Espermiograma.

Segn los criterio de OMS 2012

Prof. MSc. Luis Sarabia Villar. e mail: lsarabia@med.uchile.cl:
Si es un paciente o profesional solicite su hora o curso al mismo correo.
Programa de Anatoma y Biologa del esarrollo.
!acultad de Medicina. "ni#ersidad de $hile.
ocumento en preparaci%n.
&ntroducci%n
El presente texto busca simplificar y ayudar a la comunidad hispano parlante a
implementar las recomendaciones realizadas por la Organizacin Mundial de la Salud
(OMS) en su reciente manual '() laboratory manual for the *+amination and processing
of human semen ,fifth edition-. En este caso indicaremos las recomendaciones de la OMS y
comentaremos estas indicaciones con la experiencia del autor.
En la dcada del ! aparecen las importantes contribuciones de Mac "eod donde
comparaba los resultados obtenidos del an#lisis seminal de personas frtiles con los
obtenidos de pacientes con problemas para concebir un hi$o. Se comprob una fuerte
correlacin entre la mo%ilidad y fertilidad potencial y &ue la probabilidad de la concepcin
depend'a del porcenta$e de clulas acti%as y de la calidad de la mo%ilidad( Mac "eod ()*))
encontr &ue por encima de +! millones por mililitro (m".) no hab'a aumento de la
fertilidad potencial. ,e sus traba$os surgen las condiciones m'nimas &ue debe reunir un
esperma para ser considerado con capacidad fecundante. Sin embargo( en base a estos
%alores l'mites( debe tenerse en cuenta &ue si alg-n resultado es inferior al %alor m'nimo
correspondiente( debe compensarse con un aumento correlati%o de otro y &ue siempre se
habla en trmino de probabilidad para &ue un apare$a conciba un hi$o( sin embargo( en %ista
de la nue%a e%idencia( estos %alores han cambiado a lo largo del tiempo( lo &ue se aprecia al
comparar los manuales de la OMS en sus %ersiones( primera edicin ()*.+)( segunda
edicin ()*./)( tercera edicin ()**+)( cuarta edicin ()***) y por -ltimo la &uinta edicin
01O laboratory manual for the Examination and proccessing of human semen2 (+!)!)( al
cual simplemente nos referiremos como el manual OMS +!)!.
3igura ) a4 Sistema 5eproductor masculino (S5M)
El semen normal es una mezcla de espermatozoides suspendidos en las secreciones
&ue pro%ienen del test'culo y epid'dimo (fotograf'a)( las &ue se combinan al momento de la
)
3igura ) b4 Epid'dimo extra'do despus de una
or&uiectom'a( con la finalidad de recuperar
espermatozoides. (3oto ". Sarabia)
eyaculacin con las secreciones de la prstata( %es'culas seminales y gl#ndulas
bulbouretrales. 6or lo tanto( el an#lisis del semen pro%ee informacin sobre la produccin
de espermatozoides en los t-bulos semin'feros y condicin fisiolgica de estos te$idos.
Recoleccin de la muestra y entrega.
"as indicaciones se deben entregar al paciente en forma escrita y oral( de una forma
clara( en lo referente a la recoleccin y transporte del semen. El mane$o de la muestra debe
ser muy cuidadoso en el laboratorio( ya &ue toda muestra biolgica puede ser
potencialmente peligrosa por la presencia de %irus y bacterias patgenas.
a) "a muestra debe ser recolectada por masturbacin. El eyaculado se recoge en un
frasco limpio( estril( de boca ancha (fig. 7)( cerca del laboratorio para as'( limitar el
tiempo de exposicin del semen a las fluctuaciones de la temperatura y mantener el
control entre coleccin de la muestra y su an#lisis. ,ebe mantener la temperatura
entre los +! y 8/ 9 a temperaturas inferiores a : 9 los espermatozoides
experimentan el ;Schoc< trmico2 &ue se caracteriza por la disminucin de la
mo%ilidad de manera irre%ersible. Sin embargo( excepcionalmente una muestra
puede ser colectada en casa despus de una demostrada inhabilidad del paciente de
producir una muestra por masturbacin cerca del laboratorio.
b) "a mo%ilidad esperm#tica declina con el tiempo y las %ariaciones de temperatura.
En estos casos hay &ue ser muy claros y dar las instrucciones por escrito y
oralmente al paciente.
Instrucciones para el paciente (Se entregan por escrito)
1. !a muestra de"e estar completa. (Esto es esencial para un correcto an#lisis)$
oralmente se le puede explicar al paciente &ue la primera porcin de l l'&uido seminal
contiene la mayor cantidad de espermatozoides.
2.%e"er# rotular el &rasco con el nom"re del paciente y 'ora de emisin del
eyaculado.
(.%e"er# entregar la muestra al la"oratorio m#)imo dentro de una 'ora de emitida.
*.%urante el transporte al la"oratorio$ la muestra de"e ser mantenida entre 20 +, y
(-+ ,.
El laboratorio por su parte indicar# la hora de recepcin y an#lisis de la muestra
$unto a la especificacin &ue la muestra fue obtenida fuera del laboratorio.
b) 9uando la muestra no se puede recolectar por masturbacin se debe utilizar un condn
especial para recoleccin de semen. =ing-n otro tipo de condn es recomendable. El coitus
interruptus no es un medio adecuado para recolectar la muestra.
c) El paciente debe tener un m'nimo de + d'as de abstinencia sexual( pero no m#s all# de los
/ d'as de abstinencia (o$ala con una abstinencia constante en cada muestra del mismo
paciente). Se debe procurar &ue el tiempo de abstinencia sea registrado en d'as para
estandarizar los protocolos de traba$o. "a abstinencia debe ser %alorada de acuerdo a la
frecuencia de las relaciones sexuales en la pare$a. 9on un menor per'odo de abstinencia a la
media sexual( se puede producir una disminucin en la densidad esperm#tica o del %olumen
seminal. 9on una abstinencia mayor a los / d'as( se puede %er incrementado el n-mero de
espermatozoides inm%iles y morfolgicamente alterados.
Episodios febriles( inter%enciones &uir-rgicas o tratamientos farmacolgicos recientes
deber'an aplazar el espermiograma hasta despus de /! d'as despus (ciclo
espermatognico).
+
d) ,os muestras como m'nimo son necesarias para la e%aluacin inicial( si los resultados
entre ambas muestras son marcadamente diferentes( muestras adicionales deben ser
e%aluadas.
e) El inter%alo entre cada toma de muestra no debe ser menor a / d'as ni mayor a 8
semanas.
f) "a recoleccin de la muestra debe ser completa. Es importante se>alar &ue la primera
porcin del eyaculado emitido es la &ue contiene la mayor concentracin de
espermatozoides (/ ? aproximadamente)( y por esta razn es importante &ue no se pierda(
de lo contrario se pide una nue%a muestra para realizar el an#lisis con el mismo rango de
abstinencia antes se>alada( las -ltimas porciones eyaculadas se caracterizan por&ue
predominan los espermatozoides inm%iles y de mala morfolog'a( en donde la segunda
fraccin es predominantemente de origen prost#tico y la tercera (-ltima) fraccin es
predominantemente de origen de las gl#ndulas seminales.
g) El frasco de recoleccin debe ser adecuadamente rotulado con los datos del paciente( con
la fecha y la hora de recoleccin de la muestra y en presencia del paciente para e%itar
posteriores errores de rotulacin.
Recoleccin de la muestra para reproduccin asistida o micro"iolog.a.
"a finalidad es disminuir al m#ximo la posibilidad de contaminacin principalmente de
bacterias comensales &ue est#n en la piel y &ue podr'an contaminar la muestra. 6or lo tanto(
todo el material a utilizar debe ser estril.
En estos casos el paciente deber'a
1.Orinar
2.!a/ar sus manos y el pene con 0a"n.
(.Secar sus manos y pene con toallas desec'a"les.
*.Eyacular dentro del &rasco.
Recoleccin de la muestra mediante condn.
@na muestra puede ser colectada en condn durante una relacin sexual solo ba$o
circunstancias excepcionales( tal como demostrada incapacidad de producir una muestra
por masturbacin. 9ondiciones a tomar en cuenta.
).A Solo condones no txicos dise>ados especialmente para no da>ar a los espermatozoides
se podr#n entregar al paciente por el laboratorio.
+.A Se deber# entregar al paciente las instrucciones precisas para usar el condn( cerrarlo y
transportarlo hasta el laboratorio.
8.A ,urante el transporte hasta el laboratorio( la muestra deber# mantenerse entre +! :9 y 8/
:9.
7.A El examen deber# consignar &ue la obtencin de la muestra fue por condn y fuera del
laboratorio (fig +).
=ota4 =o se deber#n usar condones de l#tex
comunes ya contiene agentes &ue interfieren con la
mo%ilidad esperm#tica.
El coito interruptus no es indicado para la
recoleccin de semen ya &ue la primera porcin del
eyaculado( contiene la mayor concentracin
esperm#tica( y esta puede perderse( Bdem#s( se
puede producir la contaminacin de la muestra y
8
3igura +4 9ondn para espermiograma.
una ba$a del p1 debido a la acides de los fluidos %aginales &ue podr'an adem#s afectar a la
mo%ilidad esperm#tica.
