Starter Kulture Bakterija I Kvasaca U Proizvodnji Vina

TEHNOLOKI FAKULTET, NOVI SAD
Biologija proizvodnih
mikroorganizama
- SEMINARSKI RAD -

Starter kulture kvasaca i bakterija u
proizvodnji vina

PROFESOR: STUDENT:

prof. dr Sinia L. Markov MSc Marina Raji
Oktobar, 2014.
BIOLOGIJA PROIZVODNIH MIKROORGANIZAMA
Starter kulture kvasaca i bakterija u proizvodnji vina

SADRAJ

1. Uvod......................................................................................................................................1
2. Primena kvasaca kao starter kultura......................................................................................1
2.1. Selekcija sojeva kvasaca za proizvodnju vina...............................................................1
2.2. Karakterizacija kvasaca za vino....................................................................................2
2.3. Odabir aktivne suve starter kulture kvasca....................................................................3
2.4. Primena aktivne suve starter kulture kvasca..................................................................4
2.4.1. Rehidratacija aktivnog suvog kvasca................................................................5
2.4.2. Rehidratacija aktivnog suvog kvasca primenom rehidratiueg nutrijenta.......6
2.4.3. Primena vie sojeva Saccharomyces cerevisiae kao starter kulture..................7
2.4.4. Inokulisanje groanog mota sa Saccharomyces i ne-Saccharomyces
sojevima.......................................................................................................................8
2.4.5. Primena starter kultura kvasaca za nedovrene fermentacije............................9
3. Primena bakterijskih starter kultura.....................................................................................11
3.1. Selekcija i karakterizacija bakterija mleno-kiselog vrenja za pripremu starter kultura
u proizvodnji vina................................................................................................................12
3.2. Priprema malolaktike starter kulture..........................................................................13
3.3. Odabir odgovarajue malolaktike starter kulture.......................................................15
3.4. Pokretanje zastale malolaktike fermentacije..............................................................17
3.5. Doprinos malolaktike starter kulture senzornom kvalitetu vina................................19
3.5.1. MLF otkriva arome sorte................................................................................20
3.5.2. Regulisanje diacetila uticaj brzine inokulacije MLB i vremena dodavanja na
profil arome................................................................................................................21
3.5.3. Uticaj post-MLF tehnika u proizvodnji vina na senzorne osobine.................23
4. Zakljuak.............................................................................................................................23
5. Literatura.............................................................................................................................24

1

1. Uvod

Iako su kvasci za proizvodnju vina poznati od davnina, proizvodnja vina bila je vie umetnost
nego nauka sve do pre 50-ak godina. Proizvodnja i upotreba aktivnog suvog kvasca (ADY
Active Dry Yeast) poela je u Sjedinjenim Amerikim Dravama sredinom 1960-ih i odatle
se proirila po celom svetu (Degre 1993). U inokulisanim fermentacijama, odabrani sojevi
Saccharomyces cerevisiae se dodaju obino do postizanja populacije od oko 10
5
10
6

elija/mL u motu kako bi se obezbedio bri poetak fermentacije, poveana brojnost i
dominacija u odnosu na autohtone sojeve kvasaca i kako bi se obezbedile karakteristine
osobine vina. Istorija kontolisane malolaktike fermentacije (MLF) je jo kraa. Uprkos
ranom otkriu bakterija mlene kiseline (LAB Lactic Acid Bacteria) od strane Mller-
Thurgau 1891. godine, koji doprinose redukciji kiseline u vinu tako to jabunu kiselinu
razgrauju na mlenu kiselinu i CO
2
, komercijalne starter kulture su dospele na trite tek
poetkom 1980-ih. Najee se koriste starter kulture Oenococcus oeni (ranije nazivan
Leuconostoc oenos), mada postoje i drugi laktobacili koji su se pokazali da daju dobre
rezultate (Prahl 1989). Malolaktike (ML) starter kulture za laku direktnu inokulaciju su
postale dostupne tokom ranih 1990-ih. Santiago i sar. (2011) detaljno su se bavili problemom
proizvodnje starter kultura za vino. U jedanaestom poglavlju njihove knjige Molekularna
mikrobiologija vina mogu se nai podaci o izolaciji i selekciji sojeva, razvoju biomase,
procesima koji prethode pakovanju i prodaji, kao i o nainu upotrebe odabranih sojeva
kvasaca i bakterija mlene kiseline koji se koriste u proizvodnji vina.

2. Primena kvasaca kao starter kultura

U spontanim alkoholnim fermentacijama postoji rana i brza sukcesija odreenih vrsta
kvasaca kao to su Hanseniaspora, Kloeckera, Candida stellata, Metschnikowia pulcherrima,
Torulaspora delbrueckii ili Pichia, koji inae rastu u motu (Henschke 1997) ali na kraju
odumiru, dok Saccharomyces cerevisiae uglavnom dominira i zasluan je za kompletnu
alkoholnu fermentaciju (Fleet i Heard 1993). Kritina taka spontane alkoholne fermentacije
je oko 4% vol. alkohola (Dittrich i Grossmann 2005), kada ne-Saccharomyces kvasci
odumiru a sojevi Saccharomyces cerevisiae postaju dominantni. Ipak, dominacija
Saccharomyces cerevisiae ne garantuje uspenu alkoholnu fermentaciju; ona zavisi i od
genetske predispozicije dominantnih sojeva. Godinama su voene rasprave u kojima su se
razmatrali relevantni faktori za spontanu alkoholnu fermentaciju u odnosu na indukovanu
alkoholnu fermentaciju. Konano reenje ovog problema ne moe se ustanoviti jer zavisi od
vrste groa, eljene vrste vina, sastava groanog soka i berbe.

2.1. Selekcija sojeva kvasaca za proizvodnju vina

Poznato je da Saccharomyces cerevisiae proizvode razliite koncentracije aromatinih
komponenti u zavisnosti od tretmana mota i uslova u kojima se izvodi fermentacija,
2

ukljuujui temperaturu, vrstu groa, mikronutrijente, vitamine i sadraj azota u motu
(Carrau i sar. 2010). Danas je irom sveta dostupno preko 200 komercijalnih sojeva kvasaca.
Ovi sojevi su odabrani zbog svojih specifinih osobina (Tabela 1) koje mogu biti podeljene u
dve grupe: poeljne i nepoeljne karakteristike (Degre 1993), kao i zbog tehnolokih i
kvalitativnih osobina koje su opisali Dittrich i Grossmann (2005).

2.2. Karakterizacija kvasaca za vino

Potrebe za kiseonikom i azotom: Kvasci mogu od amonijumovih jona da sintetiu gotovo
sve amino kiseline i azotne baze koje su im neophodne za rast i razvoj, iako je njihov rast bri
ukoliko u hranljivoj podlozi postoje ve spremni gradivni blokovi, amino kiseline. Sadraj
azota u motu moe biti limitirajui faktor (Amerine i sar. 1980); pronaena je veza izmeu
poetnih koncentracija i maksimalne brzine fermentacije (Bely i sar. 1991). Vrednost manja
od oko 150 mg/L usvojivog azota (YAN Yeast Assimilable Nitrogen) u motu ima veze sa
veim ansama za probleme u fermentaciji (Henschke i Jiranek 1993). Dodavanje azota
tokom stacionarne faze moe biti efikasno, ali neki autori su demonstrirali to da ovaj efekat
zavisi od osobina samog soja (Jiranek i sar. 1991). Julien i sar. (2000) predloili su metod za
odreivanje koliina azota i kiseonika koje su potrebne kvascima u zavisnosti od soja
kvasaca. Potrebe azota su odreivane tokom stacionarne faze fermentacije. Kako bi se
odredila efikasnost usvajanja dodatog azota tokom ove faze, primenjena je fermentacija pri
konstantnoj brzini. Primeene su veoma bitne razlike: neki sojevi su imali dvostruko vee
potrebe za azotom u poreenju sa ostalim sojevima, pri istoj brzini fermentacije. Na osnovu
ovih saznanja sojevi kvasaca su klasifikovani kao nisko, srednje i visoko zahtevni za azotom.
Kiseonik je drugi bitan faktor za metabolizam kvasaca tokom proizvodnje vina jer je
neophodan za sintezu sterola i masnih kiselina. Sablayrolles i sar. (1996) dokazali su prednost
kombinovanog dodavanja kiseonika i azota u cilju spreavanja spore ili nepotpune alkoholne
fermentacije. I u ovom sluaju, razliiti sojevi kvasaca variraju u potrebama za kiseonikom
(Julien et al. 2001).

