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Jess Caballero-Mellado
una pelcula blanca y densa abajo de la superficie del medio de cultivo, y vire del indicador
azl de bromotimol son considerados tentativamente como positivos para el aislamiento en
cultivo puro de la bacteria.
El cultivo puro se logra en diferentes medios de laboratorio (126), siendo muy comunmente
usado un medio adicionado del colorante rojo Congo (146), en el cual A. lipoferum y A.
brasilense toman un color rojo escarlata que permite la diferenciacin de otros gneros
bacterianos. Aun cuando el medio BLCR fue diseado para mejorar el aislamiento de cepas
de Azospirillum brasilense (20), su uso no fue aceptado por haberse demostrado que no era
apropiado para el estudio de poblaciones naturales de esta bacteria (73). Posteriormente se
observ que la concentracin de estreptomicina usada (200 mg/litro) en el medio BLRC era
inhibitoria del crecimiento de un gran nmero de cepas (103).
Adems de los medios y mtodos descritos, tambien existen reportados algunos medios de
cultivo y mtodos para el crecimiento de Azospirillum en cultivo puro y en asociacin con
plantas, as como para su conservacin (2, 126).
Identificacin
El gnero Azospirillum pertenece a la subclase alfa de las proteobacterias (181), siendo A.
lipoferum la especie tipo (166). Caractersticas tiles en la identificacin rutinaria son la
forma vibroide, el pleomorfismo y su movilidad en espiral (51). Las clulas contienen
cantidades elevadas de poli--hidroxibutirato (PHB), hasta 50% del peso seco celular (124),
observndose al microscopio las clulas jvenes con abundantes granulos refringentes. En
cultivos semigelificados y gelificados con mas de 24 h de incubacin se presentan
frecuentemente clulas refringentes con forma ovoide y de paredes gruesas similares a
quistes (96). Una de las caractersticas fenotpicas ms ampliamente usada como criterio
para el reconocimiento tentativo del gnero Azospirillum es el color rojo escarlata que
toman las colonias (Fig. 1) al crecer en un medio adicionado del colorante rojo Congo
(146). No obstante, en este medio pueden hallarse colonias mutantes de Azospirillum de
color blanco debido a la incapacidad de producir polisacridos no identificados (25).
Diversas pruebas bioqumicas y fisiolgicas son utilizadas rutinariamente para el
reconocimiento de las especies de Azospirillum. En la Tabla 1 se presentan algunas
caractersticas fenotpicas que contribuyen a diferenciar las especies de Azospirillum.
Adicionalmente, la diferenciacin de especies del gnero Azospirillum se logra evaluando
la capacidad de usar diversos aminocidos y su efecto sobre la fijacin de nitrgeno (68),
recomendndose el uso de la histidina para la caracterizacin y aislamiento selectivo de la
especie A. lipoferum.
Los patrones de protenas de membrana (8, 48), as como los patrones de protenas
celulares (141), determinados mediante electroforesis en geles de poliacrilamidadodecilsulfato (SDS-PAGE), permiten una clara diferenciacin de las especies A.
lipoferum, A. brasilense, A. amazonense y A. halopraeferens.
En forma complementaria para la identificacin fenotpica de las especies de Azospirillum
pueden ser usadas diversas tcnicas inmunolgicas. La aglutinacin en tubo, tcnicas de
127). Recientemente, ha sido publicada una amplia revisin sobre las caractersticas de A.
brasilense en relacin con la agregacin celular (29).
Interaccin con la planta
Probablemente, una vez que las clulas de Azospirillum se han adaptado a las condiciones
del ambiente rizosfrico y han logrado llegar a la superficie de las races, debido a sus
caractersticas quimio y aerotcticas, se iniciar el establecimiento de la asociacin.
Diferentes estudios han mostrado que A. brasilense tiene la capacidad para adherirse a las
races de plantas gramneas como el mijo (Pennsisetum purpureum) y Digitaria decumbens
(171), trigo (77), maz (61), as como a las races de plantas de otras familias que incluyen
al algodn y tomate (98), e incluso a superficies inhertes como poliestireno y arena (22, 23,
98). La capacidad de Azospirillum para adherirse a las races, al menos a las de mijo, es
significativamente mayor que la mostrada por otras bacterias de la comunidad rizosfrica
como Rhizobium, Azotobacter, Klebsiella o Pseudomonas, e incluso que E. coli (171). La
asociacin de Azospirillum con las races de las plantas se desarrolla en dos etapas
completamente independientes (111). La primera consiste en una adsorcin rpida, dbil y
reversible, la cual es dependiente de protenas de la superficie bacteriana del tipo de las
adhesinas en conjunto con la participacin del flagelo polar (40, 111). La segunda fase
consiste de un anclaje lento pero firme e irreversible que alcanza su mximo nivel 16 h
despus de la inoculacin, el cual parece ser dependiente de un polisacrido extracelular de
Azospirillum (111). Los resultados de un estudio reciente sugieren la posibilidad de que una
protena de la membrana externa de Azospirillum participe en el proceso de adherencia a las
races de las plantas (31). El proceso de adherencia de Azospirillum a las races de las
plantas ha sido revisado recientemente (29). En diversos casos se ha reportado la aparicin
de material fibrilar que contribuye al anclaje de Azospirillum a las races de diversas plantas
(98, 171), describindose como esencial para el anclaje a las partculas de arena (23). An
en la actualidad, la naturaleza del material fibrilar no ha sido elucidada (47, 161), aunque
parece ser de origne bacteriano. Recientemente se ha publicado una revisin sobre la
capacidad de Azospirillum para adherirse a superficies abiticas del suelo (18).
