U.C.S.M. P.P. Ing.

Biotecnolgica
Operaciones unitarias II

Prcticas de

UNIVERSIDAD CATLICA DE SANTA MARA

FACULTAD DE CIENCIAS FARMACUTICAS,
BIOQUMICAS Y BIOTECNOLGICAS
PROGRAMA PROFESIONAL DE INGENIERA
BIOTECNOLGICA

Gua de prctica
OPERACIONES UNITARIAS II

Alumno
Docente

: Midwar Ancco Mamani

: Ing. Cinthia Crdova

Barrios
AREQUIPA
Ing. Cinthia Crol Crdova Barrios

U.C.S.M. P.P. Ing. Biotecnolgica

Operaciones unitarias II

Prcticas de

2013

PRACTICA N 1.
AISLAMIENTO Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES
I.

OBJETIVOS:
1.1.
1.2.
1.3.
1.4.

II.

Preparar el medio de cultivo 9K lquido y slido.

Aislar microorganismos biolixiviantes en medio de cultivo 9K a partir de
su ambiente nativo.
Mantener el desarrollo de la biomasa en las condiciones de incubacin.
Inculcar en el proceso enseanza-aprendizaje valores de puntualidad,
responsabilidad, cooperacin y perseverancia.

MARCO TERICO:
La observacin de las transformaciones naturales que sufran diversos
compuestos de hierro y azufre, procedentes de la disolucin de ciertos
minerales, hizo que desde principios del siglo XX se viniera postulando la
presencia de microorganismos quimiolittrofos en ciertas aguas. Sin embargo,
no se logr aislar un tipo de bacterias del genero Acidithiobacillus de las aguas
de drenaje de unas minas de carbn bituminoso, ni se pudo dar una explicacin
clara de estos fenmenos, hasta mediados del siglo XX.
En 1951, Temple y Colmer, comprobaron que una de estas bacterias era
responsable de la rpida oxidacin del hierro ferroso y, en consecuencia, de la
acidez de estas aguas por la hidrlisis del in frrico producido. La
denominaron Thiobacillus ferrooxidans, ya que presenta diferencias fisiolgicas
y morfolgicas respecto a otras bacterias de este mismo gnero. Esta bacteria
ha sido aislada, posteriormente, por numerosos investigadores, observndose
una amplia distribucin en microambientes de naturaleza cida, con la
presencia de in ferroso o sulfuros metlicos, ricos en metales, convirtindose
en una buena opcin para su lixiviacin.
La lixiviacin bacteriana, tambin conocida como Biolixiviacin puede ser
definida como un proceso natural de disolucin que resulta de la accin de un
grupo de bacterias especficas para lixiviar, o extraer, metales o concentrados
minerales presentes en las minas. El producto final de la biolixiviacin es una
solucin cida que contiene el metal en su forma soluble.
La lixiviacin bacteriana es un excelente ejemplo de cmo la actividad
biolgica controlada puede servir al hombre en la explotacin de los recursos
naturales sin el uso intensivo de energa.

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Desde la dcada del 50, en que se descubri que los responsables de la