Tabela 1 | Kriterijumi za selekciju sojeva kvasaca za komercijalnu upotrebu
Poeljni Nepoeljni
Kvalitativne osobine:
Proizvodnja prijatnih vonih aroma i
estara
Proizvodnja -glukozidaze
Proizvodnja glicerola
Proizvodnja mano-proteina
Proizvodnja sumpor dioksida
Proizvodnja vodonik sulfida
Proizvodnja komponenti sa S-derivatima
Proizvodnja isparljivih kiselina i etil
acetata
Proizvodnja komponenti koje vezuju SO
2
(acetaldehid, piruvat...)
Formiranje prekursora etil karbamata
Proizvodnja polifenol oksidaze
Proizvodnja biogenih amina

Za specijalne primene:
Razgradnja jabune kiseline
Formiranje mlene kiseline
Formiranje izoamilacetata
Brza autoliza
3

Tehnoloke karakteristike:
Potpuna fermentacija eera
Visoka tolerancija na alkohol
Rezistentnost na sumpor dioksid
Minimalna lag-faza tokom rehidratacije
Fermentacija na niskim temperaturama
Tolerancija na visoke temperature
Fermentacija pod pritiskom
Aktivnost tokom fermentacije
Fenomen ubice
Stvaranje pene
Stvaranje biofilma
Aktivnost tokom fermentacije

Za specijalne primene:
Svojstva aglomerizacije
Svojstva sedimentacije

Temperaturna i alkoholna tolerancija: Temperatura znaajno utie na rast kvasaca.
Saccharomyces cerevisiae moe da raste u temperaturnom opsegu od 0-45 C, dok je
optimalna temperatura za alkoholnu fermentaciju izmeu 20 i 30 C (Henick-Kling 1988).
Vano je obratiti panju na temperaturnu toleranciju odabranih kvasaca, to se obino
odreuje rastom na sintetikoj podlozi na 10, 12, 15, 20, i 30 C, kako bi se odabrao najbolji
soj kvasca za specifine uslove proizvodnje vina. Alkoholna tolerancija se testira na istoj
podlozi. Veina odabranih sojeva kvasca tolerie do 14% vol., ali se za fermentaciju sokova
veoma zrelog crnog groa preporuuju kvasci sa viom tolerancijom alkohola od 16% vol.
pa nadalje.

2.3. Odabir aktivne suve starter kulture kvasca

Tokom 70-ih i 80-ih godina, kada su se prve suve starter kulture koristile za proizvodnju
vina, kvasci su birani prvenstveno na osnovu prednosti u tehnolokom simislu; danas je
njihov doprinos senzornim karakteristikama i optem kvalitetu vina podjednako vaan. Tako
da sojevi koji su nedavno odabrani igraju veu ulogu od jednostavnog fermentovanja eera u
etanol. Iako postoji velika verovatnoe da e inokulisani S. cerevisiae da dominira u
fermentaciji (Schtz i Gafner 1993), njegovo zasejavanje nee obavezno garantovati 100%
dominaciju soja ili njegov iskljuiv doprinos fermentaciji. Znaajni faktor koji utie na
rezultat jeste populacija autohtonih kvasaca koji se ve nalaze u soku, izboru soja kvasca i
njegovoj adaptaciji specifinim uslovima u vinu. Neophodno je izabrati odgovarajui soj
kvasca koji e rasti i biti metaboliki aktivan u datim uslovima, npr. soj kvasca koji dobro
podnosi niske temperature za fermentaciju belih vina, ili soj kvasca koji moe da podnese
vie temperature pri niskom pH i visokom % alkohola u fermentaciji crvenog vina. Kako nije
uvek lako odabrati soj kvasca za specifine uslove u vinu i za doprinos senzornim osobinama,
kompanija Lallemand, koja se izmeu ostalog bavi i proizvodnjom komercijalnih sojeva,
sastavila je tabelu kvasaca (Tabela 2) kako bi se olakalo proizvoaima vina da prevaziu
potekoe u odabiru odgovarajueg kvasca za svaku fermentciju.

4

Tabela 2 | Brza ocena kvasaca
Kriterijum za odabir soja kvasca Ocena
Odgovarajue za proizvodnju belog vina
1-4
Odgovarajue za proizvodnju roze vina 1-4
Odgovarajue za proizvodnju crvenog vina 1-4
Odgovarajue za restartovanje zastalih
fermentacija
1-4
Senzorni efekti Neutralno estri EVC
a

Temperaturni opseg (C) Opseg ne indicira optimalni
temperaturni opseg
Brzina fermentacije Spora srednja brza
Faktor kompetencije Senzitivni neutralni aktivni
Alkoholna tolerancija Daje se najvii nivo alkohola
koji podnosi
Relativni zahtevi za azotom
b
Nisko srednje visoko
Proizvodnja H
2
S (60 ppm N) Nisko srednje visoko
Proizvodnja H
2
S (170 ppm N) Nisko srednje visoko
Najvia ocena (kompatibilnost) = 4, Najnia ocena = 1. Sam proizvoa daje ocenu u
zavisnosti od toga za koju je vrstu vina namenjen kvasac.
a
EVC = Enhances Varietal Character (pojaava karakter raznolikosti)
b
relativni zahtevi za azotom odnosi se na to koliko azota jedan soj zahteva u odnosu na
druge sojeve u tabeli u uslovima limitiranog azota

Mnogobrojnost i varijacije u moguim nainima pripreme odabranog aktivnog suvog kvasca
za proizvodnju vina mogu biti jo vie zbunjujui jer razliiti proizvoai obezbeuju
razliite informacije za svoje sojeve kvasaca. Kako bi se vinarima olakalo da naprave
najbolji izbor, Istraivaki Centar Geisenheim napravio je jedinstveni sistem podataka kako
bi se pratile najbitnije osobine odabranih kvasaca koji su dostupni na tritu u Nemakoj. Ovi
podaci su prikupljeni u bazu podataka i moe im se pristupiti u elektronskoj formi na web
stranici istraivake stanice ili preko www.hefefinder.de. Sistem je napravljen tako da
predlae najpogodniji soj kvasca za specifine uslove i vrstu vina na osnovu detalja koje
moe bilo ko uneti na sajtu, a takoe vri i rangiranje izmeu sojeva kvasaca.

2.4. Primena aktivne suve starter kulture kvasca

Pored tradicionalne metode inokulisanja svee pripremljenog soka sa odreenom koliinom
aktivnog fermentiueg soka, koriste se dva tipa starter kultura kvasaca: tene starter kulture i
pripreme suvih starter kultura kvasaca. Veina starter kultura kvasaca su iste i sastoje se
samo od jednog soja Saccharomyces cerevisiae. Pripremljeni teni kvasci imaju ogranieno
trite jer imaju kratak rok trajanja. Tene starter kulture pripremaju same vinarije ili
komercijalni dobavljai (npr. lokalne laboratorije za vino ili instituti). Glavna razlika izmeu
ovih kultura i aktivnih suvih kvasaca jeste u tome to one nisu podvrgavane suenju tako da
imaju veliku populaciju vijabilniih elija, ali samo u kratkom vremenskom periodu. Njihova
glavna primena je u fermentaciji specifinih sokova kao to su selekcije suvih bobica ili
Comment [m1]: KAKO SE OVA TABELA
KORISTI
MENI JE JEDINO JASNO DA JE 4 DOBAR ALI
KAKO STIEM DO BROJA 4
Comment [M2]: U KATALOGU NA SAJTU
HTTP://WWW.LALLEMANDWINE.COM/SPIP.PHP?RUBRI
QUE33&ID_MOT=19&LANG=EN SU OCENE U VIDU
***, **, *, 0
5

hladna vina, pa ak i za pripremu penuavih vina. Aktivne suve starter kulture kvasaca se
uzgajaju u vie koraka sa odgovarajuim izvorima kiseonika i nutrijenata kako bi se proizvelo
kvasci sa optimalnim sadrajem proteina, ergosterola, nezasienih masnih kiselina i rezervnih
materijala (Monk 1986). Zatim se kvasac sui kako bi se ouvao tokom transporta i
skladitenja. Pored soja, sadraj trehaloze u elijama je jedan od najbitnijih faktora koji utiu
na otpornost kvasca na suenje i naknadnu rehidrataciju. Iz tog razloga postoje dobre
inicijative za proizvoae kvasaca da stimuliu stvaranje trehaloze tokom proizvodnje kako
bi se poveala rezistentnost elija kvasaca na stres dehidratacije i rehidratacije (Degre 1993).

2.4.1. Rehidratacija aktivnog suvog kvasca

Komercijalno pripremljen suvi kvasac obino sadri manje od 8% rezidualne vlage, u
mnogim sluajevima ak i manje (6%). Zato se aktivni suvi kvasac mora rehidrirati kako bi
se revitalizirao. Rehidratacija aktivnog suvog kvasca je veoma bitna, jer ako se ne odradi
kako treba moe dovesti do oslobaanja velikih koliina elijskog sadraja i gubljenja
vijabilnosti i vitalnosti (Henick-Kling 1988). Iako je rehidratacija kvasca direktna operacija, i
objavljena je nekolicina naunih i tehnikih lanaka koji opisuju ispravne tehnike za
odravanje zdrave membrane i optimalnog tehnolokog procesa, uputstva proizvoaa
variraju.

