AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS A PARTIR DE SUELOS

CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS

Francisco DE LA GARZA, Yessica ORTIZ, Blanca CASTRO, Patricio RIVERA,
Lorenzo HEYER

Unidad Academica Multidisciplinaria Agronomia y Ciencias, Laboratorio Ambienta
Universidad Autonoma de Tamaulipas Cd. Victoria Tamaulipas, Mexico, Codigo
Postal 87149. Correo electrnico: yortizca@uat.edu.mx

Palabras clave: bioremediacin, disel, levadura, cuenca de Burgos

RESUMEN

En la Cuenca de Burgos la cual abarca al norte de Tamaulipas, se est extrayendo
gas natural, resultando alrededor de 144,000 toneladas por ao de lodos
impregnados con disel y otros hidrocarburos. Estos materiales reciben un tratamiento
fsico siendo insuficiente ya que deja residuos de entre el 2 y 3 % de hidrocarburos.

Una alternativa viable para resolver este problema, puede ser la biorremediacin.
Este trabajo pretendi aislar microorganismos capaces de utilizar suelos
contaminados con hidrocarburos especficamente del municipio de Reynosa. Este
ensayo se llevo a cabo bajo condiciones de laboratorio; se muestreo segn la NOM-
138-SEMARNAT/SS-2003. La composicin del medio de cultivo utilizado fue:
(NH
4
)
2
SO
4
7.0 g
,
KH
2
PO
4
5.7g, K
2
HPO
4
2.3g, MgSO
4
.7H
2
O 2.2g con y sin levadura,
usndose como caldo y medio slido; el aislamiento de los microorganismos fue: a)
siembra en caldo con levadura, incubacin a 37
o
C durante 48 horas a 200 rpm b)
resiembra en caldo sin levadura, incubacin a 37
o
C durante 48 horas a 200rpm c)
siembra en medio slido, incubacin a 37
o
C por 48 horas. Del crecimiento de cada
siembra se hicieron frotis para determinar la composicin microbiana presente. En
las dos primeras siembras se detect la presencia de levaduras y bacterias Gram
negativas. En el medio slido se desarrollaron colonias color beige, de dimetro de
7.5 mm a 1 mm, solo en los medios con hidrocarburos, en los medios sin
hidrocarburos no se observo ningn crecimiento microbiano. En el suelo analizado
existen microorganismos capaces de utilizar hidrocarburos como fuente de carbono.

INTRODUCCIN

La Cuenca de Burgos es una zona de explotacin de gas natural en el noreste de
Mxico, en la cual la perforacin de pozos genera alrededor de 144,000 toneladas
por ao de residuos o lodos impregnados con diesel y otros hidrocarburos a los
cuales hay que darles una salida medioambiental. Se sabe que la disposicin no
controlada de estos materiales puede crear problemas tales como la contaminacin
de aguas subterrneas y contaminacin atmosfrica (Clark, 1995).

1
La agencia de proteccin ambiental europea, sensibilizada cada vez ms por la
problemtica que stos pueden llegar a ocasionar, incluy 16 hidrocarburos en la
lista de contaminantes prioritarios (Ferrari, 1996). En la zona, estos materiales son
sometidos a tratamiento fsico para reducir la concentracin de tales sustancias
(REECOTEC, 2004) para confinarlos posteriormente en un relleno sanitario, sin
embargo dicho tratamiento deja residuos de entre el 2 y el 3 % de hidrocarburos.


