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INTRODUCCION
En la presente investigacin, se refiere al tema de la Caracterizacin de
bacterias metalofijadoras de mercurio, presentes en las aguas del Ro Gala
(aguas abajo en el recinto San Rafael), en la parroquia Tenguel, y que mediante
la tcnica de PCR-DGGE a travs de su subunidad 16s RNA, para trabajos
futuros de bioremediacin de aguas contaminadas por metales pesados
causados por la industria y la minera. Debido al alto desarrollo de la actividad
industrial, la contaminacin al medio ambiente y la destruccin de la flora y
fauna de los ros del Ecuador, es importante la ejecucin de proyectos de
investigacin para establecer tcnicas para remediar todo el dao ambiental
causado durante estas ltimas dcadas.
proporcionar una
Esta caracterizacin de bacterias del ro Gala tiene como fin, el otorgar a los
pobladores la seguridad, de una rpida recuperacin de las condiciones del
agua a su estado original, de esta manera reduciremos los impactos de salud
causados por la contaminacin. El beneficio ambiental que va contribuir esta
investigacin, es el de proporcionarnos informacin fundamental para la
realizacin de mtodos de remediacin de aguas contaminadas por metales
pesados, declinando los compuestos txicos presentes en las agua, utilizando
bacterias propias del medio, sin recurrir a la adicin de especies extranjeras,
que a largo plazo podran desplazar a las especies bacterianas residentes de la
zona, de esta forma podremos ejecutar este tipo de tratamiento a los efluentes
de las mineras y dems industrias que produzcan estos compuestos.
aeruginosa,
que
son
organismos
que
presentan
estas
un
genes ribosomales,
y distribucin de las
CAPITULO 1
1.1 OBJETIVO
Caracterizar mediante la tcnica PCR-DGGE, las bacterias del gnero
pseudomonas presentes en las aguas contaminadas con mercurio en el Ro
Gala (aguas abajo en el recinto San Rafael), en la parroquia Tenguel
1.3 JUSTIFICACION
y alterando la biodiversidad
Y por consiguiente, la
no que de todos los ros que se encuentran en las mismas condiciones por
causa de la industria.
El
identificacin de
de una muestra. Razones por las cuales, se estn remplazando todos los
mtodos tradicionales por mtodos moleculares para el estudio y anlisis de
comunidades bacterianas.
10
CAPITULO 2
2.1 ANTECEDENTES
11
Los
procesos
de
biorremediacin
emplean
clulas
vivas,
biomasas,
Muchas
12
13
14
15
Para la remosin del mercurio exiten metodos quimicos que nos permiten
eliminar o transformar el mercurio en compuestos menos txicos.
Estos
biolgica se utilizaron
hacia
16
Muchas formas de mercurio son txicas para los seres vivos. Pero
17
Las muestras
18
Frente a los problemas presentados por la presencia del mercurio en las aguas,
los microorganismos pueden ser bio-detoxificadores muy eficientes de metales
solubles y particulados, especialmente a partir de concentraciones externas
diluidas, por esto, las tecnologas basadas en los microorganismos ofrecen una
alternativa ayudando a las tcnicas convencionales para la eliminacin y
recuperacin de metales (Ehrlich, L. 1997). A partir de lo anterior se desarrollo
la investigacin basada en un diseo de bio-filtracin, el cual se define como
todo proceso biolgico utilizado para el control o tratamiento de compuestos
voltiles orgnicos e inorgnicos presentes en la fase liquida y gaseosa. Los
microorganismos son los responsables de la degradacin biolgica de los
contaminantes voltiles contenidos en corrientes de agua residual [8].
19
20
6. Por ltimo, a los medios de soporte, del bio-filtro con una concentracin
HgCl
21
22
23
24
25
energtico y minero del pas. Las funciones del Ministerio son las de regular,
controlar y fiscalizar las operaciones hidrocarburferas y mineras, promover la
inversin nacional y extranjera, precautelando los intereses del Estado
Ecuatoriano. La actividad minera en la zona examinada, data de ms de treinta
aos. Existe un estudio de Monitoreo Ambiental de las reas Mineras en el Sur
de Ecuador llamado Sub-componente 3.1, ejecutado por la Swedish
Environmental System (SES) durante el perodo de 1996 a 1998. La compaa
indica que la contaminacin relacionada con las actividades mineras en el sur
del Ecuador, ha sido monitoreada, y el impacto evaluado, durante 5 ocasiones
en los aos 1996-1998. Los estudios incluyeron 4 reas de Ponce Enrquez,
Santa Rosa, Portovelo Zaruma y Nambija.
26
es considerada insignificante.
El
QUEBRADA FRIA
Cuencas: Ro Chico y Gala
Superficie: 308 hectreas mineras.
