UD V Tecnicas Separacion Molecular

Fundamentos y tcnicas de anlisis bioqumico
UD V. TCNICAS DE SEPARACIN
1. Introduccin
2. Centrifugacin
2.1. Descripcin del equipo
2.2. Fundamento
2.3. Utilidad en el laboratorio
2.4. Control y mantenimiento
3. Filtracin
4. Dilisis
5. Decantacin
6. Extraccin
7. Destilacin
8. Cromatrografa
8.1. Fundamento
8.2. Clasificacin
8.3. Mecanismos de separacin
8.4. Tipos de soporte
8.5. Anlisis cualitativo y cuantitativo
9. Electroforesis
9.1. Fundamento
9.2. Factores que intervienen
electrofortico
9.3. Desarrollo de la tcnica
9.4. Isoelectroenfoque
9.5. Inmunoelectroforesis
10. Actividades
UDV Tcnicas de separacin
Profesor: Juan Cuenca
en
el
desarrollo
1. Introduccin.
Frecuentemente en la prctica diaria de un laboratorio de bioqumica, es necesario recurrir hacia
determinadas tcnicas para poder separar unas sustancias de otras. El objetivo final de dicha
separacin suele ser la posterior identificacin de aquello que se ha conseguido separar y
tambin su cuantificacin.
Las tcnicas ms usadas actualmente para la separacin de sustancias en cualquier laboratorio
estn basadas en los siguientes principios:
Tcnicas basadas en las diferencias de densidad:
- Centrifugacin
- Decantacin
Tcnicas basadas en las diferencias de tamao o peso molecular:
- Filtracin
- Dilisis
Tcnicas basadas en diferencias de solubilidad:
- Extraccin
Tcnicas basadas en diferencias de carga elctrica:
- Electroforesis
- Cromatografa de intercambio inico
Tcnicas basadas en diferencias de solubilidad, capacidad de absorcin, adsorcin:
- Cromatografa de gases
- Cromatografa lquido-lquido
- Cromatrografia lquido-slido (adsorcin)


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2. Centrifugacin.
Gran cantidad de determinaciones en el laboratorio comienzan con
una centrifugacin de la muestra que en general va a permitir separar
el material ms denso o pesado del resto (sobrenadante). Esta tcnica
se basa en el movimiento de las partculas, de tal modo que son
desplazadas segn sus diferentes masas.
El aparato utilizado para ello denominado centrfuga genera un
campo de fuerza tal que las partculas de material centrifugado de
mayor densidad migrarn ms rpidamente que las de menor
densidad.
2.1. Descripcin del equipo.

Las centrfugas son instrumentos que permiten someter las muestras a intensas fuerzas,
producindose la sedimentacin en poco tiempo de las partculas que tienen una densidad mayor
que la del medio que las rodea.
En general, las centrfugas se clasifican en funcin de los mrgenes de aceleracin a los que son
sometidas las muestras:
Centrfugas: de pocas g a aprox. 3000 xg
Supercentrfugas o centrfugas de alta velocidad: rango de 2000 xg a
20000xg
Ultracentrfugas: de 15000 xg a 600000 xg. Cabezal angular.
OJO: esta clasificacin puede variar segn autores ( en cuanto a los lmites de
velocidad)
En las centrfugas se suele controlar la temperatura de
la cmara para evitar sobrecalentamiento de las
muestras debido a la friccin. En las ultracentrfugas, la
velocidad extrema (ms de 100000 rpm), hace que sea
necesario hacer un intenso vaco en la cmara de la
centrfuga para evitar el calentamiento de rotor y
muestra.
Los elementos que componen la centrfuga son:

Rotor o cabezal: en una centrfuga el elemento determinante es el rotor, dispositivo
que gira y en el que se colocan los tubos. Existen varios tipos de rotor:
- Rotor
horizontal
o
basculante: en este tipo de
cabezal, los tubos se colocan
en unos dispositivos (cestilla)
que, al girar el rotor, se disponen en posicin horizontal (perpendicular al

eje de giro). Cuando la centrfuga est parada adoptan la posicin vertical.
-
Rotor angular o de ngulo fijo: los tubos se insertan

en orificios en el interior de rotores macizos de tal
manera que la posicin siempre es fija, formando un
determinado ngulo (25-40) con el eje de rotacin. El
caso extremo es el de los rotores verticales en los que
el tubo se sita paralelo al eje de giro.
Eje de la centrfuga: es la barra o vstago que soporta el rotor y acta como eje de
rotacin.
Motor: acciona el vstago con el rotor o cabezal que contiene las muestras.
Accesorios: el rotor est incluido en el interior de una cmara que generalmente
lleva tapadera con cierre de seguridad que impide su apertura hasta que haya
terminado de centrifugar. Otros accesorios que pueden llevar las centrfugas son:
- Interruptor de puesta en marcha.
- Temporizador.
- Control de velocidad.
- Freno.
- Refrigeracin para disminuir la temperatura de la cmara (por el calor que
se produce al friccionar el rotor con el aire), etc.
VIDEOS:
La centrifugacin como principio: http://youtu.be/LWZMmCgC5rQ
Tecnologa e innovacin en centrfugas alta gama
2.2. Fundamento.
La potencia de una centrfuga viene determinada por la fuerza centrfuga relativa (FCR), que
es la fuerza requerida para que se produzca la separacin, es decir, la aceleracin que pueda
generar la centrfuga.
DEBES SABER.
La FCR expresa la relacin que existe entre la fuerza centrfuga y la fuerza de la gravedad,
indicando el nmero de veces que dicha fuerza es mayor que la gravedad (g), y se calcula
mediante la siguiente frmula:
FCR = K . r. n2 = X . g (se expresa en trminos de gravedad, g)
K = es una constante: 1,118 x 10-5 .
r = radio de giro (cm). Distancia horizontal en cm desde el centro de rotacin (eje de la
centrfuga) hasta el fondo del tubo durante la centrifugacin.
n = velocidad de rotacin del rotor en r.p.m.
Por tanto, la potencia de una centrfuga depende de la velocidad del motor (nmero de r.p.m) y
del radio de giro, que van a ser las variantes en funcin del modelo y tipo de centrfuga.

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La potencia de una centrfuga puede calcularse tambin a travs de un nomograma, que

relaciona la FCR con su radio de giro en cm, es decir, sabiendo la FCR necesaria y el radio de
giro de la centrfuga a emplear, se obtiene el nmero de r.p.m., sin necesidad de usar las
frmulas.
En el nomograma la determinacin de la potencia de una centrfuga se hace mediante el uso de

una regla. Se une el radio (escala de la izquierda) con el nmero de r.p.m. (escala de la derecha)
y el punto de interseccin de esta recta con la escala central nos va a indicar la potencia de la
centrfuga expresada en g.
Adems,
tambin
debemos
considerar que la velocidad de sedimentacin (tiempo de centrifugacin) y la aceleracin de la

centrfuga son inversamente proporcionales, de manera que si se duplica la aceleracin, el

tiempo de centrifugacin puede reducirse a la mitad.
Una vez definida la FCR, se estudiar cmo acta sta sobre el tubo, accin que difiere segn el
tipo de rotor empleado:
Cabezal oscilante: durante la centrifugacin las partculas se desplazan de
forma constante a lo largo del tubo, de modo que el sedimento es distribuido
uniformemente contra el fondo del mismo, por ello la superficie del
sedimento es plana (paralela al eje de la centrfuga).
Cabezal angular: al actuar la FCR, las partculas son conducidas hacia fuera
horizontalmente pero chocan en el lado del tubo, por lo que el sedimento
impacta contra el borde y el fondo de ste, con la superficie del sedimento
paralela al eje de la centrfuga. Al desacelerar y parar, el sedimento se
deposita en el borde inferior del tubo a causa de la gravedad, formndose un
sedimento menos compacto.
RESUELVE.
Utilizando el nomograma, resuelve las siguientes cuestiones:
1) Cul es la FCR de una centrfuga cuando la velocidad es de 1.500 rpm y el radio de
giro es de 12 cm?
Resp: 300 g aprox (302 g)
2) Cul es la velocidad en rpm que debe llevar una centrfuga de 15 cm de radio de giro
para adquirir una FCR de 450g?
Resp: 160 r.p.m.
Utiliza ahora la frmula para resolver estos problemas:
1) Calcula la fuerza centrfuga relativa a la que est sometido un tubo que gira a 2000 rpm
con un radio de 10 cm.
Resp: FCR = 1,18 . 10-5 . 10 . 20002 = 447,2 g
2) Calcula las rpm de una centrfuga cuya FCR es de 1000 g y tiene un radio de 10 cm.
Resp.: N = (1,18 -5 . 10 /1000)1/2 = 2991 rpm

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2.3. Utilidad en el laboratorio.

La centrfuga es un aparato imprescindible en cualquier laboratorio por las distintas actividades
en las que se utiliza como tcnica de separacin:
Separacin de suero o plasma: actividad primordial en el laboratorio, se puede
emplear una velocidad de 3500 rpm durante 5-10 minutos.
Concentracin de clulas: estos componentes de los lquidos biolgicos se
concentran para facilitar, por una parte, el diagnstico microscpico del
sedimento y por otra, el estudio qumico del sobrenadante.
Separacin de sustancias: previamente podemos precipitarlas qumicamente,
como por ejemplo en la tcnica de determinacin de HDL-colesterol.
Aclarar lquidos orgnicos: la centrfuga acta separando las fases lquidas de
diferente densidad.
Separar quilomicrones del suero o fraccionar las distintas lipoprotenas:
para este tipo de actividad se necesitan ultracentrfugas.
La Centrifugacin diferencial: ejemplo de aplicacin
2.4. Control y mantenimiento.

