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UNIVERSIDAD SAN IGNACIO DE LOYOLA

FACULTAD DE INGENIERA Y ARQUITECTURA


CARRERA DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL Y AGRONEGOCIOS


LABORATORIO 1: MICROFLORA DE LA CARNE MOLIDA:
CONTEO ESTANDAR DE PLACA (SPC) Y CONTEO DE
ESCHERICHIA COLI

Microbiologa Agroalimentaria

Profesor: Elas Peafiel, Carlos Cesar Augusto

Integrantes:

Gil Saldarriega, HectorAlonso
Gonzales Alcarraz, Frank Antoni
Gamarra Castro, Roberto Jos Carlos
Jara Angeles, Bruno Alejandro
Torres Avalos, Luis Enrique
Romero Eyzaguirre, Victor

HORARIO
Jueves de 5:00 p.m. a 7:00 p.m.

FECHA DE LABORATORIO
28/08/2014

FECHA DE ENTREGA INFORME
04/08/2014


Lima - Per
2014

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INDICE

Captulo I: Introduccin...3

Captulo II: Marco Terico...4

Captulo III: Objetivo.....4

Captulo IV: Materiales y Mtodos.. .........5
4.1 Equipos y materiales.-..5
4.2 Mtodo.5
4.3. Procedimiento ..7
Captulo V: Resultados y Discusin.8
5.1 Resultados del grupo...8
5.2. Discusin........10
Captulo VI Conclusiones..........................................14
BIBLIOGRAFIA 15

3

CAPITULO I: INTRODUCCION

Los recuentos de aerobios viables se basan comnmente en el nmero de colonias que se
desarrollan en placas de agar nutritivo que han sido previamente inoculadas con cantidades
conocidas del alimento diluido e incubadas en condiciones ambientales predeterminadas.
Cada tipo de recuento de grmenes viables es potencialmente til para fines especficos,
pero el recuento de bacterias aerobias mesfilas es el ms comnmente utilizado para
indicar la calidad sanitaria de los alimentos. La mayora de alimentos industrializados (a
excepcin de los fermentados) deben ser considerados como inadecuados para el consumo
cuando tengan un gran nmero de microorganismos, aun cuando no se haya determinado
que stos son patgenos y no hayan alterado de forma apreciable los caracteres
organolpticos del alimento. Pueden darse las siguientes razones: recuentos altos en
alimentos estables a menudo indican materias primas contaminadas o tratamientos no
satisfactorios ya sea desde el punto de vista sanitario o de las condiciones de
almacenamiento, algunas bacterias mesfilas no consideradas como patgenas al
presentarse en nmeros muy altos pueden ser sealadas como causa d enfermedad, etc.
Los alimentos contienen una determinada carga microbiana que no causa dao ni al
alimento ni al humano que lo ingiere, es decir estos alimentos presentan microorganismos
dentro de los lmites establecidos por una norma. En el Per la norma tcnica sanitaria
actual es la NTP N 071, en la cual se establece los criterios microbiolgicos de la calidad
sanitaria e inocuidad para los alimentos y bebidas de consumo humano. A nivel nacional la
autoridad sanitaria responsable de vigilar el cumplimiento de la norma sanitaria es el
ministerio de Salud a travs de la Direccin General de Salud Ambiental (DIGESA) y por
delegacin, las Direcciones de Salud (DISAS); a nivel regional las Direcciones Regionales
de Salud (DIRESA) y a nivel local las municipalidades. La norma establece para cada tipo
de alimento los microorganismos que deben detectarse en los anlisis y los rangos dentro
de los que deben estar los resultados (lmites), en la mayora de los casos se seala como
requisito la deteccin de aerobios mesfilos pero el lmite vara segn el tipo de alimento.








