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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS


LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

EQUIPO DE TRABAJO:

 Cifuentes Paola

 Guamangallo Raúl

 Redrobán Karina

 Solis Daniel

Noveno Semestre de Alimentos

TEMA:

AISLAMIENTO, PRODUCCION Y CONSERVACION DE


BACTERIAS FOSFATO SOLUBILIZADORAS A PARTIR DE
SUELO PARA USO AGRICOLA
DE LA PROVINCIA DEL NAPO

Diciembre de 2009

Dra. Blanca
Esthela Bravo

1
INDICE
Titulo................................................................................................................................2
Problema............................................................................................................................2
Antecedentes......................................................................................................................3
Justificación.......................................................................................................................4
Marco Teórico...................................................................................................................4
Objetivos:...........................................................................................................................5
6.1 Objetivo General ...................................................................................................5
6.2 Objetivos Específicos ...........................................................................................6
Marco Metodológico.........................................................................................................6
7. 1 Toma de la muestra...............................................................................................6
7.2 Procesamiento de la muestra.................................................................................6
7.2.1 Determinación de pH..................................................................................6
7.2.2 Pre enriquecimiento y Aislamiento.............................................................6
7.2.3 Caracterización Macro y Microscópica de las Colonias.............................7
7.3 Mejoramiento y Diseño de Medio ................................................................7
7.5 Determinación de actividad enzimática. Método p-nitrofenil fosfato...................8
Factibilidad........................................................................................................................8
Bibliografía........................................................................................................................9
11.1 ANEXO I. Método de Determinación de pH ...................................................11
11.2 ANEXO II. Composición del Medio de Cultivo SMRS...................................12
ANEXO III. Método de determinación de actividad Enzimática p-nitro fenil fosfato
.....................................................................................................................................13
10.3.1 Curva Patrón...................................................................................................13
11.3.2 Preparación Buffer fosfato......................................................................13

Titulo
AISLAMIENTO, PRODUCCION Y CONSERVACION DE BACTERIAS FOSFATO
SOLUBILIZADORAS A PARTIR DE SUELO PARA USO AGRICOLA DE LA
PROVINCIA DEL NAPO.

Problema
Los sustratos orgánicos que pueden ser fuente importante de fósforo y que
deben pasar a fuente disponible, pasando de fósforo orgánico a inorgánico,
por que las plantas solo pueden tomarlos como ión ortofosfato, esto se logra
mediante hidrólisis por enzimas fosfatasas ácidas, pues el fósforo soluble es
un nutriente limitado en un ecosistema natural.

El fósforo presente en los fertilizantes fosfatados que se encuentra soluble,


pasa a forma no disponible para las plantas; así, gran parte de los
fertilizantes tienden rápidamente a acumularse en forma de fosfatos

2
insolubles lo que provoca cambios en el pH del suelo generando
inmovilización química del fosfato por metales pesados.

Antecedentes
Localización de la zona de estudio

La muestra del suelo se realizó en la provincia del Napo en la zona del


Chaco, la región tiene una temperatura aproximada de 23°C, la zona de
estudio abarca 1 hectárea y va a ser destinada para uso agrícola.

En un análisis previo de fósforo en el suelo se obtuvo 159.23 mg/kg de


fósforo total; 4.08 mg/kg de fósforo soluble, por lo tanto 155.15 mg/kg
corresponde al fósforo insoluble lo que representa a una alta cantidad
de fósforo que no puede ser aprovechado por las plantas para crecer y
desarrollar su potencial genético.

