Fungi Test

FUNGITEST
60780
10 TESTS
DETERMINATION OF THE SENSITIVITY OF YEASTS
TO ANTIFUNGAL AGENTS
IVD
1- CLINICAL VALUE
A renewed outbreak of fungal infections has been observed in recent years,
related to the increased number of immunodepressed subjects (9).
This is mainly due to the use of more aggressive anticancer chemotherapy,
more intensive immunosuppressant treatments in transplant recipients and to
the use of broad-spectrum antibiotics (2, 3).
This outbreak is accompanied by an increase in the number of pathogenic
species identified (10) and the emergence of resistance for previously
sensitive species.
An in vitro test of the sensitivity of yeasts to antifungal agents can be useful in
this new context (1, 4, 7, 8). FUNGITEST meets this objective, as it allows
determination of the sensitivity of yeasts to antifungal agents according to a
standardised method derived from a reference method (5, 6), which is easy to
perform and interpret.
2- PRINCIPLE
FUNGITEST is used to study the growth of yeasts in the presence of 6
antifungal agents at 2 different concentrations, in modified RPMI 1640
buffered medium, in the presence of a redox indicator.
Growth assessment is based on reduction of the coloured indicator which
turns the medium from blue to pink. When growth is inhibited by the
antifungal agent, the medium remains blue.
This test, presented in the form of a 16-well microplate, consists of:
2 growth control wells
12 wells containing the dehydrated antifungal agents (6 antifungal
agents at 2 different concentrations)
2 negative control wells
The breakpoints have been chosen following the study of the distribution
of the antifungal agents M.I.C.s obtained with prototype microplates
used with the same procedure as Fungitest.
This preliminary study was performed in 2 reference Laboratories, the

Unit de Mycologie of the Institut Pasteur in Paris, and the Immunoloy
Laboratory of the Facult de Pharmacie of Montpellier; 193 strains
were selected to be representative of strains isolated in routine practice,
and including resistant strains. In that study, 8 dilutions of 6 antifungal
drugs were tested, and the distribution of the resulting M.I.Cs was
obtained. Based on the distribution graphs, and on recent litterature data,
2 concentrations were selected for each antifungal drug for the final
presentation of the gallery.
In the absence of current international recommendations giving an
interpretation of M.I.C.s, the selected breakpoints are a compromise,
and they could be modified in the future : other studies are needed to
define the correspondance between the results obtained in vitro, and their
clinical relevance.
3- COMPOSITION OF THE KIT

FUNGITEST includes :
Microplate : 10 individually packed 16-well microplates (diagram of
the microplate is indicated on the label).
10 adhesive films
Suspension medium : 10 bottles containing 3 ml of ready to use
suspension medium
Each microplate is individually packaged under seal-foiled aluminum bag
with an adhesive film and a dessicant.
T+
T+
5FC2
5FC32
T+
Positive control
5 FC
5- fluorocytosine (2-32 g/ml)
AB
amphotericin B (2-8 g/ml)
MCZ
miconazole (0.5-8 g/ml)
KET0,5
KET4
KET
ktoconazole (0.5-4 g/ml)
ITR0,5
ITR4
ITR
itraconazole (0.5-4 g/ml)
FLU8
FLU64
FLU
fluconazole (8-64 g/ml)
T-
T-
T-
Negative control
LOT
AB8
MCZ8
Bio-Rad
AB2
MCZ0,5
Patient :
Ref. :
FUNGITEST
Diagram of the microplate
4- STORAGE
The reagents, stored at +2 - 8C, are stable until the expiry date
indicated on the kit.
5- MATERIAL REQUIRED NOT SUPPLIED
Sterile distilled water

20 l and 100 l micropipettes
Sterile cones
Opacity control 1 Mac Farland: code 56499
Incubator at 37C and 32C.
6- PROCEDURE
A. PREPARATION OF THE YEAST SUSPENSION
Use a pipette to take 2 similar colonies from a pure and fresh culture
obtained on Sabouraud medium with or without antibiotics and
introduce them into 3 ml of sterile distilled water in order to obtain a
first calibrated inoculum with an opacity equivalent to the Mac Farland
No. 1 standard, i.e 3 x 106 yeasts/ml.
PREPARATION OF THE INOCULUM
2 colonies isolated
100 l
Culture for 24 to 48 hours.

(Sabouraud medium ...)
1.9 ml of sterile distilled water
3 ml of sterile distilled water

Mac Farland 1 opacity 3 x 106 CFU/ml
INOCULATION
20 l
+
Positive controls
2 -- 32 5- fluorocytosine
2 - 8
100 l/well
3 ml of suspension medium
(103 CFU/ml)
amphotericin B
0.5 - 8
miconazole
0.5 - 4
ketoconazole
0.5 - 4
itraconazole
Bio-Rad
Date
PATIENT
8 - 64 fluconazole
-
Negative controls
Fungitest microplate
INCUBATION
48h at 37C
72h at 32C
(Cryptococci)
READING AND INTERPRETATION

e.g. Strain of C.krusei n4221
Date
Bio-Rad
PATIENT
INTERPRETATION
Positive controls
Strain inhibited by 5- fluorocytosine
Strain inhibited by amphotericin B
Strain intermediate to miconazole
Strain intermediate to ketoconazole
Strain intermediate to itraconazole
Strain non inhibited by fluconazole
Negative controls
Using a calibrated pipette, dilute 100 l of this inoculum in 1.9 ml of

sterile distilled water.
Inoculate 20 L of the dilution obtained in the suspension medium
supplied in the kit. The concentration of the inoculum is then equivalent
to 1 x 103 yeasts/ml.
B. INOCULATION OF THE MICROPLATE

Using a calibrated pipette, distribute 100 L of this suspension into
each well of the microplate.
Cover with the adhesive film.
C. INCUBATION OF THE MICROPLATE

Incubate : - at 32C for 72 h for Cryptococcus neoformans
- at 37C for 48 h for the other yeasts.
D.READING AND INTERPRETATION OF THE RESULTS

Only examine the plate when the positive control (T+) wells are pink.
Observe any colour change in the wells containing the antifungal
agent compared to the negative control wells (blue).
Interpret according to the colour of the 2 wells for each antifungal
agent:
- Blue-Blue =
no growth: strain inhibited by the antifungal agent in vitro
- Pink-Blue =
low growth: intermediate strain
growth: strain not inhibited by the antifungal agent in vitro.
- Pink-Pink =
7- PRECAUTIONS OF USE
Do not use reagents after the expiry date.
HYGIENE AND SECURITY RECOMMENDATIONS

The strains and reagents inoculated are potentially infectious; they must
be handled with the usual precautions and must be discarded according
to current rules of hygiene and regulations for this type of product.
8- QUALITY CONTROL OF THE TEST

FUNGITEST performances are controlled using following strains:
STRAINS
C.
C.
C.
C.
C.
C.
tropicalis ATCC 750

krusei ATCC 6258
albicans CIP 884.65
glabrata SDP A35
parapsilosis ATCC 22019
neoformans SDP B53*
T+
Pink
Pink
Pink
Pink
Pink
Pink
5FC
S
I
S
S
S
S/I
RESULT OF THE CULTURE

IN 48H AT 37C
AB MCZ KET ITRA
S/I
S
S
S
S/I
I
S/I
S/I
S/I
S
S
S
S
S/I
I
I/R
S
S/I
S
S
S
S/I
S/I
S/I
FLU
S
I
S
I/R
S
I/R
TBlue
Blue
Blue
Blue
Blue
Blue
* Incubation for 72H at 32C
9- QUALITY CONTROL OF THE MANUFACTURER

All manufactured reagents are prepared according to our Quality System,
starting from reception of raw material to the final commercialization of
the product. Each lot is submitted to quality control assessments and is
only released to the market, after conforming to pre-defined acceptance
criteria. The records relating to production and control of each single lot
are kept within Bio-Rad.
10- REFERENCES
See French version.
FUNGITEST
60780
10 TESTS
DTERMINATION DE LA SENSIBILIT DES LEVURES
AUX ANTIFONGIQUES
IVD
1- INTRT CLINIQUE
On constate ces dernires annes une recrudescence des infections fongiques
lie l'augmentation du nombre de sujets immunodprims (9).
Ceci est d principalement l'utilisation de chimiothrapies anticancreuses plus agressives, des traitements immunosuppresseurs plus
intenses chez les transplants, l'utilisation d'une antibiothrapie large
spectre (2, 3).
Cette recrudescence s'accompagne d'une augmentation du nombre
d'espces pathognes identifies (10) et d'mergence de rsistance pour
des espces antrieurement sensibles.
Dans ce nouveau contexte, tester in vitro la sensibilit des levures aux
antifongiques, peut tre un guide utile (1, 4, 7, 8). FUNGITEST rpond
ce besoin puisqu'il permet de dterminer la sensibilit des levures aux
antifongiques suivant une mthode standardise drive d'une mthode
de rfrence (5, 6) facile mettre en oeuvre et interprter.
2- PRINCIPE
FUNGITEST permet d'tudier, en milieu RPMI 1640 tamponn, modifi,
en prsence d'un indicateur d'oxydo-rduction, la croissance des levures
en prsence de 6 antifongiques 2 concentrations diffrentes.
L'apprciation de la croissance repose sur la rduction de l'indicateur
color qui entrane un virage du milieu du bleu au rose. Lorsque la croissance
est inhibe par l'antifongique, le milieu reste bleu.
Ce test prsent en microplaque de 16 cupules comprend :
2 cupules Tmoin de croissance
12 cupules contenant les antifongiques deshydrats (6 antifongiques
2 concentrations diffrentes)
2 cupules Tmoin ngatif
Un inoculum calibr de la souche tudier est dilu dans le "milieu de
suspension", puis rparti dans chaque cupule de la microplaque.
Les antifongiques prsents dans chaque cupule sont ainsi rhydrats par
le "milieu de suspension" ensemenc.
10
Les concentrations dantifongiques obtenues correspondent des

concentrations discriminantes, permettant de classer les souches en :
souches sensibles (S)
souches intermdiaires (I)
souches rsistantes (R)
Les concentrations critiques retenues ont t choisies daprs une tude de
rpartition des CMI des antifongiques obtenues sur des microplaques
prototypes mettant en uvre le mme mode opratoire que FUNGITEST.
Cette tude prliminaire a t mene dans 2 laboratoires experts, lUnit
de Mycologie de lInstitut Pasteur et le laboratoire dImmunologie de la
Facult de Pharmacie de Montpellier, et a port sur 193 souches
slectionnes afin de rassembler un effectif reprsentatif des souches
isoles en clinique, et comportant des souches rsistantes. Dans cette
tude, 8 dilutions des 6 antifongiques ont t testes, et la distribution de
leurs CMI a t obtenue. A partir des graphes de distribution, et des
donnes rcentes de la littrature, 2 concentrations ont t choisies pour
chaque antifongique dans la prsentation finale de la galerie
FUNGITEST.
En labsence actuelle de recommandations internationales permettant
linterprtation des CMI, les concentrations critiques retenues correspondent
un compromis et elles sont susceptibles lavenir dtre modifies :
dautres tudes sont ncessaires pour dfinir la correspondance entre les
rsultats obtenus in vitro et lefficacit thrapeutique obtenue.
11
3- PRSENTATION
FUNGITEST comprend :
Microplate : 10 microplaques de 16 cupules sous emballage individuel
(le schma des 16 cupules est reproduit sur une tiquette).
10 adhsifs
Suspension medium : 10 flacons contenant de 3 ml de milieu de
suspension
Chaque microplaque est conditionne sous sachet individuel en aluminium
avec un adhsif et un sachet deshydratant.
T+
T+
5FC2
5FC32
T+
Tmoins positifs
5 FC
5-Fluorocytosine (2-32 g/ml)
AB
Amphotricine B (2-8 g/ml)
MCZ
Miconazole (0,5-8 g/ml)
KET0,5
KET4
KET
Ktoconazole (0,5-4 g/ml)
ITR0,5
ITR4
FLU8
FLU64
T-
T-
LOT
AB8
MCZ8
Bio-Rad
AB2
MCZ0,5
Patient :
Ref. :
FUNGITEST
Schma de la microplaque
ITR
Itraconazole (0,5-4 g/ml)
FLU
T-
Fluconazole (8-64 g/ml)
Tmoins ngatifs
4- CONSERVATION
Les ractifs, conservs entre +2 - 8C, sont stables jusqu' la date de
premption indique sur le coffret.
5- MATRIEL NCESSAIRE NON FOURNI
12
Eau distille strile