Para un adecuado funcionamiento de la centrfuga es necesario seguir algunas recomendaciones:
- Utilizar tubos resistentes a la FCR. Tener cuidado de que no sobresalga el tubo del
portatubos, ya que puede impedir la oscilacin en las centrfugas de cabezal oscilante.
Equilibrar correctamente la centrfuga colocando los tubos de igual peso, forma y

tamao en posiciones opuestas en el interior de los contenedores, manteniendo una
disposicin geomtrica simtrica.
Tapar los recipientes para evitar la evaporacin que puede causar el aumento de la
temperatura que se produce en el interior de la cmara debido al rozamiento, as como
para impedir la formacin de aerosoles que pueden ser contaminantes.
No forzar el paro de la centrfuga con el freno de mano o con alguna maniobra manual,
evitando de este modo la posible mezcla de las dos partes ya separadas y adems el
peligro de accidente.
Chequeo de la velocidad de centrifugacin, el temporizador y control de la temperatura
en las centrfugas refrigeradas.
Limpieza peridica de la cmara y los contenedores para impedir en lo posible la
propagacin de agentes infecciosos.
3. Filtracin.
La filtracin consiste en la separacin de partculas slidas del lquido en el que se encuentran,
utilizando para ello materiales permeables y porosos, filtros, a travs de cuyos poros pasa
fcilmente el lquido (filtrado) quedando retenido el slido (residuo).
PUEDES CONSULTAR.
URL:http://www.iesalonsoquesada.org/inicio/fisica/departafyq/TecnicasLaboratorio/2SeparacionMezclas.pdf
Los filtros ms utilizados en el laboratorio son:
Papel de filtro:
- Se utiliza muy poco en el laboratorio qumico.
- Existen papeles con dimetro de poro variable que se elegirn
en funcin del tamao de las sustancias a separar.
- Los filtros de papel son de un solo uso y para su correcta
utilizacin han de colocarse en un embudo adecuado.
- Existen filtros de papel endurecidos que por sus caractersticas
presentan mayor resistencia al agrietamiento por la humedad y
la accin qumica de cidos y bases, aunque para paliar estos
problemas es recomendable el uso de membranas filtrantes.
Membranas o placas filtrantes.

- Estn formadas por polvo de vidrio aglomerado y
normalmente estn ya montadas sobre un embudo o sobre un
crisol.
- Permiten llevar a cabo repetidas filtraciones aunque para ello
es imprescindible realizar una correcta limpieza cada vez que
se utilizan.
- Son muy resistentes a la agresin qumica.
RECUERDA.
El objetivo final de cualquier filtracin es que sta sea rpida y que la retencin del slido sea
total para lo cual una eleccin adecuada del tamao del poro es fundamental. Cuando este

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tamao es excesivamente grande el slido atravesar el filtro mientras que si es demasiado

pequeo la filtracin ser muy lenta.
El paso del slido a travs del filtro puede realizarse por distintos mtodos, por accin de la
gravedad o por succin.
Filtracin por gravedad :
o Utiliza papel de filtro colocado en un embudo en posicin vertical por
el cual desciende el lquido por accin de la gravedad.
o El filtro liso es el ms indicado cuando se pretende recoger el slido
tras la filtracin.
o El filtro de pliegues aunque est comercializado puede prepararse
fcilmente en el laboratorio.
o La filtracin se lleva a cabo vertiendo a un ritmo adecuado aquello que
se desee filtrar en el interior del embudo.
o Para evitar salpicaduras es conveniente que la varilla del embudo toque
la pared interior del vaso colector.
o Dicha varilla ha de estar a la suficiente altura como para que se
encuentre siempre por encima del nivel de filtrado.
o Siempre que sea posible se debe dejar reposar la muestra antes de
mezclar para que las partculas slidas se sedimenten y la filtracin sea
ms rpida.
o El filtro no debe llenarse nunca hasta el borde.
o Cuando tras la filtracin el filtrado no aparece claro hay que pensar que
el filtro no tena la porosidad adecuada.

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Filtracin por succin:

o La filtracin por succin utiliza como medio filtrante un papel de filtro
colocado en un embudo especial provisto de una placa perforada
(Buchner) o bien una placa filtrante montada en un embudo o crisol.
o El embudo se ajusta perfectamente a la boca del recipiente de recogida
mediante una junta de goma.
o La filtracin se produce por succin, para ello se conecta el matraz
(kitasato) mediante una tubuladura lateral a una bomba de vaco, como
consecuencia el lquido que se encuentra en el embudo es aspirado y la
filtracin se produce con cierta rapidez.
o Es imprescindible que todas las conexiones estn bien ajustadas para
evitar que entre aire en el interior del matraz.
o Cuando se usa un papel de filtro, debe recortarse perfectamente
ajustado a la medida del embudo.
o Al comenzar a filtrar es conveniente usar un vaco moderado para
evitar que las partculas ms finas puedan atravesar el filtro o bien
obstruyan los poros.
o Finalizada la filtracin es conveniente desconectar el dispositivo antes
de cerrar el grifo de lo contrario es posible que entre agua y se mezcle
con el filtrado.
Ver video sobre la filtracin: (http://www.youtube.com/watch?
v=MOIqOmdYbC4&feature=relmfu)
4. Dilisis.

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La dilisis es una tcnica que permite la separacin entre macromolculas y solutos de pequeo
tamao molecular y consiste en la difusin de molculas pequeas a travs de una membrana
semipermeable, que debido a su tamao de poro impide el paso de molculas grandes. El paso
de estas molculas pequeas se debe solamente al gradiente de concentracin a ambos lados de
la membrana, es decir, pasarn las molculas de soluto cuyo tamao sea inferior al tamao de
poro de la membrana desde la zona de mayor concentracin de soluto a la zona de menor
concentracin.
CURIOSIDAD.
La dilisis es un mtodo muy antiguo de separacin de sustancias. Fu utilizado por primera
vez por Gram en 1861 para la purificacin de coloides con el fin de eliminar impurezas de tipo
inico que acompaaban al estado coloidal y que eran nocivas para la estabilidad del coloide.
En la dilisis una bolsa o vaina con estructura de membrana semipermeable se llena con la
muestra, las macromolculas presentes en la misma quedan retenidas mientras que el lquido y
las molculas de menor tamao atraviesan la membrana. El intercambio de material se produce
por difusin y por tanto es un proceso lento.
Un mtodo para acelerarlo consiste en ejercer una presin sobre la muestra o tambin se puede
utilizar la electrodilisis.

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RECUERDA.
Las membranas utilizadas tienen un dimetro de poro comprendido entre 15 y 0025 m.
PUEDES CONSULTAR.
En el siguiente enlace puedes encontrar ms informacin sobre la tcnica de dilisis.
URL: http://iespoetaclaudio.centros.educa.jcyl.es/sitio/upload/06.dialisis.pdf
5. Decantacin.
Es un mtodo de separacin que consiste en mantener la mezcla a separar en reposo
durante un cierto tiempo para que el slido sedimente totalmente en el fondo del
recipiente y posteriormente extraer cuidadosamente el sobrenadante con ayuda de
una pipeta Pasteur o similar por succin.
Un mtodo alternativo utilizado para el estudio del sedimento urinario consiste en
inclinar cuidadosamente el recipiente que contiene la muestra tras la sedimentacin
vertiendo lquido sobrenadante y manteniendo el slido en el fondo.
Es un mtodo menos eficaz que la filtracin. Esta ltima tcnica cuando es realizada despus de
un decantacin es ms rpida.
PUEDES CONSULTAR.
Si consultas este enlace podrs ver un experimento de decantacin.
URL: http://www.youtube.com/watch?v=mOFPsTVM_6Q
6. Extraccin.

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Separacin de uno o ms constituyentes de una mezcla mediante un disolvente. Para conseguir

una buena extraccin, el disolvente utilizado debe tener un buen poder separador, es decir, ser
capaz de disolver perfectamente las sustancias a extraer pero sin disolver las restantes.
Bsicamente se distinguen 2 tipos de extraccin:
Slido-lquido: consiste en la separacin de uno o ms componentes de una
mezcla slida mediante un disolvente lquido y tiene lugar en dos etapas
fundamentales:
o El contacto del disolvente con el slido: en esta etapa se produce la
separacin de uno o ms componentes de una mezcla slida mediante
un disolvente lquido. El proceso puede llevarse a cabo a temperatura
ambiente o en caliente.
o La separacin de la disolucin del resto del slido: cuando interesa
recuperar el soluto hay que completar el proceso con otras tcnicas
como la destilacin y la evaporacin.
Lquido-lquido: la sustancia que interesa extraer forma parte de una
disolucin lquida y se extrae mediante un disolvente lquido. Para que la
extraccin sea efectiva el lquido extractor debe ser insoluble o muy poco
soluble en la disolucin.
o La forma ms sencilla para efectuar una extraccin en el laboratorio
consiste en agitar vigorosamente durante unos minutos la mezcla en
una ampolla de vidrio denominada embudo de decantacin.
o Finalizada la extraccin se procede a separar las 2 capas de lquido,
para ello se deja reposar el embudo de decantacin en posicin
vertical.
o La capa situada en la parte inferior se extrae por la llave mientras que
la superior se extrae por la parte de arriba.
Veamos un video resumen del proceso de extraccin:
http://www.youtube.com/watch?v=Q3QxStCFDUo&feature=relmfu
PUEDES CONSULTAR.
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Si accedes a este enlace podrs observar un experimento sobre la extraccin: Aceite de romero
URL: http://www.youtube.com/watch?v=p5O2X2EhJk8&feature=fvwrel
7. Destilacin.
Es un procedimiento que consiste en la separacin (por accin del calor) de un lquido voltil de
una sustancia no voltil o bien de otro lquido cuyo punto de ebullicin sea distinto (cuanto ms
diferente sea mejor ser la separacin) recogiendo los vapores en un recipiente apropiado tras su
condensacin.
Se desarrolla en dos etapas:
Durante la primera el lquido alcanza su punto de ebullicin y pasa a vapor.
En la segunda se condensa y es recogido en un recipiente diferente.
Un destilador en general consta bsicamente de:
Un matraz donde hierve el lquido.
Un refrigerante en el que se condensan los vapores.
Un recipiente colector en el que se recoge el lquido ya condensado.
PUEDES CONSULTAR.
Si accedes al este enlace podrs observar un proceso de destilacin.
URL: http://www.youtube.com/watch?v=pJ2jm2J41bw
Un video que recoge los distintos tipos de destilacin: fraccionada, al vaco, etc.
8. Cromatografa.
Las tcnicas cromatogrficas son tcnicas de separacin, es decir, tienen como finalidad la
separacin de mezclas de solutos que disueltas en un solvente. Estas mezclas, son fraccionadas
en sus distintos componentes en funcin de la diferente afinidad de stos por dos fases
diferentes (fase mvil y fase estacionaria).

