Quim. Nova, Vol. 26, No.

5, 763-765, 2003
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*e-mail: tania@cenargen.embrapa.br
DETERMINAO DE TANINO EM PEDNCULO DE CAJU: MTODO DA VANILINA VERSUS MTODO DO
BUTANOL CIDO
Tnia da Silveira Agostini-Costa*
Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia, Parque Estao Biolgica, W5 Final, 70770-900 Braslia - DF
Andra Lima e Marcelo Victor Lima
Embrapa Agroindstria Tropical, R. Dra. Sara de Mesquita 2270 Planalto PICI, 60511-110 Fortaleza - CE
Recebido em 10/9/02; aceito em 27/2/03
TANNIN IN CASHEW APPLE: VANILLIN VERSUS BUTANOL ACID ASSAY. To improve tannin assay in cashew apple, several
parameters were examined, including (1) extraction solvents, (2) effects of water and boiling time on butanol acid reaction and
(3) correlation between vanillin and butanol acid assay of tannin in cashew apples. The 50-70% acetone extracted the greatest
amount of tannin from cashew apples. Concentrations of water in butanol reagents were adjusted and boiling time of butanol
reaction was reduced at 15 min. Tannin of unripe cashew apples was purified on Sephadex LH-20, aiming to obtain tannin standard
for butanol assay. The vanillin assay presented high correlation with the butanol acid assay.
Keywords: tannin; cashew apple; vanillin assay.
INTRODUO
O Brasil pioneiro e lder no aproveitamento de pednculo de
caju (Anacardium occidentale L.). Entretanto, a adstringncia de-
corrente da presena natural de tanino vem sendo tradicionalmente
referida como um dos principais obstculos contra o aumento das
exportaes dos pednculos de caju. Os taninos so compostos
fenlicos classificados em condensados e hidrolisveis. Os taninos
condensados ou proantocianidinas so polmeros de flavonides,
cujos monmeros so unidos por uma ligao carbono-carbono. Os
taninos hidrolisveis so steres de cido glico e de cido hexa-
hidroxidifnico e glicose, alm de outros poliis. Em pednculos de
caju so encontrados os taninos condensados
1
.
A grande variedade estrutural dos taninos, a natureza polimrica
e a falta de padres comerciais especficos dificultam a determina-
o destes compostos em alimentos. O mtodo de Folin & Denis,
que se baseia no princpio da oxireduo, vem sendo extensivamen-
te empregado na determinao quantitativa de taninos em pednculos
de caju
2-4
. Entretanto, verificou-se que o cido ascrbico ou vitami-
na C, agente redutor naturalmente presente em concentraes eleva-
das no pednculo de caju, apresenta forte interferncia no mtodo
de Folin & Denis e o mtodo da vanilina foi apresentado, portanto,
como o mais indicado para a determinao analtica de tanino em
suco de caju
5
.
Embora o reagente da vanilina detecte tanto flavonides
monomricos quanto polimricos, ele especfico para uma classe
limitada de compostos que apresentam uma ligao simples na posi-
o 2,3 e grupos hidroxila em posies alternadas no anel A.
Leucoantocianidinas (catequinas) e proantocianidinas (taninos) rea-
gem com a vanilina na presena de HCl para produzir um produto de
condensao vermelho
6
. A catequina comercial empregada como
padro.
O mtodo do butanol cido referido como o melhor para deter-
minao de taninos condensados, em funo da alta seletividade
7
.
Nessa determinao, as subunidades do tanino condensado so
oxidativamente clivadas para fornecer antocianidinas, que so ver-
melhas em meio cido. O desenvolvimento da cor dependente do
solvente e reduzido pela presena de gua, sendo que as condies
da reao precisam ser rigorosamente controladas
8
. Como o cido
tnico e a catequina comercial no apresentam resposta positiva para
esta reao, o tanino condensado precisa ser purificado em laborat-
rio para ser empregado como padro.
Considerando que a determinao de taninos envolve uma gran-
de diversidade qumica de compostos fenlicos, que os mtodos
oxiredutomtricos no so apropriados para determinao de tani-
nos em pednculos de caju e derivados e que os procedimentos esta-
belecidos para determinao de taninos pelo mtodo da vanilina em
suco de caju no incluem processo de extrao dos mesmos
5
, o obje-
tivo deste trabalho foi i) padronizar o processo de extrao para de-
terminar taninos em pednculos de caju; ii) otimizar as condies
para determinar taninos pelo mtodo do butanol cido em pednculos
de caju e iii) estabelecer a correlao entre o mtodo do butanol e o
mtodo da vanilina, avaliando a validade do mtodo da vanilina como
mtodo de escolha para a determinar taninos em pednculos de caju
e derivados.
