Microbiologa general y de los alimentos 1

Determinacin de coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli

Prctica No 8
DETERMINACIN DE COLIFORMES TOTALES, COLIFORMES FECALES Y ESCHERICHIA COLI

I.

OBJETIVOS:
-

II.

Aprender a determinar en nmero de coliformes totales, coliformes fecales y

Escherichia coli por el mtodo del nmero ms probable.

FUNDAMENTO:
Se basa en determinar la calidad sanitaria de un determinado alimento a travs del
nmero de coliformes totales, fecales y Escherichia coli, considerando este ltimo
como indicador microbiano proveniente de contaminacin fecal.

III.

MARCO TERICO:
La denominacin genrica
coliformes designa a un grupo
E. coli
de especies bacterianas que
tienen ciertas caractersticas
bioqumicas en comn e
importancia relevante como
indicadores de contaminacin
del agua y los alimentos.
Coliforme significa con forma
de coli, refirindose a la
bacteria principal del grupo, la
Escherichia coli, descubierta por el bacterilogo alemn Theodor von Escherich en
1860. Von Escherich la bautiz como bacterium coli ("bacteria del intestino", del
griego , kolon, "intestino"). Con posterioridad, la microbiologa sistemtica
nombrara el gnero Escherichia en honor a su descubridor.
El grupo contempla a todas las bacterias entricas que se caracterizan por tener las
siguientes propiedades bioqumicas:
1. ser aerobias o anaerobias facultativas,
2. ser bacilos Gram negativos,
3. no ser esporgenas,
4. fermentar la lactosa a 37 C en 48 horas, produciendo cido lctico y gas.

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Tradicionalmente se los ha considerado como indicadores de contaminacin fecal en el
control de calidad del agua destinada al consumo humano en razn de que, en los
medios acuticos, los coliformes son ms resistentes que las bacterias patgenas
intestinales y porque su origen es principalmente fecal. Por tanto, su ausencia indica que
el agua es bacteriolgicamente segura.
Asimismo, su nmero en el agua es proporcional al grado de contaminacin fecal;
mientras ms coliformes se aislan del agua, mayor es la gravedad de la descarga de
heces.
Qu son los coliformes fecales?
Los coliformes fecales son microorganismos con una estructura parecida a la de una
bacteria comn que se llama Escherichia coli y se transmiten por medio de los
excrementos. La Escherichia es una bacteria que se encuentra normalmente en el
intestino del hombre y en el de otros animales. Hay diversos tipos de Escherichia;
algunos no causan dao en condiciones normales y otros pueden incluso ocasionar la
muerte.
Formas patgenas de Escherichia y de otras bacterias (que por tener forma similar se
denominan genricamente coliformes fecales) se transmiten, entre otras vas, a travs
de las excretas y comnmente por la ingestin o el contacto con agua contaminada. La
Escherichia no sobrevive mucho tiempo en agua de mar, pero otros coliformes fecales s,
por lo que suelen reportarse en conjunto.

Coliformes Fecales (Recuento en placa)

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IV. PARTE EXPERIMENTAL.
Materiales.
-

Placas Petri
Pipetas de 1 mL
Tubos de ensayo
Campanas Durham
Gradilla
Balones
Mechero
Balanza mecnica
Licuadora
Pinza y tijeras
Estufa
Matraz de Erlenmeyer
Contador de colonias
Solucin salina peptonada
Caldo Brila (volumen de 10 mL en cada tubo conteniendo tubos de fermentacin)
Caldo E. C. (volumen de 10 mL en cada tubo conteniendo tubos de fermentacin)
Caldo triptona
Agar EMB (Eosin Metil Blue)

Procedimiento.
Preparacin de diluciones decimales a partir de homogeneizados de alimentos.
Una vez tomada la muestra debe iniciarse el anlisis inmediatamente, caso contrario deber ser
refrigerada (0 C 5 C) o mantenerla en condiciones especficas segn el tipo de alimento tan
pronto como sea posible.
1. Tarar el vaso del homogeneizador estril vaco y pesar en l 50 g representativos de la muestra
del alimento.

