FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

QUÍMICA DE ALIMENTOS

MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

2009
Autores:
 Andrade María José
 Correa Carina
 Cueva Patricia
 Jácome Rafael
 Simba Saskia
 Tufiño Carolina
En la Universidad Javeriana se realizó una
investigación sobre el aislamiento de bacterias
fijadoras de nitrógeno para emplearlas en un
programa de fertilización bajo un esquema de
agricultura orgánica. El aislamiento se realizó a partir
del suelo de un cultivo de Stevia Reubaudiana. La
bacteria encontrada fue Azotobacter y su rendimiento
se determinó con base en la producción de biomasa y
concentración de glucósidos en la planta presentando
mejor estabilidad, pigmentación, mayor velocidad de
crecimiento 0,1405 h-1 fase exponencial de 18 horas y
una producción de A/A promedio de 38,4 mg/ml a las
150 horas. [1]
En la India se realizaron estudios para comparar
un fertilizante químico y un biofertilizante en una
plantación de Stevia, mediante mediciones de
fósforo soluble con bacterias de Azospirillum, y los
resultados demuestran una eficiencia
incrementando la producción de biomasa en un
53,20%. La química inorgánica del biofertilizante
cambio favoreciendo el crecimiento mas no se
demostró el aumento de glucósidos en la planta.
[2]
El Azotobacter es el género que ha demostrado tener el
rendimiento de absorción más alto (72.64%) a nivel de
la rizosfera comparado con microorganismos como
Azospirillum brasilense y Rhizobium analizados
también para la elaboración de biofertilizantes, fijan
aproximadamente 20 mg N/g de azúcar en un
cultivo de Stevia en medio libre de nitrógeno, siendo
una gran fuente para obtener un biofertilizante natural
reduciendo el uso de los fertilizantes químicos
nitrogenados, tienen mayor velocidad de crecimiento
que otras cepas aisladas de cultivos diferentes
ofreciendo una mayor productividad.
El Azotobacter produce fitohormonas (ácido
indolacético y citoquininas) capaces de acelerar y
potenciar el crecimiento de las plantas; promueve la
formación de sideróforos, sustancias antifúngicas y
genera enzimas que favorecen a la solubilización de
fosfatos y oligoelementos facilitando la asimilación de
estos compuestos.

El uso de fertilizantes químicos constituye un daño

biológico a los suelos deteriorando la calidad de los
mismos: inducen el aumento de acidez y salinidad
eliminando el humus y suavizando los tejidos de la
planta provocando que ésta sea menos resistente y
saludable, eliminan el ecosistema natural de suelo
desarrollando plantas más vulnerables.
La tierra se hace dependiente a los químicos
incrementando los daños al suelo y los costos de
fertilización. Actualmente un fertilizante químico
nitrogenado se comercializa en $380 por sacos de
19Kg, este costo es alto por la energía que se utiliza
para su elaboración. a

El objetivo de la presente investigación es realizar el

aislamiento de una cepa fijadora de nitrógeno,
Azotobacter, que pueda ser empleada para la
producción de un biofertilizante en el cultivo de
Stevia rebaudiana, mediante fermentación
discontinua.
a) 1.33.5 MBtu  1 T amoniaco anhidro.

Costo de 1MBtu = 2.20 a 5.00 USD

Costo de 1 T amoniaco anhidro = 200 USD

2.1. General
Producir un biofertilizante con cepas Azotobacter spp aisladas de cultivos de Stevia
Rebaudiana mediante fermentación discontinua.

2.2. Específico
 Aislar, seleccionar y preservar la bacteria Azotobacter spp de muestras de
cultivos de Stevia Rebaudiana proveniente de la agrícola El Edén, en el agar
ashby.
 Evaluar el crecimiento de Azotobacter spp en caldo pikovskaya modificado y
caldo alternativo con melaza y establecer el más adecuado para una
producción a nivel industrial.
 Producir biomasa de la cepa escogida de Azotobacter spp ofreciéndoles las
condiciones óptimas para su crecimiento.
 Elaborar un bioreactor para la producción del biofertilizante utilizando
fermentación discontinua.
 Controlar el desarrollo del bioproceso mediante los parámetros: pH,
temperatura y concentración de oxígeno.
3.1. Stevia Rebaudiana
Es un género de plantas fanerógamas
perteneciente a la familia de las asteráceas.]
Son hierbas y arbustos de la familia del girasol
(Asteraceae), nativa de regiones subtropicales y
tropicales de América del Sur y América Central.
La especie Stevia rebaudiana Bertoni, conocida
comúnmente como dulce hoja, o, simplemente,
stevia, es ampliamente cultivada por sus hojas
dulces. Como un sustituto del azúcar.
3.2. Biofertilizante

Los biofertilizantes se caracterizan por la presencia de

microorganismos vivos que no causan daño o enfermedad al
hombre, a los animales ni a las plantas. Pueden emplearse bacterias
u hongos microscópicos, llamados micorrízicos, que se asocian en
forma natural con las raíces de las plantas, beneficiando su
crecimiento y el rendimiento de los cultivos.