=ota4 1ay &ue tomar en cuenta &ue si el hombre no puede obtener una muestra seminal por
masturbacin( se recomienda la obtencin con condn apropiado y entregado por el
laboratorio o en -ltimo caso por el test post coital &ue entregara la informacin de sus
espermatozoides( teniendo en consideracin el efecto de los fluidos %aginales sobre los
espermatozoides
!os pasos "#sicos en el an#lisis del semen son los siguientes1
).A B los !A minutos despus de emitida la muestra( se registran los datos del paciente y se
coloca en una incubadora a 8/C 9. hasta &ue licu.
+.A B los +!A+ minutos( se e%al-a la licuefaccin( la apariencia %isual y se toma nota del
olor si este esta alterado.
8.A B los 8!AD! minutos( se e%al-a la %iscosidad( la mo%ilidad esperm#tica( la
agregacinEaglutinacin esperm#tica( otros tipos celulares y el debris. Se realizan los test
para anticuerpos( se e%al-a la %italidad esperm#tica. Se hacen las diluciones para
determinar la concentracin esperm#tica( se separan )!! " de semen para e%aluar clulas
inflamatorias( se ti>en las l#minas para e%aluar la morfolog'a esperm#tica( se recupera y
centrifuga el semen para el an#lisis bio&u'mico posterior si corresponde.
7.A Mas tarde( se hace el recuento de espermatozoides en una c#mara =eubauer. Si hay un
n-mero F a ) x )!
D
clulas redondasEm" en el semen( se hace una e%aluacin de clulas
inflamatorias( se ti>en los frotis para e%aluacin de la morfolog'a esperm#tica y de clulas
redondas.
.A En el mismo d'a o despus si la muestra es congelada( se realiza el an#lisis bio&u'mico
de las secreciones de la prstata (zinc)( %es'cula seminal (fructuosa) y epid'dimo (A
glucosidasa).
M23I45!2,I63 I3I,I2! %E !2 M5ES7R2.
"as muestras de semen pueden tener agentes infecciosos peligrosos (GH1( hepatitis( herpes(
gonorrea( s'filis( etc.). "a utilizacin de %estimenta adecuada( guantes( as' como e%itar
cual&uier contacto directo con la muestra por parte del personal debe ser de estricto
cumplimiento.
E82ME3 M2,ROS,O4I,O
El an#lisis debe ser hecho mediante inspeccin simple inmediatamente despus de la
li&uefaccin( preferiblemente antes de los 8! minutos( pero no m#s all# de una hora( para
7
pre%enir la deshidratacin o cambios en la temperatura &ue afectan la calidad del l'&uido
seminal. (EspinozaA=a%arro( O. and Sarabia( ". +!)))
Rango de 9alores 3ormales Segn O.M.S$ 2010 :;<O la"oratory manual &or t'e
E)amination and proccessing o& 'uman semen= Entre parntesis se indica el rango de
%alores ;limites inferiores2.
!I,5E>2,,I631 (Iiempo normal entre AD! minutos a 8/ 9).
Hnmediatamente despus de la eyaculacin la muestra es t'picamente una masa gelatinosa y
coagulada. ,entro de unos pocos minutos( a temperatura ambiente( la muestra de semen
comienza a licuarse( 1acia los ) minutos la muestra deber'a estar licuada. 1ay &ue tener
presente &ue la presencia de moco puede interferir en el an#lisis y rara %ez la muestra no
licua antes de una hora( si esto no ocurriese dentro de la hora se debe registrar como
licuefaccin incompleta a la hora.
@na %ez licuada la muestra( se debe mezclar sua%emente el semen con un mo%imiento
rotatorio para reducir el error en la determinacin de la concentracin esperm#tica.
El semen normal puede contener cuerpos gelatinosos de origen prost#ticos normales &ue no
se licuan pero &ue no parecen tener importancia clinica. Sin embargo( los hilos de moco
pueden interferir con la mo%ilidad y recuento esperm#tico.
!icue&accin retardada1 Ocasionalmente algunas muestras no licuan a la hora y en estos
casos( un tratamiento adicional debe ser realizada( mezclando mec#nicamente o por
digestin enzim#tica( en estos casos( sin embargo en base a nuestra experiencia no hemos
conocido un laboratorio en
"atinoamrica &ue utilice la
digestin enzim#tica y en la
-ltima encuesta del 6rograma
para la estandarizacin del
an#lisis seminal &ue in%olucro a
8! expertos latinoamericanos
realizadas en Santiago de 9hile
el +!)!( todos indicaron usar en
sus laboratorios solo la
licuefaccin obtenida con
$eringa y agu$a (licuefaccin
mec#nica)( haciendo pasar la
muestra a tra%s de una gu$a
).J o )*J de D a )! %eces
(Sarabia et al.( +!)!). Sin embargo( sabemos &ue al libera a los espermatozoides del
impedimento mec#nico &ue influye sobre la mo%ilidad de los espermatozoides( la
mo%ilidad esperm#tica si es &ue aumenta no representar# necesariamente lo &ue ocurre in
%i%o.
,O3SIS7E3,I21 "a %iscosidad( est# en relacin a cmo fluye la muestra desde una
pipeta. "a muestra debe caer en forma de pe&ue>as gotas. Si se forma un hilo al caer la
muestra desde la pipeta( se dice &ue hay una %iscosidad anormal (filancia). 9uando el hilo
&ue se forma es F de + cm.( se dice &ue hay una %iscosidad ele%ada. "a %iscosidad ele%ada
se reconoce r#pidamente ya &ue al intentar pipetear la muestra( esta se adhiere fuertemente

3igura +4 "'&uido seminal con %iscosidad aumentada.

a la punta de pipeta. "os mtodos para ba$ar la %iscosidad son los mismos &ue para lograr
la licuefaccin de la muestra.
242RIE3,I2$ ,O!OR$ O!OR1 ,eben ser e%aluados a temperatura ambiente( dentro de
la primera hora despus de emitida la muestra. @na muestra normal tiene una apariencia
homognea( un color blanco opalescente a gris amarillento y un olor caracter'stico. (Se
informa como normal). 5n aspecto translucido se relaciona con una ba$a concentracin
esperm#tica y con ausencia de clulas de la espermatognesis( leucocitos hemat'es o
grmenes y un aspecto heterogneo se obser%a cuando &ueda material sin licuar. 5n ,olor
Bmarillo intenso en los casos &ue hay leucocitos (piospermia)( herrumbre indica presencia
de sangre hemolizada (%esiculitis o prostatitis)( ro$o indica presencia de sangre
(hemospermia por traumatismo o neoplasia de las %'as seminales). 9asi siempre se debe a
una afeccin banal denominada hemosperm'a crnica y un color %erdoso se correlaciona
con infeccin de pseudomonas algunas %itaminas y f#rmacos pueden alterar el color del
l'&uido seminal. Olor4 @n olor fecal indica la presencia de *. coli.
9O!5ME31 ( ). m")4 El %olumen del eyaculado es principalmente aportado por las
%es'culas seminales y gl#ndula prost#tica( con un pe&ue>o aporte de las gl#ndulas
bulbouretrales y el epid'dimo. El %olumen del
l'&uido seminal es esencial para obtener el
n-mero total de espermatozoides y clulas no
esperm#ticas en el eyaculado. OMS recomienda
el c#lculo por simple pesada del frasco sin
muestra y luego con muestra tomando en cuenta
&ue la densidad del l'&uido seminal es
aproximadamente de ) gEm" (Buger et al.( )**)
y pesando cada frasco por separado ya &ue estos
por fabricacin pueden tener diferentes pesos.
9uando el %olumen es muy pe&ue>o se informa
sin medirlo( como menor de !. m". Es
frecuente el hallazgo de %ol-menes aumentados
sobre D m" sin embargo solo se informa el
%olumen sin hacer un comentario adicional.
Blternati%amente OMS recomienda &ue se puede
medir directamente el %olumen de la muestra si
esta la coloca directamente en un frasco
graduado tipo probeta de !.) m" de precisin(
con boca ancha( pero en lo personal no hemos
%isto laboratorios latinoamericanos &ue utilicen
este medio. =o se recomienda la medicin de la muestra pas#ndola desde el frasco original
a una $eringa( probeta o tubo graduado ya &ue se sabe &ue se pierde entre !(8 y !(* m" de
li&uido seminal (9ooper et al.( +!!/).
En nuestro laboratorio hemos encontrado pacientes con %ol-menes entre * y )8 m". y dos
casos de pacientes con ). y )* m" de eyaculado &ue podr'an deberse a procesos
inflamatorios de alguna gl#ndula accesoria. Bl contrario( ba$os ni%eles de l'&uido seminal
son caracter'sticos en obstrucciones del conducto eyaculador( ausencia bilateral del
conducto deferente o pobre desarrollo de las %es'culas seminales. (0eis<e et al.( +!!!)(
eyaculacin retrograda o ausencia funcional de los conductos eyaculadores. Este -ltimo
s'ndrome fue descrito en )*/+ y lo presentan hasta el ) ? de los pacientes azoospermicos(
D
3igura 84 "'&uido seminal con apariencia normal.
los signos &ue sugieren este s'ndrome adem#s del %olumen disminuido (K ) m") son4
azoospermia( p1 disminuido (K /.!) fructosa disminuida (Marcador de funcionalidad de
las %es'culas seminales)( fosfatasa #cida o #cido c'trico aumentados (marcadores de
funcionalidad prost#tica). Otros trastornos &ue pueden dar origen a un %olumen disminuido
son el s'ndrome de Llinefelter y el hipogonadismo hipogonadotrofico( por la ba$a
estimulacin de las gl#ndulas sexuales.
p<1 /.+ El p1 del semen refle$a el balance entre diferentes %alores de p1 de diferentes
secreciones de las gl#ndulas accesorias( principalmente alcalino de las %es'culas seminales y
acida de la prstata. El p1 puede ser m#s alcalino y no necesariamente significa
anormalidad. B medida &ue transcurre el tiempo la muestra se %a alcalinizando por prdida
de anh'drido carbnico. Se mide en tanto licua la muestra preferiblemente dentro de los
primeros 8! minutos post eyaculacin y en algunos casos se puede medir a lo m#s una hora
post eyaculacin. "a exactitud y calidad del papel se puede %erificar con sustancias de p1
conocido. 6ara muestras %iscosas( el p1 puede ser medido usando un phmetro dise>ado
para medir soluciones %iscosas. (1augen and Jrotmol( )**.). Si el p1 es menor de /.! con
un ba$o %olumen y ba$o recuento esperm#tico( puede deberse a una obstruccin del
conducto eyaculador o ausencia bilateral del conducto deferente (,audin et al.( +!!!).
