CULTIVOS CELULARES

El cultivo celular o cultivo de tejidos, tiene su origen en el siglo XIX, como un

mtodo para el estudio del comportamiento de las clulas animales libres de las
variaciones sistmicas ocurridas dentro del organismo durante su normal
homeostasis y bajo el estrs de un experimento. Estas tcnicas iniciaron con el
cultivo de fragmentos no disgregados de tejidos, los cuales restringan la mitosis
de las clulas cultivadas y por tanto su crecimiento. Despus se realizaron cultivos
con fragmentos disgregados de tejidos, los cuales aumentaban el crecimiento
celular en cultivo ya que se utilizaban clulas dispersas.
EVOLUCION DE LOS CULTIVOS CELULARES
El cultivo de clulas tuvo su origen en el siglo XIX. Rechlinhausen en 1866,
mantuvo vivas clulas sanguneas de anfibio, pero fue la utilizacin de bloques de
agar con plasma coagulado que es el soporte y alimento el inicio del cultivo de
clulas in vitro (Freshney, 1987).
El desarrollo del cultivo de clulas de
vertebrados se inici con las observaciones de
Roux (1885) en cultivos de clulas de embrin
de pollo; posteriormente Harrison (1907) cultiv
tejido nervioso de rana el cual ms adelante
fue reemplazada por plasma de pollo (Burrows,
1910); posteriormente, se aplic esta tcnica
para el estudio en animales de sangre caliente
(Carrel, 1912). El empleo de tcnicas de fusin
celular (Barski, 1960; Littlefield, 1964)
estableci las bases de la gentica de clulas
somticas para el anlisis de especies animales (incluyendo al hombre);
igualmente la tcnica de anticuerpos monoclonales (Kohler y Milstein, 1975) ha
permitido estudios en inmunologa y su aplicacin a nivel teraputico.
Biologa del cultivo celular
La validez de un cultivo celular como modelo de funcin fisiolgica in vivo ha
sido criticado, ya que se presentan problemas de caracterizacin por la alteracin
del desarrollo celular; la proliferacin in vitro no se presenta de igual manera a la
de in vivo, debido a la reduccin de la relacin clula-clula y la interaccin matriz-
clula por la no presencia de la heterogeneidad y la estructura tridimensional de
las clulas hallada in vivo, adems porque el medio hormonal y nutricional se ve
alterado. Esto crea un ambiente que favorece la difusin, migracin y proliferacin
de clulas no especializadas, pero no a la expresin de funciones diferenciadas.
La provisin de un ambiente apropiado, nutriente, hormonas y sustratos son
fundamentales para la expresin de funciones especializadas (Brand, et al., 1997).
En un cultivo celular la mayora de las clulas crecidas a partir de un tejido
slido disgregado o de un subcultivo tienen la capacidad de adherirse en
monocapa, transformarse o anclarse independientemente. Esta adherencia celular
es mediada por receptores celulares especficos de superficie en la matriz
extracelular y la dispersin celular podra ser precedida por la secrecin de
protenas de matriz extracelular y proteoglicanos por parte de la clula. Las clulas
se pueden anclar y difundir en el vidrio donde se cultivan por medio de ligeras
cargas negativas y al plstico, como el poliestireno, si tienen una propiedad o
tratamiento con descargas elctricas o con radiacin ionizante de alta energa. El
cultivo en vidrio o plstico provee condiciones favorables para el crecimiento y
anclaje celular.
El crecimiento de las clulas en un cultivo celular primario depende de la
supervivencia de stas a las diferentes tcnicas de disgregacin y a la capacidad
de adherirse al sustrato o de sobrevivir en suspensin. Se cultivan clulas de
plantas, animales y humanos en un caldo de cultivo en el laboratorio. Se pueden
cultivar una amplia variedad de cultivos de clulas, as como clulas de cncer y
sangre humanas para investigar cmo los virus provocan infecciones.
Cuando el cultivo proviene de clulas que han sido disgregadas de un tejido
original tomado de un rgano de un animal recin sacrificado, reciben el nombre
de Cultivo Primario.
Cuando ste cultivo primario es sometido a procesos de transformacin que le
confiere capacidad ilimitada de multiplicacin, reciben el nombre de Lneas
Celulares.
Cuando de un cultivo primario genera otro tipo de clulas que se pueden
separar recibe el nombre de Cultivos Secundarios.
Cuando en el cultivo coexisten dos tipos de clulas de linajes diferentes que se
pueden separar recibe el nombre de Cocultivo.
Tipos de cultivo celular
CULTIVOS EN MONOCAPA
Son los que cuben la correspondiente superficie de crecimiento (confluencia), lo
que hace que su multiplicacin sea inhibida cuando establecen contacto entre s
(quiescencia).
Las clulas provenientes de cultivos primarios son las que mejor crecen en sta
condicin, dada su estabilidad gentica y su naturaleza diploide normal.