Micropipettes de 20 et 100 l
Cnes striles
Opacity control 1 Mac Farland : code 56499
Etuve 37 et 32C
6- MODE OPRATOIRE
A. PRPARATION DE LA SUSPENSION DE LEVURES
A partir d'une culture pure et frache obtenue sur milieu de Sabouraud
avec ou sans antibiotique, prlever 2 colonies identiques l'aide
d'une pipette et les dcharger dans 3 ml d'eau distille strile afin
d'obtenir un premier inoculum calibr d'opacit quivalente au
standard n1 de Mac Farland (Opacity control 1 Mac Farland), soit
3 x 106 levures/ml.
PRPARATION DE LINOCULUM
100 l
2 colonies isoles
Culture de 24 48h.
(milieu de Sabouraud...)
1,9 ml deau distille strile
3 ml deau distille strile

opacit 1 Mac Farland 3 x 106 UCF/ml
INOCULATION
20 l
+
Tmoins positifs
2 -- 32 5- fluorocytosine
2 - 8
100 l/puits
3 ml de milieu de suspension
(103 UCF/ml)
amphotricine B
0,5 - 8
miconazole
0,5 - 4
ktoconazole
0,5 - 4
itraconazole
Bio-Rad
Date
PATIENT
8 - 64 fluconazole
-
Tmoins ngatifs
microplaque Fungitest
INCUBATION
48 h 37C
72h 32C
(Cryptocoques)
LECTURE ET INTERPRTATION
ex: souche de C.krusei n4221
Date
Bio-Rad
PATIENT
INTERPRTATION
Tmoins positifs
Souche inhibe par la 5- fluorocytosine
Souche inhibe par lamphotricine B
Souche intermdiaire au miconazole
Souche intermdiaire au ktoconazole
Souche intermdiaire litraconazole
Souche non inhibe par le fluconazole
Tmoins ngatifs
13
A l'aide d'une pipette calibre, diluer 100 l de cet inoculum dans 1,9 ml
d'eau distille strile .
Ensemencer 20 l de la dilution obtenue dans le milieu de suspension
fourni dans le coffret. La concentration de l'inoculum est alors
quivalente 1 x 103 levures/ml.
B. INOCULATION DE LA MICROPLAQUE
A l'aide d'une pipette calibre, rpartir 100 l de cette suspension
dans chaque cupule de la microplaque.
Recouvrir avec l'adhsif.
C. INCUBATION DE LA MICROPLAQUE
Incuber : - 32C pendant 72 h pour Cryptococcus neoformans
- 37C pendant 48 h pour les autres levures.
D.LECTURE ET INTERPRTATION DES RSULTATS

N'effectuer la lecture que si les cupules Tmoins de croissance (T+) sont
roses.
Observer l'ventuel virage de couleur dans les cupules contenant les
antifongiques par rapport aux cupules tmoin ngatif (bleu).
Interprter en fonction de la couleur des 2 cupules pour chaque
antifongique :
- Bleu-Bleu = absence de croissance : souche inhibe par l'antifongique
in vitro
- Rose-Bleu = faible croissance : souche intermdiaire
- Rose-Rose = croissance : souche non inhibe par l'antifongique in vitro.
7- PRCAUTIONS D'UTILISATION
Ne pas utiliser les ractifs au-del de la date de premption indique.
CONSIGNES D'HYGINE ET DE SCURIT

Les souches et les ractifs ensemencs sont potentiellement infectieux ; ils
doivent tre manipuls avec les prcautions d'usage et tre limins selon
les rgles d'hygine et la rglementation en vigueur pour ce type de
produit.
14
8- CONTRLE DE QUALIT DU TEST

Les performances de FUNGITEST sont contrls laide des souches
suivantes :
SOUCHES
C.
C.
C.
C.
C.
C.
T+
tropicalis ATCC 750
ROSE
krusei ATCC 6258
ROSE
albicans CIP 884.65
ROSE
glabrata SDP A35
ROSE
parapsilosis ATCC 22019 ROSE
neoformans SDP B53*
ROSE
RESULTAT DE LA CULTURE EN 48H 37C

5FC
AB MCZ KET ITRA FLU
S
S/I
S
S
S
S
I
S/I
I
S/I
S/I
I
S
S/I
S
S
S
S
S
S
S/I
I
I/R
I/R
S
S
S/I
S
S
S
S/I
S
S/I
S/I
S/I
I/R
TBLEU
BLEU
BLEU
BLEU
BLEU
BLEU
* Incubation pendant 72H 32C
9- CONTRLE QUALIT DU FABRICANT

Tous les produits fabriqus et commercialiss par la socit Bio-Rad sont
placs sous un systme d'assurance qualit de la rception des matires
premires jusqu' la commercialisation des produits finis. Chaque lot de
produit fini fait l'objet d'un contrle de qualit et n'est commercialis que
s'il est conforme aux critres d'acceptation. La documentation relative
la production et au contrle de chaque lot est conserve par le fabricant.
15
10- RFRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

1. ANAISSIE ELIAS J, KARYOTAKIS NICHOLAS C, HACHEM RAY, DIGNANI
MARIA C., REX JOHN H., AND PAETZNICK VICTOR. Correlation between
In Vitro and In Vivo Activity of Antifungal Agents against Candida Species.
The Journal of Infection Diseases 1994 ; 170 : 384-389.
2. BERENGUER J, FERNANDEZ-BACA V , SANCHEZ R, BOUZA E. In Vitro
Activity of Amphotericin B, Flucytosine and Fluconazole against Yeasts
Causing Bloodstream Infections. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1995 ;
14 : 362-365.
3. DROMER F, DUPONT B. The increasing problem of fungal infections in the
immunocompromised host. J. Mycol. Md. 1996 ; 6, Suppl. I : 1-6.
4. ESPINEL-INGROFF A, PFALLER MA. Antifungal agents and susceptibility
testing. In MURRAY PR, BARON EJ, PFALLER MA, TENOVER FC, YOLKEN
RH, eds. Manual of Clinical Microbiology, 6th ed. Washington, DC :
American Society for Microbiology, 1995.
5. ESPINEL-INGROFF A, RODRIGUEZ-TUDELA JL, and MARTINEZ-SUAREZ JV.
Comparison of Two Alternative Microdilution Procedures with the National
Committee for Clinical Laboratory Standards Reference Macrodilution
Method M27-P for In Vitro Testing of Fluconazole-Resistant and -Susceptible
Isolates of Candida albicans. J. Clin. Microbiol. 1995 ; 33 : 3154-3158.
6. NCCLS. Antifungal Susceptibility Testing; Committee Report. NCCLS
document M27-T. NCCLS, 771 East Lancaster Avenue, Villanova,
Pennsylvania. October 1995.
7. PAUGAM A. Intrt de l'tude in vitro de la sensibilit des levures aux
antifongiques. Revue franaise des laboratoires. 1996 ; 282 : 157-159.
8. PFALLER MA, BUSCHELMAN B, BALE MJ, et al. Multicenter comparison of a
colorimetric microdilution broth method with the reference macrodilution
method for in vitro susceptibility testing of yeast isolates. Diagn Microbiol
Infect Dis. 1994 ; 19 : 9-13. 4
9. WALSH TJ, GONZALEZ C, ROILIDES E, MUELLER BU, ALI NASR, LEWIS LL,
WHITCOMB TO, MARSHALL DJ, and PIZZO PA. Fungemia in Children
Infected with the Human Immunodeficiency Virus : New Epidemiologic
Patterns, Emerging Pathogens, and Improved Outcome with Antifungal
Therapy. Clin. Infect. Dis. 1995 ; 20 : 900-906.
10. WINGARD JR. Importance of Candida Species Other than C. albicans as
Pathogens in Oncology Patients. Clin. Infect. Dis. 1995 ; 20 : 115-125.
16
FUNGITEST
10 PRUEBAS
60780
DETERMINACION DE LA SENSIBILIDAD DE LOS

HONGOS A LOS AGENTES ANTIFUNGICOS
IVD
1- INTERES CLINICO
En los ltimos aos se ha observado un nuevo brote de infecciones por
hongos, y ello debido al aumento del nmero de individuos
inmunodeficientes (9).
Esto se debe principalmente al uso de quimioterapias anticancerosas ms
potentes, a tratamientos inmunosupresores ms intensivos en receptores
de trasplantes y al uso de antibiticos de amplio espectro (2, 3).
Este brote se acompaa de un aumento del nmero de especies
patgenas identificadas (10) y de la aparicin de resistencia en las
especias previamente conocidas.
En este nuevo contexto puede ser de utilidad una prueba in vitro de la
sensibilidad de los hongos a los agentes antimicticos (1, 4, 7, 8).
FUNGITEST logra este objetivo, ya que permite la determinacin de la
sensibilidad de los hongos a los agentes antimicticos segn un mtodo
estandarizado derivado de un mtodo de referencia (5, 6), fcil de llevar
a cabo y de interpretar.
2- PRINCIPIO
FUNGITEST se usa para estudiar el crecimiento de hongos en presencia
de 6 agentes antimicticos a 2 diferentes concentraciones, en un medio
tamponado RPMI 1640 modificado, en presencia de un indicador de
oxidorreduccin.
La verificacin del crecimiento se basa en la reduccin del indicador de
color, que hace pasar el medio desde el color azul al rosa. Cuando el agente
antimictico inhibe el crecimiento, el medio permanece de color azul.
Esta prueba, que se lleva a cabo en una microplaca de 16 pocillos,
consiste en:
2 pocillos para el control del crecimiento
12 pocillos que contienen los agentes antimicticos deshidratados (6
agentes antimicticos a 2 concentraciones diferentes)
2 pocillos para el control negativo
Un inculo calibrado de la cepa que se va a someter a prueba se diluye
en el medio de suspensin y luego se distribuye en cada uno de los
pocillos de la microplaca.
18
El medio de suspensin inoculado vuelve a hidratar los agentes

antimicticos presentes en cada pocillo.
Las concentraciones antimicticas obtenidas corresponden a
concentraciones discriminadoras, que permiten la clasificacin de las
cepas en:
cepas sensibles (S)
cepas intermedias (I)
cepas resistentes (R)
Los umbrales de discriminacin han sido escogidos de acuerdo con el
estudio de la distribucin de los agentes antimicticos M.I.C. obtenidos
con microplacas prototipos utilizadas con el mismo procedimiento que el
Fungitest.
Este estudio preliminar fue llevado a cabo en dos laboratorios de
referencia, la Unidad de Micologa del Instituto Pasteur de Pars y el
Laboratorio de Inmunologa de la Facultad de Farmacia de Montpellier;
se seleccionaron 193 cepas para que fuesen representativas de cepas
aisladas en la prctica mdica corriente, con la inclusin de cepas
resistentes. En dicho estudio, 8 diluciones de 6 frmacos antimicticos
fueron sometidas a prueba y se obtuvo la distribucin de los M.I.C.
resultantes obtenidos. Sobre la base de las grficas de distribucin y de
los datos de la literatura mdica reciente se seleccionaron 2
concentraciones para cada frmaco antimictico para la presentacin
final de la galera.
Ante la ausencia de recomendaciones internacionales actuales que den
una interpretacin de los M.I.C., los umbrales de discriminacin
constituyen un compromiso y podran ser modificados en el futuro: se
necesitan otros estudios que definan la correspondencia entre los
resultados obtenidos in vitro y su importancia clnica.
19
3- COMPOSICION DEL ESTUCHE

FUNGITEST incluye:
Microplate : 10 microplacas individualmente envasadas de 16 pocillos
(el diagrama de la microplaca est indicado en la etiqueta).
10 pelculas adhesivas
Suspension medium : 10 frascos que contienen 3 ml de medio de
suspensin listo para su uso
Cada microplaca est individualmente envasada en una bolsa de
aluminio precintada con una pelcula adhesiva y un deshumidificador.
5 FC
5- fluorocitosina (2-32 g/ml)
AB
amfotericina B (2-8 g/ml)
MCZ8
MCZ
miconazol (0,5-8 g/ml)
KET0,5
KET4
KET
ketoconazol (0,5-4 g/ml)
ITR0,5
ITR4
ITR
itraconazol (0,5-4 g/ml)
FLU8
FLU64
T-
T-
FLU
fluconazol (8-64 g/ml)
T-
Control negativo
5FC2
5FC32
AB2
AB8
MCZ0,5
LOT
Control positivo
T+
Bio-Rad
T+
T+
Patient :
Ref. :
FUNGITEST
Diagrama de la microplaca
4- CONSERVACION
Los reactivos, conservados a +2 8C, son estables hasta la fecha de
caducidad indicada en el estuche.
5- MATERIAL REQUERIDO, PERO NO INCLUIDO
20
Micropipetas de 20 l y 100 l
Micropipetas de 20 l y 100 l
Conos estriles
Opacity control 1 Mac Farland: cdigo 56499
Incubadora a 37C y 32C.
6- PROCEDIMIENTO
A) PREPARACION DE LA SUSPENSION DE HONGOS
Se utiliza una pipeta para tomar 2 colonias similares de un cultivo puro
y fresco obtenido en un medio de Sabouraud con o sin antibiticos y se
introducen en 3 ml de agua destilada estril con vistas a obtener un
primer inculo calibrado con un equivalente de opacidad con el
estndar Mac Farland n 1 (Opacity control 1 Mac Farland), por
ejemplo, 3 x 106 hongos/ml.
PREPARACIN DEL INOCUL
100 l
2 colonias aisladas
Cultivo de 24 a 48h.
(medio de Sabouraud...)
1,9 ml de agua destilada estril
3 ml de agua destilada estril

opacidad 1 Mac Farland 3 x 106 CFU/ml
INOCULACIN
20 l
+
Testigos positivos
2 -- 32 5- fluorocitosina
2 - 8
100 l/pocillo
3 ml de medio de suspensin
(103 CFU/ml)
anfotericina B
0,5 - 8
miconazol
0,5 - 4
ketoconazol
0,5 - 4
itraconazol
Date
Bio-Rad
PATIENT
8 - 64 fluconazol
-
Testigos negativos
microplaca Fungitest
INCUBACIN
48h a 37C
72h a 32C
(Criptococos)
LECTURA E INTERPRETACIN
por ejemplo : cepa de C.krusei n4221
Date
Bio-Rad
PATIENT
INTERPRETACIN
Testigos positivos
Cepa inhibida por la 5- fluorocitosina
Cepa inhibida por la anfotericina B
Cepa intermedia al miconazol
Cepa intermedia al ketoconazol
Cepa intermedia al itraconazol
Cepa no inhibida por el fluconazol
Testigos negativos
21
Con una pipeta calibrada se diluyen 100 l de este inculo en 1,9 ml

de agua destilada esterilizada.
Se inoculan 20 ml de la dilucin obtenida en el medio de suspensin
incluido en el estuche. La concentracin del inculo es ahora
equivalente a 1 x 103 hongos/ml.
B) INOCULACION DE LA MICROPLACA
Con una pipeta calibrada se distribuyen 100 l de esta suspensin en
cada pocillo de la microplaca.
Se cubre con la pelcula adhesiva.
C) INCUBACION DE LA MICROPLACA
Se incuba :
- a 32 C durante 72 h para Cryptococcus neoformans

