida albicans, hongo oportunista. Agente causal de los intertrigos (submamario o
inguinal), eczema de paales, onicomicosis con paroniquia y granuloma candidisico. Adems de s
C.albicantambin pueden producir onicomicosis Candida stellatoidea, C.tropicalis, C.guillermondii y
C.parapsilosis.

Las preparaciones teidas con Gram, muestran levaduras Gram positivas redondas u ovales, con brotes de
blastosporas de 3 a 4 m acompaadas de pseudohifas de 3 a 10 micras de longitud.

La mayora de los medios de cultivo bacterianos son satisfactorios para el aislamiento de Candida; de todas
formas se recomienda efectuar la siembra en medio de Sabouraud con antibiticos (cloranfenicol). Los
medios que contienen actidiona (cicloheximida) inhiben el crecimiento de algunas especies.

La incubacin se realiza a temperatura ambiente (2530 C) cuando se trata de medios con inhibidores y a
37 C. en el caso de medios enriquecidos exentos de sustancias inhibidoras. Al cabo de 24 a 48 horas se
pueden observar las colonias caractersticas de color blanco o crema, opacas, elevadas, lisas, brillantes o
mates de 1 a 3 mm de dimetro. La prueba de filamentacin y produccin de clamidosporas caractersticas
son muy sencillas y tiles para la identificacin de C.albicans.

Dermatofitosis
Jos Huapaya aya, Martha Flrez Flores

Es una infeccin fngica de los tejidos queratinizados (piel, pelo y uas) que ocurre en los seres humanos y
animales producida por un grupo de hongos estrechamente relacionados denominados dermatofitos.

Los agente etiolgicos de las dermatofitosis se clasifican en tres gneros: Epidermophyton, Microsporum y
Trichophyton. El diagnstico se puede hacer mediante:

Examen Directo
Para el estudio micolgico se procede a tomar la muestra, que en este caso sern pelos, escamas de piel o
muestras ungueales, que se toman con pinzas o bistur estril del centro o borde de la lesin y se colocan
en un portaobjetos. Se transportan entre dos portaobjetos limpios, y se observa directamente al
microscopio, con una gota de hidrxido de potasio (KOH) al 10%, cubierto con un cubreobjeto.
Al microscopio se pueden observar las artroconidias dentro del pelo (endotrix) o en forma de vaina alrededor
del tallo (ectotrix).
Cultivo
Las muestras se siembran en SGA, adicionado de cicloheximida, que inhibe los hongos saprofitos. La
identificacin se hace sobre la base del aspecto macroscpico de las colonias entre ellos la produccin de
pigmento. Luego las caractersticas microscpicas, observacin de macroconidias y microconidias y
elementos accesorios sirven para definir cada gnero y especie.
Observar el desarrollo de los hongos en estudio y anotar las caractersticas de sus colonias desarrolladas
en SGA.
MATERIALES
Tubos sellados de SGA con cultivos de:
- Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton tonsurans
- Microsporum gypsum, Microsporum canis
Preparaciones en lmina coloreadas con azul de lactofenol
Microscopio
METODOLOGIA:

Examinar al microscopio las lminas preparadas y esquematizar sus observaciones.

RESULTADOS:
MUESTRA
NOMBRE DEL HONGO:

CARACTERISTICAS

Jos Huapaya aya, Martha Flrez Flores

OBSERVACION

MACROSCOPCA:

MICROSCOPICA:

Microsporum canis
Col. Azul de Lactofenol

Epidermophyton flocosum
Col. Azul de Lactofenol

Trichophyton rubrum
Col. Azul de Lactofenol

Jos Huapaya aya, Martha Flrez Flores

Jos Huapaya aya, Martha Flrez Flores

PRACTICA N 12
DIAGNSTICO DE LAS MICOSIS
SUBCUTNEAS, MICOSIS SISTMICAS Y OPORTUNISTAS
OBJETIVOS
Identificar microscpicamente los agentes etiolgicos de las micosis subcutneas, y subcutneas.
Describir las caractersticas morfolgicas de las colonias de hongos causantes de las micosis cutneas y
subcutneas.

Identificar microscpicamente los agentes etiolgicos de las micosis sistmicas.


Describir las caractersticas morfolgicas de las colonias de hongos causantes de las micosis sistmicas.
INTRODUCCIN
MICOSIS SUBCUTANEA:
Se consideran en ste grupo las infecciones fngicas que afectan tejido subcutneo, dermis y epidermis,
causadas por hongos exgenos, saprofitos, cuyo hbitat es el suelo y las plantas. Las infecciones ms
frecuentes son:

La esporotricosis, debida a Sporothrix schenckii, que se produce habitualmente por la penetracin en la piel
de astillas, espinas o tierra contaminada; una vez establecida la infeccin tiende a permanecer localizada en
el tejido subcutneo y a ser muy persistente. Se caracteriza por una lesin ulcerada en el punto de
inoculacin, que va seguida de la formacin de ndulos y abscesos mltiples que siguen las vas de drenaje
de los linfticos superficiales.