Degre (1993) je predloio optu proceduru u proizvodnji vina:
Posuti 500 g suvog kvasca u 5 L tople vode (35-40 C)
Promeati suspenziju nakon 5 min kako bi se resuspendovale sve elije
Ostaviti elije kvasca da stoje u suspenziji ne due od 30 min kako bi se izbeglo
korienje rezervnih materija

Dodati kvasac u 20-25 hL mota koji treba da se fermentie, to odgovara dozi od 25-30 g/hL
(oko 2-4 10
6
CFU/mL). Neki proizvoai kvasaca precizno preporuuju da se kvasci dre
u istoj vodi bez hlora tokom 15-30 min pre meanja. Drugi proizvoai preferiraju
natapanje kvasca u meavini soka i vode na temperaturi 35-40 C, jer e pri dodatku soka
elije kvasca, koje bi teoretski poele pupljenje tokom rehidratacije, imati izvor nutrijenata i
mogu se prilagoditi na uslove soka/mota. Ova procedura moe imati prednosti ukoliko
rehidratacija traje due od preporuenih 30 min. Radler i sar. (1985) su u svom najdetaljnijem
ispitivanju rehidratacije kvasca za vino, dobili da maksimalne vrednosti temperature za
rehidrataciju, pri kojima su elije kvasca jo uvek vijabilne i vre fermentaciju, iznose od 38
do 45 C. U toku 2 sata za rehidrataciju, nije uoena nikakva promena u ovim aktivnostima,
ali je sastav rehidratiue podloge imao bitnog uticaja. Otkriveno je da meavina soka od
groa i vode, rastvori koji sadre eer, vitamine ili soli imaju uticaj na metaboliku
aktivnost rehidratisanog kvasca. Najbolja aktivnost je postignuta rehidratacijom u 1%
rastvoru KCl. Rehidratacija u vie od 50% soka se ne preporuuje zbog osmotskog pritiska,
niskog pH i ponekad visokih koncentracija SO
2
ili fungicida.

6

2.4.2. Rehidratacija aktivnog suvog kvasca primenom rehidratiueg nutrijenta

Studije koje su sproveli Fornairon-Bonnefond i sar. (2002) pokazale su pozitivan uticaj
specifinih sterola tokom faze rehidratacije na strukturu plazmatske membrane, to rezultuje
boljim kapacitetom fermentacije, pogotovo u tekim uslovima u vinu. Beker i sar. (1984), su
ukazali na to da,poto su membrane pod stresom tokom procesa dehidratacije i rehidratacije,
kvasac mora da mobilie lipidne rezerve za obnavljanje. Soubeyrand (2005) je dokazao da
kvasac moe takoe i da inkorporira ekstracelularne lipide, ukljuujui i sterole, to je
interesantno jer ovi molekuli mogu da igraju vanu ulogu u vitalnosti elije kvasca i u
poslednjim fazama alkoholne fermentacije (Luparia i sar. 2004).

U groanom motu steroli su prisutni u obliku fitosterola, ali njihova priroda se razlikuje od
sterola koji su sintetisani u kvascima tokom rasta. Zbog razlike u hemijskoj strukturi, ovi
fitosteroli nisu dovoljni za zagarantovan integritet kvasca tokom cele alkoholne fermentacije
(Luparia i sar. 2004). Soubeyrand (2005) je prouavao mogunost inkorporiranja specifinih
kvasnih sterola tokom rehidratacije tako to je u medijum za rehidrataciju dodavao specifine
inaktivirane kvasce koje su bogati sterolima. Uticaj rehidratacije ADY u prisustvu
mikronitrijenata i/ili sterola i nezasienih masnih kiselina iz obogaene suspenzije
inaktiviranih kvasaca imalo je neverovatan uticaj na vijabilnost kvasaca (Kontkanen 2004).
Korienjem ovog tipa rehidratacije primeena je poveana maksimalna gustina elija kvasca
(Slika 1) i krai ukupni period fermentacije (Slika 2), naroito u uslovima visoke
koncentracije eera. Uticaj na kasniji uinak kvasaca je odlian. Preporuen postupak za
rehidrataciju kvasca korienjem rehidratiueg nutrijenta prikazan je u Tabeli 3.

Slika 1 | Uticaj rehidratacije ADY u suspenziji inaktiviranog kvasca, obogaenoj
mikronutrijentima i sterolima, na vijabilnost elija na kraju alkoholne fermentacije
(potencijalni sadraj alkohola 14% vol., temperatura fermentacije 28 C). Plava linija
predstavlja kontrolni uzorak (rehidratacija bez dodataka): 28 10
6
CFU/mL (42%). Crna
linija predstavlja rehidrataciju u prisustvu specifinih rehidratiuih nutrijenata: 42 10
6

CFU/mL (50%)

7

Slika 2 | Promena koliine osloboenog CO
2
od strane Saccharomyces cerevisiae soja
EC1118 u Chansan motu (240 g/L eera i 266 mg/L slobodnog amino azota) poreenje
rehidriranih ADY u suspenziji inaktiviranih kvasaca obogaenih mikronutrijentima i
sterolima, i standardne rehidratacije u vodi. Plava linija je kontrola (rehidratacija bez
dodataka); Crna linija predstavlja rehidrataciju u prisustvu specifinih rehidratiuih
nutrijenata. Fermentacija je voena u fermentorima zapremine 1,1 L u izotermskim uslovima
(28 C) uz lagano meanje (Sablyrolles 1993). Stopa proizvodnje CO
2
je automatski raunata
na osnovu masenog bilansa fermentora, izraena je u funkciji vremena.

Tabela 3 | Uputstvo za optimalnu rehidratacaiju kvasca primenom rehidratiueg nutrijenta
za inokulaciju 100 hL mota
Korak Radnja
1 Suspendovati 3 kg (30 g/hL) rehidratiueg nutrijenta za kvasac u 20 puta veoj
masi iste vode (43 C).
2 Kada se temperatura rastvora nutrijenta za rehidrataciju spusti na 40 C, dodati 2,5
kg aktivnog suvog kvasca (25 g/hL). Lagano promeati kako bi se razbile
eventualno prisutne grudvice. Ostaviti suspenziju da odstoji 15-30 min i ponovo
lagano promeati.
3 U toku od 5 min polako sjediniti masu mota za fermentaciju sa suspenzijom
kvasca. Ovo e pomoi kvascu da se prilagodi na hladniju temperaturu mota i
izbei e se ok na hladnou koji se moe desiti kada temperatura naglo padne za
vie od 10 C. Ovaj korak temperiranja trebalo bi ponoviti ukoliko je temperatura
mota izuzetno niska. Svaki stepen temperiranja trebalo bi da traje oko 5 min.
4 Kada se pone punjenje sudova motom, dodati suspenziju kvasca na dno
fermentora

2.4.3. Primena vie sojeva Saccharomyces cerevisiae kao starter kulture

Sponatana alkoholna fermentacije obino je voena od strane vie sojeva kvasaca. Nove
molekularne bioloke metode omoguavaju odreivanje razliitih populacija kvasaca u
prirodnim divljim fermentacijama u zavisnosti od faze fermentacije. Uinak razliitih
8

sojeva kvasca moe stvoriti veu kompleksnost arome vina na kraju, kako u pozitivnom tako
i u negativnom smislu. Pored preporuka za postizanje kompleksnosti u kontrolisanim
uslovima, pripremom odvojenih fermentacija sa odabranim sojevima kvasca i naknadnim
spajanjem fermenata razliitih kultura Saccharomyces cerevisiae, razvijene su i tehnike
kojima se imitira raznolikost spontane alkoholne fermentacije.

Sojevi kvasca se proizvode kao pojedinane kulture, a konana kombinacija se dobija
meanjem suvih istih kultura. Ipak, trite za meane kulture Saccharomyces cerevisiae je
malo zbog razliite uspenosti ovakvih inokulacija. Zbog razliitosti matriksa sok/vino,
uslovi u vinu mogu da vie pogoduju jednom od sojeva i da omogue njegovu dominaciju,
kao i da negativno utiu na interakcije izmeu sojeva, to na kraju utie na senzorne
karakteristike dobijenog vina.

2.4.4. Inokulisanje groanog mota sa Saccharomyces i ne-Saccharomyces sojevima

U nekim sluajevima vina koja se proizvode pomou istih mono-kultura nemaju
kompleksnost ukusa kao to daju dobre prirodne fermentacije. Ali divlje fermentacije
zahtevaju veu opreznost i predstavljaju rizik, mogu dovesti do stvaranja neprijatnih ukusa ili
nepotpunih fermentacija sa visokim koncentracijama rezidualnog eera, a sve to zbog
prisustva preteno nepoeljnih ne-Saccharomyces sojeva. Sojevi koji mogu obilno da rastu u
vinu, a koji imaju potpuno aerobni metabolizam ili su slabo fermentujui organizmi (npr.
Pichia membranifaciens, Pichia anomala i Candida spp.) su poznate po tome to formiraju
film na velikim povrinama vina i u polupopunjenim tankovima u kojima se ne nalazi
dovoljno sulfita za spreavanje njihovog rasta (Ocn i sar. 2010). Neke studije (Loureiro i
Malfeito-Ferreira, 2003) su pokazale da sojevi kvasaca poput Dekkera/Brettanomyces spp.,
Zigosaccharomyces bailii i Saccharomycodes ludwigii, predstavljaju najopasnije sojeve za
vino jer uzrokuju njegovo kvarenje. Ipak, ovi sojevi se retko nalaze na grou i u motu vina.

Nedavna istraivanja vina su otkrila egzotine sojeve ne-Saccharomyces kvasaca i pruila
vee saznanje o njihovom stvarnom uticaju na senzorni profil vina (Ciani 1997). Neki od
ovih sojeva, kao to su Pichia fermentans, Candida stellata ili Torulaspora delbrueckii,
prouavani su zbog svojih interesantnih organoleptikih doprinosa (Clemente-Jimenez i sar.
2005; Ciani i Ferraro 1996; Moreno i sar. 1991).