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2. Aadir al vaso 450 mL de solucin salina peptonada (ssp), y de este modo se obtiene la primera
dilucin: dilucin 10-1.
3. Homogenizar el alimento triturndolo por 2 minutos, comenzando con un bajo nmero de
revoluciones y aumentando gradualmente la velocidad hasta alcanzar el mximo de revoluciones.
Hay que tener presente que desde el que se mezcla muestra y diluyente debe evitarse cualquier
retraso innecesario.
4. Esperar de 2 a 3 minutos hasta que se separe la espuma y se formen 3 fases definidas.

5. Medir 1 mL del lquido sobrenadante y llevarlo a un tubo con 9 mL de ssp, para obtener la
dilucin 10-2 (2da dilucin). Agitar esta dilucin y las subsiguientes enrgicamente 25 veces en un
arco de 30 cm.
6. Medir nuevamente 1 mL de la dilucin anterior y, llevarlo a un tubo con 9 mL de ssp para
obtener la dilucin 10-3 (3ra dilucin). Repetir esta operacin en las siguientes diluciones o las
necesarias segn se indique la experiencia para el alimento que se va analizar (10-1, 10-2, 10-3).

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Siembra en caldo Brila.
1. Pipetear 1 mL de cada una de las diluciones del homogeneizado del alimento en tres tubos por
cada dilucin en el medio de cultivo caldo Brila conteniendo en su interior tubos de fermentacin
de forma invertida.

2. Incubar los tubos a 35 C 37 C por 24 horas a 48 horas.

3. Pasadas las 48 horas, anotar los tubos que presentan produccin de gas en las campanas
Durham (prueba presuntiva) de cada dilucin.
4. Para obtener el Nmero Ms Probable (NMP), proceder de la forma siguiente: ver en cada una
de las tres diluciones seleccionadas el nmero de tubos que presentan gas. Buscar en la tabla del
NMP y anotar el NMP que corresponde al nmero de tubos positivos de cada dilucin.

V. RESULTADOS.
1ra Lectura COLIFORMES TOTALES
En los tubos de caldo Brila de la primera etapa (Nmero Ms Probable) se observ
formacin de gas en los 3 tubos siendo el reporte para el NMP el siguiente:

Nmero De
Coliformes
Totales

10-2

10-3

10-4

RESULTADO

>1100/g

2da Lectura NMERO DE COLIFORMES FECALES

Tubos de caldo Brila a temperatura de 45 oC

Nmero De
Coliformes
Fecales

10-2

10-3

10-4

RESULTADO

<3/g

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El resultado expresa una gran carga microbiana por parte de coliformes en el queso analizado,
valor que sobrepasa lo permitido para el queso fresco dado por la siguiente tabla:
NOMBRE DEL PRODUCTO
Ensaladas verdes, crudas o de frutas
Salsas y purs cocidos
Alimentos cocinados a base de carne
de mamferos, aves, pescados
Aguas preparadas

Queso fresco

Zumos, nctares, bebidas a base de

frutas y verduras no pasteurizadas

DETERMINACIONES
Mesfilos aerobios ufc/g
Coliformes totales NMP/g
Mesfilos aerobios ufc/g
Coliformes totales NMP/g
Mesfilos aerobios ufc/g
Coliformes totales NMP/g
Mesfilos aerobios ufc/g
Coliformes totales NMP/g
Coliformes fecales NMP/g
Coliformes fecales NMP/g
Mohos y levaduras (ufc/g)
Salmonella en 25 g
Staphylococcus aureus (ufc/g)
Listeria monocytogenes en 25 g
Mesfilos aerobios ufc/g
Coliformes totales NMP/g

LMITE MXIMO
PERMISIBLE
150 000
100
5 000
50
150 000
Menos de 10
150 000
100
Negativo
100
500
Ausente
1 000
Negativo
100 000
100

Lmites microbiolgicos de la ICMSF (International Commission on Microbiological Specifications for Foods).