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CURIOSIDAD.
El botnico ruso Mikhail Tswett (Mikhail Semenovich Tsvett, 1872-1919)
emple por primera vez en 1906 el trmino "cromatografa" (que
proviene del griego y que significan a su vez
respectivamente "color" y "escribir").
A comienzos del ao 1903, Mikhail Tswett us columnas de adsorcin de
lquidos para separar pigmentos vegetales (por ejemplo, clorofilas). Las
disoluciones se hacan pasar a travs de una columna de vidrio rellena de
carbonato de calcio que interaccionaba de forma diferente con los
componentes de la mezcla, de forma que stos se separaban en distintas
bandas a lo largo de la columna.
Los primeros equipos de cromatografa de gases aparecieron en el
mercado a mediados del siglo XX. A su vez, la cromatografa lquida de
alta resolucin (HPLC) comenz a desarrollarse en los aos 1960, aumentando su importancia
en las dcadas siguientes, hasta convertirse en la tcnica cromatogrfica ms empleada. Sin
embargo esto se ira modificando con el paso de los aos.
8.1. Fundamento.
La cromatografa es un mtodo de anlisis en el cual el movimiento de una fase mvil que
contiene una mezcla de sustancias provoca la separacin de sus componentes mediante una
distribucin diferencial entre esta fase y una fase estacionaria.
Fase mvil: puede estar formada por un lquido o un gas en el cual estn los solutos
que se van a separar.
Fase estacionaria: puede ser slida o lquida y es el lecho a travs del cual va a fluir la
fase mvil.
Los distintos componentes de la mezcla se van a separar en funcin de su distribucin entre la

fase mvil y la fase estacionaria, dependiendo de sus propiedades fsico-qumicas y en virtud de
un proceso en equilibrio. Un compuesto que tenga mayor afinidad por la fase estacionaria se
retrasar en su avance a travs de ella, mientras que aquellos compuestos que tengan menor
afinidad la atravesarn antes.
Una vez que todos los componentes de la mezcla han atravesado la fase estacionaria, salen
separados unos de otros, lo que puede ser empleado con fines de identificacin o cuantificacin.
8.2. Clasificacin.
Los distintos tipos de cromatografa se han clasificado atendiendo a diversos criterios:
A. Segn las caractersticas fsicas de las fases mvil y estacionaria:
Naturaleza de la fase mvil:
o Lquida
o Gaseosa
Naturaleza de la fase estacionaria:
o Slida
o Lquida
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B. Segn el mecanismo fsico de la separacin:

Cromatografa de adsorcin
Cromatografa de particin
Cromatografa de intercambio inico
Cromatografa de exclusin molecular
Cromatografa de afinidad
C. Segn la forma fsica de los sistemas utilizados:
En soportes planos (papel, capa fina)
En columna
Habitualmente se realiza una clasificacin combinando la naturaleza de las fases y los
mecanismos fsicos de separacin, de tal manera que quedara reflejada de la siguiente forma:
RECUERDA.
En general, la cromatografa de gases siempre se lleva a cabo en columna, mientras que la
cromatografa lquida se puede hacer en soportes planos (capa fina, papel) o sobre columna.
8.3. Mecanismos de separacin.

La separacin de las sustancias se puede realizar por distintos mecanismos:
1) Intercambio inico.
2) Exclusin molecular.
3) Adsorcin
4) Particin o reparto.
5) Afinidad.
1) Cromatografa de intercambio inico.


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Es un tipo de cromatografa lquida en la

cual el sistema cromatogrfico est
compuesto por una fase mvil lquida y una
fase estacionaria slida.
Se realiza en columnas en las que se
encuentra empaquetada la fase slida.
El fundamento de la separacin se basa en
las diferencias existentes entre el signo y la
magnitud de las cargas elctricas.
La fase estacionaria consiste en resinas de
intercambio inico, que poseen grupos
cargados positivos o negativos.
Si la carga de las resinas es positiva se
denominan resinas de intercambio aninico
(separan aniones).
Si la carga de las resinas es negativa se denominan resinas
de intercambio catinico (separan cationes).
La funcin de estas resinas con carga en su superficie es la
de intercambiar iones con los de la fase mvil y los de la
muestra.
Cuando se produce el paso de la fase mvil (con los iones
a separar) a travs de la fase estacionaria, los iones de la
muestra compiten con los de la fase mvil por los sitios de
unin de la fase estacionaria, de manera que los que tienen
mayor fuerza de unin son los ms retenidos y saldrn ms
tarde en la columna.
Veamos como separar el cobre disuelto

Un video donde explica el mecanismo de funcionamiento del intercambio ionico ( en
ingles)
2) Cromatografa de exclusin molecular.

-
Se llama tambin cromatografa de filtracin en gel.

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Es una forma de cromatografa lquida en la que el sistema cromatogrfico est

compuesto por una fase mvil lquida y una fase estacionaria slida.
Se realiza en columnas en las que se encuentra empaquetada la fase slida.
El fundamento de la separacin es la diferencia en el tamao molecular de las
sustancias a separar (tambin puede influir la forma y la hidratacin de la molcula).
La fase estacionaria consiste en un gel que presenta poros de un tamao determinado.
El mecanismo de separacin es por exclusin molecular: la solucin con las sustancias
a separar se introduce en la columna atravesando la fase slida, de manera que aquellas
cuyo tamao es mayor que el del poro del soporte, pasan sin ser retenidas, y aquellas
que tienen un menor tamao que el del poro penetran en el gel y son retenidas , siendo
eluidas ms tarde (ver video)
Los geles empleados como fase estacionaria son muy variados,
el ms conocido es el Sephadex.
Veamos un video explicativo del principio de exclusin con un ejemplo
3) Cromatografa de adsorcin.
-
La separacin est basada en las interacciones que se

producen entre el soluto y las molculas de la fase mvil con
una fase slida.
Las interacciones pueden ser de tipo electrosttico, puentes
de hidrgeno o fuerzas de van der Waals.
El fenmeno que se produce entre solutos y solventes y la
fase slida o adsorbente, es un fenmeno de adsorcin. La
distinta polaridad de los componentes del sistema hace que,
al pasar una mezcla de sustancias disueltas en una fase mvil
a travs de una adsorbente, se produzcan atracciones de


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distinta fuerza y naturaleza sobre la fase estacionaria, lo que conlleva la separacin de

las sustancias segn su grado de retencin (atraccin) por la fase slida o adsorbente.
La fase mvil puede ser lquida o gaseosa.
(video sobre distintos procesos de adsorcin)
La cromatografa G/S se realiza en columnas.
La cromatografa L/S se realiza tanto en soportes planos como en columnas.
La fase estacionaria puede estar constituida por adsorbentes no polares o polares.
4) Cromatografa de particin o reparto.

-
Es una tcnica basada en la separacin de solutos por su diferente solubilidad entre una
fase mvil y una estacionaria inmiscibles.
La distribucin de sustancias se produce sobre una fase estacionaria lquida.
La fase mvil puede ser lquida (L/L) o gaseosa (G/L).
La fase estacionaria est constituida por una fase soporte recubierta por un lquido.
En la cromatografa L/L se distinguen dos tipos de mtodos:
o Particin en fase normal: la fase soporte est cubierta con una sustancia
(lquida) polar, de manera que la fase mvil es apolar:
- Los componentes ms polares de la mezcla son ms retenidos.
- Los componentes de polaridad intermedia son retenidos con menos
fuerza.
- Los componentes de menor polaridad o apolares no son retenidos y
salen eluidos en primer lugar.
o
Particin en fase invertida: la fase soporte tiene grupos no polares unidos en su

superficie, de manera que la fase lquida estacionaria es de naturaleza no polar,
siendo por tanto la fase mvil polar.
- Los solutos son separados por su carcter relativo no polar, de manera que
los ms polares son eluidos los primeros.
- Los solutos menos polares son retenidos con ms fuerza y salen eluidos en
ltimo lugar.
La mayor parte de las separaciones realizadas por HPLC se realizan por
cromatografa de particin en fase invertida.

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Cmo se reparte un colorante entre dos fases de distinta polaridad?
5) Cromatografa de afinidad.
-
La separacin se basa en mecanismos

que implican la afinidad entre dos
elementos, por ejemplo enzimasustrato, Ag-Ac, hormona-receptor,
etc
La fase estacionaria contiene unido el
ligando.
Cuando la fase mvil atraviesa la fase
estacionaria los elementos que
presenten mayor afinidad por el
ligando sern retenidos en la columna,
siendo eluidos posteriormente por la
adicin de otros metabolitos de mayor afinidad por el ligando o bien cambiando las
condiciones fsico-qumicas de la fase mvil.
8.4. Tipos de soporte.