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CAPITULO II: MARCO TERICO

Los coliformes totales son las Enterobacteriaceae lactosa-positivas y constituyen un grupo
de bacterias que se definen ms por las pruebas usadas para su aislamiento que por
criterios taxonmicos. Pertenecen a la familiaEnterobacteriaceae y se caracterizan por su
capacidad para fermentar la lactosa con produccin de cido y gas, ms o menos
rpidamente, en un periodo de 48 horas y con una temperatura de incubacin comprendida
entre 30-37C.
Son bacilos gramnegativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados. Del grupo
coliforme forman parte varios gneros: Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter,
etc. Se encuentran en el intestino del hombre y de los animales, pero tambin en otros
ambientes: agua, suelo, plantas, cscara de huevo, etc.
Una elevada proporcin de los coliformes que existen EN los sistemas de distribucin no
se debe a un fallo en el tratamiento en la planta, sino a un recrecimiento de las bacterias en
las conducciones. Dado que es difcil distinguir entre recrecimiento de coliformes y nuevas
contaminaciones, se admite que todas las apariciones de coliformes son nuevas
contaminaciones, mientras no se demuestre lo contrario.
Dentro del grupo de los coliformes totales existe un subgrupo que es el de los Coliformes
fecales. Los coliformes fecales son coliformes totales que adems fermentan la lactosa con
produccin de cido y gas en 24-48 horas a temperaturas comprendidas entre 44 y 45C
en presencia de sales biliares.

CAPITULO III: OBJETIVO
Adquirir destreza en el aislamiento y recuento de microorganismos aerobios mesfilos como
colonias individuales a partir de muestras de la carne cruda mediante la tcnica de recuento
estndar en placa.




5

CAPITULO IV. MATERIALES Y MTODOS
4.1 Materiales
Agar soya tripticasa (TSA). Este es un agar rico en nutrientes que fomenta el
crecimiento de diferentes microorganismos. Es un medio no selectivo y no
diferencial y apropiado para uso en conteo estndar en placas (CEPs).
Agar Bilis rojo violeta suplementado con 4-metilumbeliferil-b-D-glucuronido (VRBA
+ MUG). Este medio es usado para plaquear selectivamente las bacterias
coliformes. O,
Agar Eosina Azul de Metileno (EMB), diferencia para E. coli y es selectivo para
bacterias G(-). Si E. coli esta presente, las colonias tendrn un brillo verde metlico.
El EMB contiene eosina y azul de metileno como indicadores. Cuando la lactosa
fermenta, se producen cidos y se produce un cambio de color. Con la excepcin
de E. coli, las colonias de color rosado son el resultado de fermentacin de lactosa.
Si las bacterias no fermentan lactosa (no son coliformes), no se produce acido y las
colonias se presentan bsicamente incoloras, transparentes o de color ambar
como pueden ser Salmonella y Shigella. El azul de metileno acta como inhibidor
de bacterias G(+).
Agua peptonada estril
Carne molida
Incubadora
Pipetas estriles

Placas Petri con TSA
Frascos estriles
Tubos de ensayo estriles
Licuadora con vaso estriL
4.2 Mtodo
Primero, lavarse las manos, desinfectar el rea de trabajo
Preparacin de la muestra
1. Usar un utensilio estril para pesar 25 g de carne molida.
2. Agregar 225 ml de agua peptonada. Esta ser la dilucin inicial de 1/10 o 10
-1
. Licuar
por 2 min.
6

4. Preparar diluciones seriadas (Figura 1.1).
Figura 1.1. Esquema de Dilucin para EMB y SPC: para EMB diluciones en placa 10
-2

hasta 10
-4
, para SPC diluciones en placa 10
-3
hasta 10
-6
.

Use tcnicas de aislamiento de cultivos por dilucin: por incorporacin (SPC) y por
dispersin con esptula (EMB).

1 Tecnica de Dispercin con esptula

Vol (ml)
Dilucin
Dilucin
en placa
con agar
VRB

10
-2
10
-3
10
-4
9
10
-2
9
10
-4
9
10
-5
9
10
-3
225
10
-1
0.1 ml

0.1 ml

0.1 ml

25 g

1 ml

1 ml

1 ml

10
-4
10
-5
10
-6

Dilucin
en placa
con agar
SPC
0.1 ml
0.1 ml 0.1 ml
7

4.3 Procedimiento



Esperar unos
minutos hasta
que los pedazos
de carne
sedimenten.
Lavarnos las
manos y
esterilizar el
rea de trabajo.
Agregar VRB hasta
cubrir la placa y
dispersar con ayuda
de la esptula de
Drigalsky.
El agar VRB trabajar
con tubos de ensayo
que concentren
diluciones de 10
-1
10
-2
10
-3

Pesar 25 gr de
muestra (Carne
Molida).
Pipetear 1 ml a
los 5 tubos de
ensayo estriles
y homogenizar
en el vortex.
Rotular cada
placa por
duplicado.
Pipetear 0,1 ml de
los tubos de ensayo
a una placa para
obtener diluciones
de 10
-2
10
-3
10
-4

Agregar 225 ml
de agua
peptonada.
Colocar sobre el
vortex para
homogenizar.
Incubar por
24 horas a
una
temperatura
de 32 grados.
Realizar el
conteo de las
UFC.
El agar SPC trabajar
con tubos de ensayo
que concentren
diluciones de 10
-3
10
-4
10
-5


Pipetear 0,1 ml de los
tubos de ensayo a una
placa para obtener
diluciones de 10
-4
10
-5
10
-6


Rotular cada placa.
(En este caso no se
trabaj por
duplicado.
Agregar el agar SPC
hasta cubrir la placa.
Realizar ligero
movimiento para
homogenizar.