El p1 del semen %ar'a normalmente en un rango muy estrecho (/(+ A .(!)( pocos son los
trastornos capaces de alterarlo. Es importante asegurarse &ue el laboratorio est usando el
papel de p1 adecuado pues de otra manera las lecturas pueden ser falsasM el me$or es el
papel con rango D(7 A .(!( &ue es el &ue m#s se a$usta al p1 del semen( pero en su defecto
puede usarse el de rango D() A )!(!. =osotros hemos %isto estudios de otros laboratorios
donde se ha informado %alores de hasta ))(! lo &ue desde el punto de %ista biolgico es
totalmente imposible.
Se ha sugerido &ue un p1 ele%ado (F .(!) puede considerarse un signo de infeccin seminal
si se asocia a otros s'ntomas y signos de sospecha( mientras &ue un p1 disminuido (K /(+) se
obser%a cuando existe un dficit de la funcin de las %es'culas seminales( en especial en
pacientes con el s'ndrome de ausencia funcional de los conductos eyaculadores.
4RE42R2,I63 %E !2 M5ES7R2 42R2 E! 23?!ISIS %E! SEME3
/
3igura 74 Medicin de p1 con tiras Merc<.
E82ME3 %E37RO %E !2 <OR2.
"a muestra debe ser colocada inmediatamente a una temperatura de 8/ 9 hasta la
licuefaccin. @n %olumen de )! l. de semen es adecuado para ser colocado en una l#mina
portaob$eto y cubierto con una l#mina cubreob$eto de ++ mm x ++ mm de esta manera el
cubreob$eto &ueda perfectamente adherido al porta y se forma una profundidad de l'&uido
de +! m suficientes para asegurar el mo%imiento rotacional de los espermatozoides
durante su a%ance ya &ue una profundidad menor interfiere con el a%ance esperm#tico y una
profundidad mayor nos obligar'a a obtener diferentes planos focales para obser%ar
adecuadamente a todos los espermatozoides del campo. Otras alternati%as incluyen cubre
ob$etos de ). mm x ). mm en este caso se agregan D. l de l'&uido seminal para asegurar
una profundidad de +! um. Se determina una aproximacin sobre la concentracin de
espermatozoides( la calidad de mo%imiento( la presencia de clulas redondas( aglutinacin y
el debris (&ue corresponde generalmente a desechos de fragmento celulares). Esto nos dar#
una idea de cmo proceder con respecto a las diluciones para los an#lisis( &ue incluye
recuento en c#mara( %iabilidad esperm#tica( con &u %olumen hacer el frotis etc. Si la
temperatura ambiente es inferior a ++: 9 debe colocarse pre%iamente los portaob$etos y
cubreob$eto a 8/: 9 durante ) minutos. (OMS +!)!M Sarabia et al.( +!)))
Si la muestra no esta bien mezclada nos resultar#n %alores totalmente diferentes entre
nuestros duplicados de mo%ilidad( %italidad( concentracin y morfolog'a esperm#tica. 6ara
lograr una buena homogeneizacin de la muestra se mezcla la muestra en el mismo
recipiente original con mo%imientos rotacionales sua%es y con pipetas desechables( nunca se
debe utilizar %ortex a altas %elocidades debido al da>o &ue genera el mo%imiento brusco
sobre los espermatozoides.
Si en el primer an#lisis no se obser%an espermatozoides ni clulas de la espermatognesis(
se procede a centrifugar el semen y con el sedimento se hacen preparados para te>ir e
identificar la presencia de espermatozoides o clulas de la espermatognesis. Hdealmente se
centr'fuga a 8.!!! g durante ) minutos y si a-n as' no se encuentran estas clulas se
informa de la siguiente manera4
En el sedimento de la muestra centri&ugada a (000g durante 1@ minutos$ no se
o"ser/aron espermatoAoides o cBlulas de la espermatogBnesis.
2CREC2,I63.
"a adherencia entre espermatozoides inm%iles o espermatozoides m%iles con hilos de
mucus( clulas no esperm#ticas o debris se considera agregacin no espec'fica y debe ser
registrada como tal.
2C!57I32,IO3 ES4ERM27I,2. "a aglutinacin se refiere espec'ficamente a
espermatozoides m%iles y pegados entre ellos( esta aglutinacin puede ser de tipo B4
(cabezaAcabeza)( N4 (colaAcola)( 94 (solo la punta de la cola)( ,4 Se aglutina las cabezas con
las cabezas y a la %ez las colas con las colas) y E4 Se produce una mara>a de aglutinacin.
Bl mismo tiempo se registra el grado de aglutinacin como Jrado )4 Menos del )! ? de los
espermatozoides esta aglutinado( Jrado +4 entre el )! y ! ? de los espermatozoides esta
aglutinado( Jrado 84 M#s del ! ? de los espermatozoides esta aglutinado pero algunos
permanecen libres( Jrado 74 Iodos los espermatozoides est#n aglutinados e
interconectados. Espermatozoides m%iles y pegados a clulas( debris o a espermatozoides
inm%iles (agregacin) no deben ser informados como aglutinacin. "a presencia de
aglutinacin no es suficiente para deducir infertilidad por causa inmunolgica( pero es
sugesti%a de la presencia de anticuerpos anti esperm#ticos &ue deber#n in%estigarse.
.
O7ROS E!EME37OS E3 E! !DE5I%O SEMI32!
,E!5!2S RE%O3%2S1 ( x )!
D
clulasEm")
,E!5!2S CERMI32!ES I3M2%5R2S1 )A8? con respecto a )!! espermatozoides.
!E5,O,I7OS1 ) x )!
D
leucocitosEm"
El eyaculado adem#s de poseer espermatozoides( posee otros elementos y clulas &ue
pueden tener importancia clinica. Esto incluye clulas epiteliales del tracto genitourinario(
leucocitos y clulas inmaduras de la espermatogenesis. Estas clulas llamadas en general
;clulas redondas2. 6ueden ser identificadas en el frotis de la muestra y tambin con ayuda
de la determinacin de la enzima peroxidasa presente en los neutrfilos o indirectamente
cuantificadas( determinando la tasa entre espermatozoides y las clulas redondas &ue
encontremos en el frotis correlacionando esta tasa con la concentracin esperm#tica.
,etallaremos m#s adelante.
23?!ISIS %E !2 MO9I!I%2%1 (F (2 G). "a mo%ilidad debe ser determinada tan
pronto como sea posible despus de licuada la muestra y preferiblemente dentro de los
*
3igura 4 Jrados y tipos de aglutinacin esperm#tica. 6#gina +! ;01O laboratory manual for the Examination and
processing of human semen.
primeros 8! minutos de emitida( pero en ning-n caso despus de una hora de la
eyaculacin( para e%itar el deterioro por efecto del cambio de p1( deshidratacin o cambios
de la temperatura.
Se pueden traba$ar con un %olumen de )! " para cubre ob$etos de ++ x ++ mm.
Se debe e%itar &ue haya demasiado %olumen entre las l#minas para &ue el desplazamiento
de los espermatozoides sea homogneo y en lo posible en una monocapa seg-n lo
recomendado al inicio en examen dentro de la hora. "a temperatura de e%aluacin puede ser
de 8/ 9 pero al elegir esta temperatura se deber# pre temperar los portas y cubre ob$etos y
traba$ar en microscopio acondicionado con platina termo regulada( pero se puede traba$ar a
temperatura ambiente( entre +! y +7 9. Es importante estandarizar las condiciones de
temperatura para el traba$o( mezclar bien la muestra( se deben contar no menos de +!!
espermatozoides y por duplicado en otra al'cuota de la muestra y solo incluir en este
par#metro a espermatozoides intactos (&ue presentan cabeza y cola).
"os tipos de mo%ilidad a e%aluar son los siguientes4
Mo/ilidad 4rogresi/a (M4)1 "os espermatozoides se mue%en acti%amente( ya sea de
manera lineal o en un gran c'rculo( independiente de la %elocidad.
Mo/ilidad 3o 4rogresi/a1 (M34) Hncluye todos los patrones de mo%ilidad pero con
ausencia de progresin como el a%ance en pe&ue>os c'rculos.
Inm/iles (IM)1 Sin mo%imiento.
En los manuales anteriores de OMS se indicaba una separacin entre espermatozoides
r#pidos tipo B F + umEs y los progresi%os lentos o tipo N con una %elocidad inferior a esta(
sin embargo( es muy dif'cil eliminar el grado de sub$eti%idad y diferenciar las %elocidades.