Investigaciones
• A través de un buen mecanismo de mineralización de la fracción
orgánica que es muy estable y que corresponde casi al 50 por ciento del
fósforo total, se podría lograr que la misma pueda estar disponible para
la planta, logrando reducir los costos de fertilización y encaminando
hacia una agricultura orgánica. Un buen programa de encalado favorece
este proceso de mineralización. 1

• En los trópicos son comunes los suelos derivados de cenizas volcánicas


(Andisoles), los cuales dominan arcillas amorfas como la alófana,
imogolita y complejos humus-Al. Estos suelos fijan alta cantidad de P,
debido fundamentalmente a que las arcillas de estos suelos tienen una
gran afinidad para reaccionar con los iones ortofosfato.2

• Casi 30 millones de toneladas de fósforo se aplican cada año a los


campos agrícolas del mundo. Aún así, hasta un 80% de lo que se aplica
sigue fuera del alcance de mucha de la tierra cultivable del mundo. Más
de dos tercios del área total de La Tierra es ácida o alcalina por
naturaleza, de manera que el fósforo forma compuestos con el aluminio,
hierro, calcio y magnesio que se encuentra en el suelo. 3

• Las plantas absorben fósforo en estado soluble, pero cuando se


introduce fósforo al suelo, más del 90% de él pasa rápidamente a formas
solubles, no disponibles. Así, gran parte de los fertilizantes fosfatados
que se aplican no son utilizados por las plantas, sino que se almacenan
en el suelo. Por ejemplo, algunos suelos volcánicos de sur de Chile -con
gran capacidad de inmovilizar fósforo- han acumulado más de 2 ton/ha
de fósforo total (Boire, 1991), pero los niveles de fósforo soluble pueden
continuar cercanos a los 15 ppm.4

1
http://mail.iniap-ecuador.gov.ec/isis/view_detail.php?
mfn=5857&qtype=query&dbinfo=PADIPR&words=PAPA
2
http://www.papaslatinas.org/v14n1p51.pdf

3
http://www.elcato.org/node/1260
4
http://www.clades.cl/revistas/8/rev8art4.htm

3
• Los microorganismos en asociación con los cultivos son importantes para
el logro de cultivos de alta producción. El mejoramiento en la calidad
microbiológica de los suelos agrícolas debida a la incorporación de
organismos seleccionados para contribuir a la implantación, desarrollo y
producción de cultivos es una alternativa que contribuiría al logro de
mejores cultivos.
Algunos de estos microorganismos han sido eficientemente aislados y
multiplicados, permitiendo así la formulación de inoculantes para su
aplicación en escala de producción.
Entre los microorganismos que son evaluados por su potencial
contribución al desarrollo vegetal se encuentra la bacteria Pseudomonas
sp. conocida principalmente por su capacidad de solubilización del P
mineral y orgánico, si bien también tiene efecto sobre el pH del suelo
cercano a la raíz, aumentando la solubilidad de algunos otros nutrientes.5

NOTA IMPORTANTE: En este caso la muestra de suelo analizada es


excepcional pues la cantidad de fósforo insoluble es alta y no se necesitará
acondicionar el suelo con la ayuda de compost que incremente esta
cantidad de fósforo insoluble.

Justificación
Niveles óptimos de P en el suelo son obligatorios para mantener la
productividad y promover la eficiente utilización de nitrógeno en los
cultivos. Una deficiencia de fósforo en las plantas puede llevar a
manifestaciones de signos en hojas, pero influye en el crecimiento
haciéndolo lento y retrasando la maduración, posibilidad de obtener un
menor desarrollo radicular y menor floración.

Es de gran importancia la presencia de microorganismos que desarrollen


mecanismos para incrementar la disponibilidad del fósforo para los cultivos
siendo capaces de movilizar el fosfato insoluble a formas solubles
disponibles para las plantas.

Por esta razón el suelo presenta una gran alternativa de solución a


este problema, pues su elevada carga enzimática y bacteriana
aumenta la solubilización de los nutrientes haciendo que puedan
ser asimilables por las raíces.

De esta manera incrementar la viabilidad de fósforo en el suelo ayudando a


reducir la aplicación de fósforo en forma de fertilizantes químicos,
reduciendo la contaminación química en los suelos y promover una
agricultura sostenible.

Marco Teórico
IMPORTANCIA DEL FOSFORO

5
http://www.inta.gov.ar/barrow/info/documentos/agricultura/Maiz/informe_inocul_solubiliz.pdf

4
Luego del Nitrógeno, el Fósforo es un fertilizante esencial para el desarrollo
y el crecimiento de las plantas como para microorganismos. Su principal
función fisiológica es intervenir en procesos de acumulación y liberación de
energía durante el metabolismo celular; sin embargo, el fósforo soluble es
un nutriente limitado para producción de biomasa en un ecosistema natural.

