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CAMPUS IV
AISLAMIENTO, SELECCIN Y USO DE BACTERIAS
DIAZOTRFICAS DE LA RIZSFERA DE Jatropha
curcas
TESIS
QUE PARA OBTENER EL TTULO DE INGENIERO
BIOTECNLOGO
PRESENTA
JALSEN IVN TECO BRAVO
DIRECTOR DE TESIS:
Dra. Ma. DE Lourdes Adriano Anaya
ASESORES:
Dr. Miguel Salvador Figueroa
MC. Isidro Ovando Medina
TAPACHULA, CHIAPAS.
MAYO DE 2010.
AGRADECIMENTOS
A Dios
Por concederme la oportunidad de existir y con ello descubrir y llevar a cabo tantas cosas,
entre ellas, este trabajo y por darme las fuerzas que para esto se necesita, porque con el hay
sabidura y podero, el tiene consejo y entendimiento.
A mi madre
Por su incansable esfuerzo, por todo lo que ha hecho por mi, por el ejemplo que para mi
representa, por ser el motor de mis aspiraciones y sueos porque simple y sencillamente sin
ella no habra sido posible este y otros logros.
NDICE
Presentacin...........1
Resumen.........2
Introduccin...3
Materiales y Mtodos....5
Resultados y Discusin..9
Referencias...................19
Presentacin
Los biocombustibles surgen como alternativas limpias a los actuales combustibles fsiles.
Algunos de estos combustibles se obtienen de una serie de vegetales, los que requieren
cultivarse masivamente. Se ha convenido que la produccin de biodiesel preferentemente se
realice a travs del aceite de las semillas de Jatropha curcas. Por lo anterior, el cultivo a
gran escala de dicha planta requiere cumplir con los criterios actuales de sustentabilidad. En
este sentido, el empleo de fertilizantes de sntesis qumica durante dicho proceso no debera
ser un insumo contemplado. Atendiendo a lo anterior, el uso de inoculantes microbianos
como biofertilizantes resulta una alternativa sustentable para dicho propsito, puesto que se
ha comprobado que estas promueven el crecimiento de las plantas a travs de mecanismos
como la fijacin biolgica de nitrgeno, el transporte de minerales y la sntesis de
precursores de fitohormonas, entre otras funciones. Aunque los biofertilizantes ya se
encuentran en el mercado, su procedencia es una limitante de su eficacia. Por lo anterior es
necesario desarrollar inoculantes apropiados que estn adaptados a las condiciones
ambientales en que J. curcas se desarrolla. De esta forma se puede garantizar la eficacia
del biofertilizante al ser aplicado en campo y que la biofertilizacin tenga efecto en el
desarrollo de las plantas. Por lo tanto, el aislamiento de rizobacterias promotoras del
crecimiento de las plantas de la rizsfera de esta misma planta para la produccin de
inoculantes, parece ser la solucin que cumple con los requerimientos mencionados para su
viabilidad, puesto que estas bacterias se encuentran adaptadas tanto a las condiciones micro
como macro ambientales de sta.
Resumen
Jatropha curcas ha recibido especial inters en varios pases por el alto contenido de
aceite de sus semillas el cual puede utilizarse para la produccin de biodiesel. La
adaptabilidad de esta planta a suelos marginales permite pensar que la microbiota asociada
a su rizsfera desempea un papel importante en su nutricin y desarrollo. En el presente
trabajo se aislaron rizobacterias diaztrofas, ecto y endorizosfricas de J. curcas de 29
diferentes sitios del estado de Chiapas, Mxico. Las cepas se caracterizaron en funcin de
la produccin de indoles y se evalu su efecto en la germinacin y desarrollo de plntulas
de J. curcas. Un total de 524 morfoespecies fueron aisladas en medios de cultivo libres de
nitrgeno, 52.5% de la ectorizsfera y las restantes de la endorizsfera. Quince
morfoespecies, 14 de ellas ectorizosfricas, produjeron indoles en el intervalo de 1525g.ml-1 las cuales adems del diaztrofo 11B, se emplearon para la inoculacin de
semillas de J. curcas. No se observ efecto en la germinacin. En cuanto a las variables de
desarrollo de las plntulas, se encontr diferencias significativas (P0.05) en la longitud y
dimetro del tallo, peso seco y porcentaje de humedad.
Palabras clave: Jatropa curcas. Biodiesel. Biofertilizantes. Rizobacterias. cido Indol Actico.