En muy pocas oportunidades hemos obser%ado hipercinesis( &ue se caracteriza por
mo%imientos sumamente enrgicos y desordenados de los espermatozoides. Galores
inferiores al 8+ ? pueden deberse a perdida de fracciones seminales( cambios bruscos de
temperatura( p1 sobre o ba$o /.+A..!( leucocitosis &ue puede producir un aumento de la
concentracin de especies reacti%as del oxigeno( anticuerpos antiespermaticos( recipientes
contaminados aun&ue esto -ltimo cada %ez es m#s improbable ya &ue se recomienda &ue el
frasco estril sea entregado por el laboratorio y &ue sea en base a polipropileno neutro.
Mo%ilidad entre ! y ? probablemente se deban al s'ndrome de cilias inm%iles lo &ue se
correlaciona con s'ntomas respiratorios en el paciente al ser los cilios esenciales para la
depuracin del lumen respiratorio.
Recomendaciones para la determinacin correcta de mo/ilidad1
AObser%ar ordenadamente diferentes campos e%itando e%aluar el mismo campo dos %eces y
e%itar buscar un campo en base al numero de espermatozoides m%iles( la eleccin del
primer campo y de los sucesi%os debe ser al azar).
A9omenzar instant#neamente una %ez determinado el campo a e%aluar( no esperar &ue el
espermatozoide comienza a mo%erse para comenzar.
A,eterminar la mo%ilidad esperm#tica dentro de un #rea definida( esto es m#s f#cilmente
realizable cuando se utiliza un ret'culo instalable en el ocular.
A5e%isar y contar r#pidamente para e%itar la sobre estimacin del n-mero o
espermatozoides m%iles y el conteo de espermatozoides &ue recin entran al campo de la
grilla.
AHnicialmente se recomienda &ue se e%al-en primero los espermatozoides progresi%os
r#pidos (65)( luego los =o progresi%os o motilidad in situ (=6) y finalmente los inm%iles
(HM)( sin embargo( con experiencia el obser%ador podr# e%aluar los tres par#metros
simult#neamente.
A9ontar los espermatozoides y registrar el n-mero con ayuda de un multicontador.
)!
AE%aluar a lo menos +!! espermatozoides en total en al menos cinco campos en cada
replica( con el ob$eti%o de lograr el menor error de muestra.
A9alcular el porcenta$e promedio de las tres categor'as de mo%ilidad (65( =6( HM)
9I72!I%2% ES4ERM?7I,21 Se considera normal un %alor .? de
espermatozoides %i%os para las tcnicas descritas a continuacin.
Esta prueba debe ser utilizada si el porcenta$e de
espermatozoides inm%iles excede el D! ? aun&ue la
mayor'a de los laboratorios la realizan de rutina
debido a su facilidad y rapidez en entregar el resultado.
23?!ISIS %E !2 9I72!I%2%1 "a %italidad
esperm#tica se e%al-a dentro de los primeros 8!
minutos inmediatamente despus de licuada la
muestra( pero en algunos casos se puede e%aluar hasta
dentro de una hora cuando la muestra no a licuado
completamente( nunca despus de la hora para e%itar
encontrar un ele%ado numero de espermatozoides muertos por efectos de deshidratacin o
cambios de p1 o temperatura &ue puedan afectar a la muestra. i) Icnica eosina pura4 "a
proporcin de espermatozoides %i%os puede ser determinada utilizando tcnicas de tincin
las &ue se basan en el principio de &ue las clulas muertas con una membrana plasm#tica
da>ada toman ciertos colorantes. 6ara esta e%aluacin se utiliza una solucin de eosina (9.H.
78.!) al !.? en Nuffer fosfato Salino (6NS p1 /.)) o =a9l !(* ?. Se mezcla una al'cuota
de eosina ( O".) con una muestra de semen ( O")( se cubre con un cubreob$eto de ++ x ++
mm.( se de$a reposar 8! segundos y se e%al-a inmediatamente al microscopio. Se deben
contar +!! espermatozoides diferenciando los espermatozoides %i%os (no te>idos) de los
espermatozoides muertos (te>idos). ii) @na segunda forma de realizar el examen de
%italidad corresponde a la tcnica con la tincin de EosinaA=igrosina (EA=) cuya %enta$a
con respecto al test de Eosina es &ue nos permite almacenar las muestras para reAe%aluacin
y propsitos de control de calidad o re che&ueos por otros in%estigadores en casos de
e%aluacin cient'fica( con esta tincin los
espermatozoides muertos se ti>en de 5o$o o rosado
oscuro y los %i%os se ti>en de rosado claro o no se
ti>en.
6ara esta tcnica se agrega )! g de negrosina a la
eosina !( ? en 6NS o =a9l !(* ? se hier%e( luego se
enfr'a y filtra y guarda en frasco de %idrio oscuro.
El procedimiento consiste en remo%er ! O" de
semen y mezclar con igual cantidad de EA=( esperar
8! segundos mezclar y realizar un frotis (todo se
realiza en duplicado real) se de$a secar al aire y se
cubre de manera permanente con medio de monta$e
para examinar a x )!!!
iii) 6or -ltimo( una tercera manera de realizar el test de %italidad consiste en el conocido
test 1ipoosmtico en donde espermatozoides con membranas intactas se hinchan y su
forma flagelar cambia dentro de 8! minutos de exposicin al medio hiposmotico.
))
3igura /4 Espermatozoides te>idos con EosinaA=igrosoina obser%ados a x)!!! con microscopia
de luz. 6#gina +. ;01O laboratory manual for the Examination and processing of human
semen.
3igura D4 Espermatozoides muertos
te>idos de ro$o y los %i%os no se ti>en.

Nre%emente( se disuel%e !./8 g de citrato de sodio dihidrato y ).8) g de ,Afructosa en )!!
m" de agua( se congelan alicuotas de ) m" a A+! :9. 6ara realizar el test( se descongela )
m" de medio hipo osmtico y se estabiliza por minutos a 8/ : 9 luego se agregan )!! O".
de semen bien mezclado y se incuba minutos para fines teraputicos como la inyeccin
intracitoplasm#tica o%ocitaria conocida com-nmente como H9SH o 8/ minutos para fines
diagnsticos. 6osteriormente se transfieren )! O". de la mezcla a un portaob$eto y se cubre
para la obser%acin de +!! espermatozoides por duplicado con un aumento de 7! x se
calcula el promedio y se informa seg-n corresponde (%er tabla 7).
"a disminucin de la mo%ilidad esperm#tica con un porcenta$e normal de espermatozoides
%i%os( sugiere la presencia de anomal'as en la ultraestructura del flagelo del espermatozoide
como el s'ndrome de cilios inm%iles cuya causa es a ni%el gentico y su diagnstico
definiti%o se realiza mediante microscopia electrnica( de diagnosticarse esta patolog'a es
de muy mal pronostico &uedando como -nica opcin la inyeccin intracitoplasm#tica del
o%ocito con un espermatozoide de la pare$a.
RE,5E37O %E ES4ERM27OHOI%ES
!imite in&erior normal ) x )!
D
espermatozoidesEm". o 8* x )!
D
espermatozoides por
eyaculado o m#s (OMS( +!)!).
6rincipio4 El n-mero total de espermatozoides por eyaculado y la concentracin
esperm#tica se encuentran directamente relacionadas con el tiempo en &ue tarda la pare$a
en conseguir la pre>ez (Slama et al.( +!!+) y con la tasa de pre>ez (Pinaman et al.( +!!!) y
como predictor de la concepcin ("arsen et al.( +!!!). El n-mero total de espermatozoides
por eyaculado se correlaciona en condiciones normales con el %olumen testicular con
tiempos de abstinencia normales.
)+
3igura .4 5epresentacin es&uem#tica de los cambios morfolgicos en espermatozoides humanos
su$etos a estrs hiposmotico. 6#gina 8+ ;01O laboratory manual for the Examination and
processing of human semen.
"a primera obser%acin nos orientar#
para determinar la dilucin de traba$o
(%er ;Obser%acin dentro de la hora2)
teniendo en cuenta &ue siempre las
muestra debe estar perfectamente y
recin homogeneizada para comenzar
las diluciones.
!a concentracin esperm#tica solo
incluye a espermatoAoides
completos con cabeza y cola y si
existen anormalmente muchos
cabezas o colas sueltas( estas se
cuantificar#n por separado o se puede
cuantificar en el frotis y consignar
como una obser%acin( aun&ue estos
casos no son frecuentes.
Se cuantifica utilizando un
hemocitmetro de =eubauer( (-ltima recomendacin de OMS +!)!) o en c#mara Ma<ler
&ue no re&uiere dilucin.
6rocedimiento4 "as diluciones para la c#mara de =eubauer pueden ser )4( )4)!( )4+!( )4!
(lo importante para e%itar errores es tomar al menos ! ". de muestra para las diferentes
diluciones( fig *b). El diluyente es preparado adicionando a ) "itro de agua destilada( ! g
de bicarbonato de sodio( )! m" 8? (%E%) de formalina y !.+ g de azul trip#n o m" de
una solucin saturada de %ioleta de genciana. (Se almacena a 7 :9. Si se forman cristales se
filtra con papel de !.7 Om antes de usar).
Se deben transferir entre )! a ) ". de la dilucin hacia la c#mara de recuento de
=eubauer( pero lo m#s importante es &ue la c#mara &uede completamente llena pero no en
exceso para e%itar &ue la l#mina &ue la cubre se mue%a por accin de la dilucin
transferida. "a muestra se debe de$ar sedimentar (+ a 8 minuto)( y debe ser conser%ada en
una c#mara h-meda y e%aluadas dentro de )! a ) minutos para pre%enir la e%aporacin(
hasta el momento de realizar el recuento. El recuento debe ser de cabezas de
espermatozoides y no de colas para e%itar el doble recuento.