La inoculacin de diversas plantas con Azospirillum ha mostrado que los principales sitios
de colonizacin son las areas de elongacin celular y las bases de los pelos radicales (98,
82). Slo algunas clulas de Azospirillum llegan a adherirse a la cofia o a los pelos radicales
(82). Sin embargo, fue observada la presencia de Azospirillum dentro del mucigel que se
acumula en la cofia (171). La inoculacin de races de trigo con una cepa de Azospirillum
que expresa constitutivamente el gen reportero gusA mostr que en los primeros das de la
asociacin las clulas bacterianas colonizan especficamente los sitios de emergencia de las
races laterales y las regiones de los pelos radicales, tanto de la raz primaria como de las
races secundarias y posteriormente la superficie de la raz (172). En plantas de trigo fue
observado que la inoculacin de Azospirillum induce cambios en la morfologa de los pelos
radicales, siendo stos cambios significativamente mayores que los causados por
Rhizobium leguminosarum o Azotobacter chrococcum, los cuales son mnimos (77, 80).
Adems, fue observado que la inoculacin con 105 a 106 clulas de Azospirillum causa
tanto la elongacin como el aumento de la superficie total de la raz (Fig. 5), en tanto que la
inoculacin de 108 a 109 clulas causan la inhibicin del desarrollo de sta (82).
Aparentemente, el incremento del tamao del sistema radical se debe, al menos
Aplicacin
Algunas compaias en diferentes pases han registrado inoculantes de Azospirillum para
maz y otros cultivos (75, 128). Burdman y col. (30) refieren que en Sudafrica se lleva a
cabo la produccin de inoculantes a base de Azospirillum para 150,000 hectreas de maz y
12,000 de trigo. Algunas caractersticas de la produccin de inoculantes a base de
Azospirillum han sido discutidas (54, 76, 128).
Aun cuando el uso de Azospirillum como bioestimulante del crecimiento de las plantas no
se ha generalizado mundialmente, en Mxico la aplicacin de sta bacteria en diferentes
cultivos ha revasado con mucho lo hecho en otros pases. En el ciclo agrcola primaveraverano (PV) del ao 1999 la Secretara de Agricultura, a travs de su Instituto Nacional de
Investigaciones Forestales Agrcolas y Pecuarias (INIFAP) y de la Fundacin Mexicana
para la Investigacin Agropecuaria y Forestal, A.C., en colaboracin con el Centro de
Investigacin sobre Fijacin de Nitrgeno-UNAM, llev a cabo la inoculacin de alrededor
de 450,000 hectreas de maz y 150,000 hectreas de sorgo, cebada y trigo, empleando
cepas de Azospirillum seleccionadas por su capacidad para promover el crecimiento de las
plantas e incrementar el rendimiento de los cultivos.
La evaluacin del rendimiento de grano en alrededor de 675 hectreas de los diversos
cultivos, que comprendieron cerca de 170 sitios de Mxico con caractersticas edficas en
regiones climticas diferentes mostr el xito de la inoculacin en el rango de 62 a 95% de
los casos analizados, con incrementos que fluctuaron en el rango de 6 a 98%. En la Tabla 2
se presenta un resumen de los resultados obtenidos en el ciclo agrcola PV-1999. El
incremento promedio en la produccin de los cultivos de maz, trigo, cebada y sorgo bajo
las diferentes condiciones evaluadas fue del 26%. Los resultados fueron dependientes de la
variedad y cultivo, tipo de suelo, uso y nivel de fertilizantes (35). La mejor respuesta a la
inoculacin se present en suelos de tipo ligero (arenosos), con niveles intermedios de
fertilizacin en el rango de 45-90 Kg N/ha, y con las variedades "criollas" de maz.
Considerando la cantidad de variedades, cultivos, suelos y condiciones climticas
evaluadas, los resultados de la inoculacin con Azospirillum reflejan claramente la
capacidad de la bacteria para promover el desarrollo de las plantas y el impacto positivo
sobre el rendimiento de los cultivos de grano. El programa de "Biofertilizacin" se continu
durante el ciclo PV-2000, inoculndose alrededor de un milln y medio de hectreas.
El temor o las precauciones expresadas en algunas revisiones sobre el tema, por cierto muy
escasas, para extender el uso de Azospirillum a niveles comerciales debido a la
"inconsistencia de la inoculacin" tienen poco valor ante los resultados de produccin
obtenidos en decenas de experimentos, as como los obtenidos en miles de hectreas con
diferentes cultivos, variedades y condiciones edficas y climticas.
An en la actualidad hacen falta muchos estudios de investigacin bsica, tanto sobre la
bacteria como en su interaccin con la planta, para un mejor entendimiento de la asociacin
Azospirillum-planta. No obstante, en mi opinin, la aplicacin de Azospirillum como
bioestimulante que incrementa la produccin de los cultivos deberia extenderse a todos
aqullos lugares donde la aplicacin de fertilizantes es nula o escasa, como
lamentablemente ocurre en no pocos pases que tienen una agricultura subdesarrollada. En
las regiones donde se practica una agricultura moderna, la inoculacin con Azospirillum
permitira reducir las elevadas cantidades de fertilizantes que generalmente se aplican y con
ello disminuir tanto el costo de produccin como los problemas derivados de su uso,
principalmente la contaminacin, sin detrimento de la produccin.