Los microorganismos contribuyen con el crecimiento de las plantas

y el rendimiento de los cultivos, pero para que éstos sean
beneficiados es indispensable que las bacterias u hongos se
encuentren vivos. El biofertilizante debe contener varios millones
de bacterias por gramo de soporte sólido o por mililitro, en caso de
ser acuoso. Una vez que la semilla germina y las raíces empiezan a
desarrollarse, las bacterias se multiplicarán y colonizarán la
superficie de las raíces y promoverán el crecimiento de las plantas.
3.3. Fermentación discontinua

Una fermentación discontinua (en batch) puede ser considerada

como un "sistema cerrado". Al inicio de la operación se añade la
solución esterilizada de nutrientes y se inocula con el
microorganismo, permitiendo que se lleve a cabo la incubación en
condiciones óptimas de fermentación. A lo largo de toda la
fermentación no se añade nada, excepto oxígeno (en forma de aire),
un agente antiespumante y ácidos o bases para controlar el pH. La
composición del medio de cultivo, la concentración de la biomasa y
la concentración de metabolitos cambia generalmente como
resultado del metabolismo de las células observándose las cuatro
fases típicas de crecimiento: fase de latencia, fase logarítmica, fase
estacionaria y fase de muerte.

En los procesos comerciales la fermentación frecuentemente se

interrumpe al final de la fase logarítmica (metabolitos primarios) o
antes de que comience la fase de muerte (metabolitos secundarios).
3.4. Factores de crecimiento

3.4.1.Oxígeno
El oxígeno es el sustrato gaseoso más importante para el
metabolismo microbiano y el anhídrido carbónico es el
producto metabólico más importante. El oxígeno no es un
gas muy soluble ya que una solución saturada de oxígeno
contiene aproximadamente 9 mg / L de este gas en agua.
Debido a la influencia de los ingredientes del cultivo, el
contenido máximo de oxígeno realmente es más bajo de lo
que debería ser en agua pura. El suministro se logra
pulverizando aire en el fermentador durante el proceso.
Una vez disuelto el O2 éste tiene que transferirse desde la
burbuja de gas a cada célula individual.
3.4.2. Temperatura

Los microorganismos que crecen a una temperatura inferior a la óptima

tienen retardado su crecimiento y por lo tanto reducida la producción
celular, es decir su productividad. Por otro lado, si la temperatura es
demasiado alta, pero no letal, se puede inducir una respuesta de estrés al
choque térmico con la consiguiente producción de proteasas celulares que
ocasionan una disminución en el rendimiento de los productos proteicos.

3.4.3. pH

La mayor parte de los microorganismos crecen óptimamente entre pH 5,5

y 8,5. Pero durante el crecimiento en un fermentador, los metabolitos
celulares son liberados al medio, lo que puede originar un cambio del pH
del medio de cultivo. Por lo tanto se debe controlar el pH del medio de
cultivo y añadir un ácido o una base cuando se necesite para mantener
constante el pH. Por supuesto que esta adición del ácido o base debe ser
mezclada rápidamente de tal manera que el pH del medio de cultivo sea el
mismo en todo el fermentador.
3.5 Bacterias fijadoras de nitrógeno
Las bacterias fijadoras de nitrógeno son componentes muy importantes
del suelo. Para desarrollar la fertilidad del suelo, debe aumentar el
contenido de nitrógeno. En las condiciones medioambientales adecuadas,
las bacterias fijadoras de nitrógeno producen enzimas que toman el
nitrógeno en su forma gaseosa de la atmósfera, y, con los azúcares que
obtienen de la planta, fijan el nitrógeno dentro de la biomasa bacteriana. Si
las bacterias satisfacen sus necesidades de nitrógeno, entonces, el
nitrógeno pasa a la planta, y pueden observarse niveles elevados de
proteína en la planta. Este nitrógeno elevado no se libera al suelo hasta
que muere parte de la planta, o se exuda al suelo en la rizósfera

Se dividen en dos grandes grupos: las simbióticas especificas de las

leguminosas como el Rhizobium y las libres que viven en el suelo y no
necesitan la planta para su reproducción como el Azotobacter y el
Azospirillum, entre los más importantes en agricultura.