7a"la de dilucin1
)8
3igura *4 3rasco con solucin de formalina para recuento.
9#lculos y resultados.
7ipos de c#mara de conteo recomendados por OMS 2010.
El 'emocitmetro de 3eu"auer1 9ada hemocitmetro posee dos c#maras de conteo por
separado( con un #rea de 8 mm x 8 mm. (* cuadrantes de ) mm
+
conteniendo )!! n" de
%olumen cada uno) y ambas c#maras se cubren con un cubre c#mara n: 7 &ue es de !.77
milimetros de grosor( este cubre c#mara &ueda le%antado )!! m por medio de pilares de
%idrio pertenecientes a la misma c#mara de =eubauer (fig. )!). El cuadrante de la figura
)) tiene + cuadr'culas menores &ue se denomina en con$unto ret'culo de Ihomas( cada una
de estas + cuadriculas menores a su %ez tiene )D cuadr'culas m#s pe&ue>as (fig. ))
derecha).
Metodolog.a para el recuento4 Si un espermatozoide se ubica sobre la l'nea &ue di%ide
dos cuadr'culas adyacentes( debe ser contado solamente si est# en la l'nea inferior o hacia la
l'nea del lado iz&uierdo de la cuadr'cula a ser e%aluada( si las ret'culas tienen l'neas triples
la misma regla se conser%a pero para la l'nea central (fig ))).
9on la finalidad de simplificar los c#lculos de los resultados( explicaremos una metodolog'a
&ue difiere de la metodolog'a recomendada por OMS( sin embargo( entrega el mismo grado
de confiabilidad. B fin de determinar la concentracin de los espermatozoides en la muestra
original de semen en millonesEm"( el n-mero promedio de espermatozoides (+ recuentos) es
multiplicado por el factor de con%ersin apropiado. 6ara mayor claridad de lo expuesto
tenemos el siguiente e$emplo4
Si la dilucin es )E (+!! u" de semen y .!! u" de solucin de solucin)( y se han
contado las + cuadr'culas (ret'culo de Iomas completo)( entonces se multiplica el n-mero
de espermatozoides en las + cuadr'culas( por (dilucin) y por )!.!!! (x !.!!!). Segundo
e$emplo( si la dilucin es )E( y se han contado solo cuadr'culas( entonces se multiplica el
n-mero de espermatozoides registrados en las cuadr'culas por (representa los +
cuadrantes)( por (dilucin) y por )!.!!! ()!.!!! corresponde al factor de con%ersin
propio de la c#mara por sus dimensiones obtenidos al di%idir el e&ui%alente a ) m"
().!!!.!!! n") por el %olumen promedio contado en un cuadrante de los * enumerados en la
figura ))( de esta manera tenemos ).!!!.!!! n"E)!! n" Q )!.!!!). 1ay &ue tener presente
&ue el m'nimo recomendado de espermatozoides a contar son +!! por lo &ue si la muestra
no tiene suficientes espermatozoides para llegar a +!! en el ret'culo de Iomas se deber#
)7
3igura * b4 Esta tabla recomienda los %ol-menes de muestra y fi$ador necesarios para la dilucin dependiendo
la concentracin nati%a de espermatozoides y la cantidad de grillas a e%aluar &ue por lo general ser#n tres
grillas y en duplicado real. (6#g. 8*( OMS +!)!).
6#gina 8* ;01O laboratory manual fort he Examination and processing of human semen.
continuar con los cuadrantes %ecinos numerados en la figura )) de tal manera de obtener un
error de muestra calculado en solo un ? (tabla ). R una diferencia aceptable de 8*
espermatozoides como m#ximo entre ambos recuentos (tabla D). Si la diferencia fuese
mayor se repite el procedimiento desde la mezcla del li&uido seminal en adelante. (5eplicas
nue%as y duplicados reales).
3igura )) Bmpliaciones sucesi%as de la c#mara de =eubauer( el recuadro (ret'culo de Iomas) se %e
amplificado en el es&uema central () mm
+
) &ue a su %ez indica un circulo &ue se amplifica nue%amente a la
derecha para realizar el recuento (!(+ mm
+
). 6#gina 87 ;01O laboratory manual for the Examination and
processing of human semen.
) mm.
!.+ mm.

!.! mm Q ! um.
)
3igura )!4 9#mara de =eubauer Hz&uierda4 Gista desde arriba( ,erecha %ista de perfil mostrando la separacin entre
la c#mara y el cubrecamara.
3igura )+4 3otograf'as e&ui%alentes a los es&uemas central y derecha de la figura )).
3igura )84 "os c'rculos blancos indican espermatozoides &ue se cuentan en el campo indicado y los c'rculos
negros indican espermatozoides &ue no se cuentan4 Esta tcnica e%ita contar al espermatozoide + %eces. 6#gina
87 ;01O laboratory manual for the Examination and processing of human semen.
En los casos en &ue no se alcancen a contar los +!! espermatozoides en el ret'culo de
Iomas (cuadricula ( figura ))) se continuara el recuento en las otras cuadriculas de la
c#mara de =eubauer( desde la ) a la * y el resultado se di%ide por el n-mero de cuadriculas
contadas( as' por e$emplo si fue necesario contar las cuadriculas )( +( 8( 7( y D para
alcanzar los +!! espermatozoides el resultado final se di%ide en D ya &ue el #rea abarcada
fue seis %eces m#s &ue el ret'culo de tomas completo.
Recuento en c#mara MaIler
"a c#mara Ma<ler no es recomendada por OMS en el -ltimo manual del +!)!( sin embargo(
presenta la %enta$a de traba$ar con muestra sin diluir lo &ue e%ita este factor de error y
adem#s se puede determinar los distintos grados de mo%ilidad a la %ez( lo &ue ahorra tiempo
al personal del laboratorio.
6ara determinar la concentracin( se cuenta las )!! cuadr'culas y se multiplica el resultado
por )!!.!!!( para expresar la concentracin esperm#tica en millonesEm".
)D
3igura )74 9#mara de Ma<ler Hz&uierda4 Gista desde arriba( ,erecha %ista de perfil mostrando la separacin entre la
c#mara y el cubrecamara.

1ay &ue tener en cuenta &ue la centrifugacin en muestras con criptozoospermia
(concentracin esperm#tica menor de ) x )!
D
Em")( disminuir# la mo%ilidad esperm#tica en
los pocos espermatozoides &ue se pudieran encontrar y en algunos caso la mo%ilidad se
puede perder en su totalidad.
Si el numero de espermatozoides es K 7 por campo con aumento de x7!! esto representara
aproximadamente a ) x )!
D
Em" de espermatozoides y para la mayor'a de los propsitos
cl'nicos se informara una concentracin esperm#tica K + x )!
D
Em" ya sea se encuentren o no
espermatozoides m%iles.
Bl finalizar el traba$o de recuento se de$ara la c#mara en solucin desinfectante
preferiblemente durante toda la noche para eliminar posibles agentes infecciosos del semen.
!a siguiente ta"la e)plica Jue al contar un total de *00 espermatoAoides tendremos
un error de muestra de solo un @ G.
)/
3igura )4 Hz&uierda4 Gista a ba$o aumento de la grilla casi completa de la c#mara de Ma<ler4 posee )!!
cuadrantes en total. ,erecha4 Es&uema de la grilla en c#mara de Ma<ler.
6#gina 8/ ;01O laboratory manual for the Examination and processing of human semen.
Ianto el recuento( morfolog'a( motilidad y %italidad esperm#tica consideran contar en duplicado al menos +!!
espermatozoides para tener un error de muestra menor o igual al ?
O!ICOHOOS4ERMI21 Se define como el recuento de espermatozoides inferior a ) x
)!
D
Em" esta puede ser( ligera (entre )! A K) x )!
D
Em")( oligozoospermia moderada (entre
y K )! x )!
D
Em") y oligozoospermia se%era cuando la concentracin esperm#tica es
inferior a x )!
D
Em"). Blgunas causas sonM Obstruccin epididimaria( eyaculacin
retrograda( diabetes mellitus( factores congnitos( estrs y periodos febriles intensos( e
hipogonadismo hipogonadotrofico entre otros.
,RI47OHOOS4ERMI21 Se define como una concentracin de espermatozoides inferior
a ) x )!
D
Em".
2HOOS4ERMI21 Se define como la ausencia de espermatozoides en el l'&uido seminal y
puede indicar un da>o se%ero del epitelio germinal con aplasia germinal o s'ndrome de
Sertoli solo (azoospermia secretora) y la detencin de la maduracin esperm#tica (arresto
de la esperm#togenesis). "a zoospermia tambin puede deberse a una obstruccin de las
%'as seminales (azoospermia obstructi%a). En estos casos se deber# centrifugar toda la
muestra a 8!!! g durante ) minutos y re%isar en + portaob$etos todo el pellet para
informar( re%isado preferiblemente con aumento de x +! para abarcar toda el #rea del
cubreob$eto de ++ x ++ mm. Si se encuentra al menos ) espermatozoide se informa como
criptozoospermia( de lo contrario solo se sugiere la azoospermia ya &ue existe la posibilidad
&ue en el resto de la muestra si se encuentren espermatozoides ya &ue e ha demostrado &ue
no todos los espermatozoides ba$an al pellet a ese tiempo y %elocidad. (9orea et al.( +!!)
