CITRATO

FUNDAMENTO
El citrato de sodio es una sal del acido ctrico, un compuesto orgnico simple que constituye uno
de los metabolitos del ciclo de los cidos tricarboxilicos. Generalmente los microorganismos que
emplean el citrato como nica fuente de carbono, utilizan sales de amonio como nica fuente de
nitrgeno. El metabolismo del citrato realizado, por algunas bacterias se realiza por el ciclo de
krebs y requiere el desdoblamiento del citrato por la enzima citritasa (citrato-oxalacetato-liasa o
citrato desmolasa) en presencia de magnesio o manganeso y de transportadores como citrato
permeasas.
La citritasa acta sobre el citrato produciendo acido oxalacetico y acetato; productos que son
convertidos enzimaticamente a piruvato y dixido de carbono. Durante esta reaccin el medio
comienza a alcalinizarse por el CO2 que se genera, el cual se combina con el agua y el sodio para
formar Carbonato un producto alcalino, este carbonato da la alcalinidad que produce el cambio de
color del indicador de pH del medio de verde a azul Prusia oscuro (indicador: azul de bromotimol,
amarillo a pH< de 6.0 y azul a pH > de 7.6). El medio incluye citrato como nica fuente de carbono
y fosfato de amonio como nica fuente de nitrgeno.
TECNICA: Inocular el tubo con agar citrato de Simmons realizando siembra por estra tomando una
colonia del microorganismo en estudio. Incubar a 37 grados C por 24 horas.
INTERPRETACION: El desarrollo de un color azul intenso en 24-48 horas indica una prueba positiva
y revela que el microorganismo en estudio ha sido capaz de utilizar el citrato en el medio con la
formacin de productos alcalinos. La prueba tambin es positiva en ausencia de color azul si existe
crecimiento del microorganismo a lo largo de la estra de inoculacin.

TSI (TRES AZUCARES-HIERRO)

FUNDAMENTO
Es una prueba usada para la fermentacin de la glucosa, lactosa y sacarosa y la produccin de H2S
por parte de la bacteria sumndole produccin de gas. El cambio de color rojo-anaranjado (color
inicial del medio) a amarillo indica fermentacin. Si se fermenta nicamente la glucosa el cambio
de color del medio ocurre solamente en el fondo debido a que se encuentra 10 veces menos
concentrada que la sacarosa y la lactosa, adems los radicales libres no son suficientes para hacer
virar el medio.

Si se fermentan los 3 azucares hay cambio de color tanto en la superficie como en el fondo. La
presencia de burbujas que rompen el medio y a veces tienden a expulsarlo indica presencia de gas
como producto final de la fermentacin.

La produccin de H2S se manifiesta por la aparicin de un precipitado color negro debido a la

reduccin de la sal de hierro presente en el medio.
TECNICA: Inocular el medio realizando siembra mixta del microorganismo en estudio, incubar a 37
grados C por 24 horas.
INTERPRETACION
A: Reaccin acida. Color amarillo

A/A: Fermentacin 3 azucares

K: Reaccin alcalina. Color roja naranja K/A: Fermentacin de la glucosa

Burbujas: Produccin de gas
Precipitado negro: Formacin H2S

K/K: No hay fermentacin de los 3

LIA ( LISINA-HIERRO)
FUNDAMENTO
Es un medio que sirve para demostrar la produccin de dos enzimas: la lisina descarboxilasa y la
lisina desaminasa, adems la presencia de sales de hierro sirve para detectar la produccin de H2S
por algunos microorganismos.
La descarboxilacion de la lisina ocurre en ambiente anaerbico o sea en el fondo del tubo y se
pone de manifiesto por la alcalinizacin del medio produciendo un viraje del indicador prpura de
bromocresol. La presencia de glucosa en los componentes del LIA determina primero una reaccin
de fermentacin, produciendo acidificacin y cambio de color del medio a amarillo y el pH
favorable para la reaccin de descarboxilacion que ocurre despus, volviendo a su color violeta
original la parte del fondo del tubo.
La desaminacion de la lisina que se puede producir por los gneros Proteus y Providencia tiene
lugar en la parte superior del tubo produciendo acido a cetocarbonico que al combinarse con la sal
de hierro y en presencia de oxigeno forma un color violeta rojizo. La produccin de H2S se
evidencia por la presencia de un precipitado negro por utilizacin de las sales de hierro.
TECNICA

