Introduccin

Objetivo
Fundamento

Trabajo Prctico N 3 y N 4
LIMPIEZA Y DESINFECCIN. CALIDAD MICROBIOLGICA DEL AMBIENTE, SUPER- FICIES
Y PERSONAL

Procedimiento
Bibliografa

INTRODUCCI
N
La limpieza y la desinfeccin son procedimientos de
gran importancia, ya que permiten controlar la
pre- sencia de microorganismos sobre las
superficies.
La limpieza se define como el proceso de remover
fsicamente el sucio, el polvo, la grasa, y otros contaminantes de las superficies, equipos, reas,
etc. Para ello generalmente
se utilizan
detergentes que eliminan el tipo de sustancia
presente y que no daan la superficie a tratar.
La desinfeccin es un proceso que implica la
destruc- cin de microorganismos perjudiciales
(formas vege- tativas), a travs del uso de
sustancias qumicas o agentes fsicos aplicados
sobre superficies inertes. Entre los desinfectantes
ms utilizados podemos citar los alcoholes, los
compuestos de amonio cuaternario, y los
compuestos clorados, etc.
La limpieza debe ser un paso previo a la
desinfeccin ya que con este proceso, adems de
eliminar muchas sustancias que pueden servir
como nutrientes para los microorganismos, se
eliminan sustancias que pueden impedir que las
soluciones desinfectantes acten eficientemente.

LABORATORIO DE MICROBIOLOGA LIMPIEZA Y

En el Laboratorio de Microbiologa estos procesos deben realizarse de rutina,

ya que el trabajar con microorganismos exige que se tomen medidas para evitar
la contaminacin del ambiente, del material de trabajo y del personal.
Si hablamos de empresas en donde se elaboran productos farmacuticos,
cosm- ticos o alimenticios; la limpieza y la desinfeccin tienen como finalidad
eliminar los desechos y materiales que se han depositado sobre las superficies
y reducir o eli- minar los microorganismos presentes en los equipos, pisos o
techos de la misma. Por tal razn, la limpieza y la desinfeccin no deben
considerarse como el ltimo paso en la manufactura de un producto, sino
como el primer paso en la elabora- cin del siguiente lote.
En las farmacias la limpieza y desinfeccin tambin se emplea con mucha frecuencia, sobre todos en las reas destinadas a la preparacin de frmulas
extem- porneas, donde la presencia de microorganismos puede influir en la
calidad del producto. En las instituciones de salud como clnicas, hospitales,
etc. la limpieza y la desinfeccin buscan disminuir la transmisin de
microorganismos patgenos que pudieran causar alguna enfermedad.
CALIDAD MICROBIOLGICA
PERSONAL

DEL

AMBIENTE,

SUPERFICIES

El captulo <1072> de la USP sobre Desinfectantes y Antispticos,

recomienda tener un programa eficaz de limpieza y desinfeccin para aquellos
ambientes con- trolados en los que se elaboran productos farmacuticos, de
manera de prevenir contaminacin microbiana en los mismos. Es por ello que
se debe conocer y con- trolar la calidad microbiolgica del aire y de las
superficies de trabajo posterior a estos procesos, ya que los microorganismos
podran ser fuente de contaminacin para el material con el que estamos
trabajando. (Como se demostr en el trabajo prctico N 2, los microorganismos
estn presentes en todas partes).
La evaluacin de la calidad microbiolgica del ambiente nos indica la cantidad
de microorganismos que estn presentes en un rea determinada. Los
microorganismos generalmente no estn flotando en el aire sino que se
encuentran sobre partculas inertes, por ejemplo polvo, gotas de agua, etc. que
le sirven como medio de transporte, las cuales pueden depositarse sobre las
superficies; es por ello que mientras ms limpia es un rea, menor ser el
nmero de microorganismos presentes en el aire de la misma.
Las personas tambin son una fuente de contaminacin, ya que liberan gran
cantidad de partculas al moverse, toser, estornudar, por exfoliacin de la piel,
etc. Algunas de estas partculas llevan microorganismos que podran
contaminar el material con el que estamos trabajando; en este sentido los
antispticos, deben ser usados por el personal para descontaminar la piel y
los tejidos expuestos antes de entrar a las reas de manufactura.
4 y 5.

LABORATORIO DE MICROBIOLOGA LIMPIEZA Y

Por todo lo expuesto anteriormente, es necesario determinar la calidad

microbiolgica
del
aire,
las
superficies
y
el
personal.

4 y 5.