Iako neki od ovih sojeva mogu da doprinesu bukeu vina, veina njih nije sposobna da dovri
alkoholnu fermentaciju. Iz tog razloga je prouavano ukljuivanje sojava Saccharomyces
cerevisiae sa ne-Saccharomyces sojevima kako bi se prevaziao ovaj nedostatak. Prve
meovite komercijalne Saccharomyces cerevisiae/ne-Saccharomyces starter kulture
predstavljene su poetkom XXI veka sa razliitim uspehom usled nepredvidivih interakcija
izmeu populacija kvasca, koje su bile indukovane matriksom vina koji pospeuje dominaciju
jednog soja u odnosu na druge. Nedavna studija koju su sproveli Languet i sar. (2006)
pokazala je da se dobar uspeh moe ostvariti reprodukovanjem prirodnog naslea populacije
kvasaca sa sekvencijalnom inokulacijom prvo ne-Saccharomyes sojeva a zatim dodavanjem
9

dobro fermentiuih sojeva Saccharomyces cerevisiae u kasnijim fazama alkoholne
fermentacije. Ova sekvencijalna inokulacija pokazala je ne samo bolje rezultate u pogledu
intenziteta, ve i senzorne kompleksnosti.

Primena starter kultura kvasaca u proizvodnji penuavih vina: za proizvodnju penuavih vina
ili vina tipa ampanjca koriste se suve i tene starter kulture kvasaca za sekundarnu
fermentaciju u boci. Tene kulture moraju se napraviti u sterilnim uslovima ne samo da bi se
poveala zapremina inokuluma, ve i da bi se prilagodili tekim uslovima u bazi penuavog
vina. Takoe je neophodno i aklimatizovati kulture aktivnog suvog kvasca pre inokulacije za
sekundarnu fermentaciju, jer direktno dodavanje suspenzije rehidratisanog kvasca u medijum
koji sadri vee koncentracije alkohola moe da oteti elije kvasca.

I u ovom sluaju postoje varijacije protokola, a jedna iroko primenjena je opisana dole:
Rehidratisati ADY prema uputstvu proizvoaa, poeljno uz prisustvo rehidratiueg
nutrijenta
Dodati suspenziju kvasca u deo baze penuavog vina (3-10% ukupne zapremine) uz
dodatak soka od groa (do 50 g/L) ili eera (50-100 g/L) i amonijum fostata (0,5-2
g/L). Varijacija tradicionalne metode pripreme starter kulture sastoji se u upotrebi smee
jednakih delova baze vina, vode i tiranog likera (Wilkinson 1986).
Aklimatizovati tokom 12-20 h (kvasci poinju da proizvode alkohol) na 20-25 C.
Suspenzija se mora povremeno promeati kako bi kiseonik stimulisao rast kvasca. Ako
su uslovi veoma oteani ili je temperatura baze vina veoma niska, aklimatizovanje se
moe izvesti i na konstantno niskim temperaturama.
Opet, neophodno je izbegavati temperaturne razlike vee od 5 C pri prenoenju
suspenzije aklimatizovanog kvasca u konanu zapreminu vina.

2.4.5. Primena starter kultura kvasaca za nedovrene fermentacije

Dr. Paul Monk je govorio: Najbolje reenje za nepotpunu fermentaciju jeste njena
prevencija. Problemi se javljaju zbog izbistravanja mota, niske temperature fermentacije,
visokih temperatura pogotovo u prisustvu alkohola, nedostatka azota, mikro-nutrijenata,
sterola, visokih koncentracija eera ili alkohola, negativnoh interakcija sa drugim mikrobima
u vinu, rezidua prskanja. Razliiti faktori mogu imati negativan uticaj na vitalnost kvasaca
(Dittrich 1977), i koliko god okolnosti moe da uzrokuje nedovrene alkoholne fermentacije,
toliko je protokola proueno i preporueno za ponovno pokretanje nedovrene fermentacije
(Graf i Bannister 1996; Leske i Henschke 1996; Bisson i Butzke 2000; Fischer 2000). Svi
protokoli preporuuju odbacivanje starog kvasca i upotrebu alkohol-tolerantnog, energinog
fermentiueg soja kvasca, kako bi se ponovo pokrenula nedovrena fermentacija. Veina
protokola takoe preporuuje i dodatak SO
2
(30 mg/L) i/ili lizozima kako bi se izbegao rast
divljih kvasaca ili bakterija koje izazivaju kvarenje. Ako se u vinu oekuju potencijalno
inhibotrne supstance, preporuuje se i dodatak 25 g/hL inaktiviranog kvasca (Lafon-
Lafourcade i sar. 1984). Nakon to se inaktivirani kvasac istaloi (oko 48 h) vino se mora
odliti ili filtrirati. Priprema novog kvasca varira meu razliitim proizvoaima kvasaca i
10

istraivakih grupa. Grossmann je u poglavlju 7.6. knjige o mikrobiologiji vina (2005) dao 4
razliite preporuke koje su objavljene u literaturi o vinu.

Lallemand preporuuje:
1. Rehidratacija kvasca za spaavanje (50 g/hL) u rehidratiuem nutrijentu:
odgovarajua koliina rehidratiueg nutrijenta za kvasac iznosi 1,25 puta veu masu
od mase kvasca koja e se koristiti. Suspenziju rehidratiueg nutrijenta rastvoriti u 20
puta veoj masi iste vode na temperaturi od 45 C, uz lagano meanje,
omoguavajui rastvoru da se ohladi do 40 C. Kvasac se zatim pospe po suspenziji
uz lagano meanje kako bi se izbeglo stvaranje grudvica. Ostaviti suspenziju da
odstoji 15-30 min.

2. U meuvremenu, u drugoj posudi pripremiti smeu starter kulture sa 2,5% zapremine
vina sa nedovrenom fermentacijom i 2,5% zapremine vode i kompletnog kvasnog
nutrijenta (meavina 50 g/hL vina i vode). Koncentracije eera podesiti na 5 Brix (50
g/L) pomou soka, koncentrata ili eera. Temperaturu smee podesiti na 25-30 C.

3. Suspenzija rehidratisanog kvasca za ponovno pokretanje fermentacije mora se polako
dodavati u smeu vino/voda/eer. Temperaturu bi trebalo odravati na 15-30 C.
Nivo era se prati i kada opadne za polovinu (oko 2,5 Brix odn. 25 g/L) vino sa
nedovrenom fermentacijom se dodaje starter kulturi u arama od po 20% od ukupne
zapremine vina (ukupno 5 dodavanja starter kulturi). Temperaturu bi tada trebalo
odravati izmeu 20 i 25 C. Veoma je bitno da se izbegne potpuna konverzija eera
pre dodatka nove are. Jedino je dozvoljeno da se pre dodatka poslednje are vina
sa nepotpunom fermentacijom utroi sav eer.

Pre deset godina Gafnerova grupa (Stterlin et al. 2004) predloila je upotrebu
Zygosaccharomyces bailii za povratak odnosa glukoza-fruktoza na nivo iznad 0,1 zbog svog
fruktofilnog karaktera. Najbolji rezultati su dobijeni kada je soj Zygosaccharomyces bailii
inokulisan zajedno sa sojem Saccharomyces cerevisiae jer je Zygosaccharomyces bailii gubio
vijabilnost nakon korekcije glukoza-fruktoza odnosa, i tada soj Saccharomyces preuzima
fermentaciju vina do suvoe. Prve starter kulture Zygosaccharomyces bailii za restartovanje
nedovrene alkoholne fermentacije predstavljena je na nemakom tritu 2007. godine.

Jo jedan inovativni pristup jeste primena imobilizovanih sojeva kvasca Saccharomyces
cerevisiae koji su odabrani na osnovu svojih fermentacionih mogunosti i visoke tolerancije
na alkohol. Jedna od tipinih naina imobilizacije jeste inkapsuliranje koje podrazumeva
oblaganje mikroorganizama u alginatni matriks (prirodni polisaharid koji se ekstrahuje iz
morskih algi). Inkapsuliranje omoguava supstratu i metabilitima da lako difunduju kroz
matriks gela bez otputanja elija kvasca u mot ili vino. Prednost ove tehnike jeste u tome
to se kvasac moe lako inokulisati i odstraniti iz vina nakon konvertovanja eera u alkohol.

11

3. Primena bakterijskih starter kultura

Dugo vremena je spontano opadanje kiselosti vina bilo povezano samo sa taloenjem tartarne
kiseline, iako je jo 1891. Mller-Thurgau pretpostavio da smanjenje kiselosti moe biti usled
bakterijske aktivnosti. Godine 1913. Mller-Thurgau i Osterwalder, su svojim epohalnim
ispitivanjem bakterija mlene kiseline u vinu, objasnili bakterijsku degradaciju jabune
kiseline u mlenu i CO
2
prema formuli:

C
4
H
6
O
5
= C
2
H
6
O
3
+ CO
2

Ovaj fenomen su nazvali bioloka deacidifikacija ili malolaktika fermentacija, a Bacterium
gracile je opisan kao odgovorni organizam. Od ovih ranih otkria, istraivanje bakterija
mlene kiseline (LAB Lactic Acid Bacteria) je napredovalo. Ime Bacterium gracile koje je
u prolosti esto korieno za imenovanje organizma koji je zasluan za malolaktiku
fermentaciju, je revidirano. Radler (1963) je dokazao da bakterije mlene kiseline koje se
nalaze u motu i vinu pripadaju rodovima Lactobacillus, Leuconostoc i Pediococcus, a neto
novija istraivanja su dokazala i Oenococcus (Dicks i sar. 1995). Razliite LAB dospevaju u
groani sok i vino sa povrine groa, stabljika, lia, zemljita i opreme u vinarijama. Ipak,
usled visoko selektivnih uslova u razliitim sokovima i vinima, samo nekoliko tipova LAB
moe da raste u vinu (Wibowo i sar. 1985). Prouavanja u nekoliko drava pokazala su da je
Oenococcus oeni predominantna vrsta koja vri malolaktiku fermentaciju u vinu, iako u
kompoziciji LAB na poetku fermentacije dominiraju sojevi Lactobacillus.

