CARRERA DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL Y AGRONEGOCIOS
LABORATORIO 1: MICROFLORA DE LA CARNE MOLIDA: CONTEO ESTANDAR DE PLACA (SPC) Y CONTEO DE ESCHERICHIA COLI
Microbiologa Agroalimentaria
Profesor: Elas Peafiel, Carlos Cesar Augusto
Integrantes:
Gil Saldarriega, HectorAlonso Gonzales Alcarraz, Frank Antoni Gamarra Castro, Roberto Jos Carlos Jara Angeles, Bruno Alejandro Torres Avalos, Luis Enrique Romero Eyzaguirre, Victor
HORARIO Jueves de 5:00 p.m. a 7:00 p.m.
FECHA DE LABORATORIO 28/08/2014
FECHA DE ENTREGA INFORME 04/08/2014
Lima - Per 2014
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INDICE
Captulo I: Introduccin...3
Captulo II: Marco Terico...4
Captulo III: Objetivo.....4
Captulo IV: Materiales y Mtodos.. .........5 4.1 Equipos y materiales.-..5 4.2 Mtodo.5 4.3. Procedimiento ..7 Captulo V: Resultados y Discusin.8 5.1 Resultados del grupo...8 5.2. Discusin........10 Captulo VI Conclusiones..........................................14 BIBLIOGRAFIA 15
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CAPITULO I: INTRODUCCION
Los recuentos de aerobios viables se basan comnmente en el nmero de colonias que se desarrollan en placas de agar nutritivo que han sido previamente inoculadas con cantidades conocidas del alimento diluido e incubadas en condiciones ambientales predeterminadas. Cada tipo de recuento de grmenes viables es potencialmente til para fines especficos, pero el recuento de bacterias aerobias mesfilas es el ms comnmente utilizado para indicar la calidad sanitaria de los alimentos. La mayora de alimentos industrializados (a excepcin de los fermentados) deben ser considerados como inadecuados para el consumo cuando tengan un gran nmero de microorganismos, aun cuando no se haya determinado que stos son patgenos y no hayan alterado de forma apreciable los caracteres organolpticos del alimento. Pueden darse las siguientes razones: recuentos altos en alimentos estables a menudo indican materias primas contaminadas o tratamientos no satisfactorios ya sea desde el punto de vista sanitario o de las condiciones de almacenamiento, algunas bacterias mesfilas no consideradas como patgenas al presentarse en nmeros muy altos pueden ser sealadas como causa d enfermedad, etc. Los alimentos contienen una determinada carga microbiana que no causa dao ni al alimento ni al humano que lo ingiere, es decir estos alimentos presentan microorganismos dentro de los lmites establecidos por una norma. En el Per la norma tcnica sanitaria actual es la NTP N 071, en la cual se establece los criterios microbiolgicos de la calidad sanitaria e inocuidad para los alimentos y bebidas de consumo humano. A nivel nacional la autoridad sanitaria responsable de vigilar el cumplimiento de la norma sanitaria es el ministerio de Salud a travs de la Direccin General de Salud Ambiental (DIGESA) y por delegacin, las Direcciones de Salud (DISAS); a nivel regional las Direcciones Regionales de Salud (DIRESA) y a nivel local las municipalidades. La norma establece para cada tipo de alimento los microorganismos que deben detectarse en los anlisis y los rangos dentro de los que deben estar los resultados (lmites), en la mayora de los casos se seala como requisito la deteccin de aerobios mesfilos pero el lmite vara segn el tipo de alimento.