LABORATORIO DE MICROBIOLOGA LIMPIEZA Y

CONTROL
AIRE

MICROBIOLGICO

DEL

Existen diferentes mtodos que permiten evaluar la calidad microbiolgica del

aire. Uno de los ms utilizados es el mtodo de sedimentacin en placas de
agar, que consiste en exponer placas con un medio nutritivo slido al ambiente
durante un periodo determinado, incubar las placas y hacer el recuento de las
colonias obte- nidas. El tiempo de exposicin depende del ambiente a
evaluar, mientras mayor sea la contaminacin menor ser el tiempo de
exposicin de las mismas. Normal- mente se utilizan placas de 9 cm de
dimetro.
Con este mtodo se detectan los microorganismos que caen sobre la superficie
de la placa, lo cual simula lo que ocurre normalmente cuando estamos
trabajando en el laboratorio.
Como las condiciones ambientales influyen en la sedimentacin de los
microorga- nismos es necesario que, cuando se realiza este mtodo, las placas
se expongan siempre en el mismo lugar y bajo las mismas condiciones para
poder comparar los resultados obtenidos.
OBJETIVO
Al finalizar el trabajo prctico el estudiante estar en capacidad
de:
1. Desinfectar los mesones al comenzar y al finalizar cada sesin de
trabajo.
2.
Evaluar la calidad microbiolgica del aire de un rea
determinada.
FUNDAMENT
O
1.

Disminuir la contaminacin de los mesones de trabajo, previamente

limpiados, utilizando desinfectantes.

2. Al exponer la superficie de un medio de cultivo al medio ambiente durante un

periodo determinado, los microorganismos que estn presentes en l pueden
sedimentar sobre el medio de cultivo dando origen a colonias que se
pueden contar.
PROCEDIMIENT
O
4 y 5.

LABORATORIO DE MICROBIOLOGA LIMPIEZA Y

Actividad
1
Desinfeccin)

(Limpieza

1. Verificar que sobre el mesn de trabajo no exista sucio, polvo,

etc.
2. Impregnar una toalla desechable con solucin desinfectante (compuesto
de
amonio
cuaternario).

4 y 5.

LABORATORIO DE MICROBIOLOGA LIMPIEZA Y

3. Pasar la toalla con el desinfectante sobre la superficie sobre el mesn de

traba- jo haciendo trazos paralelos de atrs hacia delante.

4. Dejar secar la solucin desinfectante antes de comenzar a trabajar.

5. Repetir el procedimiento al finalizar el trabajo prctico.
Actividad 2 (Control Microbiolgico del Aire)
1. Marcar con el nmero de su equipo la tapa de la placa con agar nutritivo que
le suministre el profesor y, de acuerdo a su nmero, exponer la placa en el
lugar y durante el tiempo sealado en la siguiente tabla:
Equipo
#
1

Tiempo y lugar de exposicin de la placa

10 minutos sobre el mesn de trabajo

20 minutos sobre el mesn de trabajo

30 minutos sobre el mesn de trabajo

10 minutos sobre el mesn de la cabina del laboratorio

20 minutos sobre el mesn de la cabina del laboratorio

30 minutos sobre el mesn de la cabina del laboratorio

10 minutos en el pasillo

20 minutos en el pasillo

30 minutos en el pasillo

10

10 minutos en el rea de los baos de mara

11

20 minutos en el rea de los baos de mara

12

30 minutos en el rea de los baos de mara

13

10 minutos en el bao de caballeros

14

20 minutos en el bao de caballeros

4 y 5.

LABORATORIO DE MICROBIOLOGA LIMPIEZA Y

15

30 minutos en el bao de caballeros

16

10 minutos en el rea asptica

17

20 minutos en el rea asptica

18

30 minutos en el rea asptica

19

10 minutos en el bao de damas

20

20 minutos en el bao de damas

2. Incubar la placa a 32,5 2,5C en posicin invertida durante 48 horas.

3. Contar el nmero de colonias en la placa.
4. Calcular el nmero de microorganismos que caen por cm2 durante 1 minuto.
CLCULO DEL NMERO DE MICROORGANISMOS POR CM2
Para calcular la cantidad de microorganismos que cayeron en la placa por
unidad de tiempo:
Contar el nmero de colonias en la placa. Este nmero se expresa como
ufc (unidades formadoras de colonias), ya que varios microorganismos
podran es- tar juntos y al multiplicarse slo se ver una colonia.
Calcular el rea de la placa
A = r2
(A).
Para una placa de 9 cm de dimetro el rea es
A = 3,14 x 4,52 cm2 = 63,62 cm2
Calcular el nmero de microorganismos que caen en el rea por unidad
de tiempo.
Se puede expresar en: ufc/ placa/
min, ufc/ cm2/
min o
ufc/ rea total/ min.
Ejemplo
Se expone una placa de 9 cm de dimetro en un rea durante 30 minutos. Se
in- cuba 24 horas a 32,5 +/- 2o C y se cuentan 25 colonias. Calcular el nmero
de
ufc/
placa/
min
y
ufc/
cm2
/
min.
4 y 5.

LABORATORIO DE MICROBIOLOGA LIMPIEZA Y

25 ufc ---------30 min

X
--------- 1 min

X = 0,833 ufc/ placa/ min

Si deseamos expresar los valores en ufc/ cm2/ min

0,833ufc -------- 63,62
cm2
X
-------- 1 cm2

X =0,0131 ufc/ cm2/ min

Es importante asegurarse al momento de comparar los resultados, que

stos estn expresados en los mismos parmetros
RESULTADOS
rea evaluada:

Tiempo de exposicin de las placas:

Clculos:

Nmero de microorganismos por cm2:

CONCLUSIONES

4 y 5.