Istorijski posmatrano, MLF je opisana kao fenomen koji je nepredvidiv i nedovoljno
razumljiv, ali od velike vanosti za krajnji proizvod. U nedavnoj prolosti vinari su bili
zadovoljni preputanjem prirode da ide svojim tokom i jednostavno su ekali da se MLF
odigra spontano (Rich Morenzoni 2005). Ovo strpljenje je bilo kljuno za komentare u vezi
sa MLF tipa ne odigrava se kad ja to hou i ne svia mi se ta napravi u vinu. Nedavno
istraivanje MLF pomoglo nam je da bolje razumemo ovaj proces bioloke deacidifikacije
vina i limitirajue faktore u vinu koji su odgovorni za uinkovitost bakterija mlene kiseline
koje vre ovu biotransformaciju.

Kada se susretnemo sa vinom koje je prolo kroz spontanu malolaktiku fermentaciju, to
znai da su bakterije mlene kiseline prevazile sve potekoe koje su se javile tokom
njihovog boravka u vinu. Ipak, to ne znai da e nam ove bakterije dati MLF koju moemo
da predvidimo, niti e nam omoguiti ba onu koja pozitivno utie na senzorne i
organoleptike osobine koje mi elimo. To jedino znai da su bakterije mlene kiseline
prisutne u vinu, i da one, a ne vinar, imaju ultimativnu kontrolu na kvalitet gotovog
proizvoda (Rich Morenzoni 2005).

12

3.1. Selekcija i karakterizacija bakterija mleno-kiselog vrenja za
pripremu starter kultura u proizvodnji vina

Oslanjanje na autohtone sojeve bakterija da na vreme dovre poeljnu malolaktiku
fermentaciju moe biti nepouzdano, ak i pri niskim pH vrednostima u motu i vinu. ak i
kada su poeljne bakterije jabune kiseline nastanjene u vinarijama, za poetak malolaktike
fermentacije moe biti potrebno i do nekoliko meseci, i moe se dogoditi da se javi samo u
nekim buradima i tankovima dok u drugim ne. Iz tog razloga, preferira se opcija pokretanja
MLF primenom odabranih starter kultura bakterija. Oenococcus oeni je organizam izbora za
MLF, ali nisu svi sojevi ove bakterije dobri kandidati za primenu kao starteri. Odabir soja
Oenococcus oeni, koji je najbolji u pogledu uinka i proizvodnje najinteresantnijeg ukusa, je
viestruk i sloen zadatak (Bou i Powell 2005). Vano je da se izoluju i kultiviu samo
prirodni sojevi malolaktikih bakterija (MLB). Tako su Ruiz i sar. (2010) vrili su selekciju
autohtonih sojeva O. oeni prema njihovim enolokim osobinama i rezultatima vinifikacije.
Analiziranli su 84 soja O. oeni koji su bili predstavnici svakog velikog klastera dobijenog u
dendogramu iz prethodne studije biodiverziteta (Izquierdo i sar. 2009). Vina koja imaju
prirodno selektivni niski pH, nisku temperaturu u podrumu, visoku koncentraciju alkohola i
SO
2
, koriste se kao izvor izolata malolaktikih bakterija. Fiziologija i genetski profil novih
sojeva i sojeva od interesa odreuju se u laboratoriji i pilot vinarijama. Jedan od prvih
kriterijuma za izolat odabranih bakterija jeste sposobnost da podnese rigorozni stres kojem se
izlae tokom proizvodnje vina (Bou i Powell 2005) kao i korak liofilizacije (freeze-drying).
Pored visoke rezistentnosti na limitirajue uslove u vinu kao to su pH, alkohol, SO
2
i
temperatura, bakterije se biraju i na osnovu eljenih metabolikih aktivnosti i odstustva
neeljenih osobina (Tabela 4).

Tabela 4 | Kriterijumi za selekciju malolaktikih bakterija za proizvodnju vina
Poeljni Nepoeljni
Otpornost na stres tokom proizvodnje
Otpornost na liofilizaciju
Otpornost na niski pH
Visoka tolerancija na alkohol
Visoka tolerancija na SO
2

Dobar uinak na niskim temperaturama
Kratka lag-faza
Brza razgradnja jabune kiseline
Dobra tolerancija na kiseonik
Tolerancija na pesticide
Poveana rezistencija na lizozime
Proizvodnja bakteriocina
Formiranje velikih koliina
egzopolisaharida
Domaini pro-faga
Previsoka tolerancija na SO
2

Prebrza degradacija jabune kiseline (ima
ulogu u crvenom vinu i za stabilizaciju
boje)
Aktivnost -glukozidaze
Aktivnost esteraze
Proizvodnja prijatnih vonih aroma
Smanjenje vegetativnih nota
Proizvodnja biogenih amina
Proizvodnja etil karbamata
Proizvodnja komoponenti S-derivata
Proizvodnja isparljivih kiselina
13

Zaokruivanje oseaja u ustima
Smanjenje adstrigentnosti
Smanjenje gorine
Poveanje kompleksnosti
Smanjenje ukupnog SO
2
(razgradnja
acetaldehida i keto-komponenti)
Proizvodnja acetaldehida (stabilizacija
boje crvenog vina)
Proizvodnja umerenih koliina diacetila
Proizvodnja butandiola
Niski afinitet prema glukozi
Proizvodnja etil acetata
Proizvodnja mirisa na mievinu
Proizvodnja nestabilnih fenola
Proizvodnja neprijatnih ukusa poreklom od
geranijuma
Proizvodnja (prekomernih koliina)
diacetila
Brza degradacija limunske kiseline
Proizvodnja/degradacija acetaldehida
Degradacija limunske kiseline

3.2. Priprema malolaktike starter kulture

Kontrola malolaktike fermentacije, koja je sastavni deo procesa proizvodnje vina, esto je
bila ignorisana, sve dok nisu postale dostupne malolaktike starter kulture. Tene ML kulture
bile su dostupne i koristile su se decenijama sve do ranih 1980-ih, kada su razvijene
liofilizirane starter kulture malolaktikih bakterija. 1990-ih razvijena je tehnika direktne
inokulacije liofilizovanih ML starter kultura i njihova upotreba je doslovno revolucionarno
uticala na kontrolu i predvidivost malolaktike fermentacije u vinu (Specht 2005). U Tabeli 5
sumirani su parametri koji se odnose na razliite tipove ML startera u proizvodnji vina.

Na veinu starter kultura koje su dostupne za proizvodnju vina povoljno utiu uslovi uvanja
u friideru ili zamrzivau, u njihovom originalnom, neotvorenom pakovanju; ambalaa se ne
bi smela otvarati sve do samog momenta upotrebe. Pored toga, bakterije koje su pripremljene
liofilizacijom trebalo bi da se dre van kontakta sa kiseonikom, povienom vlagom i visokim
temperaturama, jer ti uslovi tetno deluju na preivljavanje bakterija. Kako bi se obezbedio
maksimalni efekat starter kultura ML bakterija uvek se mora pratiti preporuka proizvoaa o
nainu uvanja i rukovanja. Dole je predstavljen pregled najee korienih uputstava za
pripremu ML starter kultura:

Zamrznute ML starter kulture
1. Odmrznuti u vodi na sobnoj temperaturi, ne u friideru. Pomeati 3 L vode, 3 L soka
od groa i 30 g ekstrakta kvasca. Podestiti pH na 4,0 pomou kalcijum karbonata ili
nekog drugog dozvoljenog pufera i dobro promeati. Dodati 170 g odmrznute kulture,
zatvoriti balon i dobro promeati. Drati na 18-24 C tokom 48 h pre inokulacije.
2. Direktno dodati zamrznute pelete u vino.

Tena suspenzija ML starter kultura
Koristiti bistar istaloen sok bez dodatog SO
2
. Ako je mogue, zagrejati sok na 60 C.
Podesiti nivo eera na 180 g/L dodatkom vode (ako je sok nedostupan, moe se zameniti sa
50% gotovog vina (< 10 ppm bez SO
2
i niski ukupni SO
2
), 25% vode i 25% soka od jabuke).
Podesiti pH na 3,5-3,6 primenom kalcijum karbonata. Ako je u inokulisanom vinu pH < 3,2
14

podesiti u meukoraku na 3,4. Dodati kulturu i odravati temperaturu na 22-26 C. Pratiti do
100% razgradnje jabune kiseline, zatim uveati inokulum za 10% u svakoj narednoj fazi.
Ako se koristi gotovo vino za pripremu starter kulture onda se starter uveava tako to se
dodaje duplo vea zapremina vina sve dok se ne postigne 5-10% od ukupne zapremine koja
se inokulie.