La cromomicosis (cromoblastomicosis), es causada por Fonsecaea pedrosoi, Cladosporium carrionii y


Phialophora verrucosum, que se caracteriza por el desarrollo de una ppula en el sitio de inoculacin, que
ms tarde se extiende formando lesiones verrugosas o tumorales, semejantes a una coliflor; puede haber
infeccin secundaria y ulceracin. Las lesiones, por lo general, estn limitadas a los pies y las piernas, pero
puede afectar la cabeza, la cara, el cuello y otras superficies del cuerpo; tambin pueden haber abscesos
cerebrales.

El micetoma (maduromicosis), es causado por Nocardia y Streptomyces.

MICOSIS SISTEMICAS Y OPORTUNISTAS:


Las micosis sistmicas, son infecciones fngicas que afecta varios rganos y tejidos. Encontramos aqu dos
grupos:
(a) Las producidas por especies consideradas patgenas, con carcter endmico, este tipo de micosis se
transmite por inhalacin, ingesta, o traumatismos: blastomicosis y paracoccidiodomicosis; y
(b) Las producidas por especies oportunistas, Estas patologas se dan en huspedes inmunodeprimidos (con
trastornos endocrinos, inmunodeficiencias, enfermedades oncohematolgicas, alteraciones metablicas y
anatmicas, drogadictos endovenosos, pacientes bajo tratamiento prolongado con corticoides o citostticos,
sometidos a ciruga, dializados, quemados, trasplantados y cateterizados) y son causadas por hongos saprofitos
del ambiente o comensales de cuerpo humano. Por ejemplo Candida y Cryptococcus.
La infeccin se adquiere por la inhalacin de conidios en la fase micelial, desarrollndose en el husped un foco
pulmonar primario. En caso que el paciente presente inmunodeficiencia puede haber una diseminacin
sistmica.
El diagnstico de laboratorio se realiza mediante la observacin de la fase levaduriforme en los siguientes
productos: expectoracin, secrecin de lesiones mucocutneas y material de biopsia. La fase levaduriforme se
puede obtener en cultivos enriquecidos, incubados a 37 C. Estas pueden ser:
Blastomicosis (Blatomyces dermatitis)
La infeccin comienza habitualmente en los pulmones y se difunde por va hematgena, causando lesiones
destructivas focales en los huesos, piel, prstata y otras vsceras; en general no se afecta el tubo digestivo.
Jos Huapaya aya, Martha Flrez Flores

Las lesiones cutneas son particularmente manifiestas, parecen originarse como metstasis a partir de las
lesiones pulmonares primarias, que se abren a la superficie cutnea causando lesiones ulceradas y
encostradas. Las lesiones se caracterizan por inflamacin granulomatosa, microabscesos y progresiva
destruccin de los tejidos; la calcificacin es rara.

Paracoccidioidomicosis o blastomicosis sudamericana (Paracoccidioides brasilensis)

Las primeras lesiones aparecen en las mucosas de la boca o de la nariz y se difunden por expansin
directa, es decir, a travs de los lmites cutneo-mucosos afectan la cara; en ocasiones, la diseminacin se
produce a travs de los tejidos linfticos incluyendo el bazo.

En el tubo digestivo las lesiones comienzan en el tejido linfoide submucoso y pueden originar formacin de
lceras e incluso perforaciones; pueden formarse abscesos subcutneos que, por extensin a la superficie
cutnea, pueden producir lesiones deformantes de gran tamao, encostradas o ulceradas. Las lesiones
cutneas constituyen abscesos pigenos y lesiones inflamatorias granulomatosas.

Histoplasmosis (Histoplasma capsulatum)

Causada por la inhalacin de esporas lo que conduce a la infeccin pulmonar; aparecen lesiones miliares
distribuidas por todo el parnquima pulmonar y aumento de tamao de los ganglios linfticos. La infeccin
inicial es benigna, puede pasar completamente inadvertida o manifestarse como una infeccin respiratoria
autolimitada.

En un pequeo nmero de individuos la enfermedad progresa, se disemina y causa lesiones prcticamente


en todos los tejidos y rganos; aparece fiebre y postracin, as como el aumento del tamao del hgado,
bazo y ganglios linfticos, simulando tuberculosis miliar; en ocasiones, puede evolucionar como una
enfermedad pulmonar crnica con cavitacin, simulando la tuberculosis pulmonar crnica. Las lesiones de
los tejidos se caracterizan por la existencia de una inflamacin granulomatosa.

Coccidiomicosis (Coccidioides immitis)

La infeccin se establece por inhalacin de esporas transmitidas por el aire; aproximadamente en el 60% se
pone de manifiesto nicamente por la adquisicin de una hipersensibilidad de tipo retardado frente a los
antgenos del hongo; en un 40% se presenta neumonitis aguda acompaada con frecuencia de pleuresa y
varias erupciones cutneas; alrededor del 5% desarrollan una enfermedad pulmonar crnica con cavitacin
que se asemeja a la tuberculosis pulmonar y conduce ocasionalmente a la calcificacin; en menos del 1%
aparece una diseminacin con lesiones granulomatosas spticas en muchos rganos y tejidos, entre ellos la
piel, huesos, articulaciones y meninges.

Las lesiones de la neumonitis aguda son histolgicamente semejantes a las causadas por bacterias
pigenas, pero en la enfermedad pulmonar crnica y en las formas diseminadas, la inflamacin es
granulomatosa.