Inocular realizando siembra mixta con doble picadura a partir de una colonia del cultivo del
microorganismo en estudio e incubar 24 horas a 37 grados C
INTERPRETACION
A: Reaccin acida. Color amarillo
K: Reaccin alcalina. Color violeta
R: Reaccin alcalina: color rojo K/K: Descarboxilacion lisinaK/A: Fermentacin glucosa.
Descarboxilacion lisina R/A: Desaminacion lisina. Fermentacin glucosa

ROJO DE METILO (RM)

FUNDAMENTO
Determinar la capacidad de un microorganismo para producir y mantener estables los productos
terminales cidos de la fermentacin de la glucosa y vencer la capacidad amortiguadora del
sistema. La prueba Rojo de metilo es cuantitativa para la produccin de acido y requiere que los
microorganismos produzcan cidos fuertes a partir de la glucosa, de forma que el medio del pH
descienda a menos de 4.4. Esta distincin puede hacerse a travs del indicador Rojo de metilo que
presenta color amarillo por encima de un pH de 5.1 y solo presenta color rojo cuando el pH
desciende a 4.4.
REVELADOR

Rojo de metilo

TECNICA Inocular en el caldo RMVP con una colonia del cultivo del microorganismo en estudio.
Incubar 24-48 horas a 37 C. finalizado este periodo adicionar 5 gotas del revelador Rojo de metilo.
INTERPRETACION El desarrollo de un color rojo estable en la superficie del medio indica que la
produccin de acido es suficiente como para bajar el pH a 4.4 y es una prueba positiva. Cuando
ocurre la formacin de un color amarillo la prueba es negativa.

VOGES PROSKAUER (VP)

FUNDAMENTO Determinar la capacidad de algunas bacterias para generar un producto final

neutro (acetoina y 2,3 Butanodiol) a partir de la fermentacin d ela glucosa. Los productos neutros
formados en la presencia de oxigeno atmosfrico, alcalisis (Hidrxido de Potasio al 40%) y
peptonas, se oxidan en diacetilo, reactante para el color producido en la reaccin. El Alfa naftol
acta como catalizador para revelar un complejo color rojo.

REVELADOR Solucin A: Alfa naftol al 5% en etanol absoluto, Solucin B: Hidrxido de Potasio al

40% en agua destilada.
TECNICA Inocular en RMVP con una colonia del cultivo del microorganismo en estudio. Incubar a
37 C por 24 horas. Al finalizar este periodo adicionar 6 gotas (0.6ml) de la solucin A y 2 gotas
(0.2ml) de la solucin B. dejar en reposo durante 10-15 minutos.

INTERPRETACION: Una prueba positiva esta indicada por el desarrollo de un color rojo a los 15
minutos de aadido los reactivos reveladores por la presencia de acetoina. Una prueba negativa da
un color cobrizo.

UREA

FUNDAMENTO Los microorganismos que poseen la enzima Ureasa tienen la capacidad de

hidrolizar la urea contenida en el medio con produccin de amoniaco, para esta prueba se utiliza
el caldo urea de stuart o agar urea de christensen. El caldo sturat esta estabilizado con sales de
fosfato a un pH de 6.8. el microorganismo en estudio debe producir cantidades relativamente
grandes a fin de superar el sistema estabilizador del medio y elevar el pH del medio los suficiente
como para virar el indicador (por encima de 8.0)

TECNICA: inoculacin en caldo, incubar a 37 C por 24 horas.