- a 37 C durante 48 h para los dems hongos.
D) LECTURA E INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

Slo se examinar la placa cuando los pocillos del control positivo
(T+) sean de color rosa.
Se observar cualquier cambio de color en los pocillos que contienen
el agente antimictico, en comparacin con los pocillos negativos de
control (de color azul).
Se interpretar de acuerdo con el color de los 2 pocillos de cada
agente antimictico:
- Azul-Azul = ausencia de crecimiento: cepa inhibida por el agente
antimictico in vitro
- Rosa-Azul = crecimiento lento: cepa intermedia
- Rosa-Rosa = crecimiento: cepa no inhibida por el agente
antimictico in vitro.
7- PRECAUCIONES DE USO
No se deben usar los reactivos despus de la fecha de caducidad.
RECOMENDACIONES DE HIGIENE Y SEGURIDAD

Las cepas y los reactivos inoculados son potencialmente infecciosos; se
deben manipular con las precauciones habituales y se deben desechar
de acuerdo con los reglamentos actuales de higiene y seguridad para
este tipo de productos.
22
8- CONTROL DE CALIDAD DE LA PRUEBA

Los resultados de FUNGITEST se controlan utilizando las siguientes
cepas:
CEPAS
T+
C.tropicalis ATCC 750
C.krusei ATCC 6258
C.albicans CIP 884.65
C.glabrata SDP A35
C.parapsilosis ATCC 22019
C.neoformans SDP B53*
Rosa
Rosa
Rosa
Rosa
Rosa
Rosa
RESULTADO DEL CULTIVO

A LAS 48 HORAS A 37 C
5FC AB MCZ KET ITRA FLU
S
I
S
S
S
S/I
S/I
S/I
S/I
S
S
S
S
I
S
S/I
S/I
S/I
S
S/I
S
I
S
S/I
S
S/I
S
I/R
S
S/I
S
I
S
I/R
S
I/R
TAzul
Azul
Azul
Azul
Azul
Azul
* Incubacin durante 72 horas a 32 C
9- CONTROL DE CALIDAD DEL FABRICANTE

Todos los reactivos han sido fabricados de acuerdo con nuestro Sistema
de Calidad, desde la recepcin de las materias primas hasta la
comercializacin final del producto. Cada lote se somete a verificaciones
de control de calidad y nicamente se comercializa en el mercado
cuando est conforme con criterios predefinidos de aceptacin. Los
informes relativos a la produccin y el control de cada lote individual se
conservan en Bio-Rad.
10- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Ver la versin Francesa.
23
24
FUNGITEST
10 TESTS
60780
BESTIMMUNG DER SENSITIVITT VON HEFEN

GEGENBER ANTIMYKOTIKA
IVD
1- KLINISCHE BEDEUTUNG
In den letzten Jahren ist ein neuerlicher Ausbruch von Pilzinfektionen in
Verbindung mit der steigenden Zahl an Immungeschwchten beobachtet
worden (9).
Dieses Phnomen ist hauptschlich auf aggressive Chemotherapien
gegen Krebs, intensivere Immunsuppressionsbehandlungen bei
Transplantatempfngern und auf die Verwendung von
Breitbandantiobiotika zurckzufhren (2, 3).
Dieser Ausbruch geht mit einer steigenden Anzahl an identifizierten
Erregern (10) und dem Auftreten von Resistenzen gegenber zuvor
empfindlichen Spezies einher.
In diesem Zusammenhang ist ein in-vitro-Test fr die Empfindlichkeit von
Hefen gegenber Antimykotika sehr ntzlich (1, 4, 7, 8). FUNGITEST
entspricht diesen Anforderungen und ermglicht die Bestimmung der
Empfindlichkeit von Hefen gegenber Antimykotika gem einer
standardisierten Methode, die von einer Referenzmethode (5, 6)
abgeleitet wurde und leicht durchzufhren und zu interpretieren ist.
2- PRINZIP
FUNGITEST wird zur Analyse des Wachstums von Hefen in Gegenwart
von 6 Antimykotika in zwei unterschiedlichen Konzentrationen in
gendertem, gepuffertem RPMI 1640-Medium in Anwesenheit von RedoxIndikator verwendet.
Die Untersuchung des Wachstums basiert auf der Reduktion von
Farbindikator, der das Medium von blau in pink verfrbt. Wird das
Wachstum durch das Antimykotikum gehemmt, bleibt das Medium blau.
Der Test in Form einer Mikrotiterplatte 16 Vertiefungen besteht aus:
2 Vertiefungen mit Wachstumskontrolle
12 Vertiefungen mit dehydrierten Antimykotika (6 Antimykotika in 2
unterschiedlichen Konzentrationen)
2 Vertiefungen mit negativer Kontrolle
Ein kalibriertes Inokulum des Teststammes wird mit dem
"Suspensionsmedium" verdnnt und anschlieend in alle Vertiefungen der
Mikrotiterplatte gegeben.
26
Die in den Vertiefungen vorhandenen Antimykotika werden so durch das

beimpfte "Suspensionsmedium" rehydriert.
Die erhaltenen Antimykotika-Konzentrationen entsprechen
unterschiedlichen Konzentrationen, die eine Klassifizierung der Stmme
ermglicht in:
empfindliche Stmme (S)
mig empfindliche Stmme (I)
resistente Stmme (R)
Die Angriffspunkte wurden nach der Verteilungsstudie der MHKs der
Antimykotika, die mit Mikrotiterplattenprototypen mit dem gleichen
Verfahren wie Fungitest erzielt wurden, ausgewhlt.
Die vorlufige Studie wurde in 2 Referenzlabors, der Unit de
Mycologie des Pasteur-Instituts in Paris und dem immunologischen Labor
der Facult de Pharmacie in Montpellier durchgefhrt; 193 Stmme
wurden als reprsentative, in der Routinepraxis isolierte Stmme,
einschlielich resistenter Stmme, ausgewhlt. In dieser Studie wurden 8
Verdnnungen von 6 Antimykotika getestet und die Verteilung der
gemessenen MHKs erzielt. Auf der Grundlage dieser Verteilungstabellen
und neuerer Literatur wurden 2 Konzentrationen fr jedes Antimykotikum
fr die endgltige Form des Tests ausgewhlt.
Aufgrund des Fehlens aktueller internationaler Empfehlungen fr eine
Interpretation der MHKs sind diese ausgewhlten Angriffspunkte ein
Kompromiss, und sie knnten in der Zukunft gendert werden: Weitere
Studien sind fr die Definition der bereinstimmung zwischen den in-vitro
erzielten Ergebnissen und ihrer klinischen Bedeutung erforderlich.
27
3- ZUSAMMENSETZUNG DES KITS

FUNGITEST umfasst:
Microplate : 10 einzeln verpackte Mikrotiterplatten 16 Vertiefungen
(ein Schema der Mikrotiterplatte ist auf dem Etikett abgebildet).
10 Klebestreifen.
Suspension medium : 10 Flschchen 3 ml gebrauchsfertiges
Suspensionsmedium
Jede Mikrotiterplatte ist einzeln in einem versiegelten Aluminiumbeutel mit
Klebefolie und Trockenmittel verpackt.
5FC2
5FC32
AB2
AB8
MCZ0,5
MCZ8
KET0,5
KET4
ITR0,5
ITR4
FLU8
FLU64
T-
T-
LOT
T+
Bio-Rad
T+
Patient :
Ref. :
FUNGITEST
Schema der Mikrotiterplatte

T+
Positive Kontrolle
5 FC
5-Fluorocytosin (2-32 g/ml)
AB
Amphotericin B (2-8 g/ml)
MCZ
Miconazol (0.5-8 g/ml)
KET
Ketoconazol (0.5-4 g/ml)
ITR
Itraconazol (0.5-4 g/ml)
FLU
Fluconazol (8-64 g/ml)
T-
Negative Kontrolle
4- LAGERUNG
Die Reagenzien sind bei +2-8C bis zu dem auf der Packung
angegebenen Verfallsdatum haltbar.
5- ZUSTZLICH BENTIGTE MATERIALIEN
28
Steriles destilliertes Wasser

Mikropipetten fr 20 l und 100 l
Sterile Konen
Opacity control 1 Mac Farland: Kat.-Nr. 56499
Inkubator bei 37C und 32C.
6- TESTVERFAHREN
A) VORBEREITUNG DER HEFESUSPENSION
Mit einer Pipette 2 hnliche Kolonien einer reinen, frischen Kultur auf
Sabouraud-Medium mit oder ohne Antibiotika entnehmen und in 3 ml
steriles, destilliertes Wasser geben, um ein erstes kalibriertes Inokulum
mit einer Trbung zu erhalten, die der des Mac Farland Nr. 1-Standards
(Opacity control 1 Mac Farland), d.h. circa 3 x 106 Hefen/ml entspricht.
HERSTELLUNG DES INOKULUMS
2 isolierte Kolonien
100 l
24 bis 48 Stunden Wachstum

(Sabouraud-Nhrmedium...)
1.9 ml steriles distilliertes Wasser
3 ml steriles distilliertes Wasser

Trbung 1 Mac Farland 3 x 106 KBE/ml
BEIMPFUNG
20 l
+
Positive Vergleichslsungen
2 -- 32 5- Fluorocytosin
2 - 8
100 l/Vertiefung
3 ml Suspensionsmedium
(103 KBE/ml)
Amphotericin B
0.5 - 8
Miconazol
0.5 - 4
Ketoconazol
0.5 - 4
Itraconazol
Bio-Rad
Date
PATIENT
8 - 64 Fluconazol
-
Negative Vergleichslsungen
Mikroplatte Fungitest
BEBRTUNG
48 h bei 37C
72h bei 32C
(Kryptokokken)
ABLESUNG UND AUSWERTUNG

z.B.:C.krusei-Stramm Nr.4221
Date
Bio-Rad
PATIENT
AUSWERTUNG
Positive Vergleichslsungen
Durch 5- Fluorocytosin gehemmter Stamm
Durch Amphotericin B gehemmter Stamm
Durch Miconazol intermedirer Stamm
Durch Ketoconazol intermedirer Stamm
Durch Itraconazol intermedirer Stamm
Nicht Durch Fluconazol gehemmter Stamm
Negative Vergleichslsungen
29
Mit einer kalibrierten Pipette 100 l Inokulum in 1,9 ml sterilem,

destilliertem Wasser verdnnen.
Mit 20 l der im Suspensionsmedium des Kits erhaltenen Verdnnung
beimpfen. Die Konzentration des Inokulums entspricht circa 1 x 103
Hefen/ml.
B) BEIMPFUNG DER MIKROTITERPLATTE

Mit einer kalibrierten Pipette 100 l dieser Suspension in jede
Vertiefung der Mikrotiterplatte geben.
Mit Klebefolie abdecken.
C) INKUBATION DER MIKROTITERPLATTE

Inkubieren:
- bei 32C ber 72 Stunden fr Cryptococcus neoformans

- bei 37C ber 48 Stunden fr andere Hefen.
D) ABLESEN UND INTERPRETATION DER ERGEBNISSE

Die Platte nur dann untersuchen, wenn die Vertiefungen der positiven
Kontrolle (T+) pinkfarben sind.
Jegliche Farbnderung in den Vertiefungen mit Antimykotika im
Vergleich zu den Vertiefungen mit negativer Kontrolle (blau)
beobachten.
Gem der Farbe der 2 Vertiefungen fr jedes Antimykotikum wie folgt
interpretieren:
- blau-blau = kein Wachstum: durch das Mykotikum in-vitro
gehemmter Stamm
- pink-blau = geringes Wachstum: mig resistenter Stamm
- pink-pink =
Wachstum: nicht durch das Mykotikum in-vitro
gehemmter Stamm
7- VORSICHTSMASSNAHMEN BEI DER VERWENDUNG

Die Reagenzien nach Ablauf des Verfallsdatums nicht mehr verwenden.
HYGIENE- UND SICHERHEITSEMPFEHLUNGEN

Die Stmme und beimpften Reagenzien sind potentiell infektis. Sie
mssen daher mit der blichen Vorsicht gehandhabt
und gem den gltigen Hygienvorschriften und Regelungen fr diese Art
von Produkten entsorgt werden.
30
8- QUALITTSKONTROLLE DES TESTS

Die Leistungsmerkmale von FUNGITEST werden mit folgenden Stmmen
kontrolliert:
STMME

C.krusei ATCC 6258
C.glabrata SDP A35
ERGEBNIS DER KULTUR

NACH 48 Studen bei 37C
T+
Pink
Pink
Pink
Pink
Pink
Pink
5FC
S
I
S
S
S
S/I
AB
S/I
S/I
S/I
S
S
S
MCZ
S
I
S
S/I
S/I
S/I
KET
S
S/I
S
I
S
S/I
ITRA
S
S/I
S
I/R
S
S/I
FLU
S
I
S
I/R
S
I/R
TBlau
Blau
Blau
Blau
Blau
Blau
* Inkubation ber 72 Stunden bei 32C
31
9- QUALITTSKONTROLLE DES HERSTELLERS

Alle von der Firma Bio-Rad hergestellten Reagenzien unterliegen einem
Qualittssicherungssystem vom Rohstoffeingang bis zur Vermarktung der
Fertigprodukte. Jede Fertigproduktcharge wird einer Qualittskontrolle
unterzogen und nur dann verkauft, wenn sie den Freigabekriterien
entspricht. Die Unterlagen bezglich Herstellung und Kontrolle der
einzelnen Chargen werden bei Bio-Rad aufbewahrt.
10- LITERATUR
Siehe Franzsische version.
32
FUNGITEST
10 TEST
60780
DETERMINAZIONE DELLA SENSIBILIT DEI LIEVITI