Criptococosis
Esta ocurre en particular en sujetos con inmunodeficiencia de clulas T y se debe a Cryptococcus
neoformans, este hongo se caracteriza por ser una levadura encapsulada. Su hbitat es el suelo
contaminado con material fecal de aves.

La Criptococosis es una de las enfermedades que sirve para definir el SIDA. Dentro de las formas clnicas
existe: criptococosis pulmonar, del SNC, diseminada, cutnea y mucocutnea.

El producto ms frecuente a analizar es sedimento de LCR, en el se observan las tpicas levadura


capsulazas que se destacan por contraste negativo mediante emulsin con tinta china.

Candidiasis (Candida spp)


Las infecciones causadas por Candida es muy variada, este hongo de tipo levaduriforme puede llegar a ser
patgeno en humanos y animales en los cuales viven en estado saproftico. La cavidad bucal y el resto del
tracto gastrointestinal son los territorios preferentes, en donde C.albicans se encuentra en el 20% de las
personas y en menor proporcin otras especies de Candida.

Por lo menos cinco condiciones favorecen el surgimiento de Candidiasis:


1. Cambios fisiolgicos como diabetes y embarazo
2. Uso prolongado de antibiticos o frmacos antitumorales e inmunosupresores.
3. Maniobras diagnosticas y teraputicas agresivas (cateterismos, sondajes)
4. Debilidad general y/o desnutricin.
5. Infeccin por el virus de inmunodeficiencia humana y la drogodependencia.

Jos Huapaya aya, Martha Flrez Flores

El diagnostico de la Candidiasis en el laboratorio incluye la demostracin directa de Candida (mediante


coloraciones Giemsa, Gram) en muestra clnicas y en cultivos.

MATERIALES
Tubos sellados de SGA con cultivos de las diferentes micosis

Lminas, laminillas, colorante azul de lactofenol

Microscopio
METODOLOGA

Observacin de las muestras macroscpicamente


Realizar preparaciones en lminas con azul de lactofenol y observar a 10x y 40x.

RESULTADOS
Graficar lo observado.
MUESTRA
NOMBRE DEL HONGO:

CARACTERISTICAS

OBSERVACION

MACROSCOPCA:

MICROSCOPICA:

MACROSCOPCA:

MICROSCOPICA:

NOMBRE DEL HONGO:

CARACTERISTICAS

Jos Huapaya aya, Martha Flrez Flores

Phialophora verrucosum
Col. Azul de lactofenol

Sporothrix schenckii
Col. Azul de Lactofenol

Cladosporium carrionii
Examen directo con KOH

Jos Huapaya Yaya, Martha Flrez Flores

Candida albicans
Coloracin Gram

Histoplasma capsulatum

Cryptococcus neoformans

Coccidioides immitis
Candida albicans
Examen directo con KOH

Jos Huapaya Yaya, Martha Flrez Flores

Jos Huapaya Yaya, Martha Flrez Flores

Absceso, acumulo
local de pus que
representa los restos
licuados
de
leucocitos
(neutrfilos) y tejido
destruido.
Algodoncillo,
una
micosis de la mucosa
de la boca y vas
respiratorias altas.
Clulas
eucariticas, clula
con
membrana
nuclear.
Conidios, esporas
asexuales de hongos
nacidos
en
estructuras
ramificadas a modo
de
tallo
llamado
conidiforos.
Descamacin,
esfacelo excesivo de
las
capas
superficiales de un
tegumento, como la
epidermis de la piel.
Dermatofitos, grupo
de
hongos
queratinfilos
que
invaden las zonas
queratinizadas
superficiales
del
cuerpo (pelo, piel,
uas).
Dermatomicosis,
proceso mictico de
la piel causada por
cualquier tipo de
hongos,
frecuentemente
Candida.
Dermatitis,
inflamacin
piel.

de

la

Hematgena,
originado
en
o
transportado por la
sangre.

GLOSARIO

Hifa,
estructura
tubular de hongos
vegetativos
que
posee
paredes
cruzados (tabiques).

Hongos dimrficos,
hongos que pueden
sufrir
conversin
morfolgica y crecer
en forma de levadura
o de moho segn las
condiciones
ambientales; muchos
hongos
patgenos
son dimrficos.
Inmunodeficiente,
relativo
a
un
trastorno del sistema
inmunitario en el que
la inmunidad humoral
o
celular
es
infrecuente, y esta
disminuida
la
resistencia
a
la
infeccin.
Inmunoincompetent
e, incapacidad para
desarrollar
una
respuesta inmunitaria
al estimulo de los
antgenos.
Macroconidios, el
mayor de dos tipos
de
conidios
producidos
por
hongos que tienen
de
ambos
tipos
pequeos y grandes.

Mohos,
grupo
heterogneo
de
hongos que crece en
forma
filamentosa;
unos
pocos
son
dimrficos.
Saprofito,
microorganismo que
normalmente existe
en material orgnico
muerto.
Tia, lesin circular
causada por hongos
queratinfilos
(dermatofitos);
la
lesin es escamosa,
pruriginosa
y
se
difunde
perifricamente.
Tubo germinativo,
yemas alargadas que
se
desarrollan
cuando
hongos
dimrficos
se
convierten
de
la
forma levadura a la
forma
moho
de
crecimiento,
y
maduran
para
producir
hifas
verdaderas.