Dependiendo del tipo de suelo, se puede decir que entre un 50-60%


corresponde a la fracción orgánica, mientras que el resto se encuentra en
forma inorgánica. Las plantas absorben el fósforo en forma inorgánica en
estado soluble, pero cuando se introduce al suelo, más del 90% de esta
pasa rápidamente a formas solubles no disponibles. De esta manera, gran
parte de los fertilizantes fosfatados que se aplican no son utilizados por las
plantas, sino que se almacenan en el suelo.

Las plantas deben absorber el elemento del suelo, donde se encuentra en


muy baja concentración, normalmente en niveles que varían entre 5-30
mg.kg-1. Estos índices bajos del nutriente se deben a que el fosforo soluble
reacciona con iones como el calcio, el hierro o aluminio que provocan su
precipitación o fijación, disminuyendo su disponibilidad para los vegetales.

CICLO DEL FOSFORO

El ciclo del fósforo (P) en el suelo es un sistema dinámico y complejo que


involucra la acumulación del elemento en la biomasa microbiana, materia
orgánica y formas inorgánicas incluyen fuentes de fósforo en cuatro formas
generales: (1) P inorgánico disponible, (2) P orgánico, (3) P absorbido, (4) P
como mineral primario.

Objetivos:
6.1 Objetivo General

 Aislar y seleccionar microorganismos solubilizadores de


fosfatos a partir de un suelo agrícola de la provincia de Napo.

5
6.2 Objetivos Específicos

 Aislar en medios de cultivo: SMRS (Sundara-Rao y Sinha.1963)


y un medio diseñado, microorganismos solubilizadores de
fosfatos a partir de suelo para uso agrícola de la provincia del
Napo.
 Diseñar un medio de cultivo con una solución de fosfato.
 Evaluar la actividad fosfatasa mediante la técnica p-
nitrofenilfosfato.

Marco Metodológico
7. 1 Toma de la muestra

Se toma 500 g de muestra por 5 muestras puntuales obtenidas en muestreo


aleatorio simple, se depositan en bolsas plásticas selladas. Se almacenan a
temperatura ambiente para su transporte y luego se conservan bajo
condiciones de refrigeración a 4˚C hasta su procesamiento en el laboratorio.

7.2 Procesamiento de la muestra


El procesamiento previo de la muestra de suelo se compone de los pasos
que se describen a continuación:

7.2.1 Determinación de pH

El pH influye en el proceso del suelo debido a la acción que ejerce sobre los
microorganismos presentes; en los procesos el pH varia de acuerdo al
tiempo y en respuesta a los materiales que son utilizados y a los productos
y compuestos intermedios de la degradación de estos mismos

Se realiza la medición de pH de las muestras de suelo por el método de


pasta de saturación según el ICONTEC. (ANEXO I)

7.2.2 Pre enriquecimiento y Aislamiento

Se pesan 10g de muestra de suelo las cuales se homogenizan en


erlenmeyers con 90 ml de agua de peptona 0.1% (p/v) y se adiciona 0.5g de
fosfato ácido de calcio y 0.5g de goma arábiga. Los recipientes de las
muestras se mantienen a 30˚C en agitación a 150 rpm por 72 horas.

A partir de los erlenmeyers en los que se hizo el pre enriquecimiento, se


realizan diluciones seriadas desde 10-1 a 10-8 en tubos de ensayo con 4.5 ml
de agua peptonada al 0.1% (p/v) con el fin de aislar microorganismos de
interés. Para determinar la población microbiana se siembra en medio
diseñado con adición de cloranfenicol cuando el medio esté esteril (ver a
ANEXO II), y se aplica el método de recuento por extensión.