La separacin de mezclas de componentes se puede conseguir jugando con la puesta en comn
de dos fases entre las que se van a distribuir las sustancias a estudiar en funcin de diferentes
mecanismos. Ahora bien, la ejecucin de la tcnica se puede llevar a cabo mediante el empleo
de distintas formas de soportes sobre los que actuarn las fases de separacin:
Cromatografa plana: integra un conjunto de tcnicas en las que la fase estacionaria se
encuentra extendida en una superficie plana y la fase mvil lquida, se desplaza por
capilaridad o adsorcin.
- Cromatografa en papel (PC)

21
- Cromatografa en capa fina (TLC = Thin Layer Chromatography)

Cromatografa en columna
1) Cromatografa en papel.
Es esencialmente una cromatografa de reparto en donde la fase estacionaria es el agua retenida
entre las fibras de celulosa de una hoja de papel y la fase mvil suele ser un disolvente orgnico
o bien una mezcla de disolventes en la que ir disuelta la muestra, es por tanto una
cromatografa lquido-lquido.
El soporte es plano y consiste en una hoja de papel de celulosa de elevada pureza.
La tcnica general consiste en:
o Aplicacin de la muestra sobre el papel en un extremo con un capilar o una
micropipeta. Esperar a que se seque.
o Una vez seco, introduccin del soporte (tira de papel) en una cmara que
consiste en una cubeta de vidrio bien cerrada que contiene el eluyente o
lquido de desarrollo y en posicin vertical.
o
o
o
o
Se deja que fluya el solvente por capilaridad a travs de la tira de papel,

arrastrando a su paso los componentes de la tira de la muestra.
Separacin: dichos componentes se irn separando en funcin del reparto
entre las dos fases de forma que las sustancias muy solubles en el lquido de
desarrollo se movern libremente con ste mientras que las que sean muy
solubles en agua quedarn retenidas y por tanto ms cerca del punto de
aplicacin.
Cuando el solvente ya casi ha alcanzado el frente del papel se quita la tira
de la cmara y se deja secar. Se marca el nivel exacto alcanzado por el
solvente o eluyente.
Las sustancias separadas se detectan mediante el revelado: bien
directamente si son coloreadas bien por algn mtodo de deteccin que
las haga visibles. Se obtiene as un cromatograma que se queda en el propio
soporte.
En los tipos de cromatografa en papel el proceso puede

desarrollarse de tres formas:
Ascendente: el eluyente sube por el soporte.
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Descendente: el papel se mantiene colgado de la parte superior del recipiente y el

eluyente va descendiendo.
Didimensional: consiste en ejecutar una segunda cromatografa girando el papel 90 y
empleando un disolvente diferente, de forma que sustancias que en una primera
separacin quedaron muy juntas, se podran separar en el segundo proceso.
2) Cromatografa en capa fina.

En este tipo de cromatografa el soporte es plano y consiste en una capa muy fina de un material
poroso extendido sobre una placa que puede ser de vidrio, plstico o metal, por el que fluye la
fase mvil por capilaridad.
La fase estacionaria est constituida por las partculas slidas adheridas al vidrio, es por tanto,
slida.
La fase mvil es lquida y est formada por solventes de polaridad que va en funcin de la
polaridad de la fase slida estacionaria.
Es una cromatografa lquido/slido.
La separacin de los distintos componentes se produce en virtud de los procesos de adsorcin
sobre la fase estacionaria.
El material poroso puede ser:
- Gel de slice o silicagel
- Celulosa
- Poliamida
- Gel de xido de aluminio
- Gel de silicato magnsico
La aplicacin de muestras y el desarrollo cromatogrfico es
similar a la cromatografa en papel con la salvedad de que

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siempre es ascendente. Frecuentemente se usa la tcnica tridimensional combinando dos

sistemas distintos de disolvente.
La cromatografa en capa fina Eq-100, es una tcnica ms rpida y sensible que la
cromatografa en papel y se usa para separar sustancias de bajo peso molecular (aminocidos,
lpidos, y carbohidratos).
La elucin de los componentes se realiza mediante raspado de las distintas manchas en el
soporte y posterior disolucin del polvo del soporte, que llevar adsorbida la sustancia de
inters, con disolventes adecuados. Una vez extrados se procede a su identificacin y
cuantificacin.
Veamos un video explicativo de la cromatografa en capa fina
3) Cromatografa en columna.
Los mtodos en columna se emplean para varios tipos de cromatografa tanto en cromatografa
lquida como gaseosa, tanto en fase estacionaria lquida como slida.
Los mecanismos en virtud de los cuales se produce la separacin son de diferentes tipos:
- Adsorcin (fase estacionaria slida)
- Reparto o particin (fase estacionaria lquida)
- Intercambio inico (fase estacionaria slida)
En este mtodo de cromatografa la fase estacionaria se dispone

como el relleno de un recipiente cilndrico abierto por varios
extremos y de longitud y ancho variable que se denomina
columna, este relleno denominado tambin lecho cromatogrfico
puede ser la propia fase estacionaria o ir asociada a un lquido
que constituye la fase estacionaria.
La fase mvil es un solvente que se hace pasar a travs de la columna o bien un gas.
El flujo de la fase mvil puede estar propiciado por la accin de la gravedad (cromatografa
convencional) o bien por un sistema de bombeo de alta presin ( HPLC).
La muestra se introduce en la columna junto con la fase mvil, depositndose sobre la parte
superior del lecho cromatogrfico: se abre la columna por el extremo opuesto y se deja que vaya
fluyendo hacia el interior del lecho. Antes de que se seque se aade nueva fase mvil y se
contina as hasta el final del proceso. Las fases mvil y estacionaria se encuentran en
equilibrio, de manera que la separacin de los componentes de la muestra se lleva a cabo por su
distribucin entre las dos fases.
El eluido es fraccionado en tubos de ensayo de forma que se obtienen distintas fracciones de
fase mvil que contienen concentraciones elevadas de los distintos solutos.
El desplazamiento de los diferentes componentes de la muestra slo puede ocurrir en la fase
mvil y por tanto la velocidad de migracin va a depender del tiempo que cada componente
permanezca en esta fase. Esta fraccin de tiempo va a ser pequea para aquellas sustancias que
son retenidas fuertemente por la fase estacionaria y viceversa. En cualquier caso la diferencia de
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velocidad de los diferentes componentes va a permitir su separacin, objetivo final de la

cromatografa.
Como detector debe ser utilizado aquel que sea capaz de identificar cada una de las fracciones
de la muestra. Si la seal recogida por el detector es representada en funcin del tiempo se
obtiene una grfica (registro o cromatograma) donde aparecen una serie de picos que pueden ser
utilizados tanto para el anlisis cualitativo como cuantitativo.
La composicin de la fase mvil puede ser constante o variar (mezcla de uno o ms eluyentes en
gradiente continuo o discontinuo).
Para que la columna pueda ser reutilizada hay que regenerarla despus de cada uso para que no
queden restos de la separacin anterior. Normalmente se mantienen refrigeradas entre 2-4C.
En la actualidad, se emplean fundamentalmente dos tcnicas de cromatografa en columna:
cromatografa lquida de alta resolucin y cromatografa de gases.
Cromatografa lquida de alta resolucin
(HPLC = High performance

liquid chromatography): es un tipo de cromatografa en columna utilizada
frecuentemente en bioqumica y qumica analtica. Tambin se le denomina a veces
Cromatografa lquida de alta presin o High pressure liquid chromatography (HPLC),
aunque esta terminologa se considera antigua y est en desuso. La HPLC es una tcnica
utilizada para separar los componentes de una mezcla basndose en diferentes tipos de
interacciones qumicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatogrfica.
Dependiendo de la forma en que se use el solvente tendremos dos mtodos de trabajo:

Mtodo isocrtico: cuando durante toda la separacin se utiliza siempre el mismo
solvente, se denomina isocrtica, sin embargo es normal realizar un gradiente de
composicin del solvente a lo largo de la cromatografa para mejorar la eficiencia y
acortar la duracin del proceso
Mtodo de gradiente de elucin: proceso mediante el cual se cambia la
composicin de la fase mvil.
- En la HPLC isocrtica el compuesto
pasa por la columna cromatogrfica
a travs de la fase estacionaria
(normalmente, un cilindro con
pequeas partculas redondeadas
con ciertas caractersticas qumicas
en su superficie) mediante el
bombeo de lquido (fase mvil) a
alta presin a travs de la columna.
- La muestra a analizar es introducida
en pequeas cantidades y sus
componentes
se
retrasan
diferencialmente dependiendo de las
interacciones qumicas o fsicas con la fase estacionaria a medida que adelantan
por la columna.
- El grado de retencin de los componentes de la muestra depende de la
naturaleza del compuesto, de la composicin de la fase estacionaria y de la fase
mvil.

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El tiempo que tarda un compuesto en ser eluido de la columna se denomina

tiempo de retencin y se considera una propiedad identificativa caracterstica de
un compuesto en una determinada fase mvil y estacionaria.
La utilizacin de presin en este tipo de cromatografas incrementa la velocidad
lineal de los compuestos dentro la columna y reduce as su difusin dentro de la
columna mejorando la resolucin de la cromatografa, es decir, se consiguen
separaciones en tiempos cortos, del orden de minutos (con la cromatografa
convencional se tardaba horas o das).
Los disolventes ms utilizados son el agua, el metanol y el acetonitrilo.
El agua puede contener tampones, sales, o compuestos como el cido
trifluoroactico, que ayudan a la separacin de los compuestos.
Una mejora introducida a la tcnica de HPLC descrita es la variacin en la
composicin de la fase mvil durante el anlisis, conocida como elucin en
gradiente.
Un gradiente normal en una cromatografa de fase reversa puede empezar a un
5% de acetonitrilo y progresar de forma lineal hasta un 50% en 25 minutos.
El gradiente utilizado vara en funcin de la hidrofobicidad del compuesto. El
gradiente separa los componentes de la muestra como una funcin de la
afinidad del compuesto por la fase mvil utilizada respecto a la afinidad por la
fase estacionaria. En el ejemplo, utilizando un gradiente agua/acetonitrilo los
compuestos ms hidroflicos eluirn a mayor concentracin de agua, mientras
que los compuestos ms hidrofbicos eluirn a concentraciones elevadas de
acetonitrilo.