Micelio, la masa de
hifas,
frecuentemente
de
aspecto algodonoso,
formada por una
colonia de mohos.
Micetoma, infeccin
crnica causada por
diversos hongos y
actinomicetos.
Microconidios,
el
tipo ms pequeo de
conidios en hongos.
Miliares, relativo al
trastorno
caracterizado por la
aparicin de lesiones
muy pequeas, como
la tuberculosis miliar,
que se caracteriza
por la aparicin de
tubrculos diminutos
distribuidos por todo
el organismo.

Jos Huapaya Yaya, Martha Flrez Flores

PRACTICA N 13
MTODOS DE DIAGNOSTICO VIROLGICO
OBJETIVOS

Familiarizar al estudiante con las diferentes tcnicas de aislamiento de virus aprovechando las propiedades
que presentan.

Observar y caracterizar morfolgicamente clulas cultivadas.

Explicar la importancia de las tcnicas de cultivo de tejidos en virologa y en otras disciplinas cientficas.
INTRODUCCIN

Los virus son microorganismos intracelulares obligados por carecer de sistemas energticos. Estas
caractersticas son explotadas para su aislamiento y diagnstico adems de muchos otros tales como su
accin patgena que depende de muchos factores inherente al microorganismo y al hospedador, receptores
especficos existentes, pH.

Un factor determinante y definitivo para el aislamiento viral es la obtencin temprana de una muestra
adecuada, esto debido a que la excrecin del virus tiende a ser por pocos das y la concentracin de
partculas virales disminuye progresivamente con el tiempo. Toda muestra para estudio virolgico debe
obtenerse con mucha asepsia, usando siempre soluciones tamponadas, con antibiticos, sobre todo su
transporte debe ser con hielo inmediatamente para ser procesadas o colocadas en congeladores a -20 C,
estas no deben dejarse a temperatura ambiente o en incubadora, tampoco es recomendable congelar y
descongelar las muestras, pues as se podra alterar la estructura del agente viral.

Es importante que las muestras incluyan una ficha de datos epidemiolgicos como: Nombre, edad, sexo,
antecedentes, fecha de inicio de la enfermedad, sntomas, procedencia, etc.

TIPOS DE MUESTRAS
Hisopado farngeo
Lavado de garganta, hisopado nasofarngeo del fondo de la garganta. El lavado de garganta dentro las 18
horas de iniciado la enfermedad. Para adenovirus, influenza, sarampin, citomegalovirus y parotiditis.
Heces
Recolectar en frasco estril (aproximadamente 2 g) y guardar a 20 C, hasta el envo al laboratorio, la
muestra se obtiene dentro de los 10 das de iniciada la enfermedad, si es hisopado rectal humedecer la
torunda con suero fisiolgico; obtenida la muestra colocarla en caldo tioglicolato hasta su envo siempre en
refrigeracin. Para aislar rotavirus, adenovirus, coxsackie A y B, reovirus y poliovirus.
Piel
Raspado de la ppula o mcula, fluido de vescula o pstula con ayuda de un hisopo colocar en un caldo
buffer a 20C. Tambin puede colocarse la muestra directamente sobre un cubreobjetos para anticuerpos
fluorescentes. Para herpesvirus, varicela.
Secreciones oculares
Con ayuda de un hisopado humedecido obtenerse secreciones de la conjuntiva, lavado de ojos, colocar las
muestras en tubos con caldo buffer y con otro hisopo para improntas sobre portaobjetos para conjugados
fluorescente. Para aislar virus como adenovirus, herpesvirus, sarampin.
Tejidos
Se obtiene por biopsias, se limita a algunos rganos como hgado, bazo, verrugas, ganglios inflamados;
mantener a 20 C hasta su procesamiento.
Sangre
Sangre venosa en cantidad de 510 mL sin anticoagulante para la obtencin del suero; generalmente es
usada para pruebas serolgicas en caso de hepatitis, HIV, etc.

El xito en el aislamiento del virus depende de la correcta recoleccin, transporte y almacenamiento de las
muestras.

TCNICAS DIRECTAS PARA LA DEMOSTRACIN VIRAL

Dentro de las tcnicas directas se encuentran:


Las que visualizan la partcula viral o su efecto especifico (efecto citoptico) como las tinciones para
microscopia de luz, microscopia electrnica y el cultivo de aislamiento viral.
Las pruebas para demostracin de antgenos virales: los inmunoensayos (ELISA, IFA, RIA) y las pruebas de
ltex.
Las que evidencian la presencia de material gentico viral como: ensayos de amplificacin gentica
(reaccin en cadena de la polimerasa o PCR) e hibridacin (sondas, ADN ramificado, etc.).
Visualizacin de la partcula viral.
AISLAMIENTO VIRAL EN CULTIVO
Los virus son microorganismos intracelulares y para evidenciarlos, se deben utilizar sistemas basados en
lneas celulares. La invasin viral se evidencia a travs de un cambio celular o efecto citoptico (EC) y
mediante pruebas complementarias. Por la especificidad de los virus estos no desarrollan en cualquier clula
pues requieren de receptores especficos es por ello que existen variabilidad de clulas las que las
clasificamos por su origen en:
Cultivos primarios
Son aquellos que se obtienen por disgregacin enzimtica y mecnica de embriones, rganos o tejidos
(normales o tumorales) de humanos o animales, para producir una suspensin celular. Se mantienen
intactas por 3 a 5 pasajes.
Lnea celular
Cuando un cultivo primario es subcultivado por primera vez. Existen varios tipos de lneas celulares. Una
lnea celular diploide presenta el 75% de sus clulas con el cariotipo original de donde fueron obtenidas. Una
lnea celular establecida es aquella que ha demostrado potencialidad de ser subcultivada indefinidamente in
vitro. Ej. Vero, MCR5, HELA, Hep2, W138, Flow 2002.
TCNICAS INDIRECTAS PARA EL DESCUBRIMIENTO VIRAL