Direktna inokulacija starter kulturama (npr. malolaktike bakterije MBR

firme Lallemand)
Specijalna priprema NIJE POTREBNA, ali se radi olakanog rukovanja kultura moe
suspendovati u istoj vodi bez hlora, na temperaturi od 20 C, najdue tokom 15 min.

Brza build-up starter kultura (1-STEP
pribor)
Faza rehidratacije: rastvoriti sadraj aktivatora u 100 L vode za pie na temperaturi od 18 i 25
C. Dodati sadraj kesice sa bakterijama i paljivo suspendovati uz lagano meanje. Saekati
20 min.
Faza aklimatizacije: pomeati bakterije i rastvor aktivatora sa 100 L vina, pH > 3,5;
temperatura izmeu 20 i 25 C. Saekati 18 do 24 h. Preneti aktivnu kulturu u 1000 hL vina.

Tradicionalna liofilizirana STANDARDNA starter kultura
Rehidratisati u smei 50:50 voda/vino. Vino bi trebalo da ima pH > 3,3 i ukupni SO
2
< 30
mg/L. Pratiti opadanje koncentracije jabune kiseline, kada se ~2/3 konvertuje u mlenu
kiselinu, proiriti sa dodatkom 5% inokuluma u vino. Pobrinuti se da pH > 3,3 i sadraj
alkohola bude < 12,5%. Pratiti opadanje koncentracije jabune kiseline, kada se ~2/3
konvertuje u mlenu kiselinu, proiriti sa dodatkom 4% inokuluma u vino.

Tabela 5 | Osobine ML starter kultura (prilagoeno iz Specht 2005)
Osobina
Tip kulture malolaktikih bakterija
Zamrznuta
kultura
Tena
suspenzija
Direktna
inokulacija
(MBR)
Brza build-up
kultura
(umnoavanje
u 1 koraku)
Tradicionalna
liofilizirana
kultura
(standard)
Temp.
skladitenja
Do 120 dana na
-26 C ili do 1
Do 2 dana
na sobnoj
Do 18 meseci
na -4 C ili
Do 18 meseci
na -4 C ili do
Do 18 meseci
na -4 C ili do
i rok trajanja godine na
-29 C u
zamrzivau bez
leda
temp. ili do
2 nedelje na
-4 C
do 30 meseci
na -18 C
30 meseci na
-18 C
30 meseci na
-18 C
Otvorena
ambalaa
Nakon otvaranja
iskoristiti
odmah, ne
zamrzavati
Iskoristiti
odmah
Iskoristiti
odmah
Iskoristiti
odmah
Iskoristiti
odmah
Vreme za
pripremu
startera
48 h pre
inokulacije
desetostruki
rast tokom
3-7 dana
0-15 min 18-24 h 3-14 dana
Nutritivni
suplementi
30 g ekstrakta
kvasca na
podlogu za
1 g
ekstrakta
kvasca po
Odgovarajui
MLB
nutrijenti koji
Odgovarajui
aktivator.
MLB
Odgovarajui
MLB
nutrijenti koji
15

aktivaciju litru
podloge za
rast
su
preporueni
za zahtevnije
uslove MLF.
nutrijenti koji
su preporueni
za zahtevnije
uslove MLF.
su
preporueni
za zahtevnije
uslove MLF.
Stepen
iskorienosti
Crveno vino 1
g/hL; Belo vino
3-8,5 g/hL
2-5%
zapremine
inokuluma,
odn. 5-10%
zapremine
ukoliko se
koristi
gotovo vino
za pripremu
startera.
1 g/hL 0,5 g/hL 1 g/hL

3.3. Odabir odgovarajue malolaktike starter kulture

Postoje dve osnovne stavke koje se razmatraju pri odabiru malolaktike starter kulture:
1. Bezbednost kompatibilnost kulture sa uslovima u vinu
2. Senzorne osobine eljeni doprinos razliitih ML sojeva
Za uspeno pokretanje malolaktikih fermentacija, najvanije je da se na to bolji nain
malolaktike bakterije pripreme za uslove sredine koji preovladavaju u vinu (Tabela 6).

Kako 4 limitirajua faktora (alkohol, pH, temperatura i SO
2
) imaju kumulativni uinak na
stres bakterija, Lallemand je razvio tablicu, koja omoguava davanje ocene, kumulativnih
bodova, uticaja razliitih parametara u vinu (Tabela 7). Rezultujui TOTAL odgovara
nivou oteanosti za poetak MLF u vinu:
< 13 bodova = povoljna
13-22 bodova = nepovoljna
23-40 bodova = teka
> 40 bodova = ekstremno teka

U zavisnosti od soja Oenococcus oeni, u uoptenom sluaju starter kulture prilikom direktne
inokulacije imaju sledeu toleranciju:
Alkoholna tolerancija < 15 % vol.
pH tolerancija > 3,1
Tolerancija ukupnog SO
2
< 60 ppm
Temperaturna tolerancija > 12 C

Pored uslova u vinu koji su opisani u Tabelama 6 i 7, drugi uslovi koji se moraju uzeti u obzir
kada se planira selekcija, priprema i inokulacija za MLF podrazumevaju:
Vina koja su imala oteanu alkoholnu fermentaciju imaju veu verovatnou da ne
sadre dovoljno nutrijenata koji su neophodni za odravanje bakterija tokom MLF.
16

Limitirani nutrijenti smatraju se jednim od glavnih uzroka nepotpunih malolaktikih
fermentacija.
to je nii pH u vinu, ispod 3,5 to su vee nutritivne potrebe bakterija za MLF.
Sposobnost bakterija da rastu i vre MLF drastino opada sa padom temperature vina.
U zavisnosti od alkoholnog sadraja vina, poviene temperature vina mogu takoe da
deluju inhibitorno na razvoj i aktivnost ML bakterija.

Tabela 6 | Opta karakterizacija uslova za MLF u vinu
Uslovi u vinu za
MLF Povoljna Teka Gruba
Izuzetno
oteana/nepotpuna
MLF
Alkohol (% v/v) < 13 13-15 15-17 > 17
pH > 3,4 3,1-3,4 2,9-3,1 < 2,9
Slobodni merljivi
SO
2
(mg/L)
< 8 8-12 12-20 > 20
Ukupni SO
2

(mg/L)
< 30 30-40 40-60 > 60-80
Temperatura (C) 18-22 14-18 10-14 < 10
Problemi u vezi sa
alkoholnom
fermentacijom
Nema Stres kvasaca Spora/prekinuta
Preporuena
metoda za
inokulaciju MBR

Direktna
(MBR) bez
aklimatizacije
Direktna
(MBR) ili uz
proceduru
aklimatizacije
Direktna
(MBR) kultura
uz proceduru
aklimatizacije
MLF se ne
odigrava; metod
MBR aklimatizacije
za inokulaciju vina
sa prekinutim MLF

Opte uputstvo za izbegavanje inhibitornih efekata glasi:
1. Sadraj alkohola u vinu (% v/v), temperatura za MLF ne bi trebalo da osciluje:
manje od 14,5 % 28 C
vie od 14,5 % 23 C
2. Sadraj isparljivih kiselina u vinu iznad 0,4 g/L (u obliku tartarne kiseline) verovatno
e inhibirati malolaktike bakterije
3. Vina koja se due od 3 meseca uvaju na inaktiviranim kvascima najbolje je oistiti
pre pokuaja da se sprovede MLF.
Postoje razne procedure aklimatizovanja kako bi se prevazili limitirajui uslovi u vinu.
Protokol koji je opisan dalje u poglavlju 3.4. razvijen je u cilju inokulacije MBR priprema
bakterija u vina, kako bi se pokrenula zastala malolaktika fermentacija.

Tabela 7 | Bodovna tablica za odreivanje lakoe fermentacije jabune kiseline
1 poen 2 poena 8 poena 10 poena Rezultat
Alkohol (% vol) < 13 13-15 15-17 > 17 =
pH > 3,4 3,1-3,4 2,9-3,1 < 2,9 =
Slobodni SO
2

(mg/L)
< 8 8-12 12-15 > 15 =
Ukupni SO
2
< 30 30-40 40-60 > 60 =
17

(mg/L)
Temperatura
(C)
18-22 14-18 ili
18-24
10-14 ili
24-29
< 10 ili
> 29
=
Nutritivne
potrebe kvasca
Niske Srednje Visoke Veoma
visoke
=
Lakoa
alkoholne
fermentacije
Bez
problema
Prolazni
stres kvasca
Spora/
nepotpuna
AF
Produen
kontakt
kvasca
=
Poetni nivo
jabune kiseline
(g/L)
2-4 4-5 ili 1-2 5-7 ili 0,5-1 > 7 ili < 0,5 =
Maksimalni AF
odnos (max.
gubitak
Brix/dan)
< 2 2-4 4-6 > 6 =
Napomena: Drugi, trenutno manje poznati faktori, koji nisu razmatrani u ovoj bodovnoj
tabeli, mogu se odnositi na nivo rastvorenog kiseonika, sadraj polifenola, sleganje taloga,
ostatke pesticida itd.
Ukupni rezultat za lakou malolaktike fermentacije dobija se kao suma vrednosti iz
poslednje kolone.