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Video: la cromatografa HPLC

http://youtu.be/_dJQtQkcHmg
Cromatografa de gases:
-
La cromatografa de gases es una tcnica cromatogrfica en la que la muestra se

volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatogrfica.
La elucin se produce por el flujo de una fase mvil de gas inerte.
A diferencia de los otros tipos de cromatografa, la fase mvil no interacciona con
las molculas del analito; su nica funcin es la de transportar el analito a travs de
la columna.
Existen dos tipos de cromatografa de gases (GC): la cromatografa gas-slido
(GSC) y la cromatografa gas-lquido (GLC), siendo esta ltima la que se utiliza
ms ampliamente, y que se puede llamar simplemente cromatografa de gases (GC).
En la GSC la fase estacionaria es slida y la retencin de los analitos en ella
se produce mediante el proceso de adsorcin. Precisamente este proceso de
adsorcin, que no es lineal, es el que ha provocado que este tipo de
cromatografa tenga aplicacin limitada, ya que la retencin del analito
sobre la superficie es semipermanente y se obtienen picos de elucin con
colas.
La GLC utiliza como fase estacionaria molculas de lquido inmovilizadas

sobre la superficie de un slido inerte.
La GC se lleva a cabo en un cromatgrafo de gases. ste consta de diversos
componentes como el gas portador, el sistema de inyeccin de muestra, la columna
(generalmente dentro de un horno), y el detector.


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El gas portador debe ser un gas inerte, para prevenir su reaccin con el analito o la
columna. Generalmente se emplean gases como el helio, argn, nitrgeno,
hidrgeno o dixido de carbono, y la eleccin de este gas en ocasiones depende del
tipo de detector empleado. El almacenaje del gas puede ser en balas normales o
empleando un generador. Luego tenemos un sistema de manmetros y reguladores
de flujo para garantizar un flujo estable y un sistema de deshidratacin del gas,
como puede ser un tamiz molecular.
Ver video espectrofotometra de gases

http://youtu.be/e_ZAsfZ1AUo
8.5. Anlisis cualitativo y cuantitativo.

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A nivel cualitativo la cantidad de informacin obtenida a partir de una cromatografa es limitada

comparada con otras tcnicas como la espectroscopia de masas o la resonancia magntica
nuclear: obtenemos datos de tiempo de retencin y datos de posicin de la sustancia en la fase
estacionaria tras la evolucin.
Las tcnicas cromatogrficas pueden tambin proporcionar informacin a nivel cuantitativo:
En cromatografa plana el rea cubierta por las sustancias separadas sirve como
parmetro para el anlisis cuantitativo.
En cromatografa en columna se usa la altura o rea de los diferentes picos obtenidos
al compararlos con determinados patrones.
El mtodo ms sencillo es someter a una cromatografa, una serie de diluciones obtenidas a
partir de un punto cuya composicin es similar a la de la muestra problema. Seguidamente se
obtienen los cromatogramas de los diferentes patrones y se representan grficamente las alturas
o reas de pico en funcin de la concentracin.
La representacin de los datos deben dar una lnea recta que pase por el origen de coordenadas.
Parmetros cromatogrficos
1) Coeficiente de distribucin (Kd): es la relacin entre la concentracin molar
de soluto en la fase estacionaria y la fase mvil.
CE
concentracin molar soluto en fase estacionaria
Kd = --------CM
concentracin molar soluto en fase mvil
A mayor Kd, mayor afinidad del soluto por la fase estacionaria.
2) Relacin al frente del solvente (Rf): en la cromatografa en placas (papel o
capa fina) se define el valor de Rf como la relacin entre la distancia desde el
punto de aplicacin a la mancha (dm) y la distancia desde el punto de aplicacin
al frente del solvente (ds).
dm
distancia recorrida por la sustancia
Rf = -----------ds
distancia recorrida por el lquido de desarrollo
Cada sustancia tiene un Rf caracterstico y por ello
permite su identificacin por comparacin con
patrones.
El Rf tambin conocido como factor de retencin,
expresa la afinidad relativa de la muestra por la
fase estacionaria (a mayor Rf menor afinidad).


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3) Volumen de retencin o de elucin (Vr): es el volumen de elucin en el cual

sale un compuesto de inters.
Vr = Vm (1 + Kd)
Vm es el volumen de solvente de la fase mvil requerido para eluir un compuesto sin
afinidad por la fase estacionaria (Kd = 0)
A mayor Kd, mayor Vr.
Vr permite identificar sustancias.
4) Tiempo de retencin (tr ): es el tiempo en el que un soluto es eluido. El tiempo
de referencia ser aquel al que salga eluida una sustancia no retenida en la fase
estacionaria.
Vr = tr x F
F es la velocidad de flujo de la elucin (ml/min)
El volumen de retencin y el tiempo de retencin, trabajando en condiciones
constantes y empleando patrones de referencia, pueden servirnos para identificar
sustancias.
5) Selectividad (): es el factor que describe la capacidad para separar dos solutos.
Es la relacin entre los coeficientes de distribucin de los dos solutos en estudio.
Kd (B)
Sustancia B
= -----------Kd (A)
Sustancia A
En la separacin entre dos sustancias se persigue que la selectividad sea lo mayor
posible, normalmente es mayor de 1.
6) Resolucin (R): es la capacidad del sistema para separar lo mejor posible las
sustancias a estudiar. No tiene unidades de medida.
En un cromatograma la resolucin se calcula midiendo las distancias a las que
aparecen los picos en el cromatograma y el ancho de la base de cada pico
(cromatografa en columna).
En las cromatografas en soporte plano, los picos son manchas sobre el papel,
que idealmente son circulares. La resolucin depende del dimetro de las
manchas (a) y de las distancias entre ellas (d).
d2 d1
R = --------------------- (a1 + a2)
Si R >= 1,25 .buena separacin cromatogrfica
Si R < 0,4no se ver claramente la separacin entre los solutos.
30
RECUERDA.
Distancia, volumen de retencin y tiempo de retencin son directamente proporcionales en
la cromatografa en columna: a mayor retencin de una sustancia por el sistema, mayor ser la
distancia a la que aparece su pico en el cromatograma, mayor ser el volumen de retencin
necesario para eluirla y mayor ser el tiempo de retencin.
9. Electroforesis.
Se define como electroforesis el proceso en el cual las especies cargadas se separan en funcin
de su diferente velocidad de migracin, cuando se encuentran sometidas a la accin de un
campo elctrico.
La velocidad con que las diferentes sustancias se desplazan durante el transcurso de la
electroforesis se denomina velocidad de migracin. Dicha magnitud depende bsicamente de
la densidad de la carga y sta a su vez est condicionada por una serie de parmetros (pH,
fuerza inica, diferencia de potencial del campo elctrico aplicado, naturaleza de la muestra,
interacciones de la misma con el soporte elegido) que van a condicionar el desarrollo
experimental de la tcnica electrofortica.
La electroforesis es una herramienta prctica para el anlisis de mezclas de compuestos
biolgicos, ya que permite separar macromolculas en una mezcla, sirviendo tanto como
mtodo analtico como preparativo para la posterior realizacin de otras tcnicas analticas. Para
ello, es necesario que la sustancia se encuentre cargada de manera que al colocarla en el seno de
un campo elctrico se desplace hacia un polo u otro en funcin de su carga.

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La aplicacin en el laboratorio es muy amplia, siendo empleada para la determinacin de

numerosas sustancias, aunque su principal aplicacin es la separacin de protenas sricas.
Tambin se emplea para lipoprotenas, cidos nucleicos, hemoglobina, isoenzimas (LDH,
CPK), etc
9.1. Fundamento.
La tcnica electrofortica est basada en el movimiento diferencial de partculas que estn
cargadas elctricamente en el seno de un campo elctrico.
El desplazamiento de los distintos componentes de la muestra durante el transcurso de la
electroforesis, depende bsicamente de:
La carga de la sustancia
El voltaje del campo elctrico
El coeficiente de friccin (rozamiento entre el soporte y la
sustancia)
Otros: pH del medio, tamao (Pm), estructura de la sustancia,
etc
Cuando se aplica un campo elctrico a un medio que contiene partculas cargadas ocurre lo
siguiente:
- Las partculas cargadas negativamente (aniones)
migrarn hacia el polo positivo (nodo).
- Las partculas cargadas positivamente (cationes)
migrarn hacia el polo negativo (ctodo).
- Es necesario que todos los componentes de la
mezcla a separar se encuentren cargados de igual
forma, de manera que despus de depositar la
muestra sobre el soporte en uno de los polos, se dirijan todos hacia el polo
contrario, separndose unos de otros en funcin de la diferente velocidad de
migracin.
La velocidad de migracin de las partculas depende de varios tipos de fuerza:
La fuerza impulsora: es la fuerza que ejerce el campo elctrico sobre la
partcula cargada y es proporcional a la carga de la partcula y al voltaje del
campo elctrico aplicado.
F=QxV
Q= carga de la partcula
V= voltaje del campo elctrico
Fuerzas de retardo: son fuerzas contrarias a la fuerza impulsora y se oponen

al movimiento. Dependen del tamao de la partcula, la forma, el coeficiente de
friccin, la viscosidad del buffer
La diferencia entre ambas fuerzas, proporciona una fuerza neta que impulsa a la partcula a una
velocidad constante.
La velocidad de migracin de los diferentes componentes de la muestra que queremos separar
durante su desarrollo electrofortico por unidad de tiempo recibe el nombre de movilidad
electrofortica. Se representa por la letra y sus unidades son cm2 / V x s
32
9.2. Factores que intervienen en el desarrollo