AD AGENTI ANTIFUNGINI
IVD
1- INTERESSE CLINICO
Negli ultimi anni stata osservata una nuova diffusione di infezioni
fungine, correlata allaumento del numero di soggetti immunodepressi (9).
Questo dovuto principalmente alluso di chemioterapia anticancro pi
aggressiva, trattamenti immunosoppressivi pi intensi in soggetti
sottoposti a un trapianto e alluso di antibiotici ad ampio spettro (2, 3).
Questa diffusione accompagnata da un incremento nel numero di
specie patogene identificate (10) e linsorgenza di resistenza per specie
precedentemente sensibili.
Un test in vitro sulla sensibilit dei lieviti ad agenti antifungini pu essere
utile in questo nuovo contesto (1, 4, 7, 8). FUNGITEST raggiunge questo
obiettivo, poich consente di determinare la sensibilit dei lieviti ad
agenti antifungini in base a un metodo standardizzato derivato da un
metodo di riferimento (5, 6), facile da effettuare e da interpretare.
2- PRINCIPIO
FUNGITEST usato per studiare la crescita dei lieviti in presenza di 6
agenti antifungini a 2 differenti concentrazioni, in mezzo tamponato
modificato RPMI 1640, in presenza di un indicatore redox.
La valutazione della crescita basata sulla riduzione dellindicatore
colorato che cambia il mezzo da blu a rosa. Quando la crescita inibita
dallagente antifungino, il mezzo rimane blu.
Questo test, presentato sotto forma di una micropiastra a 16-pozzetti,
consiste in:
2 pozzetti di controllo della crescita
12 pozzetti contenenti gli agenti antifungini disidratati (6 agenti
antifungini a 2 differenti concentrazioni)
2 pozzetti di controllo negativo
Un inoculo calibrato del ceppo del test diluito nel "mezzo di
sospensione", poi distribuito in ciascun pozzetto della micropiastra.
Gli agenti antifungini presenti in ciascun pozzetto sono perci reidratati
mediante il "mezzo di sospensione" inoculato.
34
Le concentrazioni antifungine ottenute corrispondono a concentrazioni

discriminanti, che consentono la classificazione dei ceppi in:
ceppi sensibili (S)
ceppi intermedi (I)
ceppi resistenti (R)
I breakpoint sono stati scelti seguendo lo studio della distribuzione degli
agenti antifungini. La M.I.C. ottenuta con micropiastre prototipo usate
seguendo la stessa procedura di Fungitest.
Questo studio preliminare stato effettuato in 2 Laboratori di riferimento,
lUnit de Mycologie dellInstitut Pasteur di Parigi, e il Laboratorio di
Immunologia della Facult de Pharmacie di Montpellier; 193 ceppi
sono stati selezionati per rappresentare ceppi isolati nella pratica di
routine, e includevano ceppi resistenti. In quello studio, sono state testate
8 diluizioni di 6 farmaci antifungini, e la distribuzione della M.I.C
risultante stata ottenuta. In base ai grafici di distribuzione, e ai dati di
letteratura recenti, sono state selezionate 2 concentrazioni per ciascun
farmaco antifungino per la definizione finale della galleria.
In assenza di attuali indicazioni internazionali che forniscano
uninterpretazione della M.I.C., i breakpoint selezionati costituiscono un
compromesso, e potrebbero essere modificati in futuro : altri studi per
definire la corrispondenza tra i risultati ottenuti in vitro, e la loro rilevanza
clinica.
35
3- COMPOSIZIONE DEL KIT

FUNGITEST include:
Microplate : 10 micropiastre a 16-pozzetti confezionate singolarmente
(il diagramma della micropiastra indicato di seguito).
10 film adesivi
Suspension medium : 10 flaconi contenenti 3 ml di mezzo di
sospensione pronto alluso
Ciascuna micropiastra singolarmente confezionata in un sacchetto di
alluminio sigillato, con un film adesivo e un essiccante.
5FC2
5FC32
AB2
AB8
MCZ0,5
MCZ8
KET0,5
KET4
ITR0,5
ITR4
FLU8
FLU64
T-
T-
LOT
T+
Bio-Rad
T+
Patient :
Ref. :
FUNGITEST
Diagramma della micropiastra

T+
Controllo positivo
5 FC
AB
amfotericina B (2-8 g/ml)
MCZ
miconazolo (0,5-8 g/ml)
KET
ketoconazolo (0,5-4 g/ml)
ITR
itraconazolo (0,5-4 g/ml)
FLU
fluconazolo (8-64 g/ml)
T-
Controllo negativo
4- CONSERVAZIONE
I reagenti, conservati a +2 - 8C, sono stabili fino alla data di scadenza
indicata sul kit.
5- MATERIALE NECESSARIO, MA NON FORNITO
36
Acqua distillata sterile

Micropipette da 20 l e 100 l
Puntali Sterili
Opacity control 1 Mac Farland: codice 56499
Incubatore a 37C e 32C.
6- PROCEDURA
A) PREPARAZIONE DELLA SOSPENSIONE DEL LIEVITO
Usare una pipetta per raccogliere 2 colonie simili da una coltura
nuova e pura ottenuta su un mezzo Sabouraud con o senza antibiotici
e introdurle in 3 ml di acqua distillata sterile per ottenere un primo
inoculo calibrato con unopacit equivalente allo standard Mac
Farland N 1 (Opacity control 1 Mac Farland), i.e 3 x 106 lieviti/ml.
PREPARAZIONE DELLINOCULO
100 l
2 colonie isolate
Coltura da 24 a 48ore.
(terreno di Sabouraud...)
1,9 ml daqua distillata sterile
3 ml daqua distillata sterile

opacit 1 Mac Farland 3 x 106 CFU/ml
INOCULAZIONE
20 l
+
Controlli positivi
2 -- 32 5- fluorocitosina
2 - 8
100 l/pozzetti
3 ml di mezzo di sospensione
(103 CFU/ml)
amfotericina B
0,5 - 8
miconazolo
0,5 - 4
chetoconazolo
0,5 - 4
itraconazolo
Date
Bio-Rad
PATIENT
8 - 64 fluconazolo
-
Controlli negativi
micropiastra Fungitest
INCUBAZIONE
48 ore a 37C
72h ore a 32C
(Criptococchi)
LETTURA ED INTERPRETAZIONE
es : ceppo di C.krusei n4221
Date
Bio-Rad
PATIENT
INTERPRETAZIONE
Controlli positivi
Ceppo inibito dalla 5- fluorocitosina
Ceppo inibito dallamfotericina B
Ceppo intermedio con il miconazolo
Ceppo intermedio con il chetoconazolo
Ceppo intermedio con il itraconazolo
Cepa no inibito dallo fluconazolo
Controlli negativi
37
Usando una pipetta calibrata, diluire 100 l di questo inoculo in 1,9

ml di acqua distillata sterile.
Inoculare 20 L della diluizione ottenuta nel mezzo di sospensione
fornito nel kit. La concentrazione dellinoculo allora equivalente a
1 x 103 lieviti/ml.
B) INOCULO DELLA MICROPIASTRA

Usando una pipetta calibrata, distribuire 100 L di questa sospensione
in ciascun pozzetto della micropiastra.
Coprire con il film adesivo.
C) INCUBAZIONE DELLA MICROPIASTRA

Incubare :
- a 32C per 72 h per Cryptococcus neoformans

- a 37C per 48 h per gli altri lieviti.
D) LETTURA E INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI

Esaminare la piastra solo quando i pozzetti di controllo positivo (T+)
sono rosa.
Osservare qualsiasi cambiamento di colore nei pozzetti contenenti
lagente antifungino rispetto ai pozzetti di controllo negativo (blu).
Interpretare in base al colore dei 2 pozzetti per ciascun agente
antifungino:
- Blu-Blu =
nessuna crescita: ceppo inibito dallagente antifungino
in vitro
- Rosa-Blu = crescita ridotta: ceppo intermedio
- Rosa-Rosa = crescita: ceppo non inibito dallagente antifungino in
vitro.
7- PRECAUZIONI DUSO
Non usare reagenti successivamente alla data di scadenza.
RACCOMANDAZIONI PER LIGIENE E LA SICUREZZA

I ceppi e i reagenti inoculati sono potenzialmente infettivi; devono essere
manipolati con le usuali precauzioni e devono essere smaltiti secondo le
attuali norme di igiene e disposizioni per questo tipo di prodotto.
38
8- CONTROLLO DI QUALIT DEL TEST

Le prestazioni di FUNGITEST sono controllate usando i ceppi seguenti:
CEPPI

C.krusei ATCC 6258
C.glabrata SDP A35
RISULTATO DELLA COLTURA

IN 48 ore a 37C
T+
5FC
AB
Rosa
Rosa
Rosa
Rosa
Rosa
Pink
S
I
S
S
S
S/I
S/I
S/I
S/I
S
S
S
MCZ KET ITRA FLU

S
I
S
S/I
S/I
S/I
S
S/I
S
I
S
S/I
S
S/I
S
I/R
S
S/I
S
I
S
I/R
S
I/R
TBlu
Blu
Blu
Blu
Blu
Blue
* Incubazione per 72 ore 32C
9- CONTROLLO DI QUALIT DEL PRODUTTORE

Tutti i reagenti realizzati sono preparati in base al nostro Sistema di
Assicurazione di Qualit dal ricevimento delle materie prime, alla
commercializzazione finale del prodotto Ciascun lotto di prodotto finito
sottoposto a un controllo di qualit e viene messo in commercio soltanto
se risulta conforme ai criteri di approvazione predefiniti. La
documentazione relativa alla produzione e al controllo di ciascun singolo
lotto conservata presso Bio-Rad.
10- BIBLIOGRAFIA
Vedere la versione Francese.
39
40
FUNGITEST
10 TESTES
DETERMINACO DA SENSIBILIDADE DAS
LEVEDURAS A AGENTES ANTIGUNFICOS
IVD
60780
1- INTERESSE CLINICO
Nos ltimos anos tem-se assistido ao aparecimento renovado de
infeces a fungos, relacionadas com o nmero crescente de indivduos
imunodeprimidos (9).
Tal situao deve-se, essencialmente, ao uso de uma quimioterapia anticancergena mais agressiva, a tratamentos imunosupressivos mais
intensos em receptores transplantados e ao uso de antibiticos de largo
espectro (2, 3).
Este recrudescimento acompanhado de um aumento no nmero de
espcies patognicas identificadas (10) e do emergir da resistncia a
espcies anteriormente sensveis.
Um teste in vitro sensibilidade das leveduras a agentes antifngicos
pode ser utilizado neste novo contexto (1, 4, 7, 8). FUNGITEST satisfaz
este objectivo, dado permitir a determinao da sensibilidade das
leveduras a agentes antifngicos, de acordo com um mtodo
estandardizado derivado de um mtodo de referncia (5, 6), de fcil
execuo e interpretao.
2- PRINCIPIO
FUNGITEST utilizado no estudo do crescimento de leveduras, na
presena de 6 agentes antifngicos a duas concentraes diferentes, em
meio de tampo RPMI 1640 modificado, na presena de um indicador
redox.
A determinao do crescimento baseia-se na reduo do indicador de
colorao, que modifica o meio, de azul para rosa. Quando o
crescimento inibido pelo agente antifngico, o meio mantm-se azul.
Este teste, apresentado sob a forma de uma microplaca de 16 poos,
consiste em:
2 poos de controlo de crescimento
12 poos contendo os agentes antifngicos desidratados (6 agentes
antifngicos a duas concentraes diferentes)
2 poos de controlo negativos
Um inoculado calibrado da estirpe a testar diludo no "meio de
suspenso" e, em seguida, distribudo em cada poo da microplaca.
Os agentes antifngicos presentes em cada poo so assim re-hidratados
pelo "meio de suspenso" inoculado.
42
As concentraes antifngicas obtidas correspondem a concentraes de

discriminao, o que permite a classificao das estirpes em:
estirpes sensveis(S)
estirpes intermdias (I)
estirpes resistentes (R)
Os pontos de ruptura foram seleccionados no seguimento do estudo de
distribuio dos agentes antifngicos M.I.C.s obtidos com microplacas
de prottipo utilizadas segundo um procedimento idntico ao de
Fungitest.
Este estudo preliminar foi efectuado em dois Laboratrios de referncia,
Unit de Mycologie do Institut Pasteur de Paris, e o Laboratrio de
Imunologia da Facult de Pharmacie de Montpellier; 193 estirpes
foram seleccionadas como representativas das estirpes isoladas na
prtica clnica e incluam estirpes resistentes. No referido estudo, foram
testadas 8 diluies de 6 frmacos antifngicos, tendo-se obtido a
distribuio dos M.I.Cs resultantes. Com base nos grficos de
distribuio, e em dados da literatura recente, 2 concentraes foram
seleccionadas para cada substncia antifngica, para representao
final da galeria.
Na ausncia de recomendaes internacionais actuais para
interpretao dos M.I.C.s, os pontos de ruptura seleccionados so
apenas provisrios, e podem ser modificados no futuro: sero
necessrios outros estudos para definir a correspondncia entre os
resultados obtidos in vitro, e a sua relevncia clnica.
43
3- COMPOSICO DO DISPOSITIVO
FUNGITEST inclui:
Microplate : 10 microplacas de 16 poos, em embalagem individual
(o diagrama da microplaca est indicado na etiqueta).
10 pelculas adesivas
Suspension medium : 10 frascos contendo 3 ml de meio de suspenso
pronto a utilizar
Cada microplaca embalada individualmente em bolsa de alumnio
estanque, contendo uma pelcula adesiva e um dessecante.
AB2
AB8
MCZ0,5
MCZ8
KET0,5
KET4
ITR0,5
ITR4
FLU8
FLU64
T-
T-
LOT
T+
5FC32
Bio-Rad
T+
5FC2
Patient :
Ref. :
FUNGITEST
Diagrama da microplaca
T+
Controlo positivo
5 FC
AB
anfotericina B (2-8 g/ml)
MCZ
miconazole (0,5-8 g/ml)
KET
quetoconazole (0,5-4 g/ml)
ITR
itraconazole (0,5-4 g/ml)
FLU
fluconazole (8-64 g/ml)
T-
Controlo negativo
4- CONSERVACO
Os reagentes, conservados a +2 - 8C, mantm-se estveis at ao termo
do prazo de validade indicado na embalagem.
5- MATERIAL NECESSARIO MAS NO FORNECIDO
44
gua destilada esterilizada