Introduccin
El empleo de recursos renovables para la produccin de carburantes lquidos resulta en la
actualidad necesario para sustituir a los combustibles fsiles (Ginwal et al. 2005). Por tener
propiedades semejantes a las del diesel de petrleo, el biodiesel, se ha colocado como la
principal alternativa puesto que su uso no requiere modificaciones tecnolgicas en los
motores donde se utiliza (Agarwal 2007). Atendiendo a lo anterior, se estn investigando
plantas con alto potencial para la produccin de aceites no comestibles, tales como
Jatropha curcas, la cual ha recibido especial atencin por el alto contenido de aceite en
sus semillas (48%) (Kochhar et al. 2008). Adems, es reconocida por su adaptabilidad a
suelos marginales; es nativa de Mesoamrica y actualmente crece de manera amplia en
muchos pases tropicales y subtropicales (Tong et al. 2006). En busca de asegurar la
disponibilidad de semillas de J. curcas, se requerir del cultivo masivo de esta planta, sin
embargo, ste no debera llevarse a cabo en suelos de buena calidad pues competira con la
produccin agrcola, ni ser dependiente de fertilizantes elaborados a partir de petrleo
puesto que se elevaran los costos de produccin adems de impactar al ambiente, por lo
tanto, resulta necesario el desarrollo de alternativas sustentables que solventen dicha
problemtica (Kun et al. 2007; Ovando-Medina et al. 2009a). En este contexto, se ha
comprobado que el uso de Rizobacterias Promotoras del
(PGPR, por sus siglas en ingls) como biofertilizantes, promueve el crecimiento, ya sea
directamente a travs de la fijacin biolgica de nitrgeno, sntesis de fitohormonas y
solubilizacin de compuestos insolubles, o indirectamente, mediante mecanismos de
biocontrol como la sntesis de antibiticos, enzimas lticas, siderforos e iniciacin de la
Resistencia Sistmica Inducida (ISR) por parte de la planta (Curatti et al. 2005; Wu et al.
2005; Caballero-Mellado 2006; Ribaudo et al. 2006).
promocin del crecimiento de cultivos de importancia agrcola tales como, sorgo (AdrianoAnaya et al. 2006), maz (Mehnaz y Lazarovits 2006), lechuga (Pea y Reyes 2007), trigo
(Mahmoud y Mohamed 2008) y tomate (Huerta et al. 2007) entre otros; expresados en
incremento significativo en el peso fresco de brotes, plntulas, races, longitud del tallo;
pelos radicales y superficie de la raz, promocin de formacin
de races laterales;
Materiales y mtodos
Muestreo
Se tomaron muestras de rizsfera de Jatropha curcas de 29 diferentes sitios del estado de
Chiapas, Mxico, previamente georreferenciados por Ovando et al. (2009b). Se
seleccionaron tres plantas de entre 1 y 1.5 m de altura, separadas por una distancia
aproximada de 25 m, procurando obtener el total de las races, principalmente las de menor
dimetro, para ello la planta fue extrada en su totalidad, las races fueron colocadas en
bolsas de plstico con suelo propio suficiente para cubrirlas, transportadas en hielo y
conservadas a 10 C.
Cuantificacin de bacterias diazotrficas
Para determinar la cantidad de bacterias diazotrficas presente en las races de J. curcas
primeramente la rizsfera de plantas del mismo sitio, se mezcl para conformar una
muestra compleja. Las races presentes en la mezcla compleja se colocaron en un tamiz y se
lavaron con agua corriente para eliminar el exceso de suelo. Diez gramos de races
terciarias se colocaron en un matraz y se aforaron a 100 ml con agua destilada estril. La
suspensin se agit durante 20 min a 200 rev.min-1. Despus de la sedimentacin de los
slidos, con el sobrenadante se hicieron diluciones seriadas hasta 1x10-7. De las tres ltimas
diluciones se inocularon 100 l por picadura en tubos de ensayo que contenan medio de
cultivo semigelificado. Los tubos se incubaron a temperatura ambiente hasta observar
crecimiento. Se utilizaron tres medios de cultivo especficos para bacterias diazotrficas:
Nfb, LG y LGI (Dbereiner et al. 1995). Se hicieron tres rplicas por cada dilucin
empleada. La poblacin de diaztrofos se estim a travs de la tcnica del nmero ms
probable (NMP) (Woomer, 1994).