Estas son las tcnicas serolgicas tradicionales para descubrir anticuerpos contra determinado agente viral,
teniendo en cuenta que la exposicin al agente produce una respuesta por parte del sistema inmune que
genera la produccin de anticuerpos especficos. Estos ensayos se pueden clasificar en tres grupos con
base en la cuantificacin de la reaccin antgeno-anticuerpo:

a)

Los que dependen de la capacidad del anticuerpo que se une al antgeno para ejercer alguna funcin no
relacionada con el virus. Ej. Fijacin del complemento (FC), hemoaglutinacin indirecta (HAI), aglutinacin
por ltex (AL).

b)

Los que miden la capacidad de los anticuerpos para bloquear la funcin viral especfica como la
neutralizacin, la inhibicin de la hemoaglutinacin (IHAI), la inhibicin de la neuraminidasa (que mide la
capacidad de los anticuerpos para bloquear la infectividad viral), la hemoaglutinacin viral y la actividad de la
neuraminidasa.

c)

Los que miden directamente la interaccin antgeno-anticuerpo como por ejemplo: la inmunofluorescencia
(IFA) indirecta, el radioinmunoanlisis (RIA), ELISA y el Western Blot (WB).

INMUNODIAGNSTICO
ENSAYO INMUNOENZIMTICO
La prueba de inmunoabsorcin ligada a enzimas (ELISA) o inmunoensayos ligados a enzimas
(EIAs) en la cual el antgeno o anticuerpo est adsorbido a una fase slida , constituye uno de los
primeros inmunoensayos enzimticos primeramente descritos por Engvall y Perlmann en 1971 y
luego aplicados al diagnstico microbiolgico por Voller y colaboradores. ELISA tiene la ventaja sobre
las tcnicas de inmunofluorescencia (IF) de su mayor sensibilidad ya que, la enzima acta
catalticamente y de forma objetivable, por lo que es posible medir la densidad ptica de la coloracin
final. Las enzimas son seguras, de bajo costo y estables, si se comparan con los radio-istopos
utilizados en radioinmunoensayo (RIA)
En la actualidad estas pruebas estn tomando un rol importante en los laboratorios mdicos y de
investigacin, porque brindan una alternativa viable, mediante la cual es posible realizar la

identificacin de muchos virus a nivel de gnero. Estn reemplazando a los RIA en muchos
laboratorios, por su comparable sensibilidad sin los problemas de manejo, eliminacin y corto tiempo
de vida de los materiales radioactivos.
Debido a su objetividad, facilidad de automatizacin y posibilidad de trabajar con un gran nmero de
muestras, estos ensayos inmunoenzimticos estn reemplazando parcialmente a tcnicas en el
laboratorio como : inmunofluorescencia y aglutinacin.
Estos ensayos presentan tres piezas constantes que originan distintos tipos de EIA en funcin de
como se combinen : el analito (antgeno {Ag} o anticuerpo {Ac} ), el conjugado (de antgeno o de
anticuerpo) y el sustrato. Utilizan enzimas como marcadores inmunoqumicos que permiten valorar las
uniones antgeno-anticuerpo que se producen tras un periodo de incubacin, con la adicin posterior
de un sustrato.
Fundamento
La prueba de ELISA se basa en la reaccin antgeno-anticuerpo, uno de los cuales debe ser de
reactividad conocida. El color se genera por la interaccin de un sustrato cromognico y una enzima
que ha sido acoplada al anticuerpo detector. Si debe medirse el anticuerpo, se coloca el antgeno en
la fase slida, como una capa de captura. Despus de la reaccin del antgeno con el suero del
paciente, la capa de deteccin puede ser un reactivo antiinmunoglobulina clase especfica (IgM o IgG)
para detectar respuesta de anticuerpos clase especficos
Dentro de los parmetros fisicoqumicos que intervienen en la unin del antgeno con el anticuerpo
tenemos:
Fuerzas de Van der Walls producidas por el movimiento de tomos en la superficie de las
molculas generado por un cambio elctrico. Son fuerzas dbiles presentes cuando la proximidad del
Ag y el Ac es grande.
Fuerzas electrostticas originadas por la fuerza de atraccin entre molculas de carga inica
opuesta, como sucede con los grupos NH3 + (amonaco)que reaccionan vidamente con el grupo
COOH- (grupo carboxilo).
de

Uniones por puentes de hidrgeno son de carga energtica baja entre tomos electropositivos
hidrgeno
y
tomos
electronegativos
de
oxgeno
o
nitrgeno.