PARTE EXPERIMENTAL
Material
Material vegetal
Os pednculos de caju foram obtidos nas Estaes Experimen-
tais da Embrapa em Pacajus e Paraipaba, CE, safras 2000 e 2001. Os
pednculos (40 unidades) colhidos aleatoriamente pela manh, em
estado de maturao apropriado para o consumo in natura, foram
selecionados (20 unidades), quarteados, homogeneizados em
liquidificador e analisados em triplicata. Considerando a suposta
presena de antocianidinas livres na pelcula do pednculo de caju,
que poderia causar interferncia na reao da vanilina
9
, e resultados
prvios indicando que a presena de taninos em pednculos de caju
estaria concentrada principalmente na pelcula, algumas anlises de
pednculos com e sem pelcula foram realizadas em paralelo.
764 Quim. Nova Agostini-Costa et al.
Reagentes
Fase mvel forestal: cido actico-HCl-gua 30:3:10.
Butanol reagente: 95 mL de butanol, 5 mL de HCl e 0,1 mL de
sulfato frrico amoniacal 4% (2,1g de FeNH
4
(SO
4
)
2
x 12 H
2
O + 17
mL de HCl conc. + 33 mL de metanol).
A catequina empregada foi da marca Sigma, o HCl da marca
Merck e os demais reagentes foram Vetec. O butanol oriundo de
outras marcas nacionais (Synth e Qumica) no foi usado, pois no
apresentou reao positiva para determinao de tanino.
Mtodos
Purificao do tanino
Para a viabilizao do mtodo do butanol, o tanino presente em
pednculos verdes de cajueiro ano-precoce CP-076 foi extrado com
acetona 70%, purificado em Sephadex LH-20 conforme Terrill et
al.
10
e liofilizado.
Caracterizao das antocianidinas
Cerca de 3,5 mg do tanino liofilizado foram tratados com 6 mL
de butanol-HCl 95:5 em ebulio por 50 min, visando a liberao
oxidativa das antocianidinas e caracterizao das mesmas. O butanol
foi evaporado com nitrognio. As antocianidinas presentes no res-
duo prpura foram dissolvidas em pequeno volume de metanol
acidificado e separadas por cromatografia em papel, empregando
forestal como fase mvel, conforme Harbone
11
.
Extrao analtica de tanino
Um grama de pednculo de caju previamente homogeneizado
foi pesado em tubos de centrifugao de 50 mL com tampa rosqueada.
A extrao dos taninos foi feita com 10 mL de acetona 70%, por 2 h
temperatura ambiente. Este intervalo de extrao foi antecedido,
intermediado e finalizado por 3 processos de agitao mecnica em
vortex, durante 3 min cada. Encerrada a terceira agitao do tubo de
ensaio, que foi realizada aps as 2 h de extrao, o extrato foi centri-
fugado e cuidadosamente filtrado em uma fina camada de l de vi-
dro, pois o papel de filtro adsorve os taninos. O filtrado foi recolhido
em um balo de evaporao e o resduo, que permaneceu no tubo de
ensaio, foi novamente adicionado de 10 mL de acetona 70%, agita-
do por mais 3 min em vortex, centrifugado e filtrado no mesmo ba-
lo de evaporao que recebeu a primeira frao do extrato. A aceto-
na presente no extrato foi totalmente evaporada a vcuo e o resduo
aquoso foi transferido para balo de 25 mL e diludo com metanol.
As reaes especficas foram desenvolvidas em tubos de ensaio com
tampa, envoltos por alumnio, pois a presena de luz afeta a estabili-
dade das reaes
12
.
Reao da vanilina
Esta reao foi realizada conforme Broadhurst e Jones
12
, empre-
gando-se a catequina como padro. Para as anlises simultneas de
pednculos com e sem pelcula foi empregado um branco de amos-
tra, conforme recomendao de Walton et al
9
.
Reao do butanol cido
Esta reao foi realizada segundo Porter et al.