electrofortico.
Los principales parmetros que influyen o afectan en el desarrollo de una electroforesis y que
condicionan su utilidad en el laboratorio son bsicamente:
Carga neta de la sustancia en migracin
Fuerza inica del medio
Tamao y forma de la partcula
Potencial del campo elctrico
1) Carga neta de la sustancia en migracin: el grado de ionizacin y por tanto la carga
neta de las distintas sustancias de la muestra sometida a electroforesis, depende del pH
del medio en el que se lleva a cabo todo el proceso, parmetro que queda determinado
por el tampn elegido, que permite utilizar el pH ms adecuado. La carga neta es el
balance entre las cargas positivas y negativas de una partcula en solucin.
- La influencia del pH sobre la carga neta es especialmente importante, ya que
hay sustancias que dado su carcter anftero (como es el caso de las protenas
que son compuestos que presentan cargas positivas y negativas sobre la misma
molcula siendo el nmero de unas u otras dependientes del pH del medio)
pueden encontrarse cargadas positiva o negativamente.
- Para las sustancias anfteras, existe un pH denominado punto isoelctrico (PI)
y se define como aquel valor de pH al cual el balance de cargas positivas y
negativas superficiales de una sustancia es 0 (carga neta nula). Al pH de su PI
una sustancia no presenta carga neta alguna y por tanto al ser sometida a un
proceso electrofortico no migra (permanece inmvil en el punto de
aplicacin).
- Cuando el pH es superior al PI, la sustancia se encuentra cargada negativamente
(el nmero de cargas negativas supera a la de positivas) y sometido a
electroforesis migrarn hacia el polo positivo, el nodo.
- Cuando el pH de medio es inferior al de su PI la sustancia cargada
positivamente (se comporta como un catin), se dirigir hacia el ctodo que es
el polo negativo.
- El PI para la mayoria de protenas es cido, variando de 4,6 para la albmina a
5,1 y 6,2 para las globulinas.
- La carga neta de la sustancia en migracin electrofortica quedar determinada
por el tampn elegido, que nos va a permitir fijar el pH ms adecuado en cada
caso.
- La electroforesis de protenas sricas se realiza casi siempre a un pH de 8,5 a 9,
intervalo en el que todas las protenas estarn cargadas negativamente y
migrarn hacia el nodo.


33
Estructura bsica de un aminocido

2) Fuerza inica del medio: al igual que el pH final, la fuerza inica tambin depende del
tampn elegido para la electroforesis.
- En un proceso electrofortico, la corriente elctrica es transportada por todos los
iones presentes, tanto los del tampn como los de la muestra en solucin. Cuanto
ms concentrado es el tampn, mayor es la proporcin de corriente transportada por
los iones del tampn y menor la transportada por las propias partculas de la
muestra a separar, de manera que stas migrarn ms despacio (los iones en
solucin se encuentran rodeados por una nube inica de iones del tampn y se
mueven todos juntos, si la concentracin de iones del tampn es muy alta, este
fenmeno har que las partculas que nos interesan migren ms lentamente).
- Para evitar este fenmeno, la concentracin del tampn que se elige para un proceso
electrofortico debe ser la suficiente para que el tampn cumpla su doble funcin:
mantener constante el pH del medio y transportar parte de la corriente gracias a sus
iones.
- Cuando la concentracin del tampn es superior a la requerida, la migracin de las
partculas ser ms lenta y la separacin ser peor.
3) Tamao y forma de la partcula: estos factores no influyen por igual en todos los
procesos electroforticos y por tanto en funcin del tipo de electroforesis el tamao y
forma de las partculas a separar pueden tener mayor o menor importancia e incluso ser
factores ms definitivos que la propia carga que poseen; tal es el caso de aquellas
electroforesis que emplean soportes que permiten el paso selectivo de las molculas, no
slo segn su carga sino tambin segn su tamao, reteniendo las partculas ms
grandes impidiendo su movilidad y permitiendo el paso de las partculas ms pequeas.
4) Potencial del campo elctrico: como se ha visto anteriormente, la movilidad
electrofortica () de la partcula es proporcional a su carga y al potencial del campo
elctrico: cuanto ms alto sea el potencial aplicado, ms rpidamente se mover la
partcula (F = Q x V).
-
En un campo elctrico, la intensidad de corriente y el voltaje son proporcionales: V

= R x I (V= voltaje, R= resistencia del medio, I= intensidad de corriente).
Podra parecer que cuanto mayor sea el campo elctrico aplicado, mayor ser la
velocidad de migracin, pero existe una limitacin a un aumento excesivo del

34
voltaje o del amperaje ya que tiene el inconveniente de que se produce tambin un

aumento de la temperatura ocasionando efectos indeseados como la
desnaturalizacin de las protenas o la evaporacin del tampn. A su vez, como
consecuencia de la evaporacin, el tampn queda ms concentrado, aumentando su
fuerza inica y dificultando el desarrollo electrofortico.
5) El soporte
9.3. Desarrollo de la tcnica.

El proceso de electroforesis consta de las siguientes fases:
Preparacin de la muestra ------------------------ Seleccin y preparacin del soporte
Aplicacin de la muestra
Electroforesis
Revelado
Lectura
1) Preparacin de la muestra: la muestra a emplear y el tratamiento previo, dependen de
los compuestos que se pretendan analizar mediante la electroforesis. En el laboratorio
de diagnstico clnico se utilizarn los distintos lquidos biolgicos: suero, plasma,
sangre total, plasma, LCR, orina, etc
o Si vamos a realizar una electroforesis de protenas sricas se necesitar suero
fresco (si es plasma aparecer una banda adicional de fibringeno entre y ).
o En el caso de orina o LCR las muestras deben concentrarse por
ultracentrifugacin para aumentar el contenido proteico.
2) Seleccin y preparacin del soporte: en general, una electroforesis puede realizarse
directamente en una solucin tamponada de la sustancia que se desea separar
(electroforesis libre) o puede hacerse sobre un soporte de manera que una vez terminado
el proceso las fracciones queden permanentemente separadas y sea fcil proceder a su
cuantificacin, es la denominada electroforesis zonal.
Todos los soportes son slidos, de consistencia gelatinosa, que incluyen el solvente en
su preparacin que puede ser homognea (misma concentracin de gel en todo el
soporte) o heterognea ( la concentracin de gel vara a lo largo del soporte de forma
continua o discontinua).
Los principales tipos de soporte utilizados se agrupan en dos tipos:
a) NO RESTRICTIVOS: las partculas colocadas sobre ellos pueden moverse
libremente de forma que se separan nicamente en funcin de su carga
elctrica. En realidad no hay ningn tipo de soporte que sea totalmente no
restrictivo, pues las sustancias de peso molecular elevado pueden verse frenadas
en su desplazamiento o incluso no desplazarse en absoluto. Este tipo de soporte
es suficiente para la mayora de los diagnsticos clnicos por lo que son los ms
utilizados.
Papel: fue el primer soporte utilizado en electroforesis de zona. En la actualidad
prcticamente no se utiliza.

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Acetato de celulosa: se obtiene a partir de la reaccin de anhdrido actico con los

grupos hidroxilos de la celulosa. Su estructura deja gran cantidad de huecos llenos de
aire. En el momento de ser utilizado, las membranas de acetato se sumergen en el
tampn, que penetra en los huecos de aire llenndolos. Este tampn que ocupa los
huecos es el encargado de llevar la corriente elctrica a travs del soporte. El ms
utilizado son las tiras de cellogel (acetato de celulosa gelatinizado). Es un soporte muy
utilizado en el laboratorio por las ventajas que ofrece:
- Fcil manipulacin
- Rapidez de ejecucin
- Elevada reproductibilidad
- Fcil lectura
El acetato de celulosa es un material opaco que debe ser transparentado con disolventes
orgnicos antes de proceder a su determinacin mediante densitometra, lo que puede hacer
desaparecer las bandas ms dbiles: inconveniente.
Gel de agarosa: est formado por agarosa, uno de los componentes del agar (es un
compuestos de agarosa y agaropectina). Debido al elevado tamao del poro (mayor
que el de otros geles) las sustancias depositadas en l migran nicamente en funcin
de su carga elctrica. Las sustancias de alto peso molecular se ven totalmente
frenadas en su desplazamiento. Es un soporte de amplio uso y presenta las
siguientes ventajas:
- Carece de cargas elctricas que podran intervenir en la migracin
electrofortica.
- No captan el colorante (no dan lugar a colores de fondo no deseables) por
lo que no necesitan ser transparentados, y son muy adecuados para la
cuantificacin de las distintas fracciones por densitometra.
b) RESTRICTIVOS: ejercen algn tipo de resistencia al desplazamiento
electrofortico de las sustancias depositadas en ellos. Esta resistencia depende
fundamentalmente de:
- El tamao del poro de la sustancia que forma el soporte.
- El tamao y las caractersticas estructurales de las sustancias que vayan a
desplazarse sobre el mismo.
Las partculas se separan en funcin de su carga y tambin de su tamao,
consiguindose mejores separaciones que con los soportes no restrictivos.
Gel de almidn: su uso es limitado debido a las dificultades
derivadas de su preparacin. Proporciona un mayor nmero de
fracciones de la muestra a separar que otros soportes. Presenta entre
otros los siguientes inconvenientes:
- Considerable dificultad para obtener un soporte de espesor
y porosidad uniforme.
- No permite la posterior lectura por densitometra.
Geles de poliacrilamida: son el resultado de la polimerizacin de la
acrilamida con diferentes compuestos. Son los que proporcionan un
mayor nmero de fracciones y la mejor resolucin de las distintas
bandas utilizndose sobre todo en laboratorios de investigacin. El
tamao del poro puede variarse cambiando la composicin del gel,
de manera que las sustancias depositadas en este tipo de geles se
separan en funcin de su carga y su tamao. Presentan las
siguientes ventajas:
- Qumicamente inertes
- Porosidad variable
- Elevada resolucin (obtencin de bandas, estrechas y ntidas)
36
Transparencia (permite cuantificacin por densitometra)

Pueden ser utilizados para electroforesis especiales (permiten la
introduccin en su estructura de diferentes compuestos)
3) Aplicacin de la muestra: la muestra se puede aplicar en el soporte mediante distintas

tcnicas:
Aplicacin sobre la superficie del
soporte dejando que penetre (ej suero
sobre acetato de celulosa en la
electroforesis de las protenas).
En orificios o ranuras que se han
practicado sobre la superficie del
soporte (ej inmunoelectroforesis).
Incluir la muestra en el gel en el proceso de polimerizacin o formacin (ej en
gel de agarosa).
En general, para incrementar la resolucin, la aplicacin debe ser lo ms estrecha posible

para favorecer la separacin, la cantidad que se aplique depender del sistema de deteccin
pero no se debe colocar una cantidad de muestra excesiva y la muestra debe ser lo ms
homognea posible para favorecer la interpretacin.
La aplicacin de la muestra se realiza con unos aplicadores que pueden ser macro, micro o
semimicro.
4) Proceso electrofortico: la ejecucin del proceso electrofortico requiere una

instrumentacin consistente en la cubeta de electroforesis y la fuente de alimentacin,
sin olvidar la importancia en la seleccin del tampn por influencia que ejercer sobre
la migracin de las partculas.