Entre las tcnicas de recuperacin de los suelos contaminados con hidrocarburos se
pueden citar: a la extraccin de hidrocarburos por vaco, incineracin, y la
recuperacin electrocintica (Clark, 1995). Debido al elevado costo de las tcnicas
mencionadas, se buscan alternativas viables para la eliminacin de los hidrocarburos
contenidos en estos suelos. Se pretende que estas alternativas sean ambientalmente
correctas, simples y econmicas. Se tienen as tcnicas de tratamiento que se
aplican a deshechos peligrosos o materiales contaminados, y que persiguen alterar
su estado en forma permanente por medios qumicos, biolgicos o fsicos. Una
alternativa viable para resolver este tipo de problemas, puede ser la biorremediacin
(Atlas y Pramer 1990) en la cual se utilizan una variedad de organismos vivos,
principalmente microorganismos como las bacterias y levaduras, para degradar,
transformar o remover compuestos orgnicos txicos a productos metablicos
inocuos o menos txicos (Grady, 1985; Thomas y Ward, 1989; Van Deuren et al.,
1997). En el caso de los microorganismos estos eliminan el contaminante por
biodegradacin proceso mediante el cual los microbios son capaces de aceptar como
sustrato sustancias orgnicas y transformarlas en compuestos menos txicos o
inocuos o, mejor an, eliminarlos de forma total produciendo CO
2
, agua y biomasa
microbiana. Los hidrocarburos en el medio ambiente son degradados principalmente
por bacterias y hongos. Ambos son relativamente abundantes en el suelo (Bossert y
Bartha., 1984), aunque las bacterias asumen un rol predominante en medios
marinos, mientras que los hongos lo hacen en ecosistemas terrestres. Las bacterias
con capacidad degradadora de hidrocarburos en ambos medios, acutico y terrestre,
son: Achromobacter, Acinetobacter, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus,
Flavobacterium, Nocardia, Pseudomonas spp y Coryneforms. Entre los hongos
encontramos Aureobasidium, Candida, Rhodotorula, y Sporobolomyces spp, como
los ms comunes en medio acutico, y Trichoderma y Mortierella spp. en suelos.

El conocimiento de los diversos aspectos de la ecologa microbiana y su relacin con
la fisiologa es esencial para estudiar el potencial que presentan los microorganismos
para degradar petrleo en ambientes acuticos y terrestres (Soto et al., 1996). La
presencia de microorganismos a la hora de disear un proceso de biorremediacin
es esencial, ya que son los responsables de eliminar el contaminante. Por otro lado,
los suelos contaminados con hidrocarburos requieren de una concentracin mnima
de microorganismos degradadores especficos as como de microorganismos
hetertrofos no especficos (Ercoli et al., 2000). Si esta masa crtica no es suficiente
se pueden incorporar microorganismos al suelo mediante inoculacin, a travs del
proceso conocido como "bioaumentacin".

2
Se sabe que microorganismos individuales slo son capaces de metabolizar un
rango limitado de hidrocarburos (Briton, 1984), hacindose necesario usar una
mezcla de poblaciones que posean una amplia capacidad enzimtica a fin de poder
degradar grupos complejos de hidrocarburos en suelo (Bosscrt y Bartha, 1984).
El Objetivo de este trabajo fue el de detectar la presencia de microorganismos
capaces de utilizar hidrocarburos como fuente de carbono en suelos contaminados
provenientes de la cuenca de Burgos, los cuales puedan ser utilizados para
degradar, mediante la inoculacin, a estos compuestos derivados del petrleo.

MATERIALES Y MTODOS

Este trabajo de investigacin se llev a cabo en el Laboratorio Ambiental de la
Unidad Acadmica Multidisciplinara Agronoma y Ciencias de la Universidad
Autnoma de Tamaulipas.

El suelo utilizado en este ensayo fue colectado en la cuenca de Burgos,
particularmente en la zona de perforacin ubicada en el municipio de Reynosa
Tamaulipas, en un sitio contaminado y otro sitio sin contaminar en la misma zona
como lo marca la NOM-138-SEMARNAT/SS-2003.