27
CONCESION TUQUITO 3
Cuenca: Tenguel
rea concesionada: 64 hectreas mineras.
ANDREINA
Ubicacin: Parroquia Tenguel
Cuencas: Ro Gala
Superficie: 36 hectreas mineras.
3.11. Ley de Minera: Ley No 126. Registro Oficial Suplemento No 695 del 31
de mayo de 1991. Art. 79. Estudios de impacto ambiental. Los titulares de
concesiones mineras y de plantas de beneficio, fundicin y refinacin, debern
afectar estudios de impacto ambiental y planes de manejo ambiental para
28
Art. 81. Tratamiento de aguas. Los titulares de derechos mineros que utilicen
aguas para sus trabajos deben devolverlas al cauce original del ro o a la cuenca
del lago o laguna de donde fueron tomadas, libres de contaminacin para que
no se afecte a la salud humana o al desarrollo de la flora y fauna.
29
30
ambientales,
directamente
travs
de
firmas
auditoras
31
32
En consecuencia, los ros materia de anlisis, con excepcin del Gala, cuyo
mayor recorrido es limpio debido a la intervencin de la comunidad de El
Shumiral, conjuntamente con la Fundacin Ecolgica Defensores del Ro
Gala, presentan en sus tramos hasta su desembocadura en el mar, condiciones
ambientales no aceptables, pestilencia permanente y riesgo para la salud de los
habitantes ribereos, debido a las concentraciones de contaminacin qumica
33
Desde el punto de vista geogrfico, la zona de las cuencas de los ros motivo de
anlisis, constituyen las ms importantes zonas extractivas del Ecuador, con el
70% de las explotaciones. La zonas motivo de estudio, comprenden Municipios
como los que se mencionan a continuacin: del ro Caluguro y Santa Rosa al
Municipio de Santa Rosa, Ro Siete, Municipio de El Guabo, Ro Tenguel y Gala,
Municipio de Ponce Enrquez, en su parte Alta y en su parte baja el Municipio de
Guayaquil.
34
35
Los conocimientos
En la atmsfera est
36
pueden llevar a cabo la oxidacin del mercurio a partir del HgS en el sedimento,
oxidando el sulfuro a sulfito y luego a sulfato. El in mercrico (Hg2+), sin
embargo, puede ser reducido en un proceso de desintoxicacin por
microorganismos (por ejemplo pseudomonas sp.) a Hg0 en presencia de NADH
(nicotinamida adenina dinucletido reducido) que se oxida a NAD+ (nicotinamida
adenina dinucletido oxidado). El NAD es una coenzima cuya funcin es actuar
como agente en la transferencia de tomos de hidrgeno en las reacciones de
oxidacin reduccin.
37
En la actualidad el uso de los microorganismos es implementado como biosensores, en el caso de las Pseudomonas que producen seales en presencia
de contaminantes, como metales pesados e hidrocarburos para tratar equilibrar
su sistema biolgico. Los microorganismos son capaces de detectar el ms
mnimo cambio y la presencia de contaminantes, lo que genera un mtodo ms
eficaz y con costos reducidos, que implementando mtodos qumicos
exhaustivos [15].
38
Existen diferentes
Las bacterias del genero Pseudomonas se las define como bacilos gran
negativos, casi siempre mviles por uno o varios flagelos polares, son aerobios
estrictos y cuyo metabolismo slo implementa la va oxidativa. Son bacterias
muy repartidas en la naturaleza, siendo el agua y el suelo su habitad
fundamental, de estos pasan a infectar a los dems organismos superiores.
Afecta a animales y plantas y para el hombre se los considera un microbio tpico
oportunista, que genera infecciones graves que en algunos casos genera
mortalidad y tiene una gran resistencia a la presencia de antibiticos [19].
39
40
41
retencin del metal mediante una interaccin fisicoqumica del metal con
ligandos pertenecientes a la superficie celular. Esta interaccin se produce con
grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular, pertenecientes a partes
de molculas componentes de las paredes celulares, como por ejemplo:
carboxilo, amino, hidroxilo, fosfato y sulfhidrilo.
42
bacterias
Klebsiella
planticola
Pseudomonas
aeruginosa.
Bio-
43
44
millones con predicciones a la alza de $640 billones para el 2010. Estos valores
van aumentando cada da. Estos valores equivalen a la industria qumica
mundial y es como si empleramos a tres millones de personas. Por qu elegir
un proceso biolgico para el tratamiento de metales pesados en la industria ya
parece
haber
una
gama
completa
de
tecnologas?.
