Alonso Das Valverde Viernes 12.00 15.

00 horas


PRACTICA N9: BILIRRUBINA
DETERMINACION COLORIMETRICA DE BILIRRUBINA TOTAL Y DIRECTA EN
SUERO
I.-INTRODUCCION
Luego de la destruccin de los hemates por los macrfagos, la hemoglobina que
contiene es catabolizada segn la secuencia: la globulina es desdoblada en
aminocidos que e3n primer lugar, van a formar parte de la reserva de
aminocidos del organismo y posteriormente, son reutilizados.
El hierro se almacena de forma temporal a nivel de macrfagos, como ferritina y
seguidamente es captado por la transferrina plasmtica y transportando a la
medula sea para su reutilizacin.

II.-OBJETIVOS:
Determinar las concentraciones de bilirrubina total y directa en suero
Interpretar las diferentes alteraciones que pueden presentar en el dosaje
de la bilirrubina.

III.-FUNDAMENTOS DEL METODO
En medio acuoso solo reacciona la bilirrubina conjugada o directa, los
glucoronidos de bilirrubina y la bilirrubina delta reaccionan, formndose
azobilirrubina que en pH acido presenta un mximo de absorcin a 530 nm .para
medir la bilirrubina total es necesaria la incorporacin de un acelerador, el
benzoato de cafena.

IV.-Reactivos:
Componentes de reactivo
Acelerador; solucin de benzoato de cafena, tamponada y estabilizada.
Reactivo sulfanilico,solucin estabilizada de cido sulfanilico en hcl,0.165
m
Reactivo nitrito de sodio
Muestra:
Suero o plasma libre de hemolisis

EQUIPO REQUERIDO
Espectro. fotmetro o foto colormetro de filtros capaz de medir
absorbancias a 530nm
pipetas

Procedimiento:
Preparacin diazorrecativo.
BLANCO
STANDAR
STANDAR BLANCO DIRECTA TOTAL
STANDAR 0.1 0.1
SUERO 0.1 0.1 0.1
AGUA
DESTILADA
1.2 1.2 1.2
ACELERADOR 1.2 1.2
REACTIVO 0.1 0.1
PRACTICA N9
BILIRRUBINA
DETERMINACION COLORIMETRICA DE BILIRRUBINA TOTAL Y DIRECTA EN
SUERO

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SULFANILICO
DIAZORRACTIVO 0.1 0.1 0.1

Mezclar e incubar por 5 minutos a temperatura ambiental.
Leer las absorbancias a 530 nm llevando el espectrofotmetro a cero con agua
destilada.



V.-CLCULOS:
Factor= concentracin estndar/ (absorbancia standard- absorbancia blanco
estndar)
Bilirrubina directa (mg/dl) = factor * (directa-blanco)
Bilirruzina total (mg/dl)=factor *(total-blanco)


muestra blanco estndar directo total
Muestra 1 0.099 0.056 0.113 0.137
Muestra 2 0.036 0.820 0.060 0.087

Calculo del factor:
Concentracin patrn: 18 g/dl

Calculo
Bilirrubina directa (mg/dl) = factor * (directa-blanco)
Muestra 1.-
Bilirrubina directa (mg/dl) = 418.605 * (0.113-0.099)
=-5.860
Muestra 2.-
Bilirrubina directa (mg/dl) = 22.959* (0.060-0.036)
=0.551
Bilirruzina total (mg/dl)=factor *(total-blanco)
Muestra 1.-
Muestra 1

Muestra 2
FACTOR:

-418.605

FACTOR:

22.959

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Bilirruzina total (mg/dl)=-418.605 *(0.137-0,099)
=-15.906
Muestra 2.-

Bilirruzina total (mg/dl)=22.959 *(0.087-0,036)
=1.171

muestra Bilirrubina
directa
(mg/dl)
Bilirruzina
total
(mg/dl
Muestra 1
-5.860 15.906
Muestra 2 0.551
1.171

CUESTIONARIO

1.-DESCRIBIR EL CATABOLISMO DE LA HEMOGLOBINA
Esta biomolcula se forma cuando el eritrocito desaparece del aparato
circulatorio, por su extrema fragilidad, aproximadamente cuando ha alcanzado la
plenitud de su vida (121 dias). Su membrana celular se rompe y
la hemoglobina liberada es fagocitada por los macrfagos tisulares del organismo,
sobre todo los macrfagos del bazo, hgado y mdula sea.
En esta degradacin de la hemoglobina, se separan, por un lado, la molcula
de globina y, por otro, el grupo hemo.
La hemo-oxigenasa degrada el grupo hemo en los macrfagos, abriendo el anillo
tetrapirrlico para dar origen a una molcula lineal de 4 anillos pirrlicos
llamada biliverdina, adems de hierro libre (se oxida el Fe
2+
a Fe
3+
) y CO
(monxido de carbono). La biliverdina es luego reducida por la enzima biliverdina
reductasa para dar bilirrubina. Durante las horas o los das siguientes los
macrfagos liberan el hierro de la hemoglobina que ser transportado por la
transferrina hasta la mdula sea (para formar nuevos hemates), o almacenado
en el hgado y otros tejidos en forma de ferritina para situaciones de necesidad.
Los macrfagos de los tejidos transforman la porfirina de la hemoglobina en
bilirrubina que viaja unida a la albmina srica (protena transportadora) por el
torrente sanguneo al hgado, donde se separan, y la bilirrubina se secreta por
la bilis (por eso el color amarillo-verdoso de la bilis) y se degrada.