acidificacin de aguas de minas eran microorganismos, hasta hoy se ha
avanzado mucho en el entendimiento de los mecanismos a travs de los cuales
se llevan a cabo la solubilizacin de las especies metlicas, y en la aplicacin
de estos principios en desarrollos tecnolgicos.
En la Industria minera se hace frecuente la bsqueda de mtodos menos
contaminantes en la extraccin de metales, ya que se ha visto que los mtodos
convencionales generan alto costo en lo econmico y ambiental, debido a la
utilizacin de procesos qumicos que producen alto ndice de contaminacin.
Dependiendo de la composicin del mineral sulfurado, la lixiviacin bacteriana
es una alternativa biolgica ventajosa a las tecnologas pirometalrgicas por
demandar menores inversiones de capital y tener menores costos de
operacin. Por otra parte la no emisin de SO 2 la convierten en una tecnologa
ms limpia, cuestin no menor frente a la creciente preocupacin pblica por
los efectos ambientales de operaciones industriales. Esta tecnologa permite
adems el beneficio de minerales marginales y la exploracin de botadores que
en muchos casos constituyen hoy pasivos ambientales, y al ser una tecnologa
de fcil aplicacin es atractiva para ser empleada en pases en vas de
desarrollo.
Desde el aislamiento de la primera cepa de Acidithiobacillus ferrooxidans han
sido muchos los medios propuestos para el cultivo de este microorganismo,
siendo los medios ms conocidos como 9K y T&K, los que mejores resultados
muestran en el crecimiento microbiano. En cuanto al cultivo de
Acidithiobacillus ferrooxidans en medio slido es fundamental para la
purificacin del mismo, para los estudios genticos, as como la estimacin del
tamao de la poblacin mediante el recuento de microorganismos viables.
Las bacterias de este gnero se caracterizan por ser quimiolitoauttrofas,
mesfilas y acidfilas.
Entre los parmetros bsicos que influyen sobre el comportamiento del
microorganismo, cabe destacar, el pH, temperatura, oxgeno y dixido de
carbono. Sin embargo, se pueden producir efectos sinrgicos para el
crecimiento de dichos microorganismos.
III.

MATERIALES:
3.1. Muestras:
Drenaje cido de roca.
Drenaje cido de mina.
Mineral.
Relaves.
3.3. Reactivos:
Sulfato de amonio, (NH4)2SO4.
Cloruro de potasio, KCl.
Fosfato cido de potasio, K2HPO4.

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Sulfato de magnesio heptahidratado, MgSO 4. 7H2O.

Nitrato de calcio, Ca(NO3)2.
Sulfato ferroso heptahidratado, FeSO4. 7H2O.
3.4. Material de vidrio:
Baguetas.
Beakers, 250 mL.
Fiolas, 100, 250 y 500 mL.
Matraces, 250 mL.
Placas petri.
Probetas, 100 mL.
3.5. Otros:
Cinta universal de pH.
Esptula.
Parafilm.
Piceta.
Tijeras.
3.6. Aparatos:
Autoclave.
Balanza analtica.
Cocina elctrica.
Potencimetro.
Ultrasonido.
IV.

METODOLOGA:
4.1. Toma de muestra:
Se ubic geogrficamente el lugar donde se tomaron las muestras con un
GPS (Sistema de posicin geogrfica) en las siguientes coordenadas.
La muestra consisti en
4.2. Preparacin del medio 9K lquido y slido:
El medio 9K se prepar segn la formulacin propuesta por Silverman y
Lundgren (1959).
4.4. Aislamiento de microorganismos biolixiviantes:
Se inoculo la muestra en medio 9K lquido y slido. Se mantuvo las
condiciones de incubacin establecidas.

V.

PROCEDIMIENTO DETALLADO:
v.1) Obtencin de muestra

Se recolectaron dos tipos de muestras de diferentes lugares

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a. Muestra solida
Esta muestra es una roca en la cual se ve cobre en su forma
natural proveniente de la mina Tintaya.
b. Muestra liquida
Esta muestra se obtuvo de aguas termales, que se recolectaron de
las pozas naturales que se encuentran en la cuidad de Yura,
Areuipa.
v.2) Preparacin de medio 9k

Pesar los nutrientes segn los requerid

Se prepararon dos soluciones stock A y B de 500 ml con los siguientes

nutrientes:

Nutrientes

Cantidades g/L

Sulfato de amonio, (NH4)2SO4.

3.0

Cloruro de potasio, KCl.

1.0

Fosfato cido de potasio,

K2HPO4.

5.0

Sulfato de magnesio
heptahidratado, MgSO4.
7H2O.

5.0

Nitrato de calcio, Ca(NO3)2.

0.01

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Sulfato ferroso
heptahidratado, FeSO4. 7H2O.