El Azotobacter y el Azospirillum, en concentraciones adecuadas, pueden

sustituir al nitrógeno químico (urea, amoníaco) sin disminuir la
producción y a menor coste.
Otras ventajas comprobadas del uso de estas bacterias como
biofertilizante son:

a) Producen fitohormonas, como el ácido indolacètico y las citoquininas,

capaces de acelerar y potenciar el crecimiento de las plantas.
b) Al permanecer vivas durante años y reproducirse en el suelo, no sólo
no lo degradan sino que contribuyen a su enriquecimiento en nitrógeno y
a su regeneración de forma ecológica y gradual, incluso en terrenos de alta
concentración salina.
c) Se ha comprobado que fertilizando los cultivos con estas bacterias y con
nitrógeno químico en un porcentaje entre el 20 y 50% del utilizado
normalmente, se consigue un aumento de producción sobre las cosechas
obtenidas únicamente con fertilizante químico al 100%. Esto es debido a
que, al liberarse la bacteria de su función fijadora de nitrógeno, produce
más factores de crecimiento vegetal, En cereales de secano, esto puede
suponer el ahorro del abonado de cobertera.
d) Crea una barrera protectora contra hongos y bacterias patógenas en la
raíz de la planta, por lo que ésta crece más sana y fortalecida.
e) Producen enzimas que solubilizan los fosfatos y los hacen más
accesibles a la planta, así como factores que facilitan la absorción de
oligoelementos.
f) Se ha demostrado que resisten mejor las condiciones de sequía y los
climas áridos ya que se forman alginatos en las raíces de las plantas.
g) Como consecuencia de todo lo anterior, es un mayor desarrollo de las
raíces de las plantas, con el consiguiente beneficio general para ésta, así
como el peso de los frutos.
h) También se ha comprobado un mayor índice de germinación de
semillas comparada con otros sistemas de abonado.
i) Las nuevas estirpes de Azotobacter y Azospirillum son capaces de fijar
un 72,64% más de nitrógeno atmosférico, que las estirpes originales.

Hay pues un cúmulo de ventajas para el usuario, económicas, ecológicas, A

corto, medio y largo plazo en la progresiva sustitución de la fertilización
química por las bacterias naturales, totalmente inofensivas para el medio
y el ser humano.
La N2 + 16 ATP + 8e-+ 8H+ nitrogenasa 2NH3 + 8H2 + 16 ADP+ 16 P
4.1 MUESTREO DEL SUELO
De cada cultivo de Stevia se toman cinco muestras
de 500g a una profundidad de 10 a 15 cm, el
muestreo se realiza en forma de zig –zag a lo largo
del cultivo.
Las muestras se empacan en bolsas de papel que
se colocan dentro de bolsas de plásticos
herméticas y posteriormente se transportan en
coolers.
4.1.1. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
Una vez en el laboratorio, las muestras de suelo se
tamizan en un tamiz estándar de 4.75 mm, con el fin
de obtener gránulos uniformes, para realizar el
aislamiento primario.