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CAPITULO II: MARCO TERICO
Los coliformes totales son las Enterobacteriaceae lactosa-positivas y constituyen un grupo de bacterias que se definen ms por las pruebas usadas para su aislamiento que por criterios taxonmicos. Pertenecen a la familiaEnterobacteriaceae y se caracterizan por su capacidad para fermentar la lactosa con produccin de cido y gas, ms o menos rpidamente, en un periodo de 48 horas y con una temperatura de incubacin comprendida entre 30-37C. Son bacilos gramnegativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados. Del grupo coliforme forman parte varios gneros: Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, etc. Se encuentran en el intestino del hombre y de los animales, pero tambin en otros ambientes: agua, suelo, plantas, cscara de huevo, etc. Una elevada proporcin de los coliformes que existen EN los sistemas de distribucin no se debe a un fallo en el tratamiento en la planta, sino a un recrecimiento de las bacterias en las conducciones. Dado que es difcil distinguir entre recrecimiento de coliformes y nuevas contaminaciones, se admite que todas las apariciones de coliformes son nuevas contaminaciones, mientras no se demuestre lo contrario. Dentro del grupo de los coliformes totales existe un subgrupo que es el de los Coliformes fecales. Los coliformes fecales son coliformes totales que adems fermentan la lactosa con produccin de cido y gas en 24-48 horas a temperaturas comprendidas entre 44 y 45C en presencia de sales biliares.
CAPITULO III: OBJETIVO Adquirir destreza en el aislamiento y recuento de microorganismos aerobios mesfilos como colonias individuales a partir de muestras de la carne cruda mediante la tcnica de recuento estndar en placa.
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CAPITULO IV. MATERIALES Y MTODOS 4.1 Materiales Agar soya tripticasa (TSA). Este es un agar rico en nutrientes que fomenta el crecimiento de diferentes microorganismos. Es un medio no selectivo y no diferencial y apropiado para uso en conteo estndar en placas (CEPs). Agar Bilis rojo violeta suplementado con 4-metilumbeliferil-b-D-glucuronido (VRBA + MUG). Este medio es usado para plaquear selectivamente las bacterias coliformes. O, Agar Eosina Azul de Metileno (EMB), diferencia para E. coli y es selectivo para bacterias G(-). Si E. coli esta presente, las colonias tendrn un brillo verde metlico. El EMB contiene eosina y azul de metileno como indicadores. Cuando la lactosa fermenta, se producen cidos y se produce un cambio de color. Con la excepcin de E. coli, las colonias de color rosado son el resultado de fermentacin de lactosa. Si las bacterias no fermentan lactosa (no son coliformes), no se produce acido y las colonias se presentan bsicamente incoloras, transparentes o de color ambar como pueden ser Salmonella y Shigella. El azul de metileno acta como inhibidor de bacterias G(+). Agua peptonada estril Carne molida Incubadora Pipetas estriles
Placas Petri con TSA Frascos estriles Tubos de ensayo estriles Licuadora con vaso estriL 4.2 Mtodo Primero, lavarse las manos, desinfectar el rea de trabajo Preparacin de la muestra 1. Usar un utensilio estril para pesar 25 g de carne molida. 2. Agregar 225 ml de agua peptonada. Esta ser la dilucin inicial de 1/10 o 10 -1 . Licuar por 2 min. 6
4. Preparar diluciones seriadas (Figura 1.1). Figura 1.1. Esquema de Dilucin para EMB y SPC: para EMB diluciones en placa 10 -2
hasta 10 -4 , para SPC diluciones en placa 10 -3 hasta 10 -6 .
Use tcnicas de aislamiento de cultivos por dilucin: por incorporacin (SPC) y por dispersin con esptula (EMB).
Dilucin en placa con agar SPC 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 7
4.3 Procedimiento
Esperar unos minutos hasta que los pedazos de carne sedimenten. Lavarnos las manos y esterilizar el rea de trabajo. Agregar VRB hasta cubrir la placa y dispersar con ayuda de la esptula de Drigalsky. El agar VRB trabajar con tubos de ensayo que concentren diluciones de 10 -1 10 -2 10 -3
Pesar 25 gr de muestra (Carne Molida). Pipetear 1 ml a los 5 tubos de ensayo estriles y homogenizar en el vortex. Rotular cada placa por duplicado. Pipetear 0,1 ml de los tubos de ensayo a una placa para obtener diluciones de 10 -2 10 -3 10 -4
Agregar 225 ml de agua peptonada. Colocar sobre el vortex para homogenizar. Incubar por 24 horas a una temperatura de 32 grados. Realizar el conteo de las UFC. El agar SPC trabajar con tubos de ensayo que concentren diluciones de 10 -3 10 -4 10 -5
Pipetear 0,1 ml de los tubos de ensayo a una placa para obtener diluciones de 10 -4 10 -5 10 -6
Rotular cada placa. (En este caso no se trabaj por duplicado. Agregar el agar SPC hasta cubrir la placa. Realizar ligero movimiento para homogenizar.