Metodologa
Los mtodos de ELISA se dividen en:
ELISA directo: ensayo ELISA simple de dos capas
Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se
encuentra el antgeno. Se incuban con anticuerpos marcados e indican la presencia de antgeno en la
solucin analizada. Se debe incluir controles negativos que sern muestras del mismo tipo de las
analizadas (sangre, orina) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antgeno buscado y
controles positivos (soluciones donde se encuentra el antgeno buscado, o bien se le ha aadido).
ELISA indirecto
Las placas ELISA se preparan de igual forma que en el mtodo directo, los controles positivos y
negativos son los mismos. El sistema de deteccin emplea dos anticuerpos : uno primario contra el
antgeno, y uno secundario marcado contra el primario. La deteccin tiene mayor sensibilidad por
presentar una amplificacin de seal debida a la unin de dos o ms anticuerpo secundarios por cada
primario.
ELISA sndwich: ensayo de captura de antgeno y deteccin mediante inmunocomplejos
Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo antiantgeno. Despus de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se
encuentra el antgeno, que ser retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo.
Despus de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solucin con un
segundo anticuerpo anti-antgeno marcado. As pues cada molcula de antgeno estar unida a un
anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo

tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificacin de seal que permite el segundo
anticuerpo.

Fijacin del Antgeno a la fase slida:


La reaccin inmunolgica tiene lugar en la fase slida, sta puede ser de plstico, vidrio o
nitrocelulosa. Los ms usados son los de plstico, dentro de stos los de poliestireno
gammairradiados y los de cloruro de polivinilo ya que tienen mayor capacidad para formar enlaces
estables
que
los
de
poliestireno
no
tratados.
El antgeno diluido en buffer es adherido a la fase slida por enlaces electrostticos entre los sitios
activos del plstico y regiones de la protena responsables de esta interaccin. El buffer puede ser
carbonato a pH 9,6 o buffer fosfato salino ( PBS 1X ) a pH 7,4.
La estabilidad de los enlaces electrostticos, el tiempo de incubacin y la temperatura son factores
importantes a tener en cuenta para evitar prdidas de las protenas y que pueden afectar la
sensibilidad del ensayo.
Reaccin con anticuerpo:
La reaccin del antgeno con el anticuerpo se debe realizar en condiciones similares a las fisiolgicas:
pH 7,4, temperatura de 37C y concentracin salina equivalente a 0.15M de cloruro de sodio (NaCl).
El
tiempo
puede
variar
entre
1
a
3
horas.
Molculas no especficas en solucin pueden adherirse a la fase slida afectando el resultado final del
ensayo, para disminuir este riesgo se suele agregar al medio de reaccin un exceso (0,1% a 1%) de
una protena inerte para que compita eficientemente por los sitios de unin inespecficos en la fase
slida. Esta protena puede ser seroalbmina bovina, casena, suero entero, gelatina u otros.
Tambin es necesario aadir al medio Tween 20 (Monolaurato de polioxietileno sorbitn { surfactante }
)para evitar uniones inespecficas de macromolcula. Por este motivo es agregado en los tampones
de dilucin y de lavado.
Adicin del conjugado enzimtico :
El conjugado enzimtico se prepara por unin covalente de una enzima con el anticuerpo; esta
enzima puede ser peroxidasa de rbano (Horseradish peroxidase { HRP } ), fosfatasa alcalina
(Alcaline Phosphatase { AP } ) o beta-galactosidasa. Los criterios a tomar en cuenta en la seleccin
de la enzima apropiada son su toxicidad, estabilidad, disponibilidad, viabilidad de conjugarla
eficazmente con el anticuerpo elegido, sensibilidad y costo.
Las condiciones de reaccin entre el conjugado y el complejo formado por la unin antgenoanticuerpo
son
similares
a
las
descritas
en
la
etapa
anterior.
Adicin del sustrato:
La eleccin del sustrato va de acuerdo con el tipo de enzima presente en el conjugado. El sistema AP
hidroliza al p-nitrofenil fosfato o p-nitrofenol generando un producto soluble de color amarillo. El
sistema HRP reduce al sustrato perxido de hidrgeno produciendo oxgeno que oxida a otros
compuestos
cromgenos
tales
como:
Tetrametilbenzidina (TMB) : la oxidacin genera un producto de color azul oscuro.
o-phenylene diamine (OPD): es oxidado a un producto coloreado que puede variar de color naranja
a pardo oscuro.
cido azino-(3-etil)-benzo-sulfnico (ABTS) : la oxidacin genera un producto que puede variar del
color al azul.