5
La longitud de los tallos se midi con una cinta graduada, desde la superficie del suelo
hasta el pice de la plntula y el dimetro de estos a travs de un vernier a la altura de la
superficie del suelo. El peso fresco y seco de las plntulas fue medido en una balanza
analtica, para el ltimo caso, las plntulas fueron colocadas en un horno a 60C durante
72h. Mientras que el porcentaje de humedad se obtuvo mediante la siguiente frmula:
( /)100; donde: = Peso fresco; = Peso seco.
Resultados y Discusin.
Abundancia y nmero de morfoespecies de bacterias diazotrficas
La poblacin de clulas de diaztrofos de la rizsfera de J. curcas estuvo en el intervalo de
3.6 x 107 hasta > 11 x 109 clulas.ml-1 (Cuadro 1).
Cuadro 1 Abundancia de bacterias diaztroficas [clulas.ml-1 (x108)] ectorizosfricas y endorizosfricas de
Jatropha curcas aisladas de diferentes sitios del estado de Chiapas, Mxico.
Ectorizosfricas
Endorizosfricas
Ectorizosfricas
Endorizosfricas
Sitio
Sitio
LG
Nfb
LGI
LG
Nfb
LGI
LG
5.3
29
> 110 110
ND
ND
ND
ARR
> 110 LACO 110
3.5
24
> 110
2.7
1.9
110
110
40
110
110 > 110 110
RIZ
0.92 CHIC > 110 > 110 > 110
> 110 > 110 110
16
110 > 110 > 110
> 110 > 110
21
TYL
> 110 VCR
16
> 110
5.3
2.7
> 110
40
110
> 110
5.3
2.9
VCO > 110 > 110 > 110
16
5.3
> 110 > 110
PUJ > 110 > 110 > 110
40
21
2
110
2
2.7
CCR > 110
110 CDCU > 110 110
40
29
> 110 > 110
21
110
110
15
> 110 > 110
40
VIF
2
9.3
2
1.9
1.5
1.9
1.5
RV
> 110 COM
15
7.5
2.7
2
9.3
1.5
> 110 VLR
21
> 110 110
2
12
0.79
21
110
ND
ND
ND
TON > 110
Nfb, LGI, LG: medios de cultivo; ND: No Determinado; SCH: Suchiate, PC: Puerto Chiapas, CAC: Cacahoatn, MAP:
Mapastepec, PIJ: Pijijiapan, ACA: Acapetahua, HUX: Huixtla, TON: Tonal, ARR: Arriaga, SIM: Simojovel, IXT:
Ixtapa, TUX: Tuxtla, BER: Berriozabal, JIQ: Jiquipilas, OZC: Ocozocuautla, CIN: Cintalapa, LACO: Lagos de Coln,
RIZ: Rizo de Oro, CHIC: Chicomuselo, TYL: Tierra y Libertad, VCR: Venustiano Carranza, VCO: Villa Corzo, PUJ:
Pujiltic, CCR: La Concordia, CDCU: Ciudad Cuauhtmoc, VIF: Villa Flores, RV: Revolucin Mexicana, COM:
Comalapa, VLR: Villa Las Rosas.
SCH
PC
CAC
MAP
PIJ
ACA
HUX
SIM
IXT
TUX
BER
JIQ
OCZ
CIN
Nfb
110
> 110
> 110
> 110
> 110
> 110
> 110
40
> 110
> 110
> 110
110
> 110
> 110
LGI
110
21
21
> 110
15
15
2
> 110
> 110
21
> 110
21
29
> 110
LG
110
15
> 110
0.36
0.36
2.7
1.1
21
> 110
21
11
7.5
> 110
> 110
Nfb
> 110
> 110
> 110
1.5
3.5
> 110
> 110
> 110
> 110
> 110
> 110
7.5
21
29
LGI
29
> 110
110
0.36
40
7.5
1.1
> 110
> 110
2.4
> 110
> 110
5.3
110
Sitio
SCH
PC
CAC
MAP
PIJ
ACA
HUX
SIM
IXT
TUX
BER
JIQ
OCZ
CIN
TON
Nfb
3
7
5
4
5
4
6
7
6
4
4
7
4
6
8
LGI LG
3
2
5
2
2
2
1
2
4
1
1
1
4
2
1
2
2
2
3
1
5
2
3
2
4
1
4
1
3
1
Nfb
5
6
8
3
2
7
3
4
2
1
7
3
3
5
ND
LGI
5
2
3
5
2
3
3
3
3
1
2
4
3
4
ND
LG
3
2
1
1
1
3
1
1
2
2
2
2
2
2
ND
Sitio
ARR
LACO
RIZ
CHIC
TYL
VCR
VCO
PUJ
CCR
CDCU
VIF
RV
COM
VLR
Nfb
5
3
6
8
4
3
4
4
3
5
5
5
6
4
LGI LG
