Laboratorio No.

5a
EXTRACCIN DE ADN EPITELIAL


OBJETIVO
- En esta prctica realizaremos la extraccin del ADN de las clulas de
descamacin del epitelio mucoso del interior de la boca, poniendo de
manifiesto su estructura fibrilar y el extraordinario grado de arrollamiento, que
permite el empaquetamiento en el ncleo celular de las largusimas cadenas
de esta molcula.
- Tras la extraccin se suspender el ADN recuperado en alcohol de 70 para su
conservacin.


MATERIAL

- Agua mineral
- Palillo o varilla de vidrio
- Alcohol de 96 muy fro
- Cucharillas de plstico
- Sal comn
- Vasos desechables
- Tubo de ensayo
- Tubos eppendorf
- Detergente lavavajillas
- Alcohol de 70
- Gradilla


FUNDAMENTO

El ADN se encuentra en el interior del ncleo de todas las clulas, disperso y muy
replegado, unido a protenas para formar la cromatina. Por lo tanto, podremos
extraerlo a partir de prcticamente cualquier material de origen biolgico. Para ello
es necesario romper las clulas para separar el ncleo y romper ste para liberar
el ADN, separarlo de las protenas y precipitarlo para separarlo de la solucin
acuosa.

El ADN (y tambin algo de ARN) aparecer entonces como un agregado de fibras
blanquecinas de aspecto mucoso que se adhieren a una varilla de vidrio o a la
pipeta. Podemos aadir unas gotas de azul de metileno o verde de metilo al tubo
para teirlo. Por ltimo, se puede situar sobre un porta, teirlo de la misma manera
y observarlo al microscopio. Tambin se puede conservar dejndolo secar sobre
papel de filtro o suspendido en alcohol al 50% o 70%.



PROCEDIMIENTO

1. Preparar un tubo de ensayo con alcohol etlico de 96 por cada alumno y
poner a enfriar lo mximo que sea posible,por ejemplo en bao de agua con
hielo,mientras se realizan los pasos siguientes.
2. Poner un poco de agua en un vaso y enjuagarse la boca enrgicamente
durante al menos medio minuto para arrastrar el mayor nmero posible de
clulas de descamacin de la mucosa bucal (antes de hacerlo conviene
haber tragado saliva para eliminar la accin de los enzimas contenidos en
ella).
3. Mientras tanto pondremos una pequea cantidad de agua destilada (o
mineral) en el mismo vaso, unos 20ml, y aadimos dos pizcas de sal comn
y un par de gotas de detergente lavavajillas.
4. Expulsar el agua en el vaso de precipitados sobre la solucin anterior.
Dejaremos actuar durante unos 10 minutos, removiendo de vez en cuando
suavemente para disolver estos componentes evitando la formacin de
espuma.



5. A continuacin, aadir la solucin suavemente al tubo de ensayo que
contiene el alcohol muy fro dejndola resbalar por la pared del tubo
inclinado. El filtrado, ms denso que el alcohol y algo turbio, se deposita en
el fondo del tubo. Dejar reposar durante 2 3 minutos sin moverlo en
absoluto. El alcohol formar un sobrenadante por encima de la fase acuosa,
en la que se encuentra el ADN en disolucin, provocando que ste precipite
6. Esperar unos minutos mientras el ADN precipita en la interfase alcohol-
agua formando una masa blanquecina que asciende lentamente formando
un grumo de aspecto algodonoso.




7. Tras unos minutos de reposo, el ADN tiende a subir hacia la superficie
del alcohol.
8. Entonces podremos recogerlo utilizando una varilla de vidrio, una pipeta
Pasteur o simplemente un palillo. Para ello, se introduce en la masa de
ADN y se extrae suavemente mientras se hace girar entre los dedos.



9. Entretanto habremos preparado los tubos eppendorf con alcohol de 70
para la conservacin del ADN.
10. Una vez extrado el ADN podemos suspenderlo en el tubo eppendorf u
otro recipiente adecuado para su conservacin.