8
, com adaptaes
que foram includas i) na reduo do teor de gua no butanol
reagente, conforme disposto no item reagentes; ii) no tempo de re-
ao, que foi reduzido de 45 para 15 min e iii) no emprego do tanino
de pednculo de caju purificado como padro.
Esta reao foi desenvolvida com 6 mL do butanol reagente e
1 mL de extrato. Os tubos foram agitados em vortex, por 1 min, e
colocados em banho-maria em ebulio, por 15 min. Os tubos foram
resfriados em gua e a absorvncia das amostras foi lida em 559 nm.
O branco, preparado conforme a amostra, no foi aquecido, pois a
reao, contendo amostra e reagente, no se desenvolve sem ebulio.
RESULTADOS E DISCUSSO
Dentre os vrios solventes avaliados, visando a extrao de tani-
nos em pednculos de caju, a acetona 50-70% apresentou extrao
30-50% superior, aps a quantificao pelo mtodo da vanilina (Figu-
ra 1). Este solvente tambm foi empregado com sucesso na extrao
de taninos em forrageiras
10
. Em leguminosas e sorgo
13
, o metanol con-
tendo 1% de HCl apresentou um potencial de extrao de tanino pra-
ticamente dobrado, quando comparado com o metanol puro, solvente
comumente empregado na extrao de taninos em sorgo. Os demais
solventes avaliados para leguminosas e sorgo, etanol 60% e gua, ex-
traram menos de 40% dos compostos fenlicos solveis em metanol/
HCl. No caso do pednculo de caju, os resultados foram bem diferen-
ciados, evidenciando a importncia da avaliao do solvente extrator
em funo da grande diversidade da constituio qumica, do grau de
polimerizao apresentado e do tipo de interao que estes compostos
podem apresentar em diferentes fontes vegetais.
A reao original do butanol, desenvolvida para taninos extra-
dos de forrageiras, foi feita com extrato metanlico isento de gua
8
.
Para a determinao de tanino no pednculo de caju, cujo extrato
final apresentou 28% de gua, foi providenciada uma reduo no
teor de gua do butanol reagente para compensar o contedo aquoso
do extrato na reao final, uma vez que a alterao do equilbrio
aquoso reduz a sensibilidade da reao do butanol.
Para a determinao de taninos em Chaenomeles speciosa, a re-
ao do butanol cido foi desenvolvida por 40 min em ebulio
8
.
Entretanto, para o tanino do caju nenhuma diferena significativa,
em nvel de 0,05 de probabilidade pelo teste de Tukey, foi observada
entre os resultados aps 15 min de reao (Figura 2). O tempo da
reao foi reduzido, com manuteno da boa estabilidade e repeti-
Figura 1. Influncia do solvente na extrao percentual de tanino
determinado pelo mtodo da vanilina; cada resultado mdia de trs
repeties feitas para uma mesma amostra; MeOH: metanol; HCl 1%: em
metanol; EtOH: etanol; Acet: acetona
Figura 2. Influncia do tempo de ebulio no desenvolvimento da cor da
reao do butanol cido, aplicada ao extrato tnico de pednculo de caju;
cada resultado mdia de trs repeties
765 Determinao de Tanino em Pednculo de Caju Vol. 26, No. 5
bilidade do experimento. A resposta diferenciada, tambm neste caso,
pode ser explicada pela grande variao estrutural que os taninos
podem apresentar nas diferentes fontes vegetais.
A separao cromatogrfica indicou a delfinidina (mancha pink;
rf = 0,35) como a principal antocianidina componente do tanino
condensado purificado a partir do pednculo de caju. Alm desta,
outra mancha menos intensa, aparentemente pelargonidina (mancha
vermelha, rf = 0,76), foi observada. As curvas de calibrao para os
mtodos da vanilina e do butanol cido, empregando-se tanino puri-
ficado como padro, apresentaram boa linearidade entre 13 e
260 g/mL. As repeties dos mtodos apresentaram desvios padro
relativos inferiores a 5%.