Debido,
que
es importante tener en
45
interdisciplinario
de
investigacin,
el
desarrollo
de
medio
ambiente
46
47
CAPITULO 3
3.1 METODOLOGIA
DISEO EXPERIMENTAL
48
Sistema de coordenadas
El muestreo que se realizar ser tipo de estratificado, puesto que las muestras
a ser tomadas sern por capas o estratos de condiciones homogneas. Es un
muestreo muy utilizado en Ecologa. Estos muestreos sirven para confirmar
algn tipo de distribucin y caracterizacin de bacterias hetertrofas en el ro
Gala.
49
50
Gala 25.25m3/s
465Km2
Z = 4/3.75 pleamar
Z = 0.35/0.20 bajamar:
Horario de muestreo. GRAFICO [4] y Tabla 1.
51
arriba.
52
CONTEO MICROBIOLOGICO
0.0002 mg/l
53
Equipos
Autoclave
Cmara estril
pH-metro
Balanza
Cocineta
Incubadora
Materiales
Bomba de vaco
Pinzas estriles
Asa de platino
Esptula de Drygalski
Mechero de alcohol
Micro-pipetas
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Conos
Matraces
Guantes
Papel de empaque
Algodn
Alcohol potable
Tubos de 1.5 ml
54
Cinta adhesiva
Probeta
Reactivos
Agua destilada
Cloruro de mercurio
Pasos:
Cultivaremos las 48 membranas de filtrado en cada una de las cajas petri con
pseudomona agar king A. Al culmino de la incubacin contaremos las colonias
en sus respectivas membranas. Se expresar los resultados como unidades
formadoras de colonias (u.f.c.) por 100 ml de agua, considerando el volumen
filtrado y el factor de dilucin. Se seleccionar las colonias de pseudomonas
desde los 48 agares cultivado. Obteniendo la seleccin, procederemos a aislar
las colonias sospechosas, especificadas en el agar selectivo, y volveremos a
aislar las colonias para cultivar en al agar pseudomona king A, donde crecern
en condiciones de pH de 7 (+/-2).
55
1000.000ml
1000 l
1ml
X l
10 l en 1ml de solvente
56
Nota:
57
METODO DE DGGE:
Siguiendo el protocolo descrito por (G. Muyzer, E.C. de Waal and A.G.
Uitterlinden. 1993.) La utilidad de sta diferenciacin radica en donde hay
mezclas de varios fragmentos de ADN con stas caractersticas es muy comn
cuando se amplifican fragmentos de genes utilizando la tcnica PCR. Entonces
para dicho efecto, nos valdremos de un gel de poliacrilamida (6%) con gradiente
qumico lineal de 40 - 60% desnaturalizante (Urea-formamida).
Se lo
58
59
Mdulo central
60
aadiremos 0,1
61
La amplificacin exponencial del DNA por PCR - DGGE permitir obtener una
cantidad suficiente de muestra para poder llevar a cabo los anlisis
subsecuentes, lo cual lo realizaremos mediante la tcnica ya descrita por
Schaefer et al., (2001). Las bacterias sern extradas a partir de los cultivos
lquidos en los cuales se las aisl previamente, estas cadenas de ADN sern
amplificadas
por
PCR
DGGE
usando
los
primers
PRBA338F-GC
(5GCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTA
CGGGAGGCAGCAG-3)
518R1
(5-ATTACCGCGGCTGCTGG-3),
62
Tincin:
Anlisis de Imagen:
63
Mediante el uso de
ndices de Diversidad
64
65
Los ndices que proponemos adems de (S) para medir la riqueza de especies,
de manera independiente al tamao de la muestra, debe basarse en la relacin
entre S y el nmero total de individuos observados o (n), que se incrementa
con el tamao de la muestra.
66
ndice de ShannonWeaver:
Este ndice representa a los individuos que se muestran al azar a partir de una
poblacin "indefinidamente grande", esto es, una poblacin efectivamente
infinita. La ventaja de este ndice es que l lleva en consideracin el nmero de
las especies y las especies dominantes. En este caso se calcula en base a las
bandas de los perfiles obtenidos del DGGE, o sea que toma en cuenta el
nmero y la intensidad relativa de las bandas (Koizumi, 2003) [28].
Donde:
es la intensidad relativa de las bandas en un perfil.
67
68
2.
69
CAPITULO 4
70
71
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
metales pesados.
