INGENIERA GENTICA II

Primrose SB, Twyman RM y Old RW. (2001). Principles of Gene

Manipulation, 6th ed. Blackwell Science.
Sambrook J, Russell DW y Sambrook J. (2001). Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
1
1.ENZIMAS DE RESTRICCIN
2. VECTORES DE CLONACIN
3. BIBLIOTECAS GENMICAS
4. BIBLIOTECAS DE ADNc
2
ENZIMAS DE RESTRICCIN
Reconocen secuencias concretas
Simetra (palndromes)
3
Ejemplos de palndromes
Dabale arroz a la zorra el abad
La ruta natural
A man, a plan, a canal: Panama
4
Enzimas de restriccin
Reconocen secuencias concretas
Simetra (palndromes)
Nmero de nucletidos en la secuencia
4
4
N
1
N
2
N
3
N
4
N
5
N
6
N
1
N
2
N
3
N
4
N
1
N
2
N
3
N
4
N
5
N
6
N
7
N
8
4
6
4
8
256
4096
65536
5
6
Extremos cohesivos
GAATTC
CTTAAG
G- 3
CTTAA- 5
5 - AATTC
3 - G
EcoRI
7
Extremos cohesivos
CTGCAG
GACGTC
CTGCA- 3
G- 5
5 - G
3 - ACGTC
PstI
8
Extremos romos
CCCGGG
GGGCCC
CCC- 3
GGG- 5
5 - GGG
3 - CCC
SmaI
9
Extremos compatibles (I)
GAATTC
CTTAAG
GAATTC
CTTAAG
EcoRI
GAATTC
CTTAAG
EcoRI
10
Extremos compatibles (II)
GTCGAG
CAGCTC
GTCGAC
CAGCTG
SalI
CTCGAG
GAGCTC
XhoI
11
Extremos romos
(siempre compatibles)
CCCATC
GGGTAG
CCCGGG
GGGCCC
SmaI
GATATC
CTATAG
EcoRV
12
Extremos no compatibles rellenados,
transformados en romos
(siempre compatibles)
GAATTC
CTTAAG
EcoRI
CTCGAG
GAGCTC
XhoI
G- 3
CTTAA- 5
AA T- 3 T
5 - TCGAG
3 - C T C G 3 - A
GAATT
CTTAA
TCGAG
AGCTC
Degradado de cadena sencilla
+ dNTPs
13
Rellenado parcial
Extremos no compatibles
transformados en compatibles
AAGCTT
TTCGAA
HindIII
TCTAGA
AGATCT
XbaI
A- 3
TTCGA- 5
AG- 3
5 - CTAGA
3 - C C 3 - T
AAG
TTCGA
CTAGA
TCC
+ dATP, + dGTP
+ dCTP, + dTTP
14
VECTORES DE CLONACIN
Plsmidos
Bacterifagos
Csmidos
Vectores de alta capacidad
15
pBR322
16
S
a
c
N
o
t
B
a
m
E
c
o
X
h
o
X
b
a
II
H
I
R
I
II
X
b
a
X
h
o
E
c
o
B
a
m
N
o
t
S
a
c
II
R
I
H
I
II
Sfi I
T7
SfiI
SP6
(
0
'
0
)
brazo izquierdo (20 kpb)
brazo
derecho
(9 kpb)
(
4
3
'
0
)
regin central
dispensable
(14 kpb)
-GEM-12
17
ble
colE1
ori
f1(+)
ori
ScaI
SspI
PvuII
XmnI
SspI
SspI
PvuII
ApaI
SacI
PstI*
XbaI*
NcoI
SmaI
StuI
Ec oRV
PvuII
HindIII
SalI
Xho
Kpn
I
I
RI
I
I
RI
Ec o
Not
Not
Ec o
BamHI
Izt apaCos
8.3 kpb
p
p cbC
Cm
Tc yc1
cos
cos
NheI
XbaI
18
Cromosoma
eucaritico
Vector de clonaje
(plsmido)
Digestin
ADN Ligasa
Digestin
19
Vector de clonacin
digerido con EcoRI y
PvuII
ADN
Ligasa
Extremos cohesivos Extremos romos
Sitio de corte
ADN cromosmico
Sitio de corte
Secuencias de
reconocimiento
20
ADN
Extrao
pBR322
PstI
ADN
Ligasa
ADN
Hospedador
Transformacin de
clulas de E. coli
21
Seleccin
ADN
Hospedador
Transformacin de
clulas de E. coli
Todas las colonias que
tienen plsmidos
Colonias con plsmidos
recombinantes
Agar + tet
Agar + tet
(control)
Agar + tet + amp
22
23
Agrobacterium invade
aprovechando los cortes
Transferencia a placas con agar
Placas con agar, hormonas
y kanamicina
Las plantas, resistentes a kanamicina,
contienen el gen extrao
Regeneracin de las plantas
24
Planta transformada con el gen para la GFP (protena verde fluorescente)
25
26
27
28
29
30
31
32
BIBLIOTECAS GENMICAS
33
34
N =
ln (1-p)
ln (1-t)
tamao del inserto
tamao del genoma
t =
p = probabilidad de encontrar el fragmento
deseado
35
BIBLIOTECAS DE ADNc
36
ARNm AAAAAAAAAAAA-3' 5'-
TTTTTTTTTTTTGAGCTC-5'
conector-cebador
Transcriptasa reversa
5-metil dCTP
dATP, dGTP, dTTP
ARN
ADNc 5-met TTTTTTTTTTTTGAGCTC-5'
AAAAAAAAAAAA-3' 5'-
3'-
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3 XhoI
ARNasa H
ADN polimerasa I
dNTPs
ADN
ADNc 5-met
AAAAAAAAAAAACTCGAG-3' 5'-
3'-
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
TTTTTTTTTTTTGAGCTC-5'
XhoI
Adaptadores EcoR1
ADN ligasa de T4
ADN
ADNc 5-met TTTTTTTTTTTTGAGCTC...CTTAA-5'
AAAAAAAAAAAACTCGAG...G-3' 5'-AATTC...
3'-G...
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
XhoI EcoRI EcoRI
ADN
ADNc 5-met TTTTTTTTTTTTGAGCT-5'
AAAAAAAAAAAAC-3' 5'-AATTC...
3'-G...
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
XhoI EcoRI
Digestin Xho1
37