37
Fuente de alimentacin o voltmetro: su funcin consiste en aportar la energa

elctrica para que se pueda llevar a cabo el proceso. Las fuentes empleadas
pueden trabajar tanto a corriente constante como a voltaje constante.
Cubeta: la cubeta consiste en una cmara que contiene dos electrodos de carga
opuesta situados en dos receptculos que se conectan por medio de un puente
salino cuya funcin es permitir el paso de la corriente. Este puente es el mismo
medio de soporte, impregnado de tampn y en contacto con el tampn de los
receptculos. A travs de l pasar la corriente provocando la migracin de
partculas en funcin de la carga elctrica que posean.
RECUERDA.
La cubeta se mantendr tapada durante el proceso para
evitar la contaminacin y la evaporacin del tampn. Se
debe mantener en posicin horizontal y con los
receptculos llenos por igual de tampn.
Tampn: el tampn llena los dos receptculos de la cubeta hasta un

determinado nivel y al estar impregnada tambin la tira, hace posible que fluya
la corriente de un electrodo a otro.
- Hay que evitar que el tampn se contamine o vare su pH.
- Como tampn se utiliza veronal ( pH 8,6 / 0,04 M ). A este pH
todas las protenas adquieren cargas negativas y migran hacia
el nodo.
- La albmina con un pI = 4,6 tendr mayor carga negativa que
las -globulinas cuyo pI = 6,2; por ello la albmina recorre
mayor distancia que las cuando se someten a la accin de un
campo elctrico.
5) Revelado: el revelado tiene por objeto la localizacin para su posterior evaluacin de

las distintas fracciones en que ha sido separada la muestra.
38
Previamente al revelado se apaga el aparato una vez transcurrido el tiempo

adecuado de migracin y se saca la tira de la cubeta, detenindose el proceso de
separacin.
Para localizar las distintas fracciones se realiza una tincin de los componentes que
se desea visualizar. El colorante utilizado depender del compuesto a visualizar, de
manera que se unir qumicamente con dichos componentes pero no con el soporte.
Las fracciones quedan as teidas y listas para su evaluacin cualitativa o
cuantitativa (se pueden medir por densitometra o por elusin).
La tincin se realiza por inmersin de la tira de acetato de celulosa en el colorante
elegido, posteriormente se realiza la decoloracin con sustancias adecuadas al tipo
de colorante utilizado hasta que el fondo no tenga color y slo se aprecien teidas
las bandas electroforticas.
Colorantes ms utilizados:
SUSTANCIA A DETERMINAR
PROTEINAS
LIPOPROTEINAS
GLUCOPROTEINAS
ENZIMAS
(DESHIDROGENASAS,
FOSFATASAS, ENTERASAS)
COLORANTE
- Ponceau S
- Negro Amido
- Azul brillante de Coomasie
- Negro Sudn B
- Azul brillante de Coomasie
- PAS (cido peridico-Schiff)
-
NADH
Esteres de -naftol
-naftilfosfato
6) Lectura y cuantificacin: el informe de una separacin electrofortica se suele dar

como porcentaje de cada fraccin respecto a la concentracin total de las sustancias
analizadas. Esta informacin se puede obtener de dos formas:
Elucin: cada zona o banda se recorta, poniendo los trozos en tubos de
ensayo se aade a los tubos un disolvente especfico segn el
colorante utilizado, de manera que se produzca una elucin de las
muestras se obtiene en cada tubo una solucin coloreada que se
cuantifica por espectrofotometra se miden las absorbancias de
dichas soluciones para poder calcular el % de las fracciones separadas
(la lectura se realizar a 620 nm si se ha usado el negro amido como
colorante o a 520 nm si se ha utilizado rojo Ponceau).


39
Cortar las bandas y depositar en tubos de ensayo
Espectrofotometria
Densitometra: consiste en la lectura directa de la tira que presenta las
zonas separadas mediante un fotodensmetro. La longitud de onda
seleccionada ser la que corresponda al color de las fracciones a leer.
Se realiza un barrido de la tira de forma que el haz de luz ir
encontrndose con cada una de las fracciones. Un detector registrar la
intensidad de luz transmitida a travs de cada banda, que ser menor
cuanto ms densa sea la banda. De esta manera el aparato es capaz de
presentar una grfica o registro denominado proteinograma donde los
resultados se presentan en forma de picos. El propio aparato es capaz
de calcular el rea que encierra cada pico, dando el porcentaje de cada
banda con respecto del total.
Nota: para que sea vlida la densitometra el fondo de la tira debe ser
transparentado antes de introducir la tira en el densitmetro. Este paso
no es necesario en la lectura por elucin.
Fuente de luz y filtro selector de
Tiras electroforesis

40
Detector
Proteinograma
RESUELVE.
Se procede a la determinacin de las protenas sricas de un paciente por electroforesis y se
cuantifican por elucin. Explica cmo realizaras el clculo de los porcentajes de cada una de
las fracciones. Y si se pide el clculo en g/100 ml?
VALORES NORMALES DE LAS PROTEINAS SERICAS

Albmina..54 - 62 % (3,2 5 g/dl)
1 ..2 - 5 % (0,1 0,4 g/dl)
2 ..7 10 % (0,6 1 g/dl)
.8 13 % (0,6 1,3 g/dl)
.14 19 % (0,7 1,5 g/dl)

41
La alteracin de estos valores nos servir para detectar o diagnosticar algunas alteraciones
o enfermedades como problemas inflamatorios agudos o crnicos, procesos alrgicos y
autoinmunes, nefrosis, cirrosis, etc
Un video que explica la tcnica de montaje de una electroforesis
http://youtu.be/RcID2cpUZq0
Veamos un video de cmo tener una electroforesis en gel de agarosa para DNA:
http://youtu.be/6vKLT5mQoBM
9.4. Isoelectroenfoque.
Esta tcnica habitualmente denominada electroenfoque, es un tipo de electroforesis que se
emplea ampliamente en bioqumica para separar molculas cargadas en funcin de su punto
isoelctrico.
Fundamento
- Se basa en el desplazamiento de las molculas en un gradiente de pH.
- Las molculas anfotricas, como los aminocidos, se separan en un medio en el que
existe una diferencia de potencial y un gradiente de pH.
- La regin del nodo es cida y la del ctodo es alcalina. Entre ambos se establece un
gradiente de pH tal que las molculas que se han de separar tengan su punto isoelctrico
dentro del rango.
- Las sustancias que inicialmente se encuentran en regiones de pH inferior a su punto
isoelctrico estarn cargadas positivamente y migrarn hacia el ctodo.
- Las sustancias que se encuentran en medios con pH ms altos que su punto isoelctrico
tendrn carga negativa y migrarn hacia el nodo.
- La migracin las conducir a una regin donde el pH coincidir con su punto
isolctrico, tendrn una carga neta nula y se detendrn. De esta forma las molculas
anfotricas se sitan en estrechas bandas donde coincide su punto isoelctrico con el
pH.
Sobre un soporte se establece un gradiente de pH mediante una mezcla de anfolitos, de manera

que ste vaya aumentando de forma gradual desde el nodo al ctodo. Cuando una sustancia se
42
introduce en este gradiente migrar segn su carga neta inicial, que vendr determinada por el
pH de la zona donde se encuentre inicialmente: por ejemplo, si la carga inicial es positiva,
migrar hacia el ctodo (polo -), a medida que migra hacia el polo (-) va recorriendo una zona
en la que el pH vara, por lo que la sustancia ir cambiando progresivamente su carga, perdiendo
carga (+) y ganando cargas (-), hasta que al llegar a su pI sus cargas (+) y (-) se igualan
resultando su carga neta nula. Cuando la sustancia llegue a su pI dejar de moverse
obtenindose en ese punto una banda que identifica la sustancia.
Los anflitos son mezclas homogneas de cidos alifticos de pH entre 4 y 9 y cuando se
someten a una corriente elctrica migran de acuerdo con sus cargas creando zonas tamponadas
con un gradiente de pH homogneo en el cual luego se movern las protenas.
Una protena de pI = 7, situada en la posicin A se encuentra en una zona cuyo pH es ms cido
que su pI y por tanto transportar una carga (+) y migrar electroforticamente hacia el ctodo.
La misma protena en la zona B presenta una carga (-) y migra hacia el nodo. En ambos casos
el movimiento se realiza hasta alcanzar el pH correspondiente al pI, donde permanecer
inmvil.
pH 14--------10-------7----------4-------------0
OH-
X
OH-
OH
OH-
OH
CATODO (-)
X
X

X X
X
ZONA B
H+
X
X
ZONA A
H+
X
H+
H+
H+
ANODO (+)
El voltaje empleado para crear el gradiente de pH tiene que ser muy elevado, de hasta 2000
voltios, lo que genera una gran cantidad de calor y hace necesario mantener un sistema de
enfriamiento en la cubeta de electroforesis.
La principal ventaja del isoelectroenfoque es su gran poder de resolucin que hace que se
puedan separar molculas con pI muy cercanos.
Su uso es ms restringido, emplendose para estudio de inmunoglobulinas, isoenzimas y
protenas que se puedan diferenciar en funcin a su pI.
9.5. Inmunoelectroforesis.
Esta tcnica resulta de la combinacin de la electroforesis y la inmunodifusin, es decir,
combina la separacin electrofortica y la precipitacin inmunitaria por reacciones Ag-Ac entre
las protenas y anticuerpos especficos frente a ellas.
Consiste en el fraccionamiento electrofortico de las protenas sricas sobre acetato de celulosa
y posterior contacto y precipitacin de las protenas separadas con antisueros monoespecficos.
La muesta a estudiar, normalmente suero, se dispone sobre una lmina de acetato de celulosa (o
gel de agarosa) y se somete a electroforesis, de forma que las diferentes protenas migran segn