Se realizan las diluciones mencionadas anteriormente, se inoculan 0.1 ml de


muestra en la superficie del medio. Las placas de agar se dejan secar por 15
minutos sin invertir a temperatura ambiente; posteriormente se llevan a
incubar a 30˚C por hasta 48 horas hasta que se observen halos de

6
solubilización alrededor de las colonias, este halo se mide en cada colonia
con un criterio de selección según el índice de solubilización.

IS = A/B
Donde:
A = Diámetro total (diámetro de la colonia + diámetro del halo)
B = Diámetro de la colonia

Se escogen las placas que tienen colonias aisladas y además son menos de
40 colonias (entre 10 y 20) para realizar el recuento.

7.2.3 Caracterización Macro y Microscópica de las Colonias

La identificación macroscópica de las colonias se realiza teniendo en cuenta


características de su aspecto como tamaño, color y textura, se identifica la
morfología microscópica realizando tinción Gram.

7.3 Mejoramiento y Diseño de Medio

El requerimiento nutricional se basa en la composición química de la célula,


se forma primordialmente de C, H, O, N y otros en menor cantidad pero
también importantes como el P, S, K, Mg, Na, Ca, Fe entre otros, incluye
vitaminas, aminoácidos purinas y pirimidinas. El pH del medio es importante
para el crecimiento de los microorganismos la mayoría de ellos se
desarrollan mejor en medios con un pH neutro.

Se modificará la formulación del medio SMRS reemplazando el fosfato


tricálcico por una solución de fosfato, utilizando goma arábiga y
CaHPO4.2H2O

TABLA I. Medio De SMRS TABLA II. Medio Diseñado

REACTIVO CANTIDAD REACTIVO CANTIDAD


(g/l) (g/l)
Glucosa 10 Glucosa 10
Fosfato tricálcico 5 Solución de (ver Anexo
Cloruro de sodio 0.2 fosfato II)
Sulfato de 0.5 Cloruro de sodio 0.2
amonio Sulfato de amonio 0.5
Sulfato de 0.3 Sulfato de 0.3
magnesio magnesio
Extracto de 0.5 Extracto de 0.5
levadura levadura
Cloruro de 0.2 Cloruro de potasio 0.2
potasio Sulfato de Hierro 0.002
Sulfato de Hierro 0.004 Sulfato de 0.004
manganeso
Cloranfenicol 0.1
Condiciones ambientales: temperatura 30°C.

7
7.5 Determinación de actividad enzimática. Método p-
nitrofenil fosfato

El principio de la técnica se basa en el uso de una fracción artificial de un


sustrato orgánico (p-nitro fenil fosfato) el cual es hidrolizado por fosfatasas
del tipo fotomonoestereasas para obtener HPO4.

Para probar la actividad de la fosfatasa basta con ajustar el pH del medio de


incubación, estableciendo condiciones ácidas o alcalinas, y en casi todos los
ensayos para fosfatasa se emplea p-nitrofenilfosfato como sustrato, ya que
es incoloro y por acción de la fosfatasa se transforma en p-nitrofenol a partir
del cual se genera p-nitrofenolato que produce color amarillo en condiciones
alcalinas.

El aumento de coloración con el tiempo de incubación, medido a 450 nm


con un espectrofotómetro, es un indicador del nivel en el que el sustrato es
hidrolizado por la fosfatasa una vez que la reacción se detiene y la solución
se alcaliniza. (Técnica ver anexo III)

Factibilidad
El laboratorio cuenta con todos los reactivos disponibles para la preparación
del medio SMRS. Para la medición del pH del suelo el potenciómetro será
facilitado por el laboratorio de Química Ambiental. Se deberá tomar muy en
cuenta que para la realizar la curva de calibración se necesitara la
disponibilidad de luz eléctrica durante todo el día puesto que se toman
lecturas cada ½ hora, 1 hora y 2 horas hasta completar las 10 horas.
Costos
Medio SMRS

Reactivo Cantida Valor Cantidad Valor


d (g) (USD) empleada (g) (USD)
Glucosa 500 14.87 10 0.30
Fosfato 500 20.83 5 0.21
tricalcico
NaCl 500 13.64 0.2 0.005
Sulfato de 500 19.83 0.5 0.020
amonio
Sulfato de 500 27.27 0.3 0.016
magnesio
Extracto de 500 24.71 0.5 0.035
levadura
KCl 500 14.87 0.2 0.005
Sulfato de hierro 500 28.27 0.004 0.00023
Total (g/l) 0.59