Micropipetas de 20 l e 100 l
Pontas estreis
Opacity control 1 Mac Farland: referncia 56499
Incubadora a 37C e 32C.
6- MODO DE FUNCIONAMENTO
A) PREPARACO DA SUSPENSO DE LEVEDURA
Usar uma pipeta para recolher duas colnias similares de uma cultura
pura e fresca obtida em meio Sabouraud, com ou sem antibitico, e
introduzi-las em 3 ml de gua destilada esterilizada, para obter um
primeiro inoculado calibrado, com uma opacidade equivalente ao
padro Mac Farland No. 1 (Opacity control 1 Mac Farland), i.e 3 x 106
leveduras/ml.
PREPARAO DO INOCULADO
100 l
2 colnias isoladas
Cultura de 24-48 horas
(meio Sabouraud)
1,9 ml gua destilada

esterilizada
3 ml de gua destilada esterilizada

Opacidade Mac Farland 1 3 x 106 CFU/ml
INOCULAO
20 l
+
Controlos positivos
2 -- 32 5-fluorocitosina
2 - 8
100 l/pocillo
3 ml meio de suspenso
(103 CFU/ml)
anfotericina B
0,5 - 8
miconazole
0,5 - 4
quetoconazole
0,5 - 4
itraconazole
Date
Bio-Rad
PATIENT
8 - 64 fluconazone
-
Controlos negativos
microplaca Fungitest
INCUBAO
48 h a 37C
72h a 32C
(Criptococos)
LEITURA E INTERPRETAO
p.ex. estirpe de C. krusei n 4221
Date
Bio-Rad
PATIENT
INTERPRETAO
Controlos positivos
Estirpe inibida por 5-fluorocitosina
Estirpe inibida por anfotericina B
Estirpe intermdia por miconazole
Estirpe intermdia por quetoconazole
Estirpe intermdia por itraconazole
Estirpe no inibida por fluconazone
Controlos negativos
45
Utilizando uma pipeta calibrada, diluir 100 l deste inoculado em 1,9

ml de gua destilada esterilizada.
Inocular 20 L da diluio obtida no meio de suspenso fornecido
com o dispositivo. A concentrao do inoculado ser ento
equivalente a 1 x 103 leveduras/ml.
B) INOCULACO DA MICROPLACA
Utilizando uma pipeta calibrada, distribuir 100 L desta suspenso em
cada poo da microplaca.
Cobrir com pelcula adesiva.
C) INCUBACO DA MICROPLACA
- a 32C durante 72 h para Cryptococcus neoformans
- a 37C durante 48 h para as outras leveduras.
(V. quadro anexo)
Incubar :
D) LEITURA E INTERPRETACO DOS RESULTADOS

Examinar a placa apenas quando os poos de controlo positivo (T+)
estiverem rosa.
Observar qualquer alterao de cor nos poos que contm o agente
antifngico, em comparao com os poos de controlo negativo
(azul).
Interpretar de acordo com a cor dos dois poos para cada agentes
antifngico:
- Azul-Azul = sem crescimento: estirpe inibida pelo agente
antifngico in vitro
- Rosa-Azul=
crescimento reduzido: estirpe intermdia
- Rosa-Rosa = crescimento: estirpe no inibida pelo agente
antifngico in vitro.
7- PRECAUCES DE UTILIZACO
No utilizar reagentes aps o termo do prazo de validade.
RECOMENDAES DE HIGIENE E SEGURANA

As estirpes e reagentes inoculados so potencialmente infecciosos;
devero ser manuseados de acordo com as precaues habituais e
eliminados em cumprimento das normas de higiene e segurana
presentemente em vigor para este tipo de produto.
46
8- CONTROLO DE QUALIDADE DO TESTE

Os desempenhos de FUNGITEST so controladas utilizando as seguintes
estirpes:
ESTIRPES

C.krusei ATCC 6258
C.glabrata SDP A35
RESULTADO DA CULTURA
EM 48h A 37C
T+
5FC
AB
Rosa
Rosa
Rosa
Rosa
Rosa
Rosa
S
I
S
S
S
S/I
S/I
S/I
S/I
S
S
S
MCZ KET ITRA FLU

S
I
S
S/I
S/I
S/I
S
S/I
S
I
S
S/I
S
S/I
S
I/R
S
S/I
S
I
S
I/R
S
I/R
TAzul
Azul
Azul
Azul
Azul
Azul
* Incubao durante 72h a 32C
9- CONTROLO DA QUALIDADE DE FABRICO

Todos os reagentes so fabricados de acordo com o nosso Sistema de
Qualidade, desde a recepo das matrias primas at comercializao
final do produto. Cada lote submetido a avaliaes de controlo de
qualidade, sendo comercializado apenas quando em total conformidade
com os critrios de aceitao predefinidos. Os registos relativos
produo e controlo de cada lote so arquivados pela Bio-Rad.
10- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Veja a verso Francesa.
47
48
FUNGITEST
10 TEST
BESTMNING AV KNSLIGHETEN HOS
JSTSVAMPAR FR ANTIMYKOTIKA
IVD
60780
1- KLINISK BETYDELSE
Ett frnyat utbrott av svampinfektioner har observerats under de senaste
ren som hr samman med det kande antalet patienter med nedsatt
immunfrsvar (9).
Detta beror i huvudsak p anvndningen av mer aggressiv kemoterapi
mot cancer, kraftfullare immunsuppressiva behandlingar av mottagare av
transplantat och anvndningen av bredspektrumantibiotika (2, 3).
Detta utbrott tfljs av ett kat antalet identifierade patogena arter (10)
och uppkomsten av resistens hos tidigare knsliga arter.
I detta sammanhang kan ett in vitro-test av jstsvamparnas knsligheten
fr antimykotika vara anvndbart (1, 4, 7, 8). FUNGITEST uppfyller
denna mlsttning eftersom den mjliggr bestmning av knsligheten
hos jstsvampar fr antimykotika enligt en standardiserad metod som
hrrr frn en referensmetod (5, 6) som r ltt att utfra och utvrdera.
2- PRINCIP
FUNGITEST anvnds fr att studera tillvxten av jstsvampar i nrvaro
av sex antimykotika med tv olika koncentrationer i ett modifierat RPMI
1640-buffrat medium och i nrvaro av en redoxindikator.
Bedmningen av tillvxten baseras p reduktionen av en frgad indikator
som gr att mediet ndrar frg frn bltt till rosa. Om tillvxten hmmas
av antimykotikumet frblir mediet bltt.
Detta test, i form av en mikroplatta med 16 brunnar, bestr av fljande:
2 brunnar fr kontroll av tillvxt
12 brunnar som innehller dehydrerade antimykotika (6 antimykotika
med 2 olika koncentrationer)
2 negativa kontrollbrunnar
Ett kalibrerat inokulat av teststammen spds med suspensionsmediet och
frdelas drefter i varje brunn p mikroplattan.
De antimykotika som finns i varje brunn rehydreras d med det
inokulerade suspensionsmediet.
50
De antimykotikumkoncentrationer som erhlls motsvarar utmrkande

koncentrationer som mjliggr klassificering av stammarna enligt
fljande:
knsliga stammar (S)
indeterminanta stammar (I)
resistenta stammar (R)
Brytpunkterna har valts enligt studien av antimykotikans MIC (minsta
inhiberande koncentration) som uppns med prototypmikroplattor som
anvnts enligt samma frfarande som Fungitest.
Denna frstudie utfrdes p tv referenslaboratorier, Unit de
Mycologie vid Pasteurinstitutet i Paris och det immunologiska laboratoriet
vid Facult de Pharmacie i Montpellier. 193 stammar valdes ut fr att
representera de stammar som isoleras med normala rutiner och omfattade
ven resistenta stammar. I denna studie testades tta utspdningar av sex
antimykotika och frdelningen av de resulterande MIC registrerades. P
grundval av frdelningskurvorna och uppgifter ur nyutkommen litteratur,
valdes tv koncentrationer fr varje antimykotikum fr den slutliga
presentationen.
I avsaknad av aktuella internationella rekommendationer om utvrderingen
av MIC r de valda brytpunkterna en kompromiss som kan komma att
ndras i framtiden. Andra studier krvs fr att definiera verensstmmelsen
mellan resultat som fs in vitro och deras kliniska relevans.
51
3- TESTETS BESTNDSDELAR
FUNGITEST bestr av fljande:
Microplate : 10 separat frpackade mikroplattor med vardera 16
brunnar (diagram fr mikroplattan visas p etiketten)
10 sjlvhftande folier
Suspension medium : 10 flaskor med 3 ml suspensionsmedium som r
frdigt att anvnda
Varje mikroplatta r separat frpackad i en frsluten foliebelagd
aluminiumpse med sjlvhftande folie och torkmedel.
5FC2
5FC32
AB2
AB8
MCZ0,5
MCZ8
KET0,5
KET4
ITR0,5
ITR4
FLU8
FLU64
T-
T-
LOT
T+
Bio-Rad
T+
Patient :
Ref. :
FUNGITEST
Schematisk bild av mikroplattan

T+
fi
positiv kontroll
5 FC
fi
5-fluorocytosin (2-32 g/ml)
AB
fi
amfotericin B (2-8 g/ml)
MCZ
fi
mikonazol (0,5-8 g/ml)
KET
fi
ketokonazol (0,5-4 g/ml)
ITR
fi
itrakonazol (0,5-4 g/ml)
FLU
fi
flukonazol (8-64 g/ml)
T-
fi
negativ kontroll
4- FRVARING
Reagenserna r stabila till utgngsdatumet p etiketten om de frvaras
vid +28C.
5- NDVNDIGT MATERIAL SOM EJ INGR
52
Sterilt destillerat vatten

Mikropipetter fr 20 l och 100 l
Sterila provrr
Opacity control 1 Mac Farland: kod 56499
Inkubator fr +37C och +32C
6- FRFARANDE
A) BEREDNING AV JSTSVAMPSUSPENSIONEN
Anvnd en pipett fr att ta tv likadana kolonier frn en ren och frsk
kultur p ett Sabouraud-medium med eller utan antibiotika. Tillstt dem
till 3 ml sterilt destillerat vatten fr att frst f ett kalibrerat inokulat med
en opacitet som motsvarar Mac Farland-standarden 1 (Opacity control
1 Mac Farland), dvs. 3 x 106 jstsvampar/ml.
BEREDNING AV INOKULAT
2 likadana kolonier
100 l
24 48 tim kultur
(Sabouraud-medium)
1,9 ml sterilt destillerat vatten
3 ml sterilt destillerat vatten

Mac Farland-standarden 1, dvs. 3 x 106 jstsvampar/ml
INOKULERING
20 l
+
positiv kontroll
2 -- 32 5- fluorocytosin
2 - 8
100 l/brunn
3 ml suspensionsmedium
(103 jstsvampar/ml)
amfotericin B
0.5 - 8
mikonazol
0.5 - 4
ketokonazol
0.5 - 4
itrakonazol
Date
Bio-Rad
PATIENT
8 - 64 flukonazol
-
negativ kontroll
Fungitest mikroplattor
INKUBERING
+37C I 48 TIM
+32C I 72 TIM
(Cryptococci)
AVLSNING OCH UTVRDERING

Stam av C. krusei n4221
Bio-Rad
Date
PATIENT
UTVRDERING
positiv kontroll
stammen hmmad av 5-fluorocytosin
stammen hmmad av amfotericin B
indeterminant stam av mikonazol
indeterminant stam av ketokonazol
indeterminant stam av itrakonazol
stammen inte hmmad av flukonazol
negativ kontroll
53
Anvnd en kalibrerad pipett fr att spda 100 l av detta inokulat med

1,9 ml sterilt destillerat vatten.
Inokulera 20 l av den tillverkade utspdningen i det suspensionsmedium
som kommer med testet. Inokulatets koncentration motsvarar 1 x 103
jstsvampar/ml.
B) INOKULERING AV MIKROPLATTAN
Frdela med hjlp av en kalibrerad pipett 100 l av denna suspension
i varje brunn p mikroplattan.
Tck ver plattan med sjlvhftande folie.
C) INKUBERING AV MIKROPLATTAN
Inkubera:
vid +32C i 72 tim fr Cryptococcus neoformans

vid +37C i 48 tim fr alla andra jstsvampar.
D) AVLSNING OCH UTVRDERING AV RESULTAT