,ebemos tener presente &ue casi en todos los casos( esta centrifugacin afectar#
negati%amente la mo%ilidad de los escasos espermatozoides &ue pudiera tener la muestra.
9onclusin4 B pesar &ue estos protocolos se sigan con exactitud( tenemos &ue considerar
%arios factores relacionados con posibles errores( entre ellos tenemos solo como algunos
).
e$emplo m#s frecuentes( el uso de pipetas de aire en %ez de pipetas de presin positi%a(
errores en la mezcla y dilucin de las muestras( pipetas descalibradas( c#maras y contadores
defectuosos entre otros factores por lo &ue siempre se recomendara el uso de control de
calidad tanto interno como externo para asegurar la confiabilidad de nuestros resultados.
RE,5E37O %E O7R2S ,E!5!2S %I>ERE37ES 2 !OS
ES4ERM27OHOI%ES1
El semen eyaculado contiene otras clulas adem#s de los espermatozoides( entre ellas se
incluyen clulas epiteliales de la uretra( leucocitos( clulas germinales.
"a concentracin de estas clulas se puede estimar de la siguiente manera. Se cuentan las
clulas en los cuadrados &ue est#n ubicados en las es&uinas del ret'culo de Ihomas
(9uadrantes )( 8( / y *). 9ada cuadrado tiene un %olumen de !.)m"
8
pero representan un
%alor de ) m". El conteo &ue resulta en los 7 cuadrados se di%ide entre 7 y se multiplica por
el factor de dilucin para obtener el n-mero de clulas por m" de muestra. "o m'nimo &ue
hay &ue contar son +!! clulas redondas( si este %alor no se alcanza se cuentan el resto de
los cuadrantes y el resultado se di%ide por el n-mero de cuadrantes contados OMS adem#s
recomienda &ue este an#lisis se haga por duplicado real en la c#mara contra lateral.
Otra manera de estimar el n-mero de clulas redondas especificando el detalle de estas es
directamente en el mismo frotis utilizado para determinar la morfolog'a esperm#tica( lo
cual ob%iamente re&uerir# un an#lisis de un experto en citolog'a para poder discriminar
entre clulas de origen sangu'neo y de origen esperm#tico( de esta manera si 3 es el n-mero
de un tipo celular dado por )!! espermatozoides y S es la concentracin de
espermatozoides en millonesEm"( entonces la concentracin 9 de un tipo celular dado en
millonesEm". puede ser calculada con la siguiente frmula4
9Q(=xS)E+!!
Bs'( si el n-mero de clulas germinales inmaduras o leucocitos contados es por +!!
espermatozoides y el recuento de espermatozoides es )+! x )!
D
Em" la concentracin de
dichas clulas es x )+!x)!
D
E+!! Q 8 millones Em".
9on el mismo e$emplo pero ahora determinado el n-mero de neutrfilos( si encontramos +
neutrfilos por cada +!! espermatozoides tendremos &ue4
9Q + x )+!x)!
D
E+!! Q )(+ millonesEm"

3igura )D4 ,e iz&uierda a derecha( ).A =eutrfilos( +.A epitlio descamati%o( 8.Aepitlio descamati%o plano( 7.A
Esperm#tidas.
%eterminacin Ju.mica de !eucocitos.
)*
"os leucocitos pueden da>ar la mo%ilidad y el ,=B esperm#tico a tra%s de un ata&ue
oxidati%o( sin embargo( este da>o depender# de %arios factores entre ellos( el lugar de
infiltracin leucocitaria( naturaleza de los leucocitos encontrados (Macrfagos( =eutrfilos
y excepcionalmente "infocitos) y el estado de acti%acin leucocitaria. Bun&ue la
leucocitoespermia no nos asegura el diagnstico de infeccin( si se considera un signo de
sospecha si se asocia a otros signos seminales y cl'nicos &ue confirman dicho diagnstico.
Blgunos s'ntomas cl'nicos podr'an ser4 dolor al eyacular( antecedentes de infecciones de
transmisin sexual o genitourinarias( ex#menes anormales de alguna gl#ndula del sistema
reproductor y alteraciones f'sico &u'micas del plasma seminal lo &ue confirma el
diagnstico es el examen bacteriolgico positi%o. 1ay &ue tomar en cuenta &ue un segundo
grupo de an#lisis de espermiograma solo podr# realizarse solo despus de transcurridos al
menos *! d'as despus de la -ltima dosis de antibiticos ya &ue estos afecta a la
concentracin esperm#tica.
,entro de la poblacin de leucocitos( predominan los =eutrfilos. Sin embargo( estas
clulas podr'an ser confundidas por un e%aluador inexperto con esperm#ticas
multinucleadas. Blgunas caracter'sticas morfolgicas &ue los diferencia a ambos( por
e$emplo( son4 los puentes de cromatina &ue solo est#n presentes en el =eutrofilo( los
linfocitos tiene un n-cleo en promedio de * m a diferencia de un macrfago &ue posee un
tama>o nuclear promedio de ) m
En nuestro laboratorio determinamos leucocitos peroxidasa positi%os en base a una
solucin de agua oxigenada )!! " a )!A8!? mezclada con *!! " de una solucin de
ortotoluidina !.)? (relacin agua oxigenada4 Ioluidina de )4)!). ,e esta mezcla( se toman
*!! " a los &ue se agregan )!! " de muestra de semen (relacin )4)!). "a solucin final
se incuba por 8! minutos a temperatura ambiente. "os leucocitos peroxidasa positi%os dan
una coloracin marrn( y se registran como positi%os para la reaccin. Este recuento es -til
para diferenciar los leucocitos peroxidasa positi%a (=eutrfilos) de otros tipos de clulas
redondas y se cuentan en c#mara de =eubauer o Ma<ler( sin embargo( esta tcnica no
detecta a Macrfagos o =eutrfilos &ue ya hayan exocitado sus gr#nulos. @n mtodo similar
pero m#s comple$o se detalla en el Manual OMS +!)! aun&ue %arias otras tcnicas para
identificar la poblacin leucocitaria en semen( como son en base a inmunocito&u'mica(
tambin pueden ser utilizadas aun&ue estas son mas costosas y demandan un tiempo de
procesamiento y an#lisis mayor por lo &ue tendr# &ue e%aluarse el real aporte &ue puede
entregar esta tcnica al diagnstico en cada caso en particular.
"a agencia internacional de in%estigacin del c#ncer (HB59( )*.+) ha declarado &ue la
orthoAtoluidina presenta riesgo carcinognico para humanos.
+!
3igura )/4 9lulas 6eroxidas positi%as4 Se marcan de caf claro hasta marrn intenso.
%eterminacin de cBlulas inmaduras1
"as clulas germinales o clulas inmaduras incluyen esperm#tidas y espermatocitos pero
rara %ez incluyen a espermatogonias debido a &ue estas est#n unidas mediante
hemidesmosomas a la lamina basal lo &ue pre%iene su liberacin al lumen y la &ue se libera
tras una mitosis generalmente alcanza a transformarse en un elemento celular m#s
diferenciado( estas clulas generalmente son detectadas en los preparados (frotis) pero son
dif'cilmente diferenciadas de clulas inflamatorias cuando estas clulas se encuentran en
degeneracin.
El siguiente gra&ico y ta"la muestras cual es la di&erencia acepta"le entre dos
recuentos ya sea en c#mara o &rotis y aplica para las cBlulas redondas en &uncin de
los espermatoAoides.
+)
6#gina + ;01O laboratory manual for the Examination and processing of human semen.
6#gina + ;01O laboratory manual for the Examination and processing of human semen

237I,5ER4OS 237IES4ERM?7I,OS.
Se ha sabido desde hace mucho tiempo &ue los animales de experimentacin podr'a ser
infrtiles mediante la inmunizacin con el esperma. "os espermatozoides est#n
++
normalmente aislados del resto del cuerpo en los t-bulos semin'feros. Si hay ruptura de los
t-bulo y los espermatozoides &uedan expuestos al sistema inmune( estas clulas ser#n
reconocidas como extra>as y pro%ocaran una respuesta de anticuerpos. "os anticuerpos
antiAesperm#ticos se encuentran en un .A)!? de los hombres. En los hombres con
antecedentes de infeccin( traumatismo o cirug'a( los anticuerpos se pueden encontrar hasta
un D!? de los casos( tambin aumenta la posibilidad de presentar anticuerpos
antiesperm#ticos en pacientes con torsin o c#ncer testicular( %aricocele y sometidos a
biopsia testicular( tambin los pacientes sometidos a la re%ersin de la %asectom'a en un /!
? de los casos presentan anticuerpos antiesperm#ticos.
B menudo( sin embargo( no hay causa conocida para su presencia. 9uando el anticuerpo se
une a los espermatozoides( &ue pueden alterar la capacidad de los espermatozoides de nadar
(si esta unido a la cola) o fertilizar un %ulo (si esta unido a la cabeza). 9uando hay un gran
porcenta$e de espermatozoides con anticuerpos unidos a ellos( hay una buena probabilidad
de fracaso de la fertilizacin( incluso con la 3HG el H9SH es la eleccin en casos gra%es de
anticuerpos antiesperm#ticos.