3
2
2
2
3
1
4
2
2
2
4
1
3
2
5
1
4
2
2
1
2
1
1
1
3
1
2
2
Nfb
ND
5
6
5
6
6
4
6
4
6
4
3
3
4
LGI LG
ND ND
2
1
4
2
3
2
2
2
3
1
5
1
5
3
2
2
4
2
3
1
1
2
1
1
3
2
Nfb, LGI, LG: medios de cultivo; ND: No Determinado; SCH: Suchiate, PC: Puerto Chiapas, CAC: Cacahoatn, MAP:
Mapastepec, PIJ: Pijijiapan, ACA: Acapetahua, HUX: Huixtla, TON: Tonal, ARR: Arriaga, SIM: Simojovel, IXT:
Ixtapa, TUX: Tuxtla, BER: Berriozabal, JIQ: Jiquipilas, OZC: Ocozocuautla, CIN: Cintalapa, LACO: Lagos de Coln,
RIZ: Rizo de Oro, CHIC: Chicomuselo, TYL: Tierra y Libertad, VCR: Venustiano Carranza, VCO: Villa Corzo, PUJ:
Pujiltic, CCR: La Concordia, CDCU: Ciudad Cuauhtmoc, VIF: Villa Flores, RV: Revolucin Mexicana, COM:
Comalapa, VLR: Villa Las Rosas.
11
233
Nmero de morfoespecies
250
200
150
113
100
39
50
12
0
0-3.5
3.6-7
7.1-10.5
24.5-28
Concentracin (g.ml-1)
Figura 1 Intervalos de produccin de grupos indol por las morfoespecies diaztrficas aisladas de la rizsfera
de Jatropha curcas de diferentes sitios del estado de Chiapas, Mxico.
13
74
72
72
70
70
70
70
66
64
Velocidad de
germinacin
(das -1)
1.275
1.318
1.25
1.324
1.314
1.314
1.24
1.233
1.198
62
62
58
58
56
52
40
40
Velocidad de
germinacin
(das -1)
1.237
1.213
1.303
1.299
1.199
1.037
1.244
1.097
Longitud del
tallo (cm)
Hojas
verdaderas
(n+1)
Dimetro del
tallo (cm)
Contenido de
clorofila
(spad)
Longitud de
la raz (cm)
Peso seco de la
plntula (g)
Humedad (%)
HUXEXC
10.871.85 b
1.450.21 a
13.9515.96a
0.510.11 b
83.422.04 def
BERREXD
11.971.21 ab
1.470.19 a
10.572.63 a
0.640.11 ab
81.773.59 f
IXTEXE
12.212.07 ab
1.510.15 a
0.570.06 a
10.712.83 a
0.690.11 a
83.952.74 bcdef
SIMEXC
11.611.43 ab
1.50.15 a
9.762.7
ARREXA
12.241.93 ab
1.5 0.18 a
11.242.45 a
0.590.15 ab
86.141.02 ab
37.763.63 a
a 0.540.11 b
86.041.89 ab
ARREXD
12.622.29 a
1.43 0.2 a
0.570.05 ab
37.163.54 a
10.663.18 a
0.640.16 ab
86.781.08 a
LACOENC
10.851.82 b
1.410.16 a
11.522.53 a
0.540.1 b
86.442.02 a
CCREXC
11.951.67 ab
1.50.15 a
0.580.12 ab
86.061.41 ab
ACAENC
11.681.6 ab
1.450.14 a
10.933.2
a 0.570.13 ab
85.112.77 abcd
9.582.65
a 0.510.17 b
85.912.21 abc
a 13.1414.85a
PIJEXB
11.341.48 ab
1.480.16 a
0.520.07 c
PIJENB
11.771.66 ab
1.450.15 a
39.834.07 a
11.052.75 a 0.560.14 ab
85.931.95 abc
ACAEXA
12.162.04 ab
1.5 0.21 a
11.742.9
83.642.36 cdef
RVEXD
12.082.06 ab
1.530.16 a
14.1416.56a
10.442.11 a 0.560.11 b
85.992.44 abc
11.393.05 a 0.600.13 ab
82.712.69 ef
0.630.16 ab
84.683.24 abcde
SIMEXA
12.221.11 ab
1.470.17 a
0.520.06 bc
CACEXC
11.461.54 ab
1.480.16 a
11B
12.621.69 a
1.520.18 a
a 0.630.12 ab
83.422.95 def
CONTROL
11.621.33 ab
1.440.17 a
a 0.590.14 ab
84.011.7 bcdef
CV
14.6
11.49
10.25
39.243.99 a
a 0.620.12 ab
48.27
11.092.5
62.12
22.58
2.65
los valores mayores en esta variable. Para ambos casos el valor de las medias fue el mismo,
mientras que los tratamientos HUXEXC y LACOENC presentaron los valores ms bajos.