CULTIVOS EN SUSPENSION

Son sistemas en suspensin tambin requieren de matrices que son
macromolculas, que sirven de protectores a la superficie celular; stas
macromolculas se encuentran en el suero, el cual contribuye igualmente con el
medio de cultivo, proporcionando un sistema balanceado de nutrientes. Dentro de
stas matrices est el Methocel, esencial para el crecimiento de cultivos en
suspensin.


CULTIVOS TRIDIMENSIONALES
Son aquellos que buscan mantener la caracterstica o arquitectura del tejido in
vivo. Los sistemas tridimensionales permiten estudiar la proliferacin y morfologa
epitelial y su interaccin con otras clulas como son las del tejido conectivo;
igualmente con ellos se puede evaluar el efecto de sustancias que pueden
influenciar en tales interacciones intercelulares. Actualmente se producen Kits
drmicos comerciales con base en cultivos, que permiten evaluar la citotoxicidad
de componentes qumicos presentes en lociones, preservativos, detergentes,
perfumes, shampoos y solventes entre otros.
CULTIVO DE CLULAS TRANSFORMADAS.-
Este se obtiene por la inyeccin de un carcingeno, despus de una serie de
cultivos alternados y pasaje por animales.
VENTAJAS DEL CULTIVO CELULAR.-
- El control del medio fisicoqumico o sea el pH, temperatura, presin
osmtica, tensin de oxgeno (O2) y gas carbnico (CO2) de las clulas
cultivadas.
- Las condiciones fisiolgicas que deben ser constantes.
DESVENTAJAS DEL CULTVO CELULAR.-
- El gasto de esfuerzo y materiales para la produccin de una pequea
cantidad de clulas o de tejido.
- Los costos de producir clulas en cultivo son diez veces ms que el uso de
tejido animal.
- Se invierte bastante en ensayos o procedimientos preparativos que pueden
ayudar en la estandarizacin del proceso reduciendo tiempo de
manipulacin, volmenes de muestra, tiempos de centrifugacin.
USOS.-
- Para el estudio de clulas especficas, cmo crecen, qu necesitan para
su crecimiento, cmo y cundo dejan de crecer.
- Para investigaciones sobre el ciclo celular, el control del crecimiento de
clulas tumorales y la modulacin de la expresin gentica.



Niveles y normas de seguridad.-
Nivel 1. No presentan peligros reconocidos cuando se utilizan en condiciones
normales.
Nivel 2. Se emplean para materiales de origen primario humano que no se
conoce el riesgo de infeccin o que tienen la posibilidad de que en las
muestras contengan VIH, TBC, hepatitis B u otros patgenos.
Nivel 3. Su manejo pueden presentar un riesgo potencial.
Nivel 4. Extremadamente peligroso.
EN QUE CONSISTE UN LABORATORIO DE CULTIVOS CELULARES
Es un espacio independiente para el proceso de lavado y preparacin de material
y un rea propiamente destinada al trabajo con cultivos celulares, dentro de la cual
se debe contar con sistemas de refrigeracin y congelacin, incubadoras,
centrfugas, balanzas, microscopios y cabinas de flujo laminar adems de disponer
de un buen suplemento de material plstico y de vidrio y con sistemas de
esterilizacin apropiados para los diferentes tipos de reactivos y material
utilizados.
Desde el punto de vista de los sistemas de esterilizacin se pueden citar los
siguientes:
Calor Hmedo: Mediante el empleo de autoclaves los cuales proporcionan una
temperatura de 121C y una presin de 15 lb.
Calor Seco: Lo constituye el uso de hornos a temperatura de 200C por espacio
de 3 horas. Es empleado para la esterilizacin de material de vidrio
particularmente.
Filtracin: A travs del uso de equipos con membrana de nitrocelulosa o acetato
de celulosa con poro de 0.22 0.1 mm de dimetro, mediante la aplicacin de
presin positiva o negativa. Por ste sistema se esterilizan la mayor parte de los
medios de cultivo, suero, solucin de antibitico-antimictico y suplementos.
Para un experimento de cultivos con antelacin se debe tener en cuenta dos
aspectos importantes:
PROGRAMACION TIEMPOS.-
Debido a la extensin de un cultivo, en cultivos primarios se debe programar
el tiempo de un experimento desde el momento en que se cruzan los animales
para obtener el tejido necesario para los experimentos.
PROGRAMACION - TAMAO DE MUESTRA.-
Los cultivos celulares son realizados con diferentes replicaciones para
permitir la conversin de experimentos heterogneos, cuando se realiza un solo
cultivo, en experimentos homogneos o uniformes, cuando se realizan varios
cultivos (replicaciones) cada uno con muestra y caractersticas de cultivos
idnticos. Cuando las replicaciones experimentales sean virtualmente idnticas, la
necesidad del anlisis de varianza como estadstica se reduce.