6ara determinar la presencia de anticuerpos antiesperm#ticos( especialmente cuando se
detecta aglutinacin esperm#tica (anticuerpos unidos entre si y con motilidad) ya sea
cabezaAcabeza( colaAcola o una mezcla de ambas( en estos casos la presencia de anticuerpos
podr'a ser la causa( aun&ue los anticuerpos pueden estar presentes sobre los
espermatozoides sin generar aglutinacin y la aglutinacin tambin puede ser causada por
una causa diferente a la presencia de anticuerpos. "a mera presencia de anticuerpos es
insuficiente para el diagnstico de autoinmunidad esperm#tica. Es necesario demostrar &ue
los anticuerpos interfieren se%eramente con la funcin esperm#ticaM esto es usualmente
hecho por el test de penetracin de espermatozoides en moco. "os anticuerpos pueden
interferir con la unin del espermatozoide a la zona y con la reaccin acrosmica.
"os anticuerpos antiesperm#ticos en semen pertenecen casi exclusi%amente a dos clases de
inmunoglobulinas4 HgB y HgJ. "os anticuerpos de clase HgM ( debido a su gran tama>o( son
raramente encontrados en semen. "os anticuerpos del tipo HgB pueden tener gran
importancia cl'nica e incluso m#s &ue los anticuerpos HgJ (Lremer and Sager( )*.!).
Bmbas clases pueden ser detectadas sobre los espermatozoides o en fluidos biolgicos.
7est %irecto1 test para detectar anticuerpos so"re los espermatoAoides. ,escribiremos
dos test( el primero llamado MB5 Iest (mixed antiglobulina reaction). (Nronson et al.(
)*.7). R los inmunobead (HN) o inmunoperlas. (Nronson et al.( )*.+). El MB5 test es
realizado en una muestra de semen fresco mientras &ue el HN es realizado en
espermatozoides la%ados. "os resultados de ambos test no siempre concuerdan pero los
resultados de HN est#n siempre correlacionados con los resultados de los test de
inmo%ilizacin de anticuerpos detectados en suero. "os protocolos experimentales para HN y
MB5 test %ar'an( pero para ambos las preparaciones son examinadas ba$o el microscopio.
"as inmunoperlas se adhieren a los anticuerpos &ue est#n unidos sobre la superficie de
espermatozoides motiles e inmtilesM Se informa el porcenta$e de espermatozoides motiles
con perlas.
4RO,E%IMIE37O 42R2 M2R test.
MB5 test es r#pido y sensible (5a$ah et al.( )**+)( este reacti%o con anticuerpos anti HgJ o
HgB se unen a los anticuerpos del tipo HgJ o HgB &ue est#n sobre los espermatozoides. El
reacti%o &ue contiene el anticuerpo se mezcla con semen nati%o y se obser%a la presencia de
espermatozoides motiles con perlas unidas a este. En nuestra experiencia( esta tcnica es la
+8
prueba inmunolgica m#s utilizada para detectar anticuerpos antiesperm#ticos( por lo &ue
nos referiremos a ella con m#s detalles.
7Bcnica1 Mezclar muy bien la muestra de semen y toma 8. T" de semen para cada
determinacin (para HgJ e HgB)( tambin se debe incluir muestras de semen positi%as y
negati%as como control pro%enientes de indi%iduos ;controlesU. Blternati%amente controles
positi%os pueden ser producidos por incubacin de espermatozoides con suero &ue contiene
tales anticuerpos antiesperm#ticos. "ego se agrega 8. T" de HgJ cubierta por perlas de
latex (beads) a cada muestra y mezclar con una punta de micropipeta( luego se agregan 8.
T"de antisuero contra la HgJ a cada mezcla de semen Vbead y %ol%er a mezclar(
posteriormente se cubre con un cubre ob$etos de ++ x ++ mm para proporcionar una
profundidad entre portaob$eto y cubre de +!Tm( se de$a reposar por 8 minutos a temperatura
ambiente en c#mara h-meda para pre%enir el secado y posteriormente se examina de
preferencia en microscopio con contraste de fases a los 8 y )! minutos. 5epetir el
procedimiento para HgB.
E)presin de los resultados1 Se determina el porcenta$e en +!! espermatozoides motiles
&ue presenta la unin de + o m#s part'culas de l#tex unidas( ignorando a los
espermatozoides &ue tiene unidas las part'culas en la punta de la cola (se realiza en
duplicado). Se consigna el tipo de anticuerpo unido y la zona del espermatozoide afectado
(cabeza( pieza media( pieza principal).
=otas4 Si el )!! ? de los espermatozoides motiles presenta perlas unidas a los 8 minutos( se
toma como resultado final de lo contrario se lee nue%amente a los )! minutos( pero si a los
)! minutos los espermatozoides est#n inm%iles se toma como resultado el determinado a
los 8 minutos.
9alor de re&erencia1 6ositi%o hasta ! ? de los espermatozoides motiles( ya &ue la tasa de
penetracin esperm#tica en moco cer%ical es se%eramente da>ada cuando ! ? o m#s de los
espermatozoides presentas MB5 es positi%o.
Es&uema.
4RO,E%IMIE37O 42R2 Inmuno"ead (IK).
Este procedimiento consume m#s tiempo &ue el MB5 test pero entrega informacin acerca
de anticuerpos sobre los espermatozoides &ue podr'an haber sido enmascarados por
componentes del plasma seminal. En este test (HN) el reacti%o esta formado por perlas de
l#tex cubierta con anticuerpos anti HgB o HgJ &ue se mezclan directamente con
espermatozoides la%ados y la unin de las perlas a los espermatozoides indica la presencia
de HgJ o HgB en la superficie del espermatozoide. 6rocedimiento descrito en el : manual de
OMS p#g ))) y ))+.
9alor de re&erencia1 6ositi%o hasta ! ? de los espermatozoides motiles.
+7
7est Indirecto1 7est para detectar anticuerpos antiesperm#ticos en &luidos li"res de
espermatoAoides. 9omo el plasma seminal( sangre( suero y moco cer%ical solubilizado. En
estos test( los fluidos inacti%ados por calor son incubados con espermatozoides la%ados y
libres de anticuerpos de un donante. 9ual&uier anticuerpo antiesperm#ticos del paciente se
unir# a los espermatozoides la%ados del donante( el cual es tratado luego con un test directo
como el indicado anteriormente. 6ara permitir resultados seguros( es importante permitir un
tiempo suficiente de interaccin ya &ue puede tardar hasta )! minutos para &ue la mezcla y
aglutinacin sea %isible. Sin embargo( hay &ue tener en cuenta &ue la motilidad declina con
el tiempo( y el test depende de espermatozoides motiles. 6rocedimiento descrito en el :
manual de OMS p#g ))8 y ))7.
9alor de re&erencia1 6ositi%o hasta ! ? de los espermatozoides motiles.
Estos test est#n disponibles comercialmente y ambos dependen de la presencia de
espermatozoides motiles. Si hay insuficientes espermatozoides motiles se pueden utilizar los
test indirectos sobre plasma seminal( sangre o suero pueden ser usados. Iambin hay &ue
considerar &ue anticuerpos citotxicos pueden matar a todos los espermatozoides o inhibir
por completo la motilidad.

I3SER72R 2E5D E! %O,5ME37O %E E37RE32MIE37O %E
MOR>O!OCD2 ES4ERM?7I,2 %E 2( 4?CI32S. 4or el momento "sJuela
tam"iBn por Internet o escri"a a !S2R2KI2LME%.5,<I!E.,! y con gusto se la
en/iarB
23?!ISIS ES4ERM?7I,O 2SIS7I%O 4OR ,OM4572%OR2
,omputerassisted semen analysis (,2S2).
"os actuales a%ances en la tecnolog'a nos han permitido contar eficientemente
espermatozoides marcando el ,=B y algoritmo &ue detectan la cola del espermatozoide( de
esta manera se descarta el detritus o clulas redondas propias del l'&uido seminal. El uso de
sistemas computacionales para la determinacin de la motilidad esperm#tica depende de la
concentracin esperm#tica( del debris de la muestra ya &ue este -ltimo puede ser
confundido con espermatozoides motiles( tasa de im#genes obtenidas por segundo( aun&ue
la mayor'a de las compa>ias fabricantes recomiendas una ad&uisicin de im#genes &ue
%aria entre ! y D! 1z (Morris et al.( )**D). y actualmente esa tasa de ad&uisicin es mayor
+
y se recomienda especialmente para muestras con espermatozoides de ba$a linearidad yEo
hiperacti%ados e incluso para los espermatozoides m#s r#pidos conocidos como son los
espermatozoides del pez Pebra( se re&uieren tasas de ad&uisicin de +*! 1z para describir
la motilidad esperm#tica con confiabilidad (0ilsonW"eedy et al.( +!!/). Sin embargo( el
sistema entrega resultados bastante reproducibles. OMS recomienda &ue al menos +!!
espermatozoides sean analizados y en l posible sean 7!!( as' tambin el sistema debe estar
unido a un softXare &ue permita el an#lisis estad'stico de los resultados( en general tambin
es necesario estandarizar las condiciones de grabacin de los %ideos &ue determinaran la
motilidad de los espermatozoides como son la temperatura a 8/: 9 ya &ue la motilidad es
sensible a la temperatura y de preferencia realizar la determinacin en muestra si diluir.
Iambin se ha determinado &ue la motilidad de la muestra se puede realizar sin dificultad
con muestras &ue tienen una concentracin esperm#tica de entre + x )!
D
y ! x )!
D
por m"
(Jarret et al.( +!!8).
En muestras &ue superan los ! x )!