3.4. Pokretanje zastale malolaktike fermentacije

Vinari su svesni toga da su bakterije Oenococcus oeni, koje su odgovorne za malolaktiku
fermentaciju, uspene samo ako se prilagode tekim uslovima u fermentujuem motu ili
gotovom vinu. Direktno dodavanje MLB sojeva od ozbiljnih proizvoaa, koji su odabrani
kako na osnovu njihovog doprinosa senzornim osobinama, tako i zbog njihove sposobnosti
da se prilagode nepovoljnim uslovima, opisano je ranije. Tokom proizvodnje kultura, elije
MLB prolaze kroz biofoziko stanje koje indukuje proizvodnju zatitnog proteina. U ovom
fiziolokom stanju, elije se prikupljaju i zamrzavaju nakon ega se sue u smrznutom stanju.
Kao rezultat toga, dobijaju se elije koje su sposobne da razviju prirodnu otpornost na uslove
u vinu tako da se direktno mogu dodati u vino bez znaajnog gubitka vijabilnosti. Nekad se
prekinuta MLF moe pokrenuti jednostavnim dodavanjem svee rehidratisanih kultura MLB.
U drugim sluajevima je potrebna neto vea adaptacija MLB da bi se postigao isti uinak.
Ova adaptacija moe biti od presudnog znaaja za smanjenje uticaja nepovoljne sredine u
matriksu vina na bakterije, i pospeiti zavravanje MLF. Lallemand je u saradnji sa MLF
R&D timom u Australiji radio na razvijanju strategije aklimatizovanja MLB za dovravanje
zastalih malolaktikih fermentacija u vinu.

Protokol adaptacije za rukovanje zastalim malolaktikim fermentacijama (Specht 2005)

I Faza
Izvriti predtretman vina i podesiti temperaturu
Pripremiti vino sa zastalom MLF odstranjivanjem taloga, potencijalnih inhibitornih
toksina i inhibitornih organizama kvarenja. Male koliine SO
2
i/ili lizozim (ili
18

filtracija) mogu biti neophodni kako bi se kontrolisale nepoeljne bakterije
Lactobacillus ili Pediococcus.
Lizozim je veoma efikasan u inhibiranju bakterija mlene kiseline koje uzrokuju
kvarenje, naroito ako je pH vina > 3,5. Ukoliko se koristi lizozim, mora se voditi
rauna da ne ostaje nikakva rezidualna aktivnost u tretiranom vinu pre inokulacije
malolaktikih bakterija. U vinu sa zastalom MLF za koje se sumnja da sadri
supstance koje su toksine za MLB, preoruuje se predtretman sa inaktiviranim
reziduama kvasca (inaktivirani kvasci) u koncentraciji 6,25-12,5 g/hL. Pripremiti
suspenziju inaktiviranih kvasaca u vodi ili vinu, i zatim dodati u vino sa zastalom
MLF uz meanje.
Konano, podesiti temperaturu vina sa zastalom MLF na18-22 C (65-72 F)

Lizozim je enzim koji se ekstrahuje iz belanceta jajeta a ima dokazano dejstvo na bakterije
mlene kiseline. Postoje primeri koji ukazuju na to da korienje lizozima moe da sprei
MLF i kada se koriste manje koliine SO
2
. Prema Gerbaux i sar. (1998), dodavanje SO
2

moe biti smanjeno kada je prisutan lizozim u vinu i dovoljna mikrobioloka zatita postie
se i sa 30 ppm slobodnog SO
2
. Korienje lizozima nema nikakvog direktnog uticaja na
alkoholnu fermentaciju. Kada se uzima u obzir da li koristiti lizozim u belom vinu, trebalo bi
uzeti u obzir sledee injenice (Preuzeto sa www.pavin.hr):
Lizozim nema antioksidativno dejstvo. Znai SO
2
se ne moe kompletno izostaviti.
Poto lizozim ima proteinsku strukturu, tretman bentonitom e ga odmah inaktivirati.
Lizozim je protein, i njegovo delovanje prestaje nakon nekoliko nedelja. Znai
lizozim moe biti blokiran ili inhibiran za vreme vinifikacije, a vino se mora filtrirati
pre punjenja u flae kako bi se spreila MLF u flai.
Aktivnost lizozima opada sa smanjenjem pH.
Postoji rizik od kontaminacije kada se kupairaju tretirana i netretirana vina.
Inaktivirani lizozim e preostati u vinu. Zbog proteinske strukture lizozima, tretirana
vina e pokazati pozitivnu reakciju tokom zagrevanja. Meutim, brojni
eksperimentikroz nekoliko godina nisu pokazali proteinsku nestabilnost vina u flai.
Najvea korist upotrebe lizozima uoava se u sanitarnom enolokom pogledu vina.
UPOZORENJE: Dodatak metavinske kiseline, u svrhu stabilnosti vina na tartarate, u vina
tretirana lizozimom prouzrokovae jae zamuenje vina.

II Faza
Napomena: Dole navedene zapremine odnose se na 10.000 L vina sa zastalom MLF.
Aklimatizovati kulturu bakterija u tri koraka:
1. Pripremiti medijum za aklimatizovanje:
Pomeati:
- 10 L soka od groa (bez SO
2
)
- 10 L vode (bez hlora)
- 20 L vina sa zastalom MLF
Nakon dodatka svih sastojaka podesiti pH izmeu 3,6 i 4,0. Temperaturu podesiti na
25-30 C.
19

2. Rehidratacija starter kulture ML bakterija:
Podesiti temperaturu vode za pie (bez hlora) na 22-25 C. Suspendovati 1 kg
rehidratiueg nutrijenta za ML u 5 L vode.
Rehidratisati 100 g malolaktikih bakterija direktnom inokulacijom u 5 L suspenzije
voda/nutrijent.
Ostaviti suspenziju bakterija da odstoji 15 min.

3. Aklimatizovanje rehidrirane kulture malolaktikih bakterija
Pomeati medijum za aklimatizaciju (iz 1. koraka) sa rehidriranim malolaktikim
bakterijama (iz 2. koraka).
Ostaviti malolaktike bakterije da se aklimatizuju na 22-25 C najmanje tokom 2 h a
najvie tokom 4 h.
Nakon ovog prvog stepena aklimatizacije, udvostruiti zapreminu aklimatizovane
kulture vinom sa zastalom fermentacijom (npr. u 50 L kulture dodati 50 L vina).
Ukoliko nije mogue analizirati sadraj jabune kiseline na licu mesta, u cilju
praenja MLF, moe se pretpostaviti da e inokulisana kultura biti spremna za 4-6 h.
Razvoj CO
2
trebalo bi da bude oigledan i/ili trebalo bi da se oseti blagi mleni miris.
Ukoliko je dostupna brza analiza jabune kiseline, 50-70% bi se trebalo, pre poetka
III faze, konvertovati u mlenu kiselinu.

III Faza
Dodati ML nutrijent i aklimatizovanu kulturu iz II faze u vino sa zastalom
fermentacijom.
Pre inokulacije dodati nutrijent (20 g/hL) u vino. Cilj je da se prevaziu eventualni
nedostaci hranljivih materija i da se smanji rizik od rezidualnih nutrijenata u vinu.
Uz lagano meanje, kako bi se izbegla prekomerna aeracija, prebaciti aklimatizovanu
kulturu malolaktikih bakterija u 10.000 L vina sa zastalom MLF.
Preporuuje se redovno praenje nivoa jabune kiseline (svake 2 nedelje) i nestabilnih
kiselina (jednom nedeljno).

3.5. Doprinos malolaktike starter kulture senzornom kvalitetu vina

Uloga svake isparljive komponente kao mirisa u kompleksnoj aromi vina moe se opisati u
vidu jednog ili vie senzornih opisa (Franco i sar. 2004). Pored toga, kao to su i drugi autori
navodili (Gomez-Mguez i sar. 2007; Muoz i sar. 2007; Peinado i sar. 2006), mirisne (ili
aromatine serije se mogu definisati grupisanjem svih isparljivih komponenti sa slinim
senzornim osobinama; moe se izraunati opti OAV (Odour Activity Value) svake
aromatine serije sabiranjem OAV pojedinanih komponenti. Na taj nain moe se
uspostaviti mirisni profil vina crtanjem grafika svih optih OAV od svake aromatine serije;
dobijenni OAV aromatini krug omoguuje povezivanje kvantitativnih osobina, dobijenih
20

hemijskom analizom, sa senzornim percepcijama, i prua validno sredstvo za uporeivanje
aromatskih profila vina (Capone i sar. 2013).

Smanjenje kiselosti vina i modifikacija njegovog ukusa usled sekundarne bakterijske
fermentacije, esto se smatraju beneficijom za kvalitet vina. Prednost indukcije malolaktike
fermentacije (MLF) inokulacijom odabranih sojeva bakterija mlene kiseline je dvostruka.
Prvo, bolja je kontrola vremena i brzine konverzije jabune kiseine; i drugo, pozitivno utie
na ukus i kvalitet vina. Istraivanja tokom poslednjih godina pokazala su pozitivan uinak
specifinih bakterija starter kultura i uslova, ukljuujui brzinu i vreme inokulacije za MLF,
na senzorni profil belog, crvenog i roze vina. Metabolika aktivnost malolaktikih bakterija
(MLB), kao i kinetika MLF, utiu na profil vina u zavisnosti od razliitih tehnika proizvodnje
vina, fizikog i hemijskog sastava vina (pH, alkohol, temperatura, sadraj limunske kiseline,
SO
2
i aeracija) i prisustva taloga (Lallemand Winemaking Update 01/2007). Malo toga se zna
o uticaju stresa poput pH i etanola na mogunost proizvodnje isparljivih aromatinih
komponenti od strane LAB (Knoll i sar. 2011). Olgun i sar. (2009) su ispitivali uticaj
sadraja etanola i vrednosti pH na ekspresiju gena za citratni ciklus u O. oeni i pokazali su da
na ekspresiju ovih gena etanol ima velikog uticaja, dok je efekat pH neto manji.