Undersk endast plattan om brunnarna med den positiva kontrollen
(T+) r rosa.
Kontrollera om det finns ngon frgfrndring i brunnarna som innehller
antimykotika jmfrt med brunnarna med negativ kontroll (bl).
Utvrdera i enlighet med frgen fr de tv brunnarna fr respektive
antimykotikum:
- Bl-Bl =
ingen tillvxt: stammen hmmad av antimykotikumet
in vitro
- Rosa-Bl =
lg tillvxt: indeterminant stam
- Rosa-Rosa =
tillvxt: stammen inte hmmad av antimykotikumet in
vitro
7- FRSIKTIGHETSTGRDER
Anvnd inte reagenser efter utgngsdatumet.
HYGIEN- OCH SKERHETSREKOMMENDATIONER

Stammar och inokulerade reagenser kan vara smittfarliga. De mste
hanteras med sedvanliga frsiktighetstgrder och kasseras enligt
gllande hygienregler och bestmmelser fr den hr typen av produkter.
54
8- KVALITETSKONTROLL AV TESTET
Resultatet fr FUNGITEST kontrolleras med fljande stammar:
STAMMAR

C.krusei ATCC 6258
C.glabrata SDP A35
ODLINGSRESULTAT EFTER
48 TIM VID 37C
T+
5FC
AB
Rosa
Rosa
Rosa
Rosa
Rosa
Rosa
S
I
S
S
S
S/I
S/I
S/I
S/I
S
S
S
MCZ KET ITRA FLU

S
I
S
S/I
S/I
S/I
S
S/I
S
I
S
S/I
S
S/I
S
I/R
S
S/I
S
I
S
I/R
S
I/R
TBl
Bl
Bl
Bl
Bl
Bl
* Inkubering i 72 tim vid 32C
9- TILLVERKARENS KVALITETSKONTROLL
Alla reagenser tillverkas och bereds i enlighet med vrt kvalitetssystem,
frn mottagandet av rmaterial till den slutliga marknadsfringen av
produkten. Varje parti genomgr en kvalitetskontroll och slpps endast ut
p marknaden om det verensstmmer med frdefinierade
acceptanskriterier. Handlingar som beskriver produktion och kontroll av
varje enskilt parti sparas hos Bio-Rad.
10- REFERENSER
Se den Franska.
55
56
FUNGITEST
10 TESTS
60780
BESTEMMELSE AF GRARTERS SENSITIVITET OVER

FOR ANTIFUNGALE STOFFER
IVD
1- KLINISK VRDI
Gennem de seneste r er der observeret et nyt udbrud af
svampeinfektioner, som er forbundet med et get antal personer med
nedsat immunforsvar (9).
Det skyldes primrt brugen af mere aggressiv kemoterapi til
krftbehandling, mere intensive immundmpende behandlinger hos
modtagere af transplantater og brugen af bredspektrerede antibiotika (2, 3).
Dette udbrud er ledsaget af en stigning i antallet af identificerede
patogene arter (10) og fremkomsten af resistens hos arter, der tidligere
var sensitive.
I denne nye sammenhng kan en in vitro-test af grarternes sensitivitet
over for antifungale stoffer vre nyttig (1, 4, 7, 8). FUNGITEST er
beregnet til dette forml og giver mulighed for at bestemme grarternes
sensitivitet over for antifungale stoffer iflge en standardiseret metode,
udledt af en referencemetode (5, 6), som er let at udfre og fortolke.
2- PRINCIP
FUNGITEST anvendes til at undersge grarternes vkst ved tilstning
af 6 antifungale stoffer med 2 forskellige koncentrationer i et modificeret,
bufferet RPMI 1640-medium og ved brug af en redox-indikator.
Vurderingen af vksten er baseret p reduktionen i farveindikatoren,
hvor mediets farve ndres fra bl til lyserd. Nr vksten hmmes af
det antifungale stof, forbliver mediet blt.
Denne test bestr af en mikroplade med 16 brnde, herunder:
2 brnde til vkstkontrol
12 brnde med dehydrerede, antifungale stoffer (6 antifungale stoffer i
2 forskellige koncentrationer)
2 negative kontrolbrnde.
Et kalibreret inokulum af teststammen fortyndes i suspensionsmediet og
fordeles derefter i hver brnd p mikropladen.
De antifungale stoffer i de enkelte brnde bliver sledes rehydreret af det
inokulerede "suspensionsmedium".
58
De opnede antifungale koncentrationer varierer, hvilket muliggr en

klassifikation af stammerne i flgende grupper:
sensitive stammer (S)
mellemsensitive stammer (M)
resistente stammer (R).
Skillepunkterne er valgt ud fra en undersgelse af den fordeling, af de
antifungale stoffers MIC, som opns med prototype-mikroplader og ud fra
samme procedure som for Fungitest.
Denne indledende undersgelse blev udfrt i to referencelaboratorier,
Unit de Mycologie hos Institut Pasteur i Paris og Immunoloy
Laboratory hos Facult de Pharmacie i Montpellier. Der blev udvalgt
193 stammer som reprsentanter for de stammer, der isoleres i
almindelig praksis, herunder resistente stammer. I undersgelsen blev der
testet 8 fortyndinger af 6 antifungale stoffer, og fordelingen af de MICer,
som flgende blev registreret. Med udgangspunkt i fordelingsgraferne og
data i den nyeste litteratur blev to koncentrationer udvalgt for hvert
antifungalt stof til den endelige prsentation.
I mangel p gldende internationale anbefalinger for fortolkning af
MICer er skillepunkterne valgt ud fra et kompromis, som kan tilpasses i
fremtiden. Der krves andre undersgelser for at definere
sammenhngen mellem de resultater, der blev opnet in vitro, og deres
kliniske relevans.
59
3- STTETS SAMMENSTNING
FUNGITEST indeholder:
Microplate : 10 enkeltpakkede mikroplader med 16 brnde
(mikropladens diagram er angivet p etiketten).
10 selvklbende film
Suspension medium : 10 flasker, der indeholder 3 ml brugsklart
suspensionsmedium.
Hver mikroplade er pakket for sig i en forseglet aluminiumspose med
selvklbende film og trremiddel.
5FC2
5FC32
AB2
AB8
MCZ0,5
MCZ8
KET0,5
KET4
ITR0,5
ITR4
FLU8
FLU64
T-
T-
LOT
T+
Bio-Rad
T+
Patient :
Ref. :
FUNGITEST
Diagram over mikropladen

T+
fi
Positiv kontrol
5 FC
fi
5- fluorocytosin (2-32 g/ml)
AB
fi
amphotericin B (2-8 g/ml)
MCZ
fi
miconazol (0,5-8 g/ml)
KET
fi
ketoconazol (0,5-4 g/ml)
ITR
fi
itraconazol (0,5-4 g/ml)
FLU
fi
fluconazol (8-64 g/ml)
T-
fi
Negativ kontrol
4- OPBEVARING
Reagenserne er stabile indtil udlbsdatoen p sttets etiket, hvis de
opbevares ved +2 8C.
5- KRVET MATERIALE, DER IKKE MEDFLGER
60
Sterilt, destilleret vand

Mikropipetter til 20 l og 100 l
Sterile kegler
Opacity control 1 Mac Farland: kode 56499
Inkubator ved 37C og 32C.
6- PROCEDURE
A) FORBEREDELSE AF GROPLSNINGEN
Brug en pipette til at tage to ens kolonier fra en ren og frisk kultur, der
er udviklet p Sabouraud-medium med eller uden tilstning af
antibiotika, og nedsnk dem i 3 ml sterilt, destilleret vand for at opn
det frste kalibrerede inokulum med en opacitet svarende til
standarden for Mac Farland Nr. 1 (Opacity control 1 Mac Farland),testen dvs. 3 x 106 gr/ml.
FORBEREDELSE AF INOKULUM
2 kolonier
100 l
24-48 timer kultur

(Sabouraud-medium)
1,9 ml sterilt, destilleret vand
3 ml sterilt, destilleret vand

Mac Farland Nr. 1-testen dvs. 3 x 106 gr/ml
INOKULATION
20 l
+
positiv kontrol
2 -- 32 5-fluorocytosin
2 - 8
100 l/ml brnd
3 ml suspensionsmedium
(103 gr/ml)
amphotericin B
0.5 - 8
miconazol
0.5 - 4
ketoconazol
0.5 - 4
itraconazol
Date
Bio-Rad
PATIENT
8 - 64 fluconazol
-
negativ kontrol
Fungitest mikroplader
INKUBATION
37C I 48 TIMER
32C I 72 TIMER
(Cryptococci)
AFLSNING OG FORTOLKNING
Stammen af C. krusei n4221
Date
Bio-Rad
PATIENT
FORTOLKNING
positiv kontrol
Stammen hmmes af 5-fluorocytosin
Stammen hmmes af amphotericin B
Stammen er mellemsensitiv av miconazol
Stammen er mellemsensitiv av ketoconazol
Stammen er mellemsensitiv av itraconazol
Stammen er mellemsensitiv av fluconazol
Stammen hmmes ikke af negativ kontrol
61
Brug en kalibreret pipette til at fortynde 100 l af dette inokulum i 1,9

ml sterilt, destilleret vand.
Inokulr 20 l af den producerede oplsning i det suspensionsmedium,
der flger med sttet. Koncentrationen af inokulum svarer derefter til
1 x 103 gr/ml.
B) INOKULATION AF MIKROPLADEN
Brug en kalibreret pipette til at fordele 100 l af denne oplsning i
hver brnd p mikropladen.
Dk pladen med selvklbende film.
C) INKUBATION AF MIKROPLADEN
Inkubr:
- ved 32C i 72 timer for Cryptococcus neoformans

- ved 37C i 48 timer for de andre grarter.
D) AFLSNING OG FORTOLKNING AF RESULTATERNE

Undersg kun pladen, nr brndene med den positive kontrolprve
(T+) er lyserde.
Observr enhver farvendring i de brnde, der indeholder det
antifungale stof, og sammenlign med udviklingen for de negative
kontrolbrnde (bl).
Fortolk resultaterne iflge farvningen af de to brnde for hvert
antifungalt stof:
- Bl-Bl =
ingen vkst: Stammen hmmes in vitro af det
antifungale stof.
- Lyserd-Bl =
lav vkst: Stammen er mellemsensitiv.
- Lyserd-Lyserd = vkst: Stammen hmmes ikke in vitro af det
antifungale stof.
7- FORHOLDSREGLER FOR BRUG

Undg at bruge reagenser efter udlbsdatoen.
ANBEFALINGER FOR HYGIEJNE - OG SIKKERHEDSMSSIGE FORHOLD

De inokulerede stammer og reagenser er potentielt smittefarlige. Hndtr
dem derfor iflge de sdvanlige forholdsregler, og bortskaf dem iflge
de gldende regler for hygiejne og bestemmelser for denne produkttype.
62
8- KVALITETSKONTROL AF TESTEN
Ydeevnen for FUNGITEST kontrolleres ved hjlp af flgende stammer:
STAMMER

C.krusei ATCC 6258
C.glabrata SDP A35
T + 5FC
Lyserd S
Lyserd M
Lyserd S
Lyserd S
Lyserd S
Lyserd S/M
RESULTAT FOR KULTUREN

EFTER 48 TIMER VED 37C
AB MCZ KET ITRA FLU
S/M
S
S
S
S
S/M
M
S/M S/M
M
S/M
S
S
S
S
S
S/M
M
M/R M/R
S
S/M
S
S
S
S
S/M S/M S/M M/R
TBl
Bl
Bl
Bl
Bl
Bl
* Inkubation i 72 timer ved 32C
9- PRODUCENTENS KVALITETSKONTROL
Alle producerede reagenser fremstilles iflge vores kvalitetssikringssystem,
lige fra modtagelsen af rmaterialerne til markedsfringen af slutproduktet.
Hvert parti gennemgr kvalitetskontrol og markedsfres kun, hvis det
opfylder de foruddefinerede kvalitetskriterier. Dokumentation vedrrende
produktion og kontrol af hvert parti opbevares inden for Bio-Rad.
10- REFERENCER
Se den Franske.
63
FUNGITEST
10
60780
In Vitro
1-

(9).

, ,
(2, 3).
(10)
.
, in vitro
(1, 4, 7, 8). FUNGITEST ,

(5,6),
.
2-
FUNGITEST 6
2 , RPMI
1640, .
,
.
, .
, 16 , :
2
12 (6
2 )
2

M.I.C , ,
FUNGITEST.
2 , Unit de Mycologie
Pasteur Facult de Pharmacie Montpellier: 193
,
. , 8 6
M.I.C.
,
.

M.I.C.,
:
in vitro .
3- KIT
FUNGITEST :
: 10 16 (
).
10
: 10 3 ml
T+
5 FC
5- fluorocytosine (2-32 g/ml)
AB
(2-8 g/ml)
MCZ
(0,5-8 g/ml)
KET
(0,5-4 g/ml)
ITR
(0,5-4 g/ml)
FLU
(8-64 g/ml)
T-
4-
, +2 - 8C,
.
5-

20 100 l

1 Mac Farland: 56499
37C 32C.
6-
A.
2
Sabouraud 3 ml ,
Mac
Farland . 1, 3 x 106 /ml.

2
24 48 .
( Sabouraud)
3ml
Mac Farland 1 3x106 CFU/ml
1,9 ml

5-fluorocytosine

100l/
3ml
(103 CFU/ml)
FUNGITEST

.. C. krusei . 4221

5-fluorocytosine
, 100 l 1,9 ml
.
20 L .
1 x 103 /ml.
B.
, 100 L .
.
.
:
- 32C 72 Cryptococcus neoformans
- 37C 48 .
.
(T+) .

().
:
- - = : in vitro
- - = :
- - = : in vitro
7-
.

.