La intensidad del color desarrollado es de acuerdo con la cantidad de enzima presente en la reaccin.
La lectura se realiza en un espectrofotmetro a 405 nanmetros
PRUEBA RPIDA PARA VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA HUMANA
Uno de los pilares bsicos de la lucha contra el Sndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) es
la deteccin precoz de las personas infectadas por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). El
diagnstico precoz ofrece la posibilidad de beneficiarse de la terapia antirretroviral en las etapas
precoces de la infeccin, as como intentar modificar las conductas que favorecen la transmisin del
virus a otras personas.
Descripcin de las pruebas de deteccin rpida del VIH
Son ensayos de lectura visual que pueden realizarse con equipamiento mnimo y generan un
resultado en menos de 15 minutos en comparacin con la prueba estndar de cribado con tcnicas
de EIA, de las cuales no se dispone del resultado hasta al cabo de unas horas o das. Tanto la prueba
de deteccin rpida como el EIA detectan anticuerpos especficos del VIH.
Se han establecido los diferentes criterios que debera cumplir una prueba de deteccin rpida del
VIH:
Presentar alta sensibilidad y especificidad (>99%)
Ser reproducible
Ser fcil de aprender, realizar e interpretar
Ser precisa
Ser de fcil almacenamiento
No requerir equipamiento adicional
No tener carcter invasivo
Durante la realizacin de las pruebas de deteccin rpida, se recomienda que los pacientes reciban
informacin y asesoramiento sobre la enfermedad y la infeccin. Si la prueba es negativa, se
considera un negativo definitivo a no ser que haya posibilidades de que se encuentre en el perodo
ventana de exposicin (primeros 3 a 6 meses de post exposicin). Si el resultado es positivo, se
considera un resultado preliminar que debe confirmarse con tcnicas de EIA y con la prueba Western
blot.
Los resultados indeterminados se deberan repetir en un mes. La mayora de las pruebas de
deteccin rpida del VIH se comercializan con un equipo o kit que incluye todo lo necesario para
realizar la prueba y no requiere un equipamiento especializado. En general, disponen de un control de
procedimiento incorporado en el equipo o kit. Para la muestra, se puede utilizar sangre entera (ms
fcil de realizar), plasma o suero, y los resultados se interpretan visualmente.
Capacidad diagnstica de las pruebas de deteccin rpida del VIH
Es difcil realizar una comparacin de la capacidad diagnstica de las numerosas
pruebas de deteccin rpida comercializadas ya que son, muy distintas entre ellas. Los principios de
accin ms frecuentes en estas pruebas son la aglutinacin, la inmunoconcentracin (flow through), la
inmunocromatografa (lateral flow) y la fase slida (solid phase).
El mtodo de produccin y de combinacin especfica de los antgenos vara entre las distintas
pruebas de deteccin. La mayora incluye uno o ms antgenos del virus VIH-1 (gp41, gp120, gp160)
y VIH-2 (gp36). Otros incorporan el antgeno core (p24).
Actualmente, existe controversia en la duracin del perodo ventana entre 3 6 meses. En general,
se recomienda el alta mdica a los 6 meses despus de una actividad de riesgo de infeccin.
PRUEBA DE INMUNOFIJACIN DE DOT-BLOT
Prueba para la deteccin del VIH en la cual los antgenos virales se encuentran unidos a una
membrana de nitrocelulosa dentro de un contenedor plstico. Los antgenos utilizados son
recombinantes o sintticos. Se utilizan conjugados de anti-inmunoglobulina ligados a una enzima que
se fija al anticuerpo del paciente. La adicin del sustrato permite la visualizacin del color en el papel.

Su ventaja y principal indicacin es la posibilidad de identificacin entre los dos tipos de virus. Las
pruebas son rpidas y fciles de realizar, pero son costosas. Muchas producen resultados en 5 15
minutos.
TCNICAS DE INOCULACIN EN ANIMALES DE LABORATORIO
Este fue el primer mtodo que se utiliz para el aislamiento de virus, demostrndose la reaccin
positiva por la muerte y los cambios histolgicos o clnicos. Existen factores negativos en el uso de
animales de laboratorio: el confinamiento de los mismos de tal manera que no se pueda impedir una
infeccin cruzada a otros animales y al personal de laboratorio, la presencia de enfermedades vricas
latentes en los animales de experimentacin que pueden activarse por el mismo trauma que supone
la inoculacin con la consiguiente interferencia a la hora de la interpretacin de los resultados.
Debe elegirse cuidadosamente el tipo y la edad del animal que va a utilizarse , as como la va de
inoculacin, ya que cada especie tiene su propia sensibilidad y cada virus sus propios requerimientos
respecto a un tipo de clulas .El animal ms utilizado es el ratn de menos de dos das de edad
especialmente como animal de rutina con fines diagnstico siendo el que proporciona el principal
mtodo de aislamiento de los virus Coxsakie A.
el ratn lactante se utiliza en virologa para :
Inocular por va intracerebral (0,06 ml) : Herpes simple
Inocular por va subcutnea (0,06 ml) : infeccin por Coxsakie, Arbovirus y Reovirus
Inocular por va intradrmica (0,02ml) virus Coxsakie
el ratn adulto se utiliza :
Inocular por va intracerebral (0,03ml) o intraperitoneal hasta 2 ml de encefalitis
Inocular por va intracerebral : rabia, coriomeningitis linfocitaria
Inocular por va intranasal ( 0,05 ml): Influenza A,B y C
Inocular por va intraperitoneal o intracerebral para obtencin de inmunosueros.
la cobaya se utiliza para :
Inocular por va intraperitoneal hasta 5 ml de coriomeningitis linfocitaria
Inocular por va intraperitoneal o intramuscular para obtencin de inmunosueros
hasta un ml.
el conejo se utiliza para :
Inocular por va intradrmica Herpes tipo B
Inocular por va intradrmica para la obtencin de vacunas
Inocular por va intravenosa hasta 2 ml o intramuscular hasta 2 ml o intraperitoneal
hasta 2 ml para la obtencin de inmunosueros.
Materiales : jeringa con aguja de 1 ml, embudo de cristal, tubos de ensayo, algodn.
Reactivos : alcohol etlico de 70, ter etlico, solucin de inoculacin
Tcnica :
a) Anestesiar al ratn con un algodn empapado de ter etlico colocado en el interior de un embudo
invertido, introducir en l el ratn.
b) rasurar la zona a inyectar e inyectar la solucin de inoculacin en el lugar de inoculacin que puede
ser: IC intracraneal, IM intramuscular, IN intranasal, SC subcutnea, ID intradrmica, IV intravenosa,
IP intraperitoneal.
Interpretacin de los resultados: Se manifiesta la infeccin en el ratn, se observar sta por la
sintomatologa , la muerte o la elevacin del ttulo de anticuerpos. Se observar durante dos o ms
semanas el animal inoculado