72
ANEXOS
73
GRAFICOS
FIGURA 1
FIGURA 2
74
FIGURA 3
21:36
19:12
16:48
14:24
12:00
Metros
9:36
HORA
7:12
4:48
2:24
0:00
3.61 P
0.78 B
3.64 P
0.76 B
75
Microbiologa, medio
selectivo (pseudomona
agar Kin A)
Ensayo: Cultivo de
cepas en la mezcla
agar-mercurio
Primer
aislamiento de
Cepas
Segundo aislamiento
(Cepa metalofijadora)
PCR
Extraccin de ADN
Amplificado 16S
rRNA de toda la
poblacin
bacteriana
Caracterizacin
bacteriana
76
FIGURA 6
Muestra especfica
Huella digital
Banda de purificacin y
secuenciacin
Anlisis de secuencia
comparativa con base de
datos de secuencias
conocidas.
Identificacin de especies microbianas
TABLAS
77
TABLA 1.
Hora
hh:mm
Altura
Metros
00:30
3.64 P
06:30
0.76 B
12:00
3.61 P
19:30
0.78 B
TABLA 2.
Horario
Tipo de marea
00:30
3.64 P
12
06:30
0.76 B
12
12:00
3.61 P
12
19:30
0.78 B
12
8/punto
24
48
Total
TABLA 3.
78
Dilucin
100
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
Concentracin
0.1ppm 0.01ppm
Concentracin
real
0.5ppm 0.05ppm
Volumen 1
---
---
50l
50l
50l
50l
Volumen final
---
---
1000 l
1000l
1000
l
1000 l 1000 l
8000
8000
8000
8000
Total (*8c/D)
TABLA 4.
TABLA 5.
8 cajas petri
c/u 10-2
8 cajas petri
c/u 10-3
8 cajas petri
c/u 10-4
8 cajas petri
c/u 10-5
8 cajas petri
c/u 10-6
Total
40 cajas petri
50l
8000
79
Componentes de la reaccin
Metodologa
Agua MQ
Amortiguador 10x
MgCl2
dNTPs 1
Iniciador 8for
Iniciador 1492 rev
Taq polimerasa 5 U/l
DNA molde
Concentracin final
Variable
1x
1.5mM
0 mM de cada dNTP
6.6 pmol/l
6.6 pmol/l
1 U/l
0.25 mg/reaccin
25l de reaccin
17.30 l
2.50 l
1.50 l
0.5 l
1.0 l
1.0 l
0.2 l
1 l
TABLA 6.
Temperatura
Desnaturalizacin inicial
Desnaturalizacin
Alineamiento
Alargamiento
Alargamiento final
TABLA 7.
94C
94C
52C
68C
68C
Tiempo
5 min
30 seg
20 seg
40 s 35 ciclos del paso 2 al 4
7 min
80
81
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES.
ACTIVIDADES
ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DIC
el
ANALISIS DE COSTO
82
No.
ACTIVIDAD
FECHA
RECURSOS
INICIO
MATERIALES
COSTO DE
LA
HUMANOS
ACTIVIDAD
Toma de las
Botellas Boeco-
muestras
tcnico para
toma de
muestras
Canoa
1 Panguero
(aguas abajo
3 das
RECURSO
Transporte y
Hielera
preservacin de
Transporte:
muestras.
Automotor,
Chofer.
768,60
14000
combustible.
Cultivo de las
muestras
1 Mes
Cajas petri
Agar pseudomona
Biotecnlog
King A
os
123,00
Varios
Anlisis de las
colonias del
genero
2
1 mes
Biotecnlog
200,00
os
pseudomona
Obtencin de
cepas puras, en
medio liquido
Enero
TSB
44,00
500g
de cultivo.
Bioensayo en
200,00
83
Agar/Mercurio
Anlisis de los
crecimientos
obtenidas en
120,00
los distintos
cultivos
agar/mercurio
Aislamiento de
la UFC con
-----
mayor actividad
metalofijadora
Caracterizacin
por el mtodo
PCR- DGGE
-Equipo
DGGE
-Kit de extraccin
6800,00
Anlisis de los
10
ndices de
Ordenadores
1250,00
diversidad
Escritura de
11
publicacin/ es
de resultados
Ordenadores y
material de oficina
500,00
Alquiler de
12
88000,00
laboratorio de
microbiologa
COSTO TOTAL P.
98145,60
84
BIBLIOGRAFIA
1. P. R. Parrish, A. C. Hendricks, J. G. Eaton, Aquatic Toxicology,
85
04-2008, www.Ecoportal.net
11. Examen Especial Al Control De Explotacin Minera En Las Cuencas De
86
87
88
Vanegas Sarahi
de los
Angeles,
Prediccion de conteos
Ricardo,
Caracterizacin
de
Comunidades
Bacterianas
en
San Jorge river basin, Colombia (South America). The Science of the Total
Environment., 2002, 289:41-47.
34. Chasar Liac, Scudder Barbarc, A. Obintewart R., Bell Aman Dah. And
35. Stephenson Angela , Heavy metal analysis of liquid waste and sediment
89