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CAPITULO V. RESULTADOS Y DISCUSIN 5.1. Resultados del grupo Para SPC y EMB 1. Calculo de las colonias SPC 10^-4: 342 0.0001 = 3420000 / = 3,4210 6 / 10^-5: 32 0.00001 = 3200000 / = 3,210 6 / 10^-6: 1 0.000001 = 1000000 / = 110 6 / 2. Cuente las colonias tpicas de coliformes (de color rosado) 10^-2: 38 0.01 = 3.810 3 / 35 /0.01 = 3.510 3 /
Presuntivo Coliformes UFC/g = 3.65 x 10 3 UFC/gr (Asumiendo placas de 25 -250 UFC/PLACA) 5.2 Discusiones a) Asuma placas de 25 250 UFC/placa. Cul es el mnimo y mximo UFC/g que puede detectar con precisin con el esquema de dilucin de SPC? Y el mximo y mnimo conteo de coliformes? La respuesta a la pregunta se muestra en el siguiente cuadro: Agar TSA Agar VRB (Coliformes) MINIMO 3,42x10 6 UFC/ml 3.65x10 3 UFC/ml MAXIMO 3,42x10 6 UFC/ml 1.215x10 6 UFC/ml
Nota: En las placas para SPC Agar Soya Tripticasa solo se mostraba una de ellas entre 25 250 UFC/placa, por lo que se consider el mnimo y mximo con el mismo nmero.
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b) Si las placas para SPC se hubiesen incubado a 37C, esperara resultados diferentes? S, los resultados hubiesen sido diferentes al incrementarse el nmero de colonias presentes en cada placa. El medio utilizado para el SPC fue el agar soya tripticasa (TSA), el cual es un medio no selectivo y no diferencial; es decir que aqu se permite el crecimiento de diferentes tipos de microorganismos. En este caso se incub por 48 horas a la temperatura de 32; pero si se hubiese aumentado la temperatura a 37, la cual es la temperatura ms ptima para el desarrollo de coliformes hubiera incrementado la cantidad de microorganismos obtenidos en las placas. Es por eso que la temperatura es un factor que los manipuladores de alimentos alteran para poder controlar los microorganismos en los alimentos.
c) Por qu el conteo de coliformes de esta prueba se considera presuntivo? Que otros parmetros experimentales necesita para confirmar la presencia de coliformes? Porque una positividad en un tubo de la prueba presuntiva no indica necesariamente la presencia del grupo bacteriano a determinar (ColiformesTotales, Coliformes Fecales o Estreptococos Fecales), sino tan solo es una presuncin, que habr de confirmarse posteriormente. Sin embargo, una negatividad en la prueba presuntiva permite dictaminar la ausencia de dicho grupo bacteriano en el agua examinada. La denominada prueba presuntiva consiste en una metodologa de tipo general para cualquier grupo de bacterias, mientras que la prueba confirmativa es especfica. En el laboratorio se utiliz el medio de cultivo selectivo VRB para cuantificar los coliformes, el fundamento de este medio es que contienes sales biliares y cristal violeta que inhiben el crecimiento de bacterias G+, tambin contiene lactosa como el carbohidrato y rojo neutro como indicador de pH. Los organismos que fermentan lactosa, como los coliformes, crecen formando colonias rojas, mientras que los no fermentadores forman colonias a transparentes. Adems para confirmar la presencia de coliformes se pueden traspasar las colonias obtenidas al medio caldo bilis verde brillante; ya que este medio contiene bilis y verde brillante los cuales inhiben el crecimiento de bacterias G+ y G- con la excepcin de los coliformes. d) Microorganismos mximos permitidos por la Legislacin Peruana. Nuestra muestra de carne molida se encuentra en la seccin X.6 de la Resolucin Ministerial 591-2008: 12