8

CAPITULO V. RESULTADOS Y DISCUSIN
5.1. Resultados del grupo
Para SPC y EMB
1. Calculo de las colonias SPC
10^-4:
342
0.0001
= 3420000 / = 3,4210
6
/
10^-5:
32
0.00001
= 3200000 / = 3,210
6
/
10^-6:
1
0.000001
= 1000000 / = 110
6
/
2. Cuente las colonias tpicas de coliformes (de color rosado)
10^-2:
38
0.01
= 3.810
3
/
35 /0.01 = 3.510
3
/

Placa de dilucion 10
-2
a las 24 horas.
9

10^-3:
21 /0.001 = 2.110
4
/
23 /0.001 = 2.310
4
/

Placa de dilucion 10
-3
a las 24 horas.
10^-4:
108 /0.0001 = 1.0810
6
/
135 /0.0001 = 1.3510
6
/

Placa de dilucion 10
-4
a las 24 horas.


10

Cuadros de respuestas

Conteo Estndar en Placa (SPC)
Dilucin en placa UFC/placa
10
-4
3.42x10
6
10
-5
1.2x10
6
10
-6
1x10
6

SPC UFC/g = 3.42 x 10
6
(Asumiendo placas de 25 -250 UFC/PLACA)
Conteo Presuntivo de Coliformes

Dilucin en placa UFC/placa UFC/placa Promedio
10
-2
3.8x10
3
3.5x10
3
3.65x10
3
10
-3
2.1x10
4
2.7x10
4
2.4x10
4
10
-4
1.08x10
6
1.35x10
6
1.215x10
6


Presuntivo Coliformes UFC/g = 3.65 x 10
3
UFC/gr (Asumiendo placas de 25 -250
UFC/PLACA)
5.2 Discusiones
a) Asuma placas de 25 250 UFC/placa. Cul es el mnimo y mximo UFC/g que
puede detectar con precisin con el esquema de dilucin de SPC? Y el mximo y
mnimo conteo de coliformes?
La respuesta a la pregunta se muestra en el siguiente cuadro:
Agar TSA Agar VRB (Coliformes)
MINIMO 3,42x10
6
UFC/ml 3.65x10
3
UFC/ml
MAXIMO 3,42x10
6
UFC/ml 1.215x10
6
UFC/ml

Nota: En las placas para SPC Agar Soya Tripticasa solo se mostraba una de ellas entre
25 250 UFC/placa, por lo que se consider el mnimo y mximo con el mismo nmero.


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b) Si las placas para SPC se hubiesen incubado a 37C, esperara resultados
diferentes?
S, los resultados hubiesen sido diferentes al incrementarse el nmero de colonias
presentes en cada placa. El medio utilizado para el SPC fue el agar soya tripticasa
(TSA), el cual es un medio no selectivo y no diferencial; es decir que aqu se permite el
crecimiento de diferentes tipos de microorganismos. En este caso se incub por 48
horas a la temperatura de 32; pero si se hubiese aumentado la temperatura a 37, la
cual es la temperatura ms ptima para el desarrollo de coliformes hubiera
incrementado la cantidad de microorganismos obtenidos en las placas. Es por eso que
la temperatura es un factor que los manipuladores de alimentos alteran para poder
controlar los microorganismos en los alimentos.