3.5.1. MLF otkriva arome sorte

Od svih bakterija mlene kiseline koje su aktivne u vinu, Oenococcus oeni je najee
odgovoran za malolaktiku fermentaciju. Njegov sekundarni metabolizam ima veliog uticaja
na senzorne osobine vina (Bartowsky i Borneman, 2011). Analize strukture populacije O.
oeni, putem genetske karaterizacije reprezentativnih vrsta, smatra se neophodnim korakom u
cilju ispitivanja mikrobiologije MLF u odreenim podrujima gde se proizvode vina
(Borneman i sar. 2012). Iz tog razloga se poslednjih godina radi se na intenzivnijem
ispitivanju ovih bakterija. Cappello i sar. (2014) izvrili su bio-molekularnu karakterizaciju
autohtonih O. oeni sojeva iz Negroamaro vina. Bakterije O. oeni smanjuju kiselost i
modifikuju senzorni profil vina, to povoljno utie na njegov kvalitet. Na primer, intenziteti
cvetnih, vonih, zainskih i mednih nota arome (Slika 3), povezani su sa poveanjem
isparljivih komponenti poreklom od glikozida, koje nastaju tokom MLF. Studija koju su
sproveli Ugliano i Moio (2006) potvruje ulogu O. oeni u razvoju isparljivih komponenti
karakteristinih za sortu. Njihov rad je pokazao da koncentracije ukupnih glikozida drastino
opadaju tokom MLF. Dolazi do hidrolize glikozidnih aromatinih prekursora i kao posledica
toga oslobaaju se sortne arome iz groa. Vanost ovog fenomena zavisi i od bakterija koje
su se koristile za MLF i od sastava vina.

Drugim reima, ekspresija ovih razliitih aroma, koje su znaajne za ukupnu aromu vina,
zavisi ne samo od potencijala sorte groa ve i od tipa malolaktike kulture. Ovim se
potvruju ranija posmatranja uticaja aktivnosti glukozidaze iz MLB. Na primer, tokom MLF
aktivnost glukozidaze iz O. oeni dovodi do oslobaanja isparljivih komponenti koje su
povezane sa prekursorima arome groa, ukljuujui 3-hidroksidamaskon, -terpineol,
vanilin, metil-vanilat, 4-hidroksibenzoat i tirozol iz Chardonnay ekstrakta (Bartowsky i
21

Henschke 2004), kao i linalool, -terpenol, nerol i geraniol iz Muscat ekstrakta (Ugliano i sar.
2003). Ove studije ukazuju na mogunost glikozidne aktivnosti O. oeni, i naknadnog
oslobaanja grupa aroma tokom MLF, da utiu na pojaavanje senzornih karakteristika vina.

Slika 3 | Krug aroma za senzornu ocenu vina (Preuzeto sa www.chaikenvineyards.com)

3.5.2. Regulisanje diacetila uticaj brzine inokulacije MLB i vremena dodavanja na
profil arome

Diacetil je jedna od glavnih aromatinih komponenti koje nastaju u toku malolaktike
fermentacije, i odgovoran je za note putera i lenika koje su tipine za MLF. Njegov uticaj je
veoma bitan za profil vina, i u zavisnosti od eljene vrste vina, moe biti eljena ili veoma
nepoeljna komponenta. I zaista, razliite studije koje su sproveli Martineau i Henick-Kling
22

(1995) i Bartowsky i Henschke (2004) pokazale su da proizvodnja diacetila od strane
razliitih sojeva starter kultura O. oeni moe rezultovati potpuno drugaijim profilom arome.
Pri odabiru malolaktike kulture kao kriterijum mora se uzeti u obzir potencijal svakog
bakterijskog startera za proizvodnju diacetila. Pored diacetila, tip startera koji se odabere
moe takoe da modifikuje i druge familije aroma.

Inokulacija visokim nivoom malolaktikih kultura ne samo da ubrzava poetak i tok
malolaktike fermentacije, ve i rezultuje niim nivoom diacetila. Uopteno se preporuuje
da se vino inokulie populacijom od 10
6
CFU/mL kako bi se postigla kritina bakterijska
populacija, osigurala brza inicijacija MLF i pravilna razgradnja jabune kiseline. Krieger
(2005 a, b) prouavao je nivo diacetila u Pinot noir vinu gde je MLF inicirana razliitim
stopama inokulacije malolaktikih bakterija. Pri niskoj stopi inokulacije od 2 10
4
CFU/mL
produena je lag-faza (14 dana) i proizvedeno je 3,9 mg/L diacetila, dok je inokulacijom 4
10
6
CFU/mL razgradnja jabune kiseline otpoela momentalno i proizvedeno je 0,8 mg/L
diacetila. Inokulisanjem vie od 2 10
6
CFU/mL rezultovalo je taloenjem diacetila u vinu sa
granicom od skoro 1,5 mg/L za bela i roze vina.

Vreme kada se vri inokulacija moe biti jednako vano za krajnje senzorne osobine vina. U
saradnji sa DLR Neustadt & Trier pravljena su Rizling vina primenom razliitih tajminga
inokulacije malolaktikih kultura (Krieger 2006). Ovi eksperimenti pokazali su da
koinokulacija istovremena inokulacija bakterija i kvasaca ne utie na alkoholnu
fermentaciju niti na poveanje isparljivih kiselina; ali smanjuje ukupno trajanje MLF.
Koinokulisana Rizling vina nisu imala mlene ili puteraste arome, koje potiu od MLF, ali su
imali jak intenzitet isparljivih vonih aroma. Diacetil koji je proizveden u takvim uslovima,
tokom alkoholne fermentacije, momentalno je transformisan u butandiol, koji pri tim
koncentracijama nema miris. Ista vina koja su inokulisana kulturama za MLF nakon
alkoholne fermentacije imala su tipiniji senzorni karakter za MLF, sa dominacijom nota
putera i lenika dok je vona aroma nestala. Kontrolna vina bez MLF bila su vie kisela,
zelena i vegetativna.

Neto novijeg datuma, Caas i sar. (2012) su ispitivali uticaj vremena inokulacije odabranih
autohtonih bakterija mlene kiseline na senzorne osobine Tempranillo i Merlot vina u
paniji. Vreme koje je bilo potrebno da sadraj eera u svakoj vrsti mota padne ispod 1 g/L
i da koncentracija L-jabune kiseline bude < 0,1 g/L, bilo je mnogo krae u odnosu na
primenu koinokulacije. Sama duina trajanja MLF, koja je merena kao vreme od inokulacije
LAB do smanjenja koncentracije jabune kiseline, bilo je due u sluajevima ispitivanja
sekvencijalne inokulacije nego ukupno vreme fermentacije pri tretmanu koinokulacijom
(Caas i sar. 2012). Ovi rezultati se podudaraju sa izvetajima drugih autora (Azzolini i sar.
2010; Jussier i sar. 2006; Massera i sar. 2009) i znaajni su sa tehnoloke take gledita jer je
potrebno manje vremena za zavravanje procesa proizvodnje vina i potvrena je rana
mikrobioloka stabilnost vina.

23

3.5.3. Uticaj post-MLF tehnika u proizvodnji vina na senzorne osobine

Izbor izmeu sazrevanja na talogu i filtriranja nakon malolaktike fermentacije utie na
senzorni profil vina. Kvasci iz taloga mogu da razgrade diacetil, i batona moe da smanji ili
ak eliminie puterastu aromu. Proizvodnja diacetila se poveava kada je vino u kontaktu sa
kiseonikom. Kiseonik doprinosi oksidaciji acetolaktata u diacetil. Nielsen and Richelieu
(1999) pokazali su da akumulacija diacetila u semi-aerobnim uslovima moe biti i do 6 puta
vea nego u anaerobnim uslovima. Pored toga, redukcija diacetila u acetoin i butandiol zavisi
od redoks potencijala vina. Niski redoks potencijal je u vezi sa niskim nivoom diacetila.

4. Zakljuak

irom sveta dostupno je vie od 200 sojeva aktivnog suvog vinskog kvasca, to vinskoj
industriji omoguuje znaajnu bioloku raznovrsnost. Broj komercijalno dostupnih aktivnih
suvih malolaktikih starter kultura je limitiran, ali se od nedavno poveao. Dok kulture
aktivnog suvog kvasca uglavnom pripadaju Saccharomyces cerevisiae, starter kulture za
pokretanje malolaktike fermentacije uglavnom se sastoje od Oenococcus oeni. Sojevi
kvasaca i bakterija odabrani su na osnovu njihove tolerancije na limitirajue uslove u vinu,
njihovih senzornih i enolokih sposobnosti da isprate kreativne i bezbednosne zahteve