Aqu podemos ver la cantidad mxima de microorganismos permitidos y la cantidad de microorganismos que solo un nmero determinado de muestras puede exceder, es decir la calidad aceptable que deben tener las muestras. En base a esta tabla, se puede decir que las muestras superan el nmero de microorganismos que deberan tener para tener una calidad aceptable: Asumiendo el conteo solo en placas de 25-250UFC/placa para lograr mayor precisin se observa: Agar TSA Agar VRB (Coliformes) MINIMO 3,42x10 6 UFC/ml 3.65 x10 3 UFC/ml MAXIMO 3,42x10 6 UFC/ml 1.215 x10 6 UFC/ml MAXIMO PERMITIDO POR LA RM. 591-2008 10 7 5 x 10 2
En el Agar TSA se obtuvo 1 resultado dentro de los lmites microbiolgicos entre 10 6 y 10 7 de un total de 1 prueba. Para rechazar al lote se debera realizar 4 pruebas ms a otras muestras de la carne molida y realizar el conteo de mesfilos nuevamente. Si de estas 5 pruebas 3 resultan dentro de este lmite se rechaza el lote Adems se obtuvo un conteo de coliformes bastante elevado, lo cual puede implicar que el nmero de E.colis obtenidos es mayor al lmite mximo (se debe recordar que es una prueba presuntiva y no confirmativa). Por todo esto se puede decir que la carne molida de la cual se extrajo la muestra no cumple con los requisitos establecidos por el Gobierno Peruano; y por lo tanto no es inocua y la gente puede contraer enfermedades graves si la consumen.
e) Posibles factores de contaminacin de la muestra de carne molida. De acuerdo a los resultados la microflora bacteriana est presente en todos los casos, esto se podra deber a muchas causas de contaminacin externa. En el caso de la carne molida, esta contiene microorganismos en la parte interna 13
debido a que, al realizar la molienda, los microorganismos que se encuentran en la parte externa de la carne se mezclan con la parte interior. Las prcticas comunes en los mataderos eliminan los ganglios linfticos de las partes comestibles. Sin embargo, la contaminacin ms importante es de origen externo y se produce durante la sangra, desuello y cuarteado, los microorganismos proceden principalmente de las partes externas del animal (piel, pezua y pelo) y del tracto intestinal. Los mtodos de sacrificio recientemente aprobados, ya sean mecnico, qumicos o elctricos, dan lugar, por s mismo, a escasa contaminacin, pero la incisin y la sangra que se efectan a continuacin puede determinar una contaminacin importante. Los cuchillos, paos, aire, manos y ropa del personal pueden actuar como intermediarios de contaminacin. Durante la manipulacin posterior de la carne puede haber nuevas contaminaciones, a partir de las carretillas de transporte, cajas u otros recipientes, as de otras carnes contaminadas, de aire y del personal. Debido a la gran variedad de fuentes de contaminacin, los tipos de microorganismos que suelen encontrarse en la carne son muchos. Mohos de diferentes gneros, llegan a la superficie de la carne y se desarrollan sobre ella. Son especialmente interesante las especies de los gneros Cladosporium, Sporotrichum, Geotrichum, Thamnidium, Mucor, Penicillium, Alternaria y Monilia. A menudo se encuentran levaduras, especialmente no esporuladas. Entre las muchas bacterias que pueden hallarse, las ms importantes son las de gnero Pseudomonas, Alcaligenes, Micrococcus, Sttreptococcus, Sarcina, Leuconostoc, Lactobacillus, Proteus, Flavobacterium, Bacillus, Clostridium, Escherichia, Salmonellas y Streptomyces. Muchas de estas bacterias crecen a temperatura de refrigeracin. Tambin es posible la contaminacin de la carne y de sus productos por grmenes patgenos del hombre, especialmente de origen entrico. f) Prevencin de la contaminacin de la carne. La prevencin y control requieren un enfoque interdisciplinario en la produccin animal, as como enfoques basados en riesgos a lo largo de toda la cadena de abastecimiento de alimentos. stos incluyen la aplicacin de Buenas Prcticas de Fabricacin (BPF), Buenas Prcticas de Higiene (BPH) y Anlisis de Peligros y de Puntos Crticos de Control (APPCC), desde la granja hasta llegar al consumidor. 14