Prcticas de
44.22

a. Medio liquido

Se llev la solucin A al autoclave por 20 min a 120 C a 1,5

atm.
Luego se agreg a un matraz solucin A requerida en si
para preparar 200 ml de medio y solucin B igual para 200
ml pero este fue agregado utilizando un filtro.
Luego se midi el pH, si no era el indicado de le agregaba
cido sulfrico o una base

b. Medio solido
Se llev la solucin A se llev al autoclave por 20 min a 120
C a 1,5 atm.
Luego se agreg a un matraz solucin A requerida en si
para preparar 200 ml de medio y solucin B igual para 200
ml pero este fue agregado utilizando un filtro.
Luego se midi el pH, si no era el indicado de le agregaba
cido sulfrico o una base
Se agreg agarosa (12g/L) la cantidad necesaria para lo
requerido y se disolvi exponindola a una fuente de calor

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Prcticas de

v.3) Sembro y manteniendo de muestras cultivadas

a. Muestra solida

En este caso al roca fue triturada hasta llegar a un tamao de polvo

Posteriormente fue inoculada al medio lquido
Se dej la muestra para su crecimiento
Luego de tener una respuesta positiva en medio lquido se procedi a
sembrar en medio slido, sembrando en una placa utilizando una micro
pipeta
b. Muestra liquida

VI.

En este caso solo se coloc un inoculo en el medio liquido

Se dej la muestra para su crecimiento
Luego de tener una respuesta positiva en medio lquido se
procedi a sembrar en medio slido, sembrando en una placa
utilizando una micro pipeta

RESULTADOS

El crecimiento se pudo deducir debido a la cambio de color de medio,

tornndose de color amarillento debido a la oxidacin de sus
componentes
El crecimiento de microorganismos fue muy lento a comparacin de los
que vemos normalmente.
A partir de la muestra solida se pudo observar microrganismos
En la muestra liquida no se observ crecimiento de microorganismo

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VII.

DISCUSIN:

VIII.

Al parecer el modo en que se trat a la muestra lquida fue la causa de

que no diera resultados positivos debido a que este tipo de bacterias son
termfilas y la muestra no tuvo el tratamiento adecuado
Al corregir el pH del medio debe utilizarse cidos o bases diluidos para
lograr un medida casi exacta
Se tiene que buscar mtodos para acelerar el crecimientos de estas
bacterias

CONCLUSIONES:

IX.

Prcticas de

El medio liquido se prepar correctamente al igual que el medio solido

debido a que se pudo observar el crecimiento de microrganismos
El medio 9K nos servir para hacer estudios posteriores con cepas
nativas encontradas
No todas las muestras presentaron crecimiento, una razn tal vez es el
tratamiento que estas recibieron

CUESTIONARIO:
1. Qu estrategias se utiliza para preparar o procesar la muestra?
2. Qu mtodos se utilizan para la determinacin de la oxidacin del medio
de cultivo?
3. Haga un comentario sobre las oportunidades de la Biotecnologa en la
Biominera?
4. Cmo optimizar el crecimiento de microorganismos biolixiviantes?
Desarrollo de cuestionario
1. Bueno todo depende de la muestra a tomar, si es slida, liquida u otro tipo;
en el caso de que sea solida simplemente se obtiene una muestra
significativa y luego esta se guarda en un contenedor el que no vaya a
sufrir cambios significativos; ahora si al muestra es lquida esta tiene que
ser almacenada en unos frascos los cuales tienen que ser protegidos de la
luz del sol y tenerlos a una temperatura no muy diferente a de donde se
obtuvo
2. Bueno un mtodo seria analizar los elementos que pueden estar sufriendo
una oxidacin en este caso el Fe y sulfatos mediante pruebas de difraccin
de rayos X y pruebas FTIR

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3. La biotecnologa es sino el nico medio para que la biomineria pude llegar

a ser lo que todas las industrias mineras desean para sus procesos, que
son extraccin eficiente de su mineral y disminuir la emisin de
contaminantes al medio ambiento todo esto con beneficio econmico y
igual o mayor a comparacin de la tecnologa que se aplica normalmente.
4. El primer paso a tomar seria aumentar la temperatura del medio de cultivo
y as elevar el proceso de metabolismo, otro aspecto seria aumentar o dar
agitacin a medio de cultivo para asi hacer que los microorganismos
tengas mayor facilidad de crecer y otra posibilidad es adicionar al medio de
cultivo algunos compuestos orgnicos los cuales facilitaran el crecimiento
de los microorganismo
X.