Una vez en el laboratorio se procedi a su anlisis, utilizando el mtodo para el
aislamiento de microorganismos degradadores de petrleo del Manual de Ecologa
Microbiana del Instituto Politcnico Nacional (Flix et. al., 1996)

Los medios de cultivo usados para el aislamiento de microorganismos que estuvieran
presentes en los suelos contaminados, y que tuvieran la capacidad de utilizar a los
hidrocarburos como fuente de carbono, fueron dos principalmente: un medio basal
para degradadores de hidrocarburo con o sin extracto de levadura al 0.4% (Tabla I).

Compuesto Cantidad
(NH
4
)
2
SO
4
7.0 g
KH
2
PO
4
5.7 g
K
2
HPO
4
2.3 g
MgSO
4
.7H
2
O 2.2 g
Agua destilada 1000 ml
Tabla I. Medio de cultivo usado para el aislamiento de lo microorganismos presentes
en los suelos contaminados con hidrocarburos.

El caldo con y sin levadura, disuelto en agua destilada fue distribuido en matraces de
250ml colocndose 100ml por matraz para ser esterilizado en autoclave a 15 libras
de presin durante 15 minutos.

Se prepar una serie de 6 matraces conteniendo el medio basal ms levadura a dos
de ellos se les aadi, a cada uno, 1ml de aceite para lubricacin de motor y a otros
dos 1ml de diesel, dndoles los siguientes tratamientos (Tabla II):
3
Tabla II. Diferentes tratamientos usados
: Tratamientos Suelo
1 Medio Basal +Levadura Intacto
2 Medio Basal +Levadura Contaminado
3 Medio Basal +Levadura +Aceite Intacto
4 Medio Basal +Levadura + Diesel Intacto
5 Medio Basal +Levadura +Aceite Contaminado
6 Medio Basal +Levadura + Diesel Contaminado

Como se menciono anteriormente los suelos utilizados en este ensayo provenan del
municipio de Reynosa, Tamaulipas. Para la inoculacin de los matraces conteniendo
el medio basal ms levadura y los diferentes tratamientos se le agreg un gramo de
suelo, incubndose a temperatura ambiente en agitacin a 200 rpm durante 48
horas (Fig. 1).



Figura1. Matraces conteniendo el medio basal ms levadura y los diferentes
tratamientos, en agitacin a 200 rpm.

Una vez que hubo crecimiento microbiano en los matraces, notado por la turbidez del
caldo y corroborado a travs de frotis que mostraban la presencia de
microorganismos, se transfiri 1ml de este cultivo a 100 ml de medio basal sin
levadura esterilizado (Fig. 2) colocndose en incubacin en la mesa de agitacin a
200 rpm durante 48 horas. Tres matraces contenan solo el medio basal, otros 3 se
les aadi 1ml de aceite y a otra serie de 3 1 ml de diesel.


Figura 2. Transferencia del cultivo microbiano inicial.
4

Transcurrido el tiempo de incubacin se observ crecimiento microbiano en los
matraces que contenan, adems del medio basal, aceite o diesel. Se prepararon
cajas petri con este medio basal solidificado con agar. Como el objetivo en esta
etapa del ensayo era observar el crecimiento de microorganismos que utilicen a los
hidrocarburos o sus derivados como fuente de carbono, se incorpor separadamente
al medio de cultivo tanto aceite como diesel en una concentracin del 1%. Se sembr
por estra a partir de los cultivos microbianos obtenidos en la etapa anterior, se
incub a 37
o
C durante 48 horas.

RESULTADOS Y DISCUSIN

En los matraces que contenan el medio basal ms levadura mas aceite o diesel e
inoculados con suelo contaminado se present, a las 48 horas, turbidez que
manifestaba crecimiento microbiano. En los frotis realizados a este cultivo se observ
la presencia de un gran nmero de levaduras y de bacterias Gram negativas en
menor nmero. Estos microorganismos son los ms comnmente encontrados en
suelos contaminados con hidrocarburos (Bossert y Bartha., 1984) y denotan la
capacidad que tienen para degradar a estos compuestos utilizndolos como fuente
nutricia. Cabe mencionar que no se determin el nmero ms probable de
microorganismos.