As anlises de tanino pelos mtodos da vanilina e do butanol
cido em vrios lotes de pednculos de caju (Figura 3) apresentaram
um alto coeficiente de correlao de Pearson (0,98126), que foi sig-
nificativo no nvel 0,0001 de probabilidade. Embora o mtodo do
butanol seja mais especfico para taninos condensados do que o m-
todo da vanilina, que tambm detecta monmeros, a alta correlao
obtida entre os dois mtodos indica que, em pednculos de caju, no
existe quantidade significativa de flavonides monomricos com li-
gao simples na posio 2,3 e grupos hidroxila em posio alterna-
da no anel A, condio exigida para reao com a vanilina.
A resposta do tanino para as duas reaes, vanilina e butanol,
diferente, uma vez que as mesmas so baseadas em princpios qu-
micos tambm diferenciados. Alm disso, diferentes valores obtidos
para o mtodo da vanilina, empregando-se catequina e tanino purifi-
cado como padres, so decorrentes das equivalncias diferenciadas
para os dois compostos
10
. Entretanto, para efeito de resultados com-
parativos, a catequina tem sido amplamente empregada na literatura,
pois apresenta resposta satisfatria para essa reao e facilmente
obtida no mercado. O mtodo do butanol cido, cuja reao basea-
da na clivagem oxidativa dos taninos condensados para fornecer
antocianidinas, no apresenta reao positiva para a catequina.
Amostras compostas de pednculos de caju com pelcula e
despeliculados, procedentes de cajueiro microcarpum e de seis clones
de cajueiro ano-precoce, foram simultaneamente analisadas. Neste
caso, foi empregado um branco de amostra
9
, que indicou ausncia
de interferncia significativa de antocianidinas no mtodo da vanilina.
Os resultados obtidos confirmaram resultados prvios, indicando que
a presena de taninos, em pednculos de caju, est concentrada prin-
cipalmente na pelcula, que reteve percentual varivel de tanino (Fi-
gura 4), influenciada pelo peso mdio do pednculo. Os pednculos
de cajueiro microcarpum, que apresentam peso mdio reduzido e
maior proporo de pelcula, mostraram maior diferena entre os
teores de taninos, quando analisados com e sem pelcula. A presena
de taninos em rgos vegetais est associada proteo das plantas,
o que pode justificar a disposio dessas molculas, em maior con-
centrao, na superfcie externa do pednculo (pelcula).
Os teores de tanino foram determinados pelos mtodos da vanilina
e do butanol em pednculos de cajueiro ano-precoce CP-076 ma-
duros e verdes. Os pednculos maduros apresentaram teores de tani-
no 60-66% inferiores, quando comparados com pednculos verdes.
Este resultado apresenta coerncia com o processo de maturao dos
pednculos, quando observada uma reduo acentuada da
adstringncia dos mesmos.
CONCLUSO
A acetona 50-70% apresentou-se como o melhor solvente para
extrao de tanino em pednculos de caju. Os resultados fornecidos
pelo mtodo do butanol cido apresentaram alta correlao com os
obtidos pelo mtodo da vanilina, indicando que o ltimo pode ser
empregado na determinao especfica de taninos condensados em
pednculos de caju. O teor de tanino determinado pelo mtodo da
vanilina, utilizando catequina como padro, no deve ser interpreta-
do como o contedo real de tanino em pednculo de caju, podendo
ser empregado apenas para classificar comparativamente diferentes
cultivares em relao aos demais.
AGRADECIMENTOS
Ao Banco do Nordeste do Brasil pelo suporte financeiro.
REFERNCIAS
1. Agostini-Costa, T. S.; Santos, J. R.; Garruti, D. S.; Feitosa, T.; Bol. CEPPA
2000, 18, 129.
2. Moura, C. F. H.; Dissertao de Mestrado, Universidade Federal do Cear,
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de cajueiros ano precoce, EPACE: Fortaleza, 1994.
5. Agostini-Costa, T. S.; Garruti, D. S.; Lima, L.; Freire, S.; Abreu, F. A.;
Feitosa, T.; Bol. CEPPA 1999, 17, 167.
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13. Carmona, A.; Seidl, D. S.; Jaff, W. G.; J. Sci. Food Agric. 1991, 56, 291.
Figura 3. Correlao entre teores de tanino determinados pelos mtodos
da vanilina e do butanol em pednculo de caju; os pednculos foram
procedentes de sete clones de cajueiro ano-precoce, analisados em
diferentes lotes
Figura 4. Teor de tanino em pednculos de sete clones de cajueiro ano-
precoce sem pelcula e com pelcula; cada resultado mdia de trs
repeties