c) Por qu el conteo de coliformes de esta prueba se considera presuntivo? Que
otros parmetros experimentales necesita para confirmar la presencia de
coliformes?
Porque una positividad en un tubo de la prueba presuntiva no indica necesariamente la
presencia del grupo bacteriano a determinar (ColiformesTotales, Coliformes Fecales o
Estreptococos Fecales), sino tan solo es una presuncin, que habr de confirmarse
posteriormente. Sin embargo, una negatividad en la prueba presuntiva permite
dictaminar la ausencia de dicho grupo bacteriano en el agua examinada.
La denominada prueba presuntiva consiste en una metodologa de tipo general para
cualquier grupo de bacterias, mientras que la prueba confirmativa es especfica.
En el laboratorio se utiliz el medio de cultivo selectivo VRB para cuantificar los
coliformes, el fundamento de este medio es que contienes sales biliares y cristal violeta
que inhiben el crecimiento de bacterias G+, tambin contiene lactosa como el
carbohidrato y rojo neutro como indicador de pH. Los organismos que fermentan
lactosa, como los coliformes, crecen formando colonias rojas, mientras que los no
fermentadores forman colonias a transparentes. Adems para confirmar la presencia de
coliformes se pueden traspasar las colonias obtenidas al medio caldo bilis verde
brillante; ya que este medio contiene bilis y verde brillante los cuales inhiben el
crecimiento de bacterias G+ y G- con la excepcin de los coliformes.
d) Microorganismos mximos permitidos por la Legislacin Peruana.
Nuestra muestra de carne molida se encuentra en la seccin X.6 de la Resolucin
Ministerial 591-2008:
12

Aqu podemos ver la cantidad mxima de microorganismos permitidos y la cantidad de
microorganismos que solo un nmero determinado de muestras puede exceder, es
decir la calidad aceptable que deben tener las muestras. En base a esta tabla, se puede
decir que las muestras superan el nmero de microorganismos que deberan tener para
tener una calidad aceptable: Asumiendo el conteo solo en placas de 25-250UFC/placa
para lograr mayor precisin se observa:
Agar TSA Agar VRB (Coliformes)
MINIMO 3,42x10
6
UFC/ml 3.65 x10
3
UFC/ml
MAXIMO 3,42x10
6
UFC/ml 1.215 x10
6
UFC/ml
MAXIMO PERMITIDO
POR LA RM. 591-2008
10
7
5 x 10
2

En el Agar TSA se obtuvo 1 resultado dentro de los lmites microbiolgicos entre 10
6
y
10
7
de un total de 1 prueba. Para rechazar al lote se debera realizar 4 pruebas ms a
otras muestras de la carne molida y realizar el conteo de mesfilos nuevamente. Si de
estas 5 pruebas 3 resultan dentro de este lmite se rechaza el lote
Adems se obtuvo un conteo de coliformes bastante elevado, lo cual puede implicar
que el nmero de E.colis obtenidos es mayor al lmite mximo (se debe recordar que es
una prueba presuntiva y no confirmativa). Por todo esto se puede decir que la carne
molida de la cual se extrajo la muestra no cumple con los requisitos establecidos por el
Gobierno Peruano; y por lo tanto no es inocua y la gente puede contraer enfermedades
graves si la consumen.