INTERPRETACION: Un cambio de color Rojo fucsia indica que la urea fue hidrolizada por la ureasa
del microorganismo. Ausencia de cambio de color indica reacciona negativa

PRUEBA AMINO-ACIDOS (CALDO DESCARBOXILASA DE MOELLER)

FUNDAMENTO
El caldo descarboxilasa de Moeller es el medio base mas comnmente utilizado para determinar la
capacidad de descarboxilacion de amino-cidos por las Enterobacterias.
El amino-acido por ensayar se aade al medio base antes de inocular el microorganismo en
estudio. Se debe emplear paralelamente un control que consiste en un tubo con medio base sin el
amino-acido. Ambos se incuban anoxignicamente adicionando una capa de aceite mineral estril.
Durante las etapas iniciales de incubacin ambos tubos se vuelven amarillos debido a la
fermentacin de la pequea cantidad de glucosa del medio (pH 5.6). Si el amino-acido es
descarboxilado se forman aminas alcalinas y el medio retorna a su color prpura inicial. Los aminocido Lisina, Arginina y Ornitina son 3 amino-cidos ensayados y producen las siguientes aminas
especficas.

Lisina

Cadaverina (Descarboxilasa)

Ornitina

Putrescina (Descarboxilasa)

Arginina

Citrulina ( Dihidrolasa)

TECNICA: Inocular con material de una colonia del cultivo del microorganismo en estudio, dos
tubos de caldo de Moeller, uno con el amino-acido y otro sin este (control). Cubrir ambos tubos
con una capa de aceite mineral estril. Incubar a 37 C por 24 horas.
INTERPRETACION:
El desarrollo de un color amarillo en el tubo control indica que el
microorganismo es viable y que el pH del medio ha disminuido lo suficiente para activar las
enzimas descarboxilasas. El retorno al color prpura o violeta del tubo que contiene el aminoacido indica una reaccin positiva debido a la liberacin de aminas por descarboxilacion.

NITRITOS

FUNDAMENTO Determinar la capacidad de un microorganismo de reducir los Nitratos o gas

Nitrgeno libre. La reduccin de Nitrato (NO3) a Nitrito (NO2) y a Nitrgeno gaseoso (N2) se
produce en condiciones de anaerobiosis, en las cuales el microorganismo produce su oxigeno del
Nitrato. El oxigeno acta como un aceptor de Hidrgeno; es decir el protn y el aceptor final de
protones. La mayora de las bacterias aerobias son anaerobias facultativas y solo pueden reducir
los Nitratos en ausencia de oxigeno.

REVELADOR:
La presencia de Nitritos se detecta en el medio, aadiendo el reactivo de Griess- llovays, con al
formacin de un colorante Rojo de Diazonio.
PROCEDIMIENTO: Inocular el medio de Nitrato con una parte de la colonia del cultivo Axenico del
microorganismo en estudio. Incubar 24 horas a 37 C. despus de este tiempo aadir 5 gotas del
reactivo de Griess-llovays.
INTERPRETACION: El desarrollo de un color rojo despus de aadir el reactivo, indica la presencia
de Nitritos y representa una prueba positiva. La ausencia del color tras el agregado del reactivo
puede indicar que los nitritos no han sido reducidos (Una verdadera prueba negativa), o que han
sido reducidos a productos distintos de los nitritos, como Amoniaco, Nitrgeno molecular u Oxido
Nitroso e Hidroxilamina. Por lo tanto es necesario aadir una pequea cantidad de polvo de zinc a
todas las reacciones negativas. Los iones de Zinc reducen los nitratos a Nitritos y el desarrollo de
un color Rojo tras agregar polvo de zinc indica la presencia de nitratos residuales y confirma la
reaccin negativa verdadera. Si no hay cambio de color tras agregar el polvo de zinc indica que los
nitratos fueron reducidos a otros compuestos como amoniaco, Nitrgeno molecular, Oxido Nitroso
e Hidroxilamina.