D
por m" las colisiones pueden ocurrir con una
alta frecuencia y es probable &ue eso induzca a errores( tales muestras deben ser diluidas
con plasma seminal del mismo paciente obtenido de una alicuota centrifugada a )D.!!! g
por D minutos( tambin deben disponerse de c#maras dobles &ue del sistema generalmente
hace las recomendaciones para una adecuada grabacin en cuento a intensidad de luz(
contraste y aumento. @n dato importante a considerar es &ue en Estados @nidos solo un + ?
de los laboratorios &ue realizan mediciones de motilidad esperm#tica para fines cl'nicos
utilizan un sistema 9BSB (Bmann +!!7).
7a"la 11 Resumen de !.mites de Re&erencia In&eriores (!RI)$ con un percentil de @ e
inter/alo de con&ianAa de un M@ G.
+D
6#gina ++7 ;01O laboratory manual for the Examination and processing of human semen.
7a"la 21 >orma para registrar el an#lisis del espermiograma y moco cer/ical$ segn
el manual de la OMS 2010.
+/
6#gina ++ ;01O laboratory manual for the Examination and processing of human semen.
7a"la (1 3omenclatura para algunas /aria"les seminales ;<O 2010 y Sara"ia et al$
2010
7ERMI3O %E>I3I,I63
3ormoAoospermia1 Eyaculado normal definido por los %alores
de referencia.
OligoAoospermia1 9oncentracin esperm#tica menor a los
+.
%alores de referencia. (K ) millones de
espermatozoides por m")
2stenoAoospermia1 Mo%ilidad menor al %alor de referencia. (K
8+ ? de espermatozoides progresi%os)
7eratoAoospermia Morfolog'a menor al %alor de referencia. (K
7 ? de espermatozoides de morfolog'a
normal)
Oligoastenoterato Aoospermia1 Significa alteraciones en tres %ariables.
(Iambin se usar la combinacin de +
prefi$os).
2Aoospermia1 Busencia de espermatozoides en el
Eyaculado.
2spermia Busencia de eyaculado.
,ryptoAoospermia1 Espermatozoides ausentes en el preparado
examinado al fresco pero presentes en el
pellet.
<emospermia1 1ematospermiaM
6resencia de eritrocitos en el eyaculado.
!eucospermia1 "eucocitospermia( 6iospermiaM
6resencia de leucocitos en el eyaculado por
sobre el %alor de referencia.
3ecroAoospermia1 6orcenta$e de espermatozoides %i%os menor
al %alor de referencia.
(K . ? espermatozoides %i%os).
El su&i0o espermia se re&iere al eyaculado y Aoospermia al espermatoAoide. 6or lo
tanto( los siguientes trminos =O deben ser usados4 astenospermia( astenoteratospermia(
criptospermia( oligoastenospermia( oligoteratospermia( oligospermia( teratospermia.
!as siguientes ta"las nos resuel/en el pro"lema Jue ten.an los la"oratorios al o"tener
di&erentes /alores en las /aria"les determinadas en duplicados reales.
7a"la *1 %i&erencias acepta"les entre dos porcenta0es promedios pro/enientes de la
misma muestra$ al e/aluar 200 cBlulas en cada placa$ total *00 cBlulas.
E0emplo 11
+*
Si la %italidad en la placa ) nos da un %alor del D! ? y en la placa + un %alor de D. ?
tenemos &ue4
6romedio( D7 ? para lo cual la m#xima diferencia aceptable obser%ada en esta tabla
corresponde a )!( entonces como D.AD! es . la %italidad esperm#tica &ue informaremos es
de D. ? de lo contrario si la diferencia fuese mayor a la diferencia aceptable( se tendr# &ue
analizar un nue%o set de preparados.

6#gina + ;01O laboratory manual for the Examination and processing of human semen.
7a"la @1 Error de muestreo en porcenta0e (G) de acuerdo al nmero total de cBlulas
contadas.
E0emplo 21 El %alor m'nimo a e%aluar para todas las %ariables( ser# de +!! clulas y por
duplicado( lo &ue nos entrega un %alor total de 7!! clulas analizadas y con esto
aseguramos un error de muestra del ?.
8!
6#gina 8/ ;01O laboratory manual for the Examination and processing of human semen.
7a"la N1 %i&erencia acepta"le entre dos recuentos Jue entregan una suma
E0emplo (1 Si el recuento de clulas redondas en la placa ) nos entrega un %alor del )!! y
en la placa + un %alor de )+! tenemos &ue4
"a suma es ++! para lo cual la m#xima diferencia aceptable obser%ada en esta tabla
corresponde a +*( entonces como )+!A)!! es +!( Se acepta la suma de ++! y se proceden a
hace los c#lculos para determinar la concentracin de las clulas( determinadas seg-n
dilucin.
6#gina 7+ ;01O laboratory manual for the Examination and processing of human semen.
7a"la -1 %i&erencia acepta"le entre dos "a0os recuentos Jue entregan una suma
E0emplo *1 Hdntico al e$emplo 8 y se incluye el calculo para ba$as concentraciones.
8)
6#gina ! ;01O laboratory manual for the Examination and processing of human semen.
3ormograma4 ,e especial utilidad para extrapolar la fuerza centrifuga a las re%oluciones
por minutos (rpm) y %ice%ersa.
En este e$emplo una fuerza de rotacin centrifuga (593) de ! g para una centrifuga con
un radio de rotor de . cm. 9orresponder# a +!! rpm.
8+
6#gina +8) ;01O laboratory manual for the Examination and processing of human semen.
INFORME DE ESPERMOGRAMA
NUMERO DE BOLETA: __________ FECHA: _____________
NOMBRE DEL PACIENTE: _______________________________________________ EDAD: ______
NOMBRE DE LA PAREJA: ________________________________________________
MEDICO QUE REFIERE AL PACIENTE: ____________________________________
88
RECOLECCION DE MUESTRA
Recipiente suministr!" p"r e# #$"rt"ri": _____ %I _____ NO D&s !e A$stinenci _______ H"r !e Rec"#ecci'n:
____________________ Muestr c"#ect! en: ____ L$"rt"ri" ____ Cs
Di(icu#t!es en # "$tenci'n !e muestr: __________________Me!icment"s ) ntece!entes:
___________________________________________
H"r !e entre* # #$"rt"ri": _______ H"r !e Inici" !e# n+#isis: __________
PARAMETROS A EVALUAR RESULTADOS VALORES DE REFERENCIA SEGN OMS 2010
EXAMEN MACROSCOPICO
Licue(cci'n T"t# , - ./ minut"s 01 2C
3"#umen 4 56, mL
3isc"si!! N"rm#: 7 8 cm9 Aument!: : 8 cms
C"#"r B#nc" Op#escente " ;ris mri##ent"
pH 4 168
EXAMEN MICROSCOPICO
A*#utinci'n esperm+tic: Ne*ti<"
;r!" 5: 7 5/=9 ;r!" 8: 5/ > ,/ =9 ;r!" 0: : ,/=9 ;r!" ?:
5//=
Tip" A: c$e@Ac$e@9 Tip" B: pie@ me!iApie@ me!i9 Tip" C:
c"#Ac"#9 Tip" D: c$e@Ac$e@ ) c"#Ac"#9 Tip" E: MrB !e
*#utinci'n6
Recuent" T"t# !e espermt"@"i!es 4 0C D 5/
.
A 3"#umen T"t#
C"ncentrci'n Esperm+tic 45, D 5/
.
espermt"@"i!es A mL
3it#i!! 4 ,E = espermt"@"i!es <i<"s
M"<i#i!! t"t# FMP G MNPH 4 ?/ =
M"<i#i!! Pr"*resi< A MP 4 08 =
M"<i#i!! N" pr"*resi< A MNP
Inm'<i#es
M"r("#"*&
N"rm# 4 ? =
An"rm#
De(ect" !e c$e@
De(ect" !e cue##" ) pie@ me!i
De(ect" !e pie@ princip#
EDces" !e cit"p#sm resi!u#
PRUEBAS DIVERSAS
CI#u#s Re!"n!s N" !e$e superr e# , = re#ti<" # recuent" espemtic"6
CI#u#s per"Di!s p"siti<" J 5 D 5/
.
#euc"cit"s A mL
Test !e MAR 7 ,/ = !e espermt"@"i!es m'<i#es c"n prt&cu#s !Keri!s
Test Inmun"$e! 7 ,/ = !e espermt"@"i!es m'<i#es c"n *"ts !Keri!s
Linc 4 86? Mm"# A <"#umen t"t# !e semen
Fruct"s 4 50 Mm"# A <"#umen t"t# !e semen
;#uc"si!s Neutr 4 50 Mm"# A <"#umen t"t# !e semen
OTROS
NOTAS: Un s"#" n+#isis !e #&Nui!" semin# " un pr+metr" (uer !e #"s rn*"s !e re(erenci se*On e# Mnu# !e # OM% 8/5/P pue!e ser un e<ent"
#et"ri" ) n" in!icn su$(erti#i!!P pr est" est+ in!ic!" un se*un!" n+#isis semin# tres " m+s semns m+s tr!e6 As& mism" #"s <#"res p"r
(uer !e #"s rn*"s !e re(erenci pue!en re(#eQr !es'r!enes mI!ic"sP ur"#'*ic"s )A" su$(erti#i!!P Nue pue!en )u!r # !i*n'stic" mI!ic"6 N" se
rec"mien! Kcer un !i*n'stic" !e su$(erti#i!! " !e !is(unci"nes repr"!ucti<s en $se un n+#isis semin#P est"s resu#t!"s !e$en ser
interpret!"s en c"nQunt" c"n un Kist"ri c#&nic c"mp#et6
____________________________________________
FIRMA
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