.
8-
FUNGITEST :
C. tropicalis ATCC 750

C. krusei ATCC 6258
C. albicans CIP 884.65
C. glabrata SDP A35
C. parapsilosis ATCC 22019
C. neoformans SDP B53*
T+
48 37C
5FC
AB
MCZ
KET
ITRA
FLU
S
S/I
S
S
S
S
I
S/I
I
S/I
S/I
I
S
S/I
S
S
S
S
S
S
S/I
I
I/R
I/R
S
S
S/I
S
S
S
S/I
S
S/I
S/I
S/I
I/R
* 72 32C
9-
,
.

.
Bio-Rad.
10-
. .
FUNGITEST
10 TESTW
OZNACZANIE WRALIWOCI DRODAKW NA LEKI
PRZECIWGRZYBICZE
60780
1 - ZNACZENIE KLINICZNE
W ostatnich latach notuje si coraz wiksz liczb zakae grzybiczych, wystpujcych u
pacjentw w immunosupresji (9).
Przede wszystkim jest to spowodowane agresywniejsz terapi przeciwnowotworow,
wyszym poziomem immunosupresji u pacjentw po przeszczepie narzdw lub szpiku,
stosowaniem antybiotykw o szerokim spektrum (2,3).
Wzrost liczby zakae jest jednoczenie zwizany z coraz czstszym wystpowaniem
rzadkich dotd gatunkw patogennych drodakw (10), oraz z narastaniem opornoci
gatunkw dotd wraliwych.
Biorc pod uwag powysze aspekty, test do oznacze in vitro wraliwoci drodakw na
preparaty przeciwgrzybicze wydaje si by wielce przydatnym (1, 4, 7, 8). FUNGITEST
spenia podane kryteria, jest atwym do wykonania i interpretacji testem, ktry pozwala
oznaczy wraliwo drodakw na preparaty przeciwgrzybicze wystandaryzowan
metod, opracowan na podstawie metody referencyjnej (5,6).
2 - ZASADA METODY
FUNGITEST pozwala na badanie wzrostu grzybw w obecnoci 6 preparatw
przeciwgrzybiczych, zastosowanych w dwch rnych steniach, w zmodyfikowanym
zbuforowanym podou pynnym RPMI 1640, w obecnoci barwnego wskanika redox.
O wzrocie drodakw wiadczy redukcja wskanika, dziki czemu podoe zmienia
barw z niebieskiej na row. Jeli wzrost badanego szczepu jest zahamowany przez
preparat przeciwgrzybiczy, podoe pozostaje niebieskie.
Zestaw w postaci mikropytki o 16-tu studzienkach, zawiera:
2 studzienki kontroli wzrostu
12 studzienek z odwodnionymi czynnikami przeciwgrzybiczymi (6 czynnikw w dwch
rnych steniach)
2 studzienki kontroli ujemnej
Wartoci ste antybiotykw ustalono na podstawie wartoci MIC dla poszczeglnych
preparatw, uzyskanych na prototypowej mikropytce w tej samej procedurze, wg ktrej
wykonuje si FUNGITEST.
Badania wstpne wykonano w dwch referencyjnych laboratoriach; w Zakadzie Mikologii
Instytutu Pasteura w Paryu oraz w Laboratorium Immunologicznym Wydziau Farmacji w
Montpellier; do testu wybrano 193 reprezentatywne szczepy odpowiadajce izolowanym
podczas rutynowej diagnostyki, w tym szczepy oporne na antybiotyki. W tecie tym, badano
wzrost szczepw w 8 rozcieczeniach szeciu preparatw przeciwgrzybiczych, co
pozwolio oznaczy wartoci MIC dla poszczeglnych antybiotykw. W oparciu o wykres
czstoci rozkadu oraz najnowsze dane literaturowe, wybrano stenia lekw do panelu.
Z powodu braku aktualnych midzynarodowych rekomendacji, dotyczcych interpretacji
wartoci MIC, stenia wybrane jako warto graniczna (breakpoint) stanowi pewn
wypadkow dostpnych danych i mog by w przyszoci zmienione; okrelenie zalenoci
pomidzy wynikami uzyskiwanymi in vitro a odniesieniami klinicznymi wymaga dalszych
bada.
3 - SKAD ZESTAWU
FUNGITEST zawiera:
Mikropytka: 10 indywidualnie zapakowanych mikropytek o 16-tu studzienkach (diagram
mikropytki przedstawiono na etykiecie)
10 sztuk folii adhezyjnej
Podoe do sporzdzenia zawiesiny: 10 fiolek po 3 ml podoa gotowego do uycia
podoa do sporzdzenia zawiesiny
Kada mikropytka jest osobno zapakowana w zgrzewan torebk z folii aluminiowej z foli
adhezyjn i pochaniaczem wilgoci.
Diagram mikropytki
T+
kontrola dodatnia
5 FC
5-fluorocytozyna (2-32 l/ ml)
AB
amfoterycyna B (2-8 l/ ml)
MCZ
mikonazol (0.5-8 l/ ml)
KET
ketokonazol (0.5-4 l/ ml)
ITR
itrakonazol (0.5-4 l/ ml)
FLU
flukonazol (8-64 l/ ml)
T-
kontrola ujemna
4 - PRZECHOWYWANIE
Odczynniki, przechowywane w temperaturze +2-8C, s trwae zgodnie z dat wanoci
podan na opakowaniu.
5 - INNE NIEZBDNE MATERIAY

Jaowa woda destylowana
Mikropipety pobierajce 20 l i 100 l
Jaowe prbwki
Wzorzec gstoci 1 w skali McFarlanda: nr kat. 56499
Cieplarka o temp. 37C i 32C
6 PROCEDURA
A. PRZYGOTOWANIE ZAWIESINY DRODAKW
Z czystej, modej hodowli na podou Sabouraud z antybiotykami lub bez, pobra
dwie podobne kolonie i zawiesi w 3 ml jaowej wody destylowanej. Inokulum
powinno mie gsto wzorca nr 1 w skali McFarlanda, co w przyblieniu odpowiada
liczbie 3 x 106 komrek/mililitr.
Pipet kalibrowan rozcieczy inokulum w wodzie destylowanej: 100 l inokulum w

1.9 ml wody.
Pobra 20 l rozcieczonego inokulum i zaszczepi podoe doczone w zestawie.

Liczba komrek w tej zawiesinie wynosi w przyblieniu 1 x 103 / mililitr.
B. INOKULACJA MIKROPYTKI
Pipet kalibrowan nanie po 100 l zawiesiny komrek do kadej studzienki
mikropytki.
Zakry foli adhezyjn.
C. INKUBACJA MIKROPYTKI
Inkubowa:
- W temperaturze 32C przez 72 godziny w przypadku Cryptococcus neoformans
- W temperaturze 37C przez 48 godzin w przypadku innych drodakw
D. ODCZYT I INTERPRETACJA WYNIKW
Test jest wany tylko wtedy, gdy kontrola dodatnia (T+) ma barw row.
Naley obserwowa zmian barwy w studzienkach zawierajcych preparaty
przeciwgrzybicze w porwnaniu ze studzienkami kontroli ujemnej (niebieskie).
Wynik dla kadego preparatu uzyskuje si na podstawie interpretacji barwy w dwch
studzienkach o rnych jego steniach:
- Niebieska Niebieska =
- Rowa Niebieska =
- Rowa Rowa =
brak wzrostu: wzrost szczepu zahamowany przez

antybiotyk in vitro
saby wzrost: szczep rednio-wraliwy
wzrost: szczep oporny na antybiotyk in vitro
7 RODKI OSTRONOCI
Nie uywa odczynnikw po upywie terminu wanoci.
BEZPIECZESTWO I HIGIENA PRACY
Kliniczne szczepy drodakw i ich zawiesiny w wodzie i podou stanowi materia
potencjalnie zakany; naley obchodzi si z nimi zachowujc odpowiednie rodki
ostronoci, przestrzega zasad higieny, oraz eliminowa w odpowiedni sposb.
8 - KONTROLA JAKOCI
Parametry jakociowe Fungitestu kontrolowane s z uyciem podanych szczepw
wzorcowych:
SZCZEP
C.krusei ATCC 6258
C.glabrata SDP A35
WYNIK PO INKUBACJI W 37C PRZEZ 48 GODZIN

T+
5 FC
AB
MCZ KET ITRA FLU
TRowa
S
S/I
S
S
S
S niebieska
Rowa
I
S/I
I
S/I
S/I
I
niebieska
Rowa
S
S/I
S
S
S
S niebieska
Rowa
S
S
S/I
I
I/R
I/R niebieska
Rowa
S
S
S/I
S
S
S niebieska
Rowa
S/I
S
S/I
S/I
S/I
I/R niebieska
* inkubacja w temp. 32C przez 72 godziny
9 KONTROLA JAKOCI PRODUCENTA

Wszystkie odczynniki s produkowane oraz sprzedawane zgodnie z naszym Systemem
Jakoci, zaczynajc od otrzymania surowcw do wykonania finalnego produktu. Kada seria
odczynnikw jest poddana kontroli jakoci i dopuszczona do sprzeday po uzyskaniu
okrelonych kryteriw. Dane dotyczce procesu produkcji oraz kontroli jakoci kadej serii
odczynnikw s archiwizowane u producenta.
10 - LITERATURA
Patrz wersja francuska
FUNGITEST
60780
10 TESZT
LESZTK ANTIMIKOTIKUMRZKENYSGNEK MEGHATROZSA
1-
KLINIKAI JELENTSG
Az immunszupresszlt betegek szmnak nvekedsvel a gombs fertzsek felbukkansa
az utbbi vekben ismt megszaporodott (9).
Ez fknt az agresszvebb rkellenes kemoterpinak, a szervtltetsen tesettek
intenzvebb immunszupresszv kezelsnek s a szles spektrum antibiotikumok
hasznlatnak kvetkezmnye (2, 3).
A gombs betegsgek megszaporodsval prhuzamosan egyre tbb patogn fajt
identifiklnak (10), s szaporodik a korbban rzkeny, de ma mr rezisztens speciesek
szma is.
Ebbl a szempontbl hasznos lehet egy j in vitro teszt, amellyel vizsglhat az lesztk
gombaellenes szerekkel szembeni rzkenysge (1, 4, 7, 8). A FUNGITEST megfelel ennek
a clnak, mert olyan szabvnyostott mdszert nyjt az lesztk antimikotikumokkal szembeni
rzkenysgnek meghatrozsra, mely egy knnyen kivitelezhet s kirtkelhet
referenciamdszerbl szrmazik (5, 6).
2-
ALAPELV
A FUNGITEST-tel 6 gombaellenes szer 2 klnbz koncentrcija mellett vizsgljuk az
lesztk nvekedst, mdostott RPMI 1640 pufferelt kzegben, redox indiktor
jelenltben.
A nvekeds mrtknek megllaptsa azon alapul, hogy a sznes indiktor redukcija miatt
a kzeg kkbl rzsasznbe vlt t. Ha a nvekedst gtolja a gombaellenes szer, akkor a
kzeg kk szn marad.
A 16 tesztlyukas mikrolemez formjban felptett teszt az albbiakat tartalmazza:
2 nvekedsi kontroll tesztlyuk
12 tesztlyuk, amelyek beszrtott gombaellenes szert tartalmaznak (6 antimikotikum 2
klnbz koncentrciban)
2 negatv kontroll tesztlyuk
A breakpoint-okat a Fungitesttel azonos mdszerrel, mikrolemez prototpusokkal kapott
antimikotikum MIC (minimlis gtl koncentrci) rtkek eloszlsa alapjn llaptottk meg.
Ezt az elzetes vizsglatsorozatot 2 referencia laboratriumban vgeztk el, a prizsi Pasteur
Intzet Mikolgiai rszlegben s a montpellier-i Gygyszerszeti Kar Immunolgiai
laboratriumban. 193 trzset vlasztottak ki a napi gyakorlatban izollt trzsek reprezentatv
mintjaknt, belertve rezisztens trzseket is. A vizsglatsorozatot 6 antimikotikummal
vgeztk 8 hgtsban s megllaptottk a kapott MIC rtkek eloszlst. Az eloszlsi
grbk alapjn s a legfrissebb irodalmi adatok szerint 2 koncentrcit vlasztottak ki minden
egyes antimikotikumra a teszt vgleges konfigurcijnak eldntsekor.
Mivel az aktulis nemzetkzi ajnlsok nem foglalkoznak a MIC rtkekkel, a kivlasztott
breakpoint-ok kompromisszumos megoldst jelentenek, amelyek mg vltozhatnak a
jvben: tovbbi vizsglatokat kell vgezni annak megllaptsra, hogy milyen mrv az
egyezs az in vitro eredmnyek s klinikai alkalmazhatsguk kztt.
3-
A KIT SSZETTELE
A FUNGITEST az albbi komponenseket tartalmazza:
10 db egyenknt csomagolt, 16-tesztlyukas mikrolemez (a mikrolemez kiosztsa a cmkn
lthat).
10 db ntapad flia
2
10 db, egyenknt 3 ml, felhasznlsra ksz szuszpendl kzeget tartalmaz veg.