Caso contrario ocurre para el nmero de coliformes fecales, ya que no se observ presencia de
estos en el queso fresco analizado, ms no podemos dejar de mencionar la gran cantidad de
contaminacin que presento.
VI. DISCUSIONES
No se realiz las pruebas de aislamiento para la E. coli ya que el recuento de coliformes
fecales fue mnima, por lo tanto se sospecha la presencia mnima de esta enterobacteria.
Segn Salas, Sonia (1999) en su libro Retos de la Agroindustria Rural Andina en el
Contexto de la Globalizacin menciona lo siguiente: Los quesos fabricados a nivel
artesanal contienen una alta contaminacin fecal ya que no se pasteuriza la leche, a la
falta de higiene en la obtencin de la leche y en la fabricacin del queso, a la inexistencia
de sanitizacin del equipo y a la inadecuada higiene de los operarios
*Lo mencionado anteriormente por el autor se puede dar por cierto, ya que el queso
analizado en clase result siendo cuna de millares de bacterias, siendo un riesgo para
quien lo consuma. Menciona tambin lo importante que es la higiene en todos los puntos
del proceso de produccin lo que podemos dar por cierto ya que para presentar tales
niveles de carga microbiana en nivel de higiene con el que fue procesado y posteriormente
comercializado fue completamente errneo.

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Alarcn, Luis Roberto en su libro Manual de Prcticas de Microbiologa Bsica y de los
Alimentos nos dice lo siguiente: La interpretacin de la presencia y abundancia de
coliformes en alimentos generalmente es considerada con un triple significado en
ingeniera sanitaria: A) Como indicador de contaminacin fecal o de malas prcticas de
trabajo en el manejo de los alimentos. B) Como causa de la alteracin de los alimentos. C)
Como agentes etiolgicos de enteritis.
* Segn lo trabajado en prctica podemos descartar la causa B que nos presenta el autor,
ya que el queso analizado presentaba buenas caractersticas organolpticas, descartando
malos olores o cualquier tipo de hinchamiento anmalo, cuestin que es an ms
peligrosa pues no se puede observar con facilidad un queso contaminado a simple vista.
VII. CONCLUSIONES
El conteo final para coliformes totales fue de >1100 NMP/g y para coliformes fecales <3
NMP/g.
La elevada carga microbiana en las muestras de queso analizadas refleja deficiencias
higinicas en la manipulacin del queso fresco artesanal que se comercializa en el
mercado estudiado, lo cual representa un riesgo para la salud del consumidor. No se
observ la presencia de coliformes fecales, pero s gran nmero de coliformes totales.
La causa de que dentro del gran nmero de coiformes totales encontrados no haya
habido presencia significativa de fecales, fue que las tcnicas utilizadas y estudiadas en
clase no se pudieron llevar a cabo concretamente por las deficiencias de nuestro
laboratorio.
La contaminacin de un alimento por E. Coli implica que uno o ms de una amplia
diversidad de patgenos entricos puede contaminar un alimento, por lo tanto es un
riesgo para la salud.
Existe un gran riesgo para los consumidores por las malas prcticas que se llevan a cabo
en los mercados zonales, ya que al comercializar estos quesos contaminados ponen en
riesgo la salud de muchas personas.
La carga microbiana tan elevada podran indicar que durante la manipulacin de la
materia prima o su procesamiento no se han cumplido las medidas sanitarias de rigor. Una
carga microbiana elevada puede afectar a la calidad del producto, ya que la presencia de
estos microorganismos se asocia con el deterioro precoz de los quesos o con
fermentaciones anormales.
El examen microbiolgico siempre ha sido til, no solo como ndice de descomposicin,
sino tambin como indicador del estado sanitario de producto por medio del recuento
total de bacterias, el conteo de coliformes totales y fecales y otros microorganismos
patgenos; adems constituye un anlisis obligado en los controles de calidad en casi
todos los pases.

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VIII. BIBLIOGRAFA
Alarcn, Luis Roberto (2001) Manual de Prcticas de Microbiologa Bsica y de los Alimentos.
Universidad Autnoma de Jurez: Mxico.
Herrera C. (2003) Qumica de alimentos. Editorial Universidad de Costa Rica: Costa Rica
Salas, Sonia (1999). Retos de la Agroindustria Rural Andina en el Contexto de la Globalizacin.
LIMA-PER.