2.-DEFINIR BILIRRUBINA TOTAL, BILIRRUBINA INDIRECTA Y BILIRRUBINA
DIRECTA
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Bilirrubina directa o bilirrubina conjugada. Se encuentra unida con cido
glucurnico, para luego ser acumulada en la vescula biliar y constituir parte
de la bilis, para su posterior eliminacin. Su valor normal estndar es de 0 a
0,3 mg/dl adultos.
Bilirrubina indirecta o bilirrubina no conjugada. Se encuentra unida a
la albmina ya que an no se ha unido a cido glucurnico, en el hgado para
su eliminacin, porque an no ha tenido el proceso adecuado de degradacin
para formar parte de la bilis. Su valor normal aproximado es de 0,1 a
0,5 mg/dl adultos. Tambin encontramos formas no unidas a albmina que
pueden atravesar la BHE y producir dao cerebral (kernicterus). As pues, la
bilirrubina indirecta viene determinada por la bilirrubina no conjugada, ligada
y no ligada a albmina.
Bilirrubina total es la suma de bilirrubina directa y bilirrubina indirecta, lo
que da como resultado aproximado del valor normal de 0,3 a 1,0 mg/dl.

3.-NUMERAR LAS CAUSAS QUE INCREMENTAN LA BILIRRUBINA TOTAL,
DIRECTA, INDIRECTA
Hiperbilirrubinemia No Conjugada o indirecta:
- Anemia Hemoltica
- Sndrome de Gilbert
- Sndrome de Crigler-Najjar
Hiperbilirrubinemia Conjugada o Directa: habitualmente la hiperbilirrubinemia
de predominio directo es causada por enfermedades hepticas, en las que hay
insuficiente capacidad de excretar la bilirrubina. Esta dificultad puede localizarse
en el hgado o en la va biliar (ictericia obstructiva).
Dentro de las causas ms frecuentes de hiperbilirrubinemia directa se
encuentran:
2

- Hepatitis aguda: Una hepatitis aguda viral o de otra causa puede
producir elevaciones de bilirrubina por dao en los hepatocitos.
- Obstruccin biliar: Cualquier factor que obstruya la va biliar puede
asociarse a hiperbilirrubinemia directa. En estos casos se eleva tambin
las fosfatasas alcalinas y la gama glutamil transpeptidasa.
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- Cirrosis heptica: En la cirrosis heptica avanzada se observa elevacin
de bilirrubina de predominio directo.
- Colestasia: Algunas enfermedades hepticas de predominio colestsico
son la cirrosis biliar primaria, la colangitis esclerosante primaria y la
hepatotoxicidad por ciertos frmacos.
Otras causas menos frecuentes son:
- Sndrome de Dubin-Johnson
- Sndrome de Rotor


4.-DEFINIR LA UROBILINEMIA

Urobilinemia es la seleccin de urobilina con orina (en la tasa de 2-4 mg por da).
Urobilinemia obtiene el valor de un sntoma patolgico, mientras que el aumento
del contenido de urobilina en la orina. Las pruebas utilizadas para la deteccin de
urobilina, abren la recuperacin de grupo de productos de bilirrubina -
estercobilina (ver), stercobilinogen, la urobilina (ver), urobilingeno. Casi todas
estas sustancias definir e indicar el total bajo el nombre urobilina General. El
contenido de urobilina en la orina puede aumentar cuando el hgado y el
aumento de la hemlisis. La falta de urobilina en la orina se produce si la
obstruccin completa de las vas biliares y en ocasiones a la altura de la ictericia
en la hepatitis epidmica.
Mtodos de posicionamiento. Muestra Bogomolova - ver Orina (investigacin).
Muestra Schlesinger. Para 4-5 ml de orina aadir un nmero igual de pre
sacudido Schlesinger reactivo (10% de acetato de suspensin de zinc en 96% de
alcohol) y 1 gota de solucin de Lugol. Despus de 10 minutos se filtr. Cuando
se ve filtrado sobre un fondo oscuro en la luz reflejada en la presencia de
urobilina fluorescencia verde visible. Muestra Floransa. Para 8-10 ml de orina
aadir 3-4 gotas de cido sulfrico y 3-4 ml de ter. Cierre de tubo tubo, rodar
ella sobre la mesa para conseguir un extracto etreo. ltima chupar una pipeta y
la capa a otro tubo en cido clorhdrico fuerte. En presencia de urobilina en el
lquido se forma anillo rojo de diferente intensidad.
Las muestras Bogomolov y Schlesinger slo se pueden detectar altas
concentraciones de muestra de orina urobilina Floransa (como ms sensibles) de
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contenido positivo y normal de urobilina en la orina, lo que es importante para
determinar la ausencia total de urobilina en la orina.