BIBLIOGRAFA:

XI.

http://es.scribd.com/doc/38084383/Biolixiviacion-o-Lixiviacion-Bacteriana
http://www.monografias.com/trabajos33/biolixiviacionmineral/biolixiviacion-mineral.shtml#ixzz2fP0tU7Da
http://www.unicolmayor.edu.co/invest_nova/NOVA/artorig5_5.pdf

ANEXOS:
BIOLIXIVIACIN
La biolixiviacin de minerales, concentrados y relaves sulfurados
que contienen Au y Cu encapsulados es un concepto relativamente nuevo
en comparacin a losprocesos de tostacin, oxidacin a presin y/o
oxidacin qumica, y rpidamentefue establecido como un pretratamiento alternativo de oxidacin viable.La tcnica de oxidacin
bacteriana empleada para el tratamiento de mineralessulfurados aurferos
se fundamenta en la accin efectiva de la bacteria ThiobacillusFerrooxidans
para oxidar especies reducidas de azufre a sulfato, y para oxidar elin
ferroso a in frrico. El Thiobacillus Ferrooxidans es eficaz en
ambiente cido,aerbico, mvil y quimioautotrfico y se presenta en forma
de bastoncitos de 1-2 nde largo por 0.5-1.0 n de ancho, gran negativas.
Presentan punto isoelctricoentorno de 4.0 - 5.0 y se C. La fuente de
energa

desenvuelven en el intervalo detemperatura de 28 - 35 fundamental

para el Thiobacillus Ferrooxidans es el inFe+2, pudiendo ser utilizados
tambin el azufre y sus formas reducidas. Usanutrientes bsicos para su
metabolismo a base de N, P, K, y Mg, Ca, comoelementos de trazo.La
biolixiviacin de sulfuros como proceso biohidrometalrgico involucra
unconjunto de reacciones qumicas, metablicas, enzimticas y no

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enzimticas, en elcul el mineral insoluble es oxidado y otros metales de

inters son liberados ensolucin
Lixiviacin bacteriana de un mineral sulfurado refractario
argentfero
Los minerales sulfurados concentrados refractarios argentferos (MSRP), se
tratan por diversos mtodos como: la tostacin, la lixiviacin con agentes
qumicos quelantes, la autoclave y la oxidacin qumica.
Estos mtodos tienen una eficiencia relativa, un elevado costo y
desafortunadamente un dao ambiental; por ello, se buscan alternativas
como la biolixiviacin (BL)o lixiviacin bacteriana es un proceso natural en
la cual bacterias quimiolitotrficas oxidan el azufre, y/o el hierro de los
minerales
y
con
ello
facilitan
la
extraccin
de
los metales de valor comercial a bajo costo y sin contaminar el ambiente,
aunque tiene la limitante de que la plata en la solucin lixiviante inhibe el
crecimiento de los microorganismos que participaron en el proceso, por ello
se busca aumentar la resistencia de estas bacterias al metal.
Los objetivos de este trabajo fueron: i) Aislar y seleccionar bacterias
lixiviantes
Para ello se prepararon matraces con medio de cultivo 9K modificado,
mezclado con el MSRP como fuente de energa para los microorganismos
acompaantes de este mineral.
Para determinar su capacidad lixiviante se midi la concentracin de
sulfato producida por la oxidacin del azufre del MSRP, por una bacteria
quimiolitotrfica, el aislado con la mxima actividad de lixiviacin del
mineral, se adapt a concentraciones crecientes de plata, lo que
nuevamente se midi por la produccin de sulfatos en presencia de una
concentracin elevada de nitrato de plata.
Los resultados indican que los MSRP contienen como acompaantes
microorganismos quimiolitotrficos capaces de lixiviar este mineral para
extraer la plata. Una de estas bacterias se adapt, a una elevada
concentracin de plata. Por el tipo de actividad de lixiviacin y las
caractersticas fisiolgicas de la bacteria, se sabe que pertenece a una
especie del gnero Thiobacillus sp.
Se concluye que la lixiviacin es una alternativa econmicamente viable
para la extraccin de metales preciosos a partir de MSRP y no causa dao
ambiental.