Medio preparado:

Reactivo Cantida Valor Cantidad Valor


d (g) (USD) empleada (g) (USD)
Fosfato de 500 15.68 10 0.31
calcio
Goma arábiga 500 4.39 5 0.044
Cloranfenicol 0.5 0.20 0.1 0.04
NaCl 500 13.64 0.2 0.005
Sulfato de 500 19.83 0.5 0.020

8
amonio
Sulfato de 500 27.27 0.3 0.016
magnesio
Extracto de 500 24.71 0.5 0.035
levadura
KCl 500 14.87 0.2 0.005
Sulfato de hierro 500 28.27 0.004 0.00023
Total (g/l) 0.48

En las tablas se muestran los costos del medio SMRS y del medio diseñado;
para el medio SMRS la producción de un litro de este medio de cultivo tiene
un valor de $ 0.58; mientras que el valor del medio diseñado es de $ 0.48.
Lo que demuestra que el medio diseñado es factible frente al medio SMRS.
Lo que es conveniente la utilización del medio diseñado para una
producción a gran escala. La utilización del medio SMRM o de preparación
como fertilizante dependerá de los requerimientos del suelo al cual sería
aplicado.

Si se desea mantener las condiciones de fósforo estable y las necesidades


en cuanto a concentraciones de fósforo en niveles aceptables, se puede
utilizar el medio diseñado para mantener las condiciones de fósforo
asimilables disponibles.

Bibliografía

1. BROCK, T. D. y M- T. MADIGAN, “Ecología


Microbiana”, Prentice Hall Hispanoamericana, México, Págs. 655 –
685.
2. PLASTER, EDWARD J., “La ciencia del suelo y su
manejo”. Primera Edición, Madrid, Editorial Thomson, 2005.
3. National Plant Food Institute, “Manual de
Fertilizantes”, Segunda Edición, México, Editorial Limusa, 1992

Direcciones Electrónicas

1. http://www.slideshare.net/desarrollo_sostenible/como-hacer-y-
usar-el-compost-1444481?src=related_normal&rel=1444478

2. http://www.uteq.edu.ec/u_investigacion/uict/guias/Triptico_Estudio
%20de%20Mercado_Poster.pdf

3. http://www.quito.cipotato.org/PRESENTACIONES/Resumenes/Articu
lo%20cientifico%20de%20Wilian%20Viera%20y%20Gustavo
%20Bernal.doc

9
4. http://ciat-
library.ciat.cgiar.org/Articulos_Ciat/Compostaje_Pescador.pdf

10
1. ANEXOS

11.1 ANEXO I. Método de Determinación de pH

Norma Técnica Colombiana 5167. ICONTEC.

Determinación del pH del Suelo: La determinación del pH se puede


realizar en pasta de suelo saturada en agua. Para ello se añade a la
muestra, sin pesar, cantidades de agua hasta obtener una pasta espesa. Se
deja macerar durante media hora y se procede a la medida potenciométrica
del pH.

pH (pasta saturado)

• Valor normal entre 6.5 - 7.5

Preparación de la Pasta Saturada

Colocar de 500 g de suelo en un recipiente de saturación se le agrega agua


destilada lentamente y se va amasando hasta obtener una pasta lo más
homogénea posible. Se agrega tanta agua como sea necesaria para obtener
una pasta Saturada. Se debe eliminar el aire lo más completamente posible.
Esto permitirá obtener una alícuota volumétrica de suelo lo suficientemente
representativa. A partir de esta pasta es posible obtener tantas alícuotas
como sea necesario.
Para determinar el pH de la Pasta Saturada preparada tal como se describió
anteriormente, se introduce el electrodo del potenciómetro directamente en
la pasta saturada y se toma la lectura.