43
su carga. Despus se dispone el antisuero especfico frente a una o varias sustancias en ranuras o
regueros paralelos al campo de migracin de la sustancia antignica (protenas) y se deja que se
produzca la inmunodifusin sobre el acetato de celulosa (durante 24 h): el encuentro entre las
diferentes protenas (sistemas antignicos) y el antisuero correspondiente (Ac) produce
diferentes arcos de precipitacin en el lugar donde coinciden Ag y Ac; estos arcos pueden
identificarse por comparacin con arcos testigo obtenidos con protenas puras conocidas.
Esta tcnica se utiliza para el estudio de inmunoglobulinas, en concreto es de gran utilidad para
el estudio de gammapatas monoclonales.
10. Actividades.
1.- En un campo elctrico, una molcula cargada negativamente migra hacia el:
a) Anodo
b) Ctodo
c) Polo negativo
d) Polo positivo
e) A y d son correctas
2.- La fuerza que ejerce el campo elctrico aplicado sobre una partcula cargada:
a) Es directamente proporcional a la carga de la partcula
b) Es inversamente proporcional a la carga de la partcula
c) Es directamente proporcional al voltaje del campo elctrico
d) A y b son correctas
e) A y c son correctas
3.- La movilidad electrofortica se define como:
a) Velocidad de migracin en un tampn determinado
b) Velocidad de migracin por unidad de campo elctrico
c) Los centmetros que recorre por minuto
d) Los metros que recorre por segundo
e) Velocidad de migracin respecto a un testigo
4.- Qu factores afectan a la movilidad de una partcula en el seno de un campo elctrico?
a) pH del tampn
b) Fuerza inica del tampn
c) Tamao y forma de la partcula
d) Potencial del campo elctrico
e) Todos
44
5.- El punto isoelctrico es:

a) El pH al cual una partcula no se mueve
b) El pH al cual una partcula migra al nodo
c) El pH al cual la carga neta de la partcula es cero
d) A y c son correctas
e) A y b son correctas
6.- Cul o cules de los siguientes medios de soporte se emplean en electroforesis?
a) Acetato de celulosa
b) Acetato de gelatina
c) Gel de agarosa
e) A y c son correctas
7.- De los siguientes medios de soporte, no son restrictivos:
b) Acetato de celulosa gelatinizado
c) Gel de agarosa
e) A, b y c son correctas
8.- De los siguientes medios de soporte, son restrictivos:
b) Gel de poliacrilamida
c) Acetato de gelatina
d) Gel de agarosa
e) Gel de agar
9.- El mtodo de eleccin para la lectura de un espectro electrofortico es:
a) Elucin
b) Elucin + fotodensitometra
c) Fotodensitometra
d) Fluorimetra
e) Nefelometra
10.- En la electroforesis en acetato de celulosa, la separacin se lleva a cabo con arreglo a:
a) Forma de la partcula
b) Tamao de la partcula
c) Carga de la partcula
d) Color de la partcula
e) Secuencia de aminocidos
11.- En la electroforesis en gel de poliacrilamida, la separacin se lleva a cabo con arreglo a:
a) Forma de la partcula
b) Tamao de la partcula
c) Carga de la partcula
d) Secuencia de aminocidos
e) B y c son correctas
12.- En las tcnicas de isoelectroenfoque:
a) Se emplean anfolitos

45
b)
c)
d)
e)
Se usa un tampn de pH 8,6

La migracin cesa cuando la protena alcanza la zona de su pI
A y b son correctas
A y c son correctas
13.- Cmo acta la FCR? Qu expresa?
14.- En qu unidades se expresa la FCR?
15.- De qu depende la FCR de una centrfuga?
16.- Cul es la FCR de una centrfuga cuando la velocidad es de 1.500 rpm y el radio de giro
12 cm?
17.- Cul es la velocidad en rpm que debe llevar una centrfuga de 15 cm de radio de giro para
adquirir una FCR de 450?
18.- Qu diferencia hay entre las centrfugas de cabezal oscilante y las de cabezal angular?
19.- Qu son las ultracentrfugas.
20.- Se quiere centrifugar una muestra de orina para proceder al anlisis del sedimento, qu
precauciones se deben considerar para la centrifugacin?

46
21.- Qu es y para qu sirve la dilisis?
22.- En la electroforesis, de qu depende la velocidad de migracin de las sustancias?
23.- Qu tipo de fuerzas intervienen en la migracin electrofortica de las partculas a separar?
24.- Qu es la movilidad electrofortica? De qu depende?
25.- Qu es el punto isoelctrico.
26.- Qu ocurre a valores de pH superiores al pI? y a valores inferiores?
27.- Explica lo que ocurre en la electroforesis cuando la concentracin de tampn es demasiado

elevada.


47
28.- Indica la funcin del tampn en la electroforesis.
29.- Es cierto que al aumentar el potencial del campo elctrico ms rpidamente se movern
las partculas en la electroforesis? Razona la respuesta
30.- Qu tipo de soportes son los que permiten una mejor separacin.
31.- Cita y esquematiza las fases de que consta el proceso de electroforesis.
32.- En qu consiste el isoelectroenfoque y cul es su mayor ventaja.
33.- En qu consiste la inmunoelectroforesis.

48
34.- A partir de una electroforesis en acetato de celulosa para fraccionamiento de protenas

sricas y la cuantificacin por elucin, se han obtenido los siguientes datos:
A 530 nm
Alb (d )
0,26
1
0,038
2
0,067
0,088
0,051
Protenas totales: 6,82 g/100 ml

A) Calcula el % de cada fraccin frente al total
B) Calcular los g/100 ml de cada fraccin
35.- Cul ser el coeficiente de distribucin Kd de un soluto en un sistema cromatogrfico en
el que se encuentra en una concentracin de 10 mol/l en la fase mvil y 20 mol/l en la fase
estacionaria?
36.- De un sistema cromatogrfico salen eluidos dos compuestos con los siguientes parmetros:
V1= 5 ml, V2 = 15 ml, a1 = 3 ml, a2 = 5 ml, Vo = 1ml.
a) Qu resolucin presentar
b) Con los mismos parmetros, calcular el coeficiente de distribucin.

c) Con los mismos parmetros, calcular la selectividad del sistema para las sustancias 1 y 2.


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Fundamentos y tcnicas de anlisis bioqumico

Fundamentos y tcnicas de anlisis bioqumico

UDV Tcnicas de separacin

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2.1. Descripcin del equipo.

Los elementos que componen la centrfuga son:

Fundamentos y tcnicas de anlisis bioqumico

que, al girar el rotor, se disponen en posicin horizontal (perpendicular al

Rotor angular o de ngulo fijo: los tubos se insertan

Fundamentos y tcnicas de anlisis bioqumico

La potencia de una centrfuga puede calcularse tambin a travs de un nomograma, que

En el nomograma la determinacin de la potencia de una centrfuga se hace mediante el uso de

considerar que la velocidad de sedimentacin (tiempo de centrifugacin) y la aceleracin de la

Fundamentos y tcnicas de anlisis bioqumico

centrfuga son inversamente proporcionales, de manera que si se duplica la aceleracin, el

Fundamentos y tcnicas de anlisis bioqumico

2.3. Utilidad en el laboratorio.

2.4. Control y mantenimiento.

Fundamentos y tcnicas de anlisis bioqumico

Equilibrar correctamente la centrfuga colocando los tubos de igual peso, forma y

Membranas o placas filtrantes.

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tamao es excesivamente grande el slido atravesar el filtro mientras que si es demasiado

UDV Tcnicas de separacin

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Filtracin por succin:

Ver video sobre la filtracin: (http://www.youtube.com/watch?

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Separacin de uno o ms constituyentes de una mezcla mediante un disolvente. Para conseguir

Fundamentos y tcnicas de anlisis bioqumico

Fundamentos y tcnicas de anlisis bioqumico

Los distintos componentes de la mezcla se van a separar en funcin de su distribucin entre la

Fundamentos y tcnicas de anlisis bioqumico

B. Segn el mecanismo fsico de la separacin:

8.3. Mecanismos de separacin.

1) Cromatografa de intercambio inico.

Fundamentos y tcnicas de anlisis bioqumico

Es un tipo de cromatografa lquida en la

Veamos como separar el cobre disuelto

2) Cromatografa de exclusin molecular.

Se llama tambin cromatografa de filtracin en gel.

UDV Tcnicas de separacin

Fundamentos y tcnicas de anlisis bioqumico

Es una forma de cromatografa lquida en la que el sistema cromatogrfico est

Veamos un video explicativo del principio de exclusin con un ejemplo

La separacin est basada en las interacciones que se

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Fundamentos y tcnicas de anlisis bioqumico

distinta fuerza y naturaleza sobre la fase estacionaria, lo que conlleva la separacin de

(video sobre distintos procesos de adsorcin)

La cromatografa G/S se realiza en columnas.

La cromatografa L/S se realiza tanto en soportes planos como en columnas.

La fase estacionaria puede estar constituida por adsorbentes no polares o polares.

4) Cromatografa de particin o reparto.

Particin en fase invertida: la fase soporte tiene grupos no polares unidos en su

UDV Tcnicas de separacin

Fundamentos y tcnicas de anlisis bioqumico

Cmo se reparte un colorante entre dos fases de distinta polaridad?

La separacin se basa en mecanismos

8.4. Tipos de soporte.