Para la variable dimetro del tallo, los valores ms altos encontrados correspondieron a los
tratamientos IXTEXE y ARREXD con 0.57 cm para ambos casos. Por otra parte, el
tratamiento PIJEXB fue el que present valor mas bajo.
Los resultados obtenidos en cuanto al peso seco de las plntulas colocaron al tratamiento
IXTEXE como el mas alto con 0.69 g. El porcentaje de humedad de las plntulas de los
tratamientos ARREXD y LACOENC resultaron ser los mayores.
Por otra parte, para las variables nmero de hojas, contenido de clorofila y longitud de la
raz principal no existieron diferencias significativas entre tratamientos.
La nula diferencia en el nmero de hojas y contenido de clorofila podra deberse a la edad
de las plntulas de J. curcas del presente trabajo, ya que como mencionan Desai et al.
(2007) el contenido de clorofila es bajo en edades tempranas de una planta, puesto que sta
le da prioridad a la formacin de los tejidos que le proporcionan soporte ante las
condiciones del
fotosinttico, lo anterior se refuerza si tomamos en cuenta que entre las medidas del
dimetro del tallo si existieron diferencias significativas y que estas fueron tomadas a la
altura de la superficie del suelo, sugirindonos que, precisamente, las plntulas en el inicio
de su establecimiento, buscan asegurar su estabilidad
condiciones ambientales.
Mientras que el nulo efecto de los inoculantes en la promocin del crecimiento de la raz
principal de las plntulas de J. curcas podra atribuirse al estadio de la planta en que se
realiz la inoculacin ya que sta se aplic sobre la semilla y no en la raz de las plntulas
16
puesto que la colonizacin de estas bacterias se lleva a cabo en las races y es ah donde
estas intercambian metabolitos con las plantas y provocan cambios morfolgicos y
fisiolgicos (Ribaudo et al. 2006). Adems, la inoculacin nicamente se llev a cabo en el
da uno del experimento y no se realiz posteriormente cuando el sistema radicular estaba
formado, lo que pudo haber impedido que las clulas inoculadas sobrevivieran hasta el
momento en que las races empezaron a formarse y ejercer as su efecto, ya que de acuerdo
a Murty y Ladha (1987) las rizobacterias colonizan la superficie de la raz a travs de
mecanismos como la imbibicin en la capa de mucigel de la superficie de estas y de la
sntesis de un canal fibrilar de naturaleza proteica, con los cuales estas bacterias aseguran
su adhesin y supervivencia en la raz. Por otra parte, Bashan y Levanony (1990) resaltan
que el proceso anterior llevado a cabo por las bacterias, resulta clave no solo para la
sobrevivencia de stas, sino porque de lo contrario, las sustancias excretadas por ellas, se
difunden a travs del suelo y son consumidas por microorganismos metablicamente
verstiles antes de que puedan ejercer efecto alguno sobre la semilla o la planta.
Por otra parte, a diferencia de los resultados del presente trabajo, Desai et al. (2005)
inoculando semillas de J. curcas con Bacillus pumilus, reportaron porcentaje de
germinacin del 100% nicamente para las semillas inoculadas as como incremento en la
longitud de las races de las plntulas de hasta 140 % respecto al tratamiento control, sin
embargo, ellos inmovilizaron las clulas bacterianas con Carboxil Metil Celulosa
suplementado con quitina y las adhirieron de este modo a la superficie de las semillas, este
proceso pudo haber asegurado que las bacterias se mantuvieran sobre stas y que los
metabolitos excretados por ellas llegaran hacia la semilla y posteriormente a las races,
17
ser atribuida a la
18
Referencias
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