Tomado de Microbiologa Granados 1aedicin

TCNICAS DE INOCULACIN EN EMBRIN DE POLLO


Existen varios mtodos de inoculacin de huevos frtiles, dependiendo del virus que desea cultivarse.
Una vez inoculados, los huevos se incuban a temperaturas entre 35 y 38C dependiendo del virus).
Antes de proceder a la inoculacin de un huevo debe limpiarse cuidadosamente su superficie con
alcohol.
Inoculacin corio-alantoidea
Edad del embrin : 10 a 12 das
Mtodo :
Examinar el huevo en ovoscopio provisto de lmpara de 100 vatios. sta tcnica llamada de
iluminacin permite apreciar los vasos sanguneos del embrin, la cmara de aire con claridad a
travs de la cscara. Con un lpiz se delimitar la cmara de aire as como tambin el punto en que el
corio-alantoides es bien notorio y desarrollado. Practicar una cmara de aire artificial de la siguiente
manera:
a) Quitar un pequeo tringulo de cscara de encima del corio-alantoides sin daar la frfara
b) Utilizando una aguja de diseccin incidir cuidadosamente la frfara sin daar la membrana corioalantoidea que est debajo.
c) Realizar una pequea abertura en la cmara de aire y valindose de un gotero realizar una succin
suave en el agujero hecho anteriormente. La membrana corio-alantoidea se separa de la frfara
efectundose entonces la inoculacin a travs de la hendidura de la misma.
Sellar la abertura e incubar durante 2 a 4 das examinando diariamente
Inoculacin en saco amnitico
Edad del embrin: 7 a 14 das
Mtodo
Proceder como para la inoculacin corio-alantoidea. Cuando la membrana corio-alantoidea aparezca
se aumenta el tamao del orificio .A travs de la membrana corio-alantoidea y utilizando unas pinzas
estriles se extrae una parte de la membrana amnitica. Inocular en la cavidad amnitica, sellar e
incubar.
Inoculacin de saco alantoideo
Edad del embrin : 10 das
Mtodo
Se procede como en la inoculacin corio alantoidea pero sin extraer la membrana. Inocular
directamente en la cavidad alantoidea. Con el agujero realizado en la cmara de aire se evita el
reflujo del inculo motivado por la presin. Sellar e incubar.
Inoculacin en saco vitelino
Edad del embrin: 3 a 8 das
Mtodo

Se efectuar la inoculacin directa a travs de la cmara de aire, puesto que a la edad sealada el
saco vitelino rellena casi por completo el huevo. Sellar e incubar.
Examen
Colocar el huevo en una placa de Petri, sobre algodn empapado en desinfectante. Utilizando
tijeras y pinzas estriles eliminar la cscara de encima de la cmara de aire. Extraer la membrana
interna (frfara) y colocarla en agua destilada estril. Examinarla para apreciar lesiones.
La identificacin de virus aislados en huevos puede hacerse por tcnicas de neutralizacin o de
fijacin del complemento con sueros especficos. Es posible neutralizar tanto el efecto particular
producido por el virus como la formacin de placas o muerte del embrin, como en el caso de los
myxovirus, neutralizar o inhibir la propiedad de estos virus de aglutinar los hemates. Las pruebas de
fijacin de complemento tienden a dar reacciones de grupo ms que especficas de tipo.

Tomado de Manual de Tcnicas de Microbiologa Mdica Baker

MATERIALES

Frascos para cultivos celulares con medio de cultivo de crecimiento EAGLE (20% de suero bovino fetal).
Lminas fijadas con efectos citopticos de virus de la rabia
Microplacas para ELISA para VHA.
Prueba de ELISA rpida para VIH

METODOLOGA

Observar los medios de cultivos usados para cultivo celular


Observar las laminas fijadas al microscopio y las pruebas de

Efecto citoptico

Corpsculo de Negri en Neuronas


Virus de la Rabia

Sincitio (Clulas multinucleadas)


Virus Sincitial Respiratorio

Jos Huapaya Yaya, Martha Flrez Flores