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PRACTICA N 2.
CARACTERIZACIN DE MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES
I.

OBJETIVOS:
1.1.

1.2.
1.3.

II.

Caracterizar macroscpicamente el cultivo de microorganimos

biolixiviantes aislados de su ambiente nativo en medio 9K slido y
lquido.
Caracterizar microscpicamente con tincin diferencial el cultivo de
microorganimos biolixiviantes.
Enfatizar en el proceso enseanza-aprendizaje valores de puntualidad,
responsabilidad, cooperacin y perseverancia.

MARCO TERICO:
La observacin al microscopio ptico con distintas coloraciones de los cultivos
bacterianos, el conocimiento de la composicin bioqumica de las diferentes
estructuras bacterianas, as como su metabolismo, tienen un rol importante en
la identificacin de las bacterias y su ubicacin taxonmica.
Recientemente, los avances de la gentica bacteriana hicieron posible el
desarrollo de tcnicas de biologa molecular con aplicaciones a nivel de la
investigacin cientfica y la industria.
Las bacterias que intervienen en los procesos de lixiviacin son generalmente
aerbicas, mesfilos, acidfilos y quimiolitoauttrofas, lo que implica que
obtienen las energa necesaria para su funcionamiento mediante la oxidacin
de compuestos inorgnicos, utiliza C02 como nica fuente de carbono para
todas sus necesidades metablicas, no requiere de nutrientes orgnicos y es
capaz de desarrollarse a valores de pH muy bajos, en el rango de 1 a 3.
Acidithiobacillus ferrooxidans, ha sido la bacteria ms estudiada, tiene forma
bacilar, es gramnegativa y mide aproximadamente 0.5 m de dimetro y 2 m
de longitud. Otras importantes bacterias lixiviantes son Acidithiobacillus
thiooxidans y Leptospirillum ferrooxidans. Estas tres especies son las ms
frecuentemente encontradas en operaciones mineras y tienen un papel directo
en las reacciones de biolixiviacin. En los ltimos aos han despertado gran

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inters microorganismos termfilos extremos, capaces de crecer a

temperaturas de 65 y 80 C, que presentan buenas caractersticas lixiviantes
sobre sulfuros reconocidamente recalcitrantes. Estos organismos pertenecen al
dominio de la arqueas, las cuales han sido mayoritariamente aisladas de aguas
termales y giseres.
III.

MATERIALES:
3.1. Materia prima:
Cultivo de microorganismos biolixiviantes.
3.2. Reactivos:
Aceite de inmersin.
Alcohol isoproplico.
Tincin de Gram.
3.3. Material de vidrio:
Pipetas pasteur.
Portaobjetos.
3.4. Otros:
Algodn.
Asa de Kolle.
Picetas.
Soporte de tincin.
3.5. Equipos:
Microscopio ptico compuesto.

IV.

METODOLOGA:
4.1. Caracterizacin macroscpica
Registrar las caractersticas descriptivas del medio de cultivo 9K lquido.
Describir las caractersticas fenotpicas de las colonias de los
microorganismos biolixiviantes aislados.
4.3. Caracterizacin microscpica:
Caracterizar los cultivos de microorganismos biolixiviantes utilizando la
tincin diferencial de Gram.

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V.