e) Posibles factores de contaminacin de la muestra de carne molida.
De acuerdo a los resultados la microflora bacteriana est presente en todos los
casos, esto se podra deber a muchas causas de contaminacin externa.
En el caso de la carne molida, esta contiene microorganismos en la parte interna
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debido a que, al realizar la molienda, los microorganismos que se encuentran en la
parte externa de la carne se mezclan con la parte interior.
Las prcticas comunes en los mataderos eliminan los ganglios linfticos de las
partes comestibles. Sin embargo, la contaminacin ms importante es de origen
externo y se produce durante la sangra, desuello y cuarteado, los microorganismos
proceden principalmente de las partes externas del animal (piel, pezua y pelo) y
del tracto intestinal.
Los mtodos de sacrificio recientemente aprobados, ya sean mecnico, qumicos o
elctricos, dan lugar, por s mismo, a escasa contaminacin, pero la incisin y la
sangra que se efectan a continuacin puede determinar una contaminacin
importante.
Los cuchillos, paos, aire, manos y ropa del personal pueden actuar como
intermediarios de contaminacin. Durante la manipulacin posterior de la carne
puede haber nuevas contaminaciones, a partir de las carretillas de transporte, cajas
u otros recipientes, as de otras carnes contaminadas, de aire y del personal.
Debido a la gran variedad de fuentes de contaminacin, los tipos de
microorganismos que suelen encontrarse en la carne son muchos. Mohos de
diferentes gneros, llegan a la superficie de la carne y se desarrollan sobre ella. Son
especialmente interesante las especies de los gneros Cladosporium,
Sporotrichum, Geotrichum, Thamnidium, Mucor, Penicillium, Alternaria y Monilia. A
menudo se encuentran levaduras, especialmente no esporuladas. Entre las muchas
bacterias que pueden hallarse, las ms importantes son las de gnero
Pseudomonas, Alcaligenes, Micrococcus, Sttreptococcus, Sarcina, Leuconostoc,
Lactobacillus, Proteus, Flavobacterium, Bacillus, Clostridium, Escherichia,
Salmonellas y Streptomyces. Muchas de estas bacterias crecen a temperatura de
refrigeracin. Tambin es posible la contaminacin de la carne y de sus productos
por grmenes patgenos del hombre, especialmente de origen entrico.
f) Prevencin de la contaminacin de la carne.
La prevencin y control requieren un enfoque interdisciplinario en la produccin animal,
as como enfoques basados en riesgos a lo largo de toda la cadena de abastecimiento
de alimentos.
stos incluyen la aplicacin de Buenas Prcticas de Fabricacin (BPF), Buenas
Prcticas de Higiene (BPH) y Anlisis de Peligros y de Puntos Crticos de Control
(APPCC), desde la granja hasta llegar al consumidor.
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Segn la FAO, las estrategias que reducen el contagio entre animales vivos ofrecen
mtodos para reducir las poblaciones de agentes patgenos en animales destinados a
la alimentacin antes de que ingresen a la cadena alimentaria. Por ejemplo, se ha
demostrado que cambiar drsticamente la alimentacin del ganado de una racin alta
en granos a una dieta basada en heno de alta calidad reduce la E. coli genrica y las
poblaciones de E. coli (O157:H7).
En la elaboracin de la carne molida, para garantizar que las personas que tengan
contacto directo o indirecto con los alimentos no se contaminen con la E. coli patgena,
los manipuladores de alimentos deben ceirse al Cdigo Internacional Recomendado
de Practicas - Principios Generales de Higiene de los Alimentos del Codex Alimentarius.
CAPITULO VI: CONCLUSIONES
En la prctica de laboratorio realizado se obtuvo un minimo de 3.42x10
6
UFC/gr
de carne molida en el Agar TSA y un minimo de 3.65x103 UFC/gr y un mximo
de 1.215x106 UFC/gr de carne molida en el Agar VRB para Coliformes.
En el Agar TSA se obtuvo 1 resultado dentro de los lmites microbiolgicos entre
10
6
y 10
7
de un total de 1 prueba. Para rechazar al lote se debera realizar 4
pruebas ms a otras muestras de la carne molida y realizar el conteo de
mesfilos nuevamente. Si de estas 5 pruebas 3 resultan dentro de este lmite se
rechazara el lote.
Se obtuvo un conteo de coliformes bastante elevado, lo cual puede implicar
que el nmero de E.colis obtenidos es mayor al lmite mximo .Por lo tanto se
puede concluir que la carne molida de la cual se extrajo la muestra no cumple
con los requisitos establecidos por el Gobierno Peruano; y por lo tanto no es
inocua y la gente puede contraer enfermedades graves si la consumen.
Los posibles fuentes de contaminacin de la carne molida utilizada en el
laboratorio puede ser: la maquina moledora, mala prctica de higiene en la
cadena productiva, mal almacenamiento de la carne antes y despus de la
molienda.
La prevencin y control requieren un enfoque interdisciplinario en la produccin
animal, as como enfoques basados en riesgos a lo largo de toda la cadena de
abastecimiento de alimentos que incluyen Buenas Prcticas de Fabricacin
15

(BPF), Buenas Prcticas de Higiene (BPH) y Anlisis de Peligros y de Puntos
Crticos de Control (APPCC), desde la granja hasta llegar al consumidor
BIBLIOGRAFIA
Bioconservacin de carne molida de res y cerdo, disponible en la web:
http://www.ingquimica.uady.mx/revista/pdf/Revista47.pdf
Sistema de control del carne molida, disponible en la web:
http://www.slideshare.net/BorhaCM/sistemas-de-control-de-microorganismos-
en-carne
NSO RTCA 67.04.50:08. Reglamento Tecnico Centroamericano. Alimentos.
Criterios Microbiologicos para la inocuidad de alimentos.
Prevencion de E.coli en Alimentos., disponible en
http://www.fao.org/fileadmin/user_upload/agns/pdf/Preventing_Ecoli_es.pdf
RM N 591-2008 "Norma Sanitaria que Establece los Criterios de Calidad
Sanitaria", disponible en la web:
http://www.lablouispasteur.com/index.php/alimentos/resolucion-ministerial-n-
591-2008

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