4.1.2. MEDICIÓN DE pH DE LAS MUESTRAS DEL

SUELO
La medición del pH se realizan siguiendo el protocolo
descrito por Van Lierop, 1981; se coloca en un frasco
de vidrio limpio suelo tamizado y agua destilada en
proporción 1:1 p/v. Posteriormente, la suspensión se
deja precipitar durante 5 min y se toma el valor de pH
del sobrenadante con un potenciómetro. Los valores
de pH del sobrenadante a partir de cuatro mediciones
en cada cultivo.
4.2.1. AISLAMIENTO PRIMARIA
A partir de cada muestra de suelo obtenida en los
diferentes cultivos, se realiza el aislamiento
primario por triplicado, empleando la técnica de
gránulos de suelo; Se colocan 20 gránulos en cajas
de Agar Ashby – Sacarosa (medio especifico para
Azotobacter spp) a una distancia aproximada de 1
cm. Las cajas se incuban a 28°C por 7 días hasta
observar alrededor de los gránulos colonias
translucidas y mucilaginosas.
El aislamiento secundario se realiza
mediante siembra por agotamiento en cajas
con Agar Ashby – Sacarosa a partir de las
colonias obtenidas en el aislamiento
primario. Las cajas son incubadas por 7 días
a 28°C, posteriormente se observa el
crecimiento en el medio selectivo Ashby –
Sacarosa, la morfología de la colonia y de las
células por medio de la coloración de Gram.
Con el fin de observar la producción de
pigmentos en medio solido, de cada
aislamiento se realiza una siembra en agar
diferencial Ashby con 5 g/l de benzoato,
remplazando la fuente de carbono (sacarosa)
en cajas petri para observar la pigmentación
en las colonias. La siembra se realiza tomando
una colonia de cada aislamiento y realizando
un estria en toda la caja, se incuba a 28°C por
7 días y se observa pigmentación
A cada aislamiento se le realiza una
caracterización con base en el
comportamiento bioquímico frente a la
fermentación de glucosa, maltosa, manitol y
ramnosa también se realiza una prueba de
asimilación y crecimiento en benzoato como
fuente de carbono, test de catalasa, oxidasa y
desnitrificación en caldo nitrato.
A partir de las cepas aisladas y evaluadas se
realizan cultivos en erlenmeyer de 100 ml con
50 ml de caldo nutritivo, el cual se incuba a
28°C por 24 Horas con agitación de 150 rpm.
El cultivo se deposita en 10 viales de 1.5 ml de
50 % V/V de glicerol puro estéril. Luego se
mantiene en congelación a -80°C.
El caldo Ashby es un medio de cultivo selectivo para
Azotobacter debido a que no contiene nitrógeno. Su
ventaja es que al ser un medio selectivo el crecimiento es
lento, es observable a partir de los 3 – 5 días de realizada
la siembra lo que implica un mayor gasto de energía para
la producción.
El caldo Pikovskaya modificado es un medio no selectivo
pero permite el crecimiento rápido de las bacterias y
requiere un gasto de energía menor
En ambos casos se necesitan reactivos químicos que
implican un costo alto adecuado solo para producciones
pequeñas a escala de laboratorio, por este motivo se
formula un medio de cultivo alternativo a base de melaza
tomando al caldo Pikovskaya modificado como patrón.
Se partió de un estudio químico de la composición de la
melaza y se procedió a sustituir los componentes del medio
químicamente definido (CPM), por el medio natural, que
constituye un medio adecuado para el crecimiento de
microorganismos.
Se toma como base la fuente de carbohidratos y proteínas
(carbono y nitrógeno), garantizando el contenido requerido
por la bacteria, según el caldo Pikovskaya modificado.
Una vez obtenida la concentración teórica de melaza
necesaria para sustituir los componentes del medio químico
se realizan pruebas de crecimiento a nivel laboratorio, para
ello se siembran cepas de Azotobacter spp en CA sólido
utilizando concentraciones menores y mayores a la obtenida
teóricamente. Las siembras se realizan por triplicado.
4.6.1. REACTIVACIÓN DE LAS CEPAS
BACTERIANAS
Para reactivar a las bacterias se utiliza el caldo
Pikovskaya modificado liquido, ideal para el
crecimiento de Azotobacter spp. La cepa madre se
inocula en los tubos con el medio, bajo condiciones
de esterilidad y se incuba a 30°C por 24 horas.
Para la preparación del pre inoculó se toman en cuenta los
siguientes requisitos:
1.- El cultivo debe estar metabólicamente activo y libre de
contaminantes.
2.- El inoculo debe estar en su fase exponencial (grado máximo de
desarrollo). Para ello se evalúa el crecimiento bacteriano
durante 30 horas que es el tiempo estimado que tarda en
alcanzar la fase exponencial. Se procura obtener pre inóculos
con una concentración de biomasa del orden de 108-109
células/ml.
3.- Se debe dispones de una cantidad de cultivo suficiente para
inocular el volumen de medio liquido a utilizar en la
fermentación, el cual debe estar entre el 3 – 10 % del volumen
total a fermentar. En este caso se trabaja con un volumen
equivalente al 10% del volumen total a fermentar.
Con las cepas reactivadas anteriormente se
realiza un pool bacteriano, 10 ml de pool se
inoculan en 90 ml de caldo Pikovskaya
modificado (10% de volumen total a
fermentar) y otros 10 ml en 90 ml de caldo
alternativo, obteniéndose un volumen final
de 100 ml de cultivo por cada caldo de
fermentación. Posteriormente se incuban a
30°C por 24 horas y 150 rpm en matraces
de 250 ml.
Una vez obtenidos los preinoculos, estos se
inoculan en 900 ml de CPM y 900 de CA.
Luego, son incubados a una temperatura
promedio de 28°C por 72 horas. El oxigeno se
suministra utilizando un aireador para pecera
con un flujo de aire aproximado de 1 m3 /h en
matraces de 2000 ml.
El esquema del proceso global de producción
de Azotobacter spp a nivel de laboratorio
Se ha realizan una serie de corridas
cinéticas en las que se evalúa la variación de
pH, la temperatura del caldo de cultivo y la
concentración de biomasa. Además se
evalúa el consumo de sustrato en CPM con
lo que se puede obtener las variaciones
cinéticas de crecimiento. Las muestras se
toman casa tres horas durante las 72 horas
que dura la fermentación. Este
procedimiento se realiza tres veces
Se utiliza la técnica de determinación de biomasa por
densidad óptica para el CPM y la determinación del Peso
seco para el CA, debido a que por el color de la melaza es
imposible de medir la absorbancia. Además se realizan
conteos de colonias en caja para determinar las
unidades formadores de colonias por litro.
Se mide la absorbancia de cada muestra a 540 nm y
luego se obtiene la concentración de biomasa en gramos
por litro utilizando la curva de calibración de
absorbancia en función de peso seco para Azotobacter.
Se utiliza medio estéril como blanco.
Para el conteo de bacterias en caja se realizan diluciones
de 10-1 a 10-9 y se siembran en CPM sólido. Cada
dilución se realiza por duplicado.
 Para determinar el uso de glucosa se utilizo la técnica de DNS que se
basa en el uso de 3,5 – dinitrosalicilico para provocar la oxidación de
los azucares y, al mismo tiempo, se propia reducción, desarrollándose
la siguiente reacción:

PROCEDIMIENTO
Se centrifuga cada muestra por 10 min a 5000rpm. Posteriormente se
recupera el sobrenadante en tubos limpios. Se preparan tubos de
ensayos forrados con aluminio para proteger de la luz y se coloca 0.25
ml de sobrenadante con 0.25 ml de reactivo 3,5 DNS en cada uno.
Además se prepara un blanco al que se le coloca únicamente el
reactivo. Se llevaron los tubos a ebullición por 5 minutos y
posteriormente se frena la reacción con hielo. Finalmente se agregan
2.25ml de agua destilada en cada tubo y se lee la absorbancia a 546 nm
ajustando a cero con el blanco. El blanco se coloca 2.75 ml de agua para
completar el volumen.
Se utiliza la curva de calibración de absorbancia en función de glucosa
para obtener concentración residual de sustrato en gramos por litro.
De cada muestra tomada se mide el pH para determinar la variación del
mismo durante la fermentación, para ello se utilizo un pH metro
previamente calibrado.

La temperatura del caldo de cultivo se mide durante todo el proceso de

producción del bio fertilizante utilizando para ello un termómetro
acoplado al equipo de fermentación.

Para determinar la viabilidad del producto se almaceno el producto

terminado en envases plásticos cerrados y se los coloca en refrigeración
(4ºC) bajo condiciones higiénicas para evitar la contaminación
Cada semana se evalúa el estado del producto mediante observación
directa al microscopio. Se evalúa la población microbiana, la actividad y
la contaminación por un periodo establecido de tiempo. Además se
deben realizar conteos de colonias en caja con el medio Ashby como
medio de cultivo selectivo
4.9.1. TINCIÓN GRAM
- Se preparan frotis del cultivo. Se secan al aire y se fijan al
calor.
- Se cubre el frotis con el reactivo cristal violeta durante un
minuto.
- Se lava el frotis con agua durante 5 segundos, y luego se
aplica el reactivo yodo de Lugol durante un minuto.
- Se lava y se aplica el decolorante.
- Se lava y se cubre con el reactivo de Safranina durante 30
segundos.
- Se lava, se seca y se coloca en el microscopio.
4.9.2. PRUEBA DE QUISTE
- Se coloca un asas del cultivo en un portaobjetos, emulsionado
con agua estéril
- Se agrega una o dos gotas de Yodo Lugol y se fija al aire.
- Se coloca al microscopio con aceite de inmersión.

4.9.3. PESO SECO CELULAR (PCS g/ml)

- Se toma 5 ml de cada dilución y de elimina en el horno el
sobrenadante.
- Se pesa la biomasa seca y se obtiene el PCS en gr/ml.

4.10. ANÁLISIS DE DATOS

Para analizar los datos obtenidos se utilizan regresiones lineales
con el objetivo de determinar la tendencia del crecimiento
bacteriano en ambos medios de cultivo.
 [1]
http://www.javeriana.edu.co/universitas_scientiarum/articulos
/produccion_biofertilizante.pdf

 [2] http://www.nobelonline.net/UserFiles/File/7kdas.pdf

 [3] http://nostoc.usal.es/sefin/MI/tema12MI.html

 [4]http://www.google.com.ec/search?hl=es&rlz=1R2ADBF_es&
q=bacterias+fijadoras+de+nitrogeno&meta=&aq=0&oq=bacteri
as+fijadoras

 [5] http://jb.asm.org/cgi/reprint/77/1/86.pdf