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CONTROL
SUPERFICIES

MICROBIOLGICO

DE

El control microbiolgico de superficie nos proporciona informacin sobre la

canti- dad de microorganismos presentes sobre una superficie, la cual
puede ser un equipo, mesn, ropa, etc. Esta evaluacin generalmente se hace
utilizando:

Placas
(RODAC)

de

contacto

Las placas de contacto o RODAC (Replicate Organism Direct Agar Contact) son
placas de 55-60 mm de dimetro llenas con medio de cultivo hasta obtener una
superficie convexa, que sobresale del borde de la placa. Estas placas pueden
pre- parase en el laboratorio o adquirirse comercialmente.

Placa Rodac
Generalmente se utilizan para determinar la calidad microbiolgica de
superficies planas. Para tomar la muestra se abre la placa y se presiona sobre
la superficie a ensayar, sin deslizarla. Se tapa la placa y se incuba bajo las
condiciones adecua- das. Se cuenta el nmero de colonias y se calcula el
nmero de ufc/rea de la pla- ca, la cual est entre 24 y 30 cm2, dependiendo
del dimetro de la misma.
NOTA: Es necesario desinfectar la superficie evaluada luego de tomar la
muestra, ya que podran quedar restos del medio de cultivo que favorecen el
crecimiento de los microorganismos.

Mtodo
Hisopo

del

Se recomienda para tomar muestras de superficies irregulares donde no se

pue- den utilizar placas RODAC. Se debe definir el rea donde se va a tomar
la mues- tra, generalmente se usa una plantilla con un rea entre 24 y 30 cm2.
El hisopo estril se humedece en un diluente y se frota sobre la superficie a
evaluar, en por
lo menos dos direcciones distintas, rotndolo ligeramente. Luego la punta del
hiso- po se coloca en el diluente y se toman alcuotas para sembrarlas en
placas con agar. Se incuba y se cuenta el nmero de colonias. Se calcula el
nmero de ufc/rea.

4 y 5.

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CONTROL
PERSONAL

MICROBIOLGICO

DEL

Para evaluar al personal se pueden utilizar placas RODAC, las cuales se

presio- nan sobre su vestimenta. Cuando queremos detectar la presencia de
microorga- nismos en las manos del personal se pueden usar placas con medio
de cultivo (Touch plates), el personal toca el agar de dichas placas con la
punta
de
los
de-

4 y 5.

LABORATORIO DE MICROBIOLOGA LIMPIEZA Y

dos, luego se incuban por el tiempo y bajo las condiciones adecuadas. Al final
del periodo de incubacin se cuentan las colonias.
NOTA: El personal debe lavarse y desinfectarse las manos luego de tocar las
pla- cas, ya que podran quedar restos del medio de cultivo en los dedos y
favorecer el crecimiento de los microorganismos.
Actividad
3
Superficies)

(Control

Microbiolgico

de

1. Seleccionar para el muestreo una seccin del mesn, del piso, pared, etc.
que tenga una superficie de 25 cm2, segn lo indique el profesor.
2.
Identificar
necesarios.

la placa

con

los datos

3. Retirar la tapa de la placa RODAC y presionar suavemente la superficie

del agar sobre el rea de muestreo elegida.
4. Tapar la placa e Incubar durante 24-48 horas a 32,5
2,5C.
5. Limpiar con solucin desinfectante el rea muestreada, para eliminar los
resi- duos de agar.
Nota: La superficie delimitada por las placas es de 25 cm2, por lo que el
resultado se expresa en ufc/25 cm2 / placa rodac.

4 y 5.

LABORATORIO DE MICROBIOLOGA LIMPIEZA Y

BIBLIOGRAFA
Carlberg, D. 1995. Cleanroom Microbiology for the Non Microbiologist.
Interpharm
Press, Inc. Buffalo Grove, Illinois.
Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiologa. Manual de Mtodos
Ge- nerales (2da edicin). Facultad de Farmacia. Universidad Central de
Venezuela.
De Rossi, L.; Clavell, L. 2000. rea Limpias. Facultad de Farmacia.
Universidad
Central de Venezuela.
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Repraz, F.; Arina, P.; Artajo, P.; Snchez, M.T.; Escobar, E. Octubre 2001.
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URL: http://www.cfnavarra.es/salud/anales/textos/suple11/suple8.html
Tortora G.J., B.R. Funke and C.L. Case. 2007. Introduccin a la Microbiologa.
9
Edicin. Editorial Medica Panamericana. Buenos Aires.

Prof. Sofa Gutirrez de Gamboa

Prof. Luisa Rossi Devivo
Octubre 2001
Actualizado por
Prof. Alessandra Garcs
Prof. Katiuska Saravia
2008

4 y 5.