Prcticas de

PROCEDIMIENTO DETALLADO:
v.1) Preparado de muestra

Se coloc aproximadamente 1 ml de muestra con crecimiento positivo

en un porta objetos.
Con ayuda de calor se fij la muestra
Todo cerca de un mechero

v.2) Coloracin con tensin Gram

Aplicar Violeta cristal 1 min. lavar

Fijamos con Lugol, 1min. lavar
Decoloremos con una mezcla alcohol-cetona 30 seg. Lavar
Aplicar Safranina 1 min. Lavar
Esperar a que seque

v.3) Identificacin de microrganismo

Utilizando un microscopio se identificaron los microoganismos.

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VI.

RESULTADOS

VII.

La cantidad de colonias o microorganismos no es muy significativa

debido a la poca cintica de crecimiento que poseen estos
Es necesario utilizar el objetivo de 100x junto con aceite de inmersin
para poder distinguir bien los microrganismos

CONCLUSIONES:

IX.

Se observaron claramente bacilos gram negativos muy dispersos

La colonias en el medio no son muy identificables

DISCUSIN:

VIII.

Prcticas de

La tensin fue realizada correctamente debido a que se observ los

microogaminos esperados.
Se puedo lograr aislar bacterias nativas exitosamente

CUESTIONARIO:
1. Caracteriza a las arquea s como organismos lixiviantes.
2. Utilizando las herramientas de la Biologa molecular Qu mtodos se
utilizan para caracterizar microorganismos biolixiviantes?

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Prcticas de

3. En qu consiste la tcnica de epifluorescencia directa en filtro (DEFT)?

Desarrollo de cuestionario
1. Bueno generalmente son gram negativos excepto el sulfobacillus, estos
tiene la capacidad de sobrevivir en ambientes cidos y oxidar azufre y
fierro; tambin tien la capacidad de vivir en ambientes con temperaturas
considerablemente altas
2. Identificacin de ADN ribosomal especficamente el 16S utilizando PCR
3. El microscopio de epifluorescencia es un microscopio ptico que se
funcionamiento se basa en la propiedad de fluorescencia que tienen ciertas
molculas denominadas fluorocromos. un microscopio de epifluorescencia
la luz que incide sobre la muestra estudiada no la atraviesa sino que el
mismo lente ilumina y recibe la luz emitida por la muestra.
X.

BIBLIOGRAFA:

XI.

http://perso.wanadoo.es/microdominguez/b.htm
http://iie.fing.edu.uy/investigacion/grupos/gti/timag/trabajos/2007/proteus/
epifluorescencia.html

ANEXOS
Evaluacin de oxidacin bacteriana de sulfuros con
Acidithiobacillus ferrooxidans mediante pruebas de
FTIR y difraccin de rayos X
Una cepa bacteriana nativa con capacidad de oxidar hierro ferroso y
compuestos del azufre fue aislada a partir de
efluentes y material de la mina de oro La Maruja, en el municipio de
Marmato (Caldas), la cual fue identificada
bioqumicamente como Acidithiobacillus ferrooxidans. Esta cepa fue
evaluada en su capacidad de oxidar concentrados de sulfuros metlicos a
dos diferentes concentraciones de pulpa y dos tamaos de partcula.
Despus de 15 das
de biooxidacin de los sulfuros se observ que, efectivamente, la bacteria
mostr accin catalizadora sobre el proceso de disolucin del mineral.
Espectroscopia de infrarrojo (FTIR)
A los concentrados de sulfures metlicos expuestos a la accin bacteriana,
se le realizaron mediciones de oxidacin, mediante la tcnica de
espectroscopia de infrarrojo con transformada de Fourier (FTIR), en un
equipo Spectrum BX FTIR System de Perkim Elmer. Los datos fueron
procesados con el software Spectrum v.2.00. Para esta tcnica se tomaron
2 mg de la fase slida de los diferentes reactores cada 5 das, con las

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cuales se prepararon pastillas finamente homogenizadas, agregando 150

mg de bromuro de potasio (Kbr) calidad espectroscopia infrarroja.

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