Minden egyes mikrolemez hegesztett alumnium tasakba, ntapad flival s nedvszv
anyaggal egytt, egyenknt van csomagolva.
A mikrolemez kiosztsa
T+
Pozitv kontroll
5 FC
5-fluorocitozin (2 - 32 g/ml)
amphotericin B (2 - 8 g/ml)
AB
4-
MCZ
miconazol (0,5 - 8 g/ml)
KET
ketoconazol (0,5 - 4 g/ml)
ITR
itraconazol (0,5 - 4 g/ml)
FLU
fluconazol (8 - 64 g/ml)
T-
Negatv kontroll
TROLS
A +2 - 8C kztt trolt reagensek a dobozon feltntetett szavatossgi ideig stabilak.
5-
SZKSGES, DE NEM SZLLTOTT ANYAGOK
6-
steril desztilllt vz
20 l-es s 100 l-es mikropipettk
steril tlcsrek
1 MacFarland egysgnek megfelel denzits kontroll. Kdszm 56499
37C-os s 32C-os inkubtor.
HASZNLATI TMUTAT
A. AZ LESZT SZUSZPENZI ELKSZTSE
Egy pipettval vegynk ki kt hasonl telepet antibiotikumos vagy anlkli Sabouraud
tptalajon tenysztett tiszta, friss kultrbl s 3 ml steril desztilllt vzben eloszlatva
ksztsk el az els, 1 MacFarland egysgnek megfelel denzits (kb. 3x106 leszt/ml),
kalibrlt inokulumot.
Kalibrlt pipettval hgtsunk 100 l inokulumot 1,9 ml steril desztilllt vzben.
Az gy kapott hgtsbl oltsunk 20 l-t a kittel szlltott szuszpendl kzegbe. Az
inokulum koncentrcija ekkor krlbell 1x103 leszt/ml-nek fog megfelelni.
B. A MIKROLEMEZ BEOLTSA
Egy kalibrlt pipettval mrjnk ebbl a szuszpenzibl 100 l-t a mikrolemez minden
tesztlyukba.
ntapad flival fedjk le a mikrolemezt.

C. A MIKROLEMEZ INKUBLSA
Inkubljuk
- 32C-on 72 rn t a Cryptococcus neoformans esetben
- 37C-on 48 rn t a tbbi leszt esetben.
3
D. LEOLVASS S AZ EREDMNYEK KIRTKELSE

Csak akkor vizsgljuk meg a lemezt, amikor a pozitv kontroll (T+) mr rzsaszn lett.
Az antimikotikumot tartalmaz tesztlyukak sznben bekvetkezett brmilyen vltozst
hasonltsunk ssze a negatv kontroll tesztlyukakkal (kk).
7-
Az eredmnyeket az egyes antimikotikumokhoz tartoz 2 tesztlyuk szne alapjn

rtelmezzk:
- Kk-Kk = nincs nvekeds: a trzset in vitro gtolja a gombaellenes szer
- Rzsaszn-Kk = csekly nvekeds: tmeneti rzkenysg trzs
- Rzsaszn-Rzsaszn = a trzset in vitro nem gtolja a gombaellenes szer.
KEZELSI ELRSOK
Ne hasznljuk a reagenseket a szavatossgi id letelte utn.
HIGINIAI S BIZTONSGI ELRSOK
A leoltott trzsek s reagensek potencilisan fertzek, gy az ilyen anyagokra vonatkoz
aktulis egszsggyi elrsoknak megfelelen kell azokat kezelni s rtalmatlantani.
8-
A TESZT MINSGNEK ELLENRZSE

A FUNGITEST minsgt az albbi trzsekkel ellenrizzk:
TRZSEK
C. tropicalis ATCC 750
C. crusei ATCC 6258
C. albicans CIP 884065
C. glabrata SDP A35
C. parapsilosis ATCC 22019
C. neoformans SDP B53*
EREDMNYEK 48-RS, 37C-OS TENYSZTS UTN

T+
5FC
AB
MCZ KET ITRA FLU
TRzsaszn
S
S/I
S
S
S
S
Kk
Rzsaszn
I
S/I
I
S/I
S/I
I
Kk
Rzsaszn
S
S/I
S
S
S
S
Kk
Rzsaszn
S
S
S/I
I
I/R
I/R
Kk
Rzsaszn
S
S
S/I
S
S
S
Kk
Rzsaszn
S/I
S
S/I
S/I
S/I
I/R
Kk
* Inkubls 72 rn t, 32 C-on
9-
A GYRTNL FOLY MINSGELLENRZS

Minden termknk minsgellenrzsi rendszernk keretn bell kszlt, a nyersanyag
tvteltl kezdve a termk forgalmazsig. Minden egyes gyrtsi sorozat minsgt
ellenrizzk, s csak akkor hozzuk forgalomba, ha az megfelel az elre fellltott
kritriumoknak. Minden sorozat gyrtsi s minsgellenrzsi jegyzknyve megtallhat a
Bio-Radnl.
10- HIVATKOZSOK
1. ANAISSIE ELIAS J, KARYOTAKIS NICHOLAS C, HACHEM RAY, DIGNANI MARIA C.,
REX JOHN H., AND PAETZNICK VICTOR. Correlation between In Vitro and In Vivo
Activity of Antifungal Agents against Candida Species. The Journal of Infection Diseases
1994 ; 170 : 384-389.
2. BERENGUER J, FERNANDEZ-BACA V , SANCHEZ R, BOUZA E. In Vitro Activity of
Amphotericin B, Flucytosine and Fluconazole against Yeasts Causing Bloodstream
Infections. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1995 ; 14 : 362-365.
3. DROMER F, DUPONT B. The increasing problem of fungal infections in the
immunocompromised host. J. Mycol. Md. 1996 ; 6, Suppl. I : 1-6.
4. ESPINEL-INGROFF A, PFALLER MA. Antifungal agents and susceptibility testing. In
MURRAY PR, BARON EJ, PFALLER MA, TENOVER FC, YOLKEN RH, eds. Manual of
Clinical Microbiology, 6th ed. Washington, DC : American Society for Microbiology, 1995.
5. ESPINEL-INGROFF A, RODRIGUEZ-TUDELA JL, and MARTINEZ-SUAREZ JV.

Comparison of Two Alternative Microdilution Procedures with the National Committee for
Clinical Laboratory Standards Reference Macrodilution Method M27-P for In Vitro Testing
of Fluconazole-Resistant and -Susceptible Isolates of Candida albicans. J. Clin. Microbiol.
1995 ; 33 : 3154-3158.
6. NCCLS. Antifungal Susceptibility Testing; Committee Report. NCCLS document M27-T.
NCCLS, 771 East Lancaster Avenue, Villanova, Pennsylvania. October 1995.
7. PAUGAM A. Intrt de l'tude in vitro de la sensibilit des levures aux antifongiques.
Revue franaise des laboratoires. 1996 ; 282 : 157-159.
8. PFALLER MA, BUSCHELMAN B, BALE MJ, et al. Multicenter comparison of a
colorimetric microdilution broth method with the reference macrodilution method for in vitro
susceptibility testing of yeast isolates. Diagn Microbiol Infect Dis. 1994 ; 19 : 9-13. 4
9. WALSH TJ, GONZALEZ C, ROILIDES E, MUELLER BU, ALI NASR, LEWIS LL,
WHITCOMB TO, MARSHALL DJ, and PIZZO PA. Fungemia in Children Infected with the
Human Immunodeficiency Virus : New Epidemiologic Patterns, Emerging Pathogens, and
Improved Outcome with Antifungal Therapy. Clin. Infect. Dis. 1995 ; 20 : 900-906.
10. WINGARD JR. Importance of Candida Species Other than C. albicans as Pathogens in
Oncology Patients. Clin. Infect. Dis. 1995 ; 20 : 115-125.
- CE jelzs (Eurpai direktva 98/79/CE az in vitro diagnosztikai cl orvosi

eszkzkrl)
- Csak in vitro diagnosztikai

felhasznlsra!
- Katalgusszm
- Gyrt
- Meghatalmazott Kpviselet
- Gyrtsi szm
- Szavatossgi id
- Trolsi hmrskleti hatrok
- Lsd a hasznlati utastst
- CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices)

- Marquage CE (Directive europenne 98/79/CE relative aux dispositifs mdicaux de diagnostic
in vitro)
- Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnstico in vitro)
- EG Markierung (Europische Richtlinie 98/79/EG ber In-vitro-Diagnostika)
- Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro)
- Marcao CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos mdicos de diagnstico
in vitro)
- CE-mrkning (Europa direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter lr in vitro-diagnostik)
- CE-mrkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik)
IVD
- For in vitro diagnostic use

- Pour diagnostic in vitro
- Para diagnstico in vitro
- In vitro-Diagnostikum
- Per uso diagnostico in vitro
- Para uso em diagnstico in vitro
- In vitro diagnostik
- In vitro diagnose
- Manufacturer
- Fabricant
- Fabricante
- Hersteller
- Produttore
- Fabricante
- Tillverkad av
- Fremstillet af
LOT
EC REP
- Batch code
- Code du lot
- Cdigo de lote
- Chargen-Bezeichnung
- Codice del lotto
- Cdigo do lote
- Batch nr.
- Batchkoden
- Storage temperature limitation
- Limites de tempratures de stockage
- Temperatura limite
- Lagerungstemperatur
- Limiti di temperatura di conservazione
- Limites de temperatura de armazenamento
- Temperaturbegrnsning
- Temperaturbegrnsning
66
REF
- Catalogue number
- Rfrence catalogue
- Nmero de catlogo
- Bestellnummer
- Numero di catalogo
- Nmero de catlogo
- Katalognummer
- Katalognummer
- Authorised Representative
- Reprsentant agr
- Representante autorizado
- Bevollmchtigter
- Distributore autorizzato
- Representante Autorizado
- Auktoriserad representant
- Autoriseret reprsentant
- Expiry date YYYY/MM/DD
- Date de peremption AAAA/MM/JJ
- Estable hasta AAAA/MM/DD
- Verwendbar bis JJJJ/MM/TT
- Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG
- Data de expirao AAAA/MM/DD
- Utgngsdatum r/Mnad/Dag
- Anvendes fr /MM/DD
- Consult Instruction for use

- Consulter le mode d'emploi
- Consulte la instruccin para el uso
- Siehe Gebrauchsanweisung
- Consultare le istruzioni per uso
- Consulte o folheto informativo
- Se instruktionsanvisning vid anvndning
- Se instruktion fr brug
The other languages which are required in conformity to the European

Directive can be obtained from your local Bio-Rad agent.
Les autres langues requises par la Directive Europenne sont disponibles
auprs de votre reprsentant Bio-Rad local.
Los otros idiomas que se requiren para la conformidad de la Directiva
Europea puede ser obtenida en su oficina local Bio-Rad.
Die anderen Sprachen, die in bereinstimmung mit der europischen IVD
Direktive bentigt werden, erhalten Sie ber Ihre lokale Bio-Rad
Niederlassung.
Le altre lingue che sono richieste in conformit con le Direttive Europee
possono essere ottenute dal locale agente Bio-Rad.
As restantes lnguas, obrigatrias em conformidade com a Directiva
Europeia, podem ser obtidas atravs da subsidiria Bio-Rad mais prxima
de si.
vriga sprk som krvs i enlighet med EG-direktivet kan erhllas frn din
lokala Bio-Rad-representant.
De vrige sprog som krves i henhold til EU direktiv kan fs ved
henvendelse til den lokale Bio-Rad leverandr.
67
Bio-Rad
3, boulevard Raymond Poincar
92430 Marnes-la-Coquette France
Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00
Fax.: +33 (0) 1 47 41 91 33
10/2003
code: 880023

Fungi Test

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FUNGITEST

This preliminary study was performed in 2 reference Laboratories, the

3- COMPOSITION OF THE KIT

5- fluorocytosine (2-32 g/ml)

amphotericin B (2-8 g/ml)

miconazole (0.5-8 g/ml)

ktoconazole (0.5-4 g/ml)

itraconazole (0.5-4 g/ml)

fluconazole (8-64 g/ml)

Diagram of the microplate

5- MATERIAL REQUIRED NOT SUPPLIED

Sterile distilled water

PREPARATION OF THE INOCULUM

Culture for 24 to 48 hours.

1.9 ml of sterile distilled water

3 ml of sterile distilled water

READING AND INTERPRETATION

Strain inhibited by 5- fluorocytosine

Strain inhibited by amphotericin B

Strain intermediate to miconazole

Strain intermediate to ketoconazole

Strain intermediate to itraconazole

Strain non inhibited by fluconazole

Using a calibrated pipette, dilute 100 l of this inoculum in 1.9 ml of

B. INOCULATION OF THE MICROPLATE

C. INCUBATION OF THE MICROPLATE

D.READING AND INTERPRETATION OF THE RESULTS

HYGIENE AND SECURITY RECOMMENDATIONS

8- QUALITY CONTROL OF THE TEST

tropicalis ATCC 750

RESULT OF THE CULTURE

* Incubation for 72H at 32C

9- QUALITY CONTROL OF THE MANUFACTURER

Les concentrations dantifongiques obtenues correspondent des

5-Fluorocytosine (2-32 g/ml)

Amphotricine B (2-8 g/ml)

Miconazole (0,5-8 g/ml)

Ktoconazole (0,5-4 g/ml)

Itraconazole (0,5-4 g/ml)

Fluconazole (8-64 g/ml)

5- MATRIEL NCESSAIRE NON FOURNI

Eau distille strile

1,9 ml deau distille strile

3 ml deau distille strile

Souche inhibe par la 5- fluorocytosine

Souche inhibe par lamphotricine B

Souche intermdiaire au miconazole

Souche intermdiaire au ktoconazole

Souche intermdiaire litraconazole

Souche non inhibe par le fluconazole

D.LECTURE ET INTERPRTATION DES RSULTATS

CONSIGNES D'HYGINE ET DE SCURIT

8- CONTRLE DE QUALIT DU TEST

RESULTAT DE LA CULTURE EN 48H 37C

* Incubation pendant 72H 32C

9- CONTRLE QUALIT DU FABRICANT

10- RFRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

DETERMINACION DE LA SENSIBILIDAD DE LOS

El medio de suspensin inoculado vuelve a hidratar los agentes

3- COMPOSICION DEL ESTUCHE

5- fluorocitosina (2-32 g/ml)

amfotericina B (2-8 g/ml)

miconazol (0,5-8 g/ml)

ketoconazol (0,5-4 g/ml)