Segn la FAO, las estrategias que reducen el contagio entre animales vivos ofrecen mtodos para reducir las poblaciones de agentes patgenos en animales destinados a la alimentacin antes de que ingresen a la cadena alimentaria. Por ejemplo, se ha demostrado que cambiar drsticamente la alimentacin del ganado de una racin alta en granos a una dieta basada en heno de alta calidad reduce la E. coli genrica y las poblaciones de E. coli (O157:H7). En la elaboracin de la carne molida, para garantizar que las personas que tengan contacto directo o indirecto con los alimentos no se contaminen con la E. coli patgena, los manipuladores de alimentos deben ceirse al Cdigo Internacional Recomendado de Practicas - Principios Generales de Higiene de los Alimentos del Codex Alimentarius. CAPITULO VI: CONCLUSIONES En la prctica de laboratorio realizado se obtuvo un minimo de 3.42x10 6 UFC/gr de carne molida en el Agar TSA y un minimo de 3.65x103 UFC/gr y un mximo de 1.215x106 UFC/gr de carne molida en el Agar VRB para Coliformes. En el Agar TSA se obtuvo 1 resultado dentro de los lmites microbiolgicos entre 10 6 y 10 7 de un total de 1 prueba. Para rechazar al lote se debera realizar 4 pruebas ms a otras muestras de la carne molida y realizar el conteo de mesfilos nuevamente. Si de estas 5 pruebas 3 resultan dentro de este lmite se rechazara el lote. Se obtuvo un conteo de coliformes bastante elevado, lo cual puede implicar que el nmero de E.colis obtenidos es mayor al lmite mximo .Por lo tanto se puede concluir que la carne molida de la cual se extrajo la muestra no cumple con los requisitos establecidos por el Gobierno Peruano; y por lo tanto no es inocua y la gente puede contraer enfermedades graves si la consumen. Los posibles fuentes de contaminacin de la carne molida utilizada en el laboratorio puede ser: la maquina moledora, mala prctica de higiene en la cadena productiva, mal almacenamiento de la carne antes y despus de la molienda. La prevencin y control requieren un enfoque interdisciplinario en la produccin animal, as como enfoques basados en riesgos a lo largo de toda la cadena de abastecimiento de alimentos que incluyen Buenas Prcticas de Fabricacin 15
(BPF), Buenas Prcticas de Higiene (BPH) y Anlisis de Peligros y de Puntos Crticos de Control (APPCC), desde la granja hasta llegar al consumidor BIBLIOGRAFIA Bioconservacin de carne molida de res y cerdo, disponible en la web: http://www.ingquimica.uady.mx/revista/pdf/Revista47.pdf Sistema de control del carne molida, disponible en la web: http://www.slideshare.net/BorhaCM/sistemas-de-control-de-microorganismos- en-carne NSO RTCA 67.04.50:08. Reglamento Tecnico Centroamericano. Alimentos. Criterios Microbiologicos para la inocuidad de alimentos. Prevencion de E.coli en Alimentos., disponible en http://www.fao.org/fileadmin/user_upload/agns/pdf/Preventing_Ecoli_es.pdf RM N 591-2008 "Norma Sanitaria que Establece los Criterios de Calidad Sanitaria", disponible en la web: http://www.lablouispasteur.com/index.php/alimentos/resolucion-ministerial-n- 591-2008