En la pasta del suelo Saturado

1. Pese aproximadamente 500 g de suelo.


2. Colóquelos en un recipiente apropiado y añada agua destilada en
pequeñas cantidades, mezclando bien después de cada adición hasta
lograr su saturación, la cual se alcanza cuando, sin quedar agua libre
en la superficie del suelo, ésta adquiere una apariencia brillante, fluye
ligeramente al inclinar el recipiente donde se encuentra y no se
adhiere a la espátula al introducirla en la pasta de suelo.
3. Si observa agua en la superficie de la pasta, debe añadir un poco más
de suelo hasta lograr la saturación de la misma.
4. Proceda a tomar la lectura del pH en el potenciómetro, introduciendo
con cuidado el electrodo.

11
11.2 ANEXO II. Composición del Medio de Cultivo SMRS

Fuente de carbono: Glucosa


Fuente de fósforo: Fosfato Tricálcico

COMPONENTE g/L
Glucosa 10
Extracto de
0.5
Levadura
Púrpura de
0.1
Bromocresol
Ca3(PO4)2 5
Agar 15

Medio base: (NH4)2SO4, 0,5; KCl, 0,2; MgSO4.H2O, 0,3; FeSO4.7H2O, 0,004; NaCl, 0,2;

ANEXO II. Composición del Medio de Cultivo Diseñado

Fuente de carbono: Glucosa


Fuente de fósforo: Solución de fosfato (goma arábiga 0.5 g, CaHPO4. 2H2O
0.5 g) en 100 ml de agua destilada.

COMPONENTE g/L
Glucosa 10
Extracto de
0.5
Levadura
Cloranfenicol 0.1
Agar 18

Medio base: (NH4)2SO4, 0,5 g; KCl, 0,2 g; MgSO4.H2O, 0,3 g; MnSO4.H2O, 0.004 g;
FeSO4.7H2O, 0,002 g; NaCl, 0,2 g. en 900 ml de agua destilada

NOTA: Ajustar el pH del medio a 7.2 con una solución de NaOH 0.1 N

12
ANEXO III. Método de determinación de actividad Enzimática
p-nitro fenil fosfato

10.3.1 Curva Patrón

Preparar una solución de p – nitrofenil a una concentración de


1umol/ml, simultáneamente preparar 100 ml de una solución buffer
de fosfato (Na2HPO4 1M) a pH 7.0. Preparar concentraciones
conocidas de p – nitro fenol empleando buffer fosfato (ANEXO 10.3.2).
Los cálculos se realizaran mediante una ecuación:

C1V1 = C2V2

Donde:
C1 = p – nitro fenol 1umol/ml
V1 = volumen de nitro fenol requerido
C2 = concentración en umol/ml a la que se quiere llegar
V2 = volumen de muestra en cada tubo

Medir los valores de absorbancia en un espectrofotómetro a una


longitud de onda de 450 nm.

Tomar 0.7ml de cada una de las muestras, las cuales fueron


adicionadas a tubos con 0.9 ml de p – nitrofenil fosfato al 0.08%, 1%
y 1.5% (v/v) dejando actuar durante 1 hora a 35ºC, adicionar 1.6 ml
de NaOH 0.02M para frenar la reacción. Las muestras someter a
centrifugación a 5000 rpm durante 5 minutos, luego leer las
absorbancias a 450 nm en espectrofotómetro.

11.3.2 Preparación Buffer fosfato

Para un volumen de 100 ml se adiciona 57.7ml de Na2HPO4 1M para


obtener un pH de 7.0.

Curva patrón de p – nitro fenol

Preparar una solución de p – nitro fenol de 1 umol/ml en buffer fosfato


pH 7.0 a partir de esta y utilizando la ecuación C1V1 = C2V2
Se utilizará espectrofotómetro, la lectura se realizara a 450 nm,
colocando 3 ml del blanco (buffer fosfato solo) y los demás de cada
concentración, realizando la lectura por triplicado.
Realizar regresión lineal determinado de la ecuación de la recta y el
coeficiente de correlación lineal debe ser mayor de 0.9.

Concentraciones para la curva de calibración 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4,


0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0

13

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