Los microorganismos alctonos como los que utilizan a los hidrocarburos como
fuente de carbono, pueden existir en suelos no contaminados en poblaciones
pequeas las cuales son estimuladas por la presencia de estos compuestos (Mark et
al., 2004), esto se pudo observar en este ensayo ya que se present una ligera
turbidez en los matraces con medio basal +levadura +aceite o diesel +suelo intacto
de la vecindad de los suelos contaminados. En los frotis realizados aparecen
levaduras y hongos como los causantes de esa turbidez.

En la resiembra que se hizo utilizando como inculo a los cultivos microbianos
obtenidos en la primera parte del ensayo, est vez con el caldo sin levadura, se
observ a las 48 horas una gran turbidez del medio de cultivo.
Los microorganismos encontrados en estos matraces eran levaduras y bacilos Gram
negativos.

Se pudo corroborar con una siembra en placa del crecimiento microbiano detectado
en el medio basal + agar + levadura + aceite o diesel e inoculados con suelo
contaminado. Se observo en el microscopio crecimiento de colonias color beige,
consistencia cremosa, colonias distribuidas a lo largo de la estra y tambin crecieron
en forma aislada, de forma ovalada, dimetro de entre 7.5 mm a 1 mm solo en los
medios con hidrocarburos (Fig. 3 4 y 5), en los medios con medio basal +agar +
levadura + aceite o diesel + suelo intacto no se observo ningn crecimiento de
bacterias o levaduras, al parecer el medio slido no fue apropiado para el desarrollo
de las bacterias que estaban presentes en los cultivos presentes en los caldos.
5

Figuras 3 4 y 5. Muestran el crecimiento y la forma de las colonias en las estras, as
como en forma aislada

CONCLUSIONES

Se detect en los suelos provenientes de la Cuenca de Burgos en el municipio de
Reynosa, Tamaulipas, la presencia de levaduras y bacilos Gram negativos capaces
de utilizar a los hidrocarburos como fuente de carbono; estos microorganismos
forman parte de las poblaciones normales de estos suelos, ya que se detect su
presencia tanto en suelos intactos como en suelos contaminados.

REFERENCIA

Atlas, R.M. y Pramer, D. (1990). Focus on Bioremediation of Oil Spills. J ournal
Chemical Technology Biotechnology. 52: 149-156.
Clark, L. (1995). Hydrocarbon pollution control and remediation of groundwater: a
brief review. Quarterly J ournal of Engineering Geology. 28: 93-100
Empresa REECOTEC. (2004).
Flix J . N., Gutirrez T. C, Lemos A. P., Ortiz M. J ., Pescador N. E., Varela L. F.,
(1996) Manual de laboratorio de ecologa microbiana. Instituto Politcnico Nacional,
Mxico
Ferrari, M.D. (1996). Biodegradacin de hidrocarburos aromticos policclicos y su
aplicacin en la biorremediacin de suelos y lodos contaminados. Revista Argentina
de Microbiologa. 28: 83-98
Mark Ibekwe A., Sharon K. Papiernik and Ching-Hong Yang. 2004. Enrichment and
molecular characterization of chloropicrin- and metam-sodium-degrading microbial
communities. Applied Microbiology and Biotechnology Issue: Volume 66, Number 3.
Pages: 325 - 332
Soto J ., Gutirrez T., Lemos A., Ortiz M., Pescador N., Varela L. (1996).
Biodegradacin y biotransformacin de molculas orgnicas. Manual de Laboratorio
de Ecologa Microbiana. Instituto Politcnico Nacional.
Van Deuren, J ., Z. Wang, Z. y J . Ledbetter (1997). Remediation Technologies
Screening Matrix and Reference Guide. 3 Ed. Technology Innovation
Office, EPA. http://www.epa.gov/tio/remed.htm.
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