5.-DEFINA UROBILINA, UROBILINOGENO, ESTERCOLINA,
ESTERCOBILINOGENO
LA UROBILINA: es una sustancia cromgena, que da color amarillo claro intenso
a la orina. Es un producto del metabolismo de la bilirrubina,
1
que a su vez se
produce por degradacin de la hemoglobina, la molcula que transporta
el oxgeno en el interior de los glbulos rojos. La bilirrubina proviene de la
ruptura del grupo hemo de los glbulos rojos degradados.
La bilirrubina en su forma simple (no conjugada) no es soluble, por lo que en la
sangre se asocia a una protena plasmtica, la albmina srica, para permitir su
transporte hacia el hgado. Una vez all, la bilirrubina se conjuga con el cido
glucurnico, formando diglucurnido de bilirrubina (o simplemente "bilirrubina
conjugada"), para hacerla soluble en agua. Esta reaccin es catalizada por la
enzima UDP-glucurnido transferasa.
La bilirrubina conjugada se excreta del hgado a travs de los conductos biliares y
csticos como parte de la bilis. En el colon, las bacterias intestinales deconjugan y
reducen la bilirrubina y la convierten en:
urobilingeno (20%), que puede ser reabsorbido por las clulas intestinales y
transportado por la sangre hasta el hgado, donde vuelve a reconjugarse (5%)
para ser excretado de nuevo por la bilis; el resto (15%) se convierte en
urobilina, que se excreta por los riones;
estercobilinas (80%), que son eliminadas con las heces y son los productos
responsables de la coloracin de las mismas.
Los colores de la orina diferentes al amarillo claro (color amarillo intenso hasta
rojo) son indicacin de una enfermedad o tambin puede deberse a la ingesta
de frmacos.
EL UROBILINGENO: es un metabolito incoloro con estructura
de tetrapirrol cuya frmula molecular es C33H44N4O6.
3
Se produce en
el intestino de los vertebrados por accin de las bacterias de la flora
anaerobia sobre labilirrubina,
5
procedente de las excreciones biliares en el tracto
digestivo.
En pacientes sanos, aproximadamente la mitad del urobilingeno es eliminado
por va renal,
6
considerndose normales las cantidades que oscilan entre 1 y
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4 miligramos cada 24 horas.
7

8
El resto del urobilingeno es reabsorbido por
el sistema vascular portal y luego pasa al hgado, donde es procesado por
los hepatocitos y excretado de nuevo en la bilis.
Cuando existen enfermedades hepticas o hematolgicas, en las que hay una
mayor produccin de bilirrubina, el sistema de transporte heptico se ve
desbordado y una parte del urobilingeno en exceso es eliminado por va
renal.
9

5
En la orina, el urobilingeno es transformado en urobilina, su
variante oxidada,
8
que presenta un color amarillento caracterstico. El exceso de
urobilingeno en las heces es transformado enestercobilina, un pigmento de
color marrn.
LA ESTERCOBILINA: es un pigmento biliar tetrapirrlico de color marrn cuya
frmula molecular es C33H46N4O6. Esta sustancia procede de la degradacin de
la bilirrubina en el curso de la digestin intestinal
3
(producto final
del catabolismo del hemo). Es la forma oxidada del estercobilingeno
4
y procede
principalmente de la deconjugacin y la reduccin de la bilirrubina por parte de
las bacterias de la flora intestinal. Fue aislada originalmente a partir de heces
en 1932.
5

Esta sustancia es eliminada con las heces y es el producto responsable de la
coloracin de las mismas.
EL ESTERCOBILINGENO: o urobilingeno fecal es un metabolito incoloro con
estructura de tetrapirrol cuya frmula molecular es C33H48N4O6.
2
Se obtiene como
consecuencia de la digestin de la bilis, y procede principalmente de la
deconjugacin y la reduccin de la bilirrubina por parte de las bacterias de
la flora intestinal.
Su oxidacin conduce a la formacin de estercobilina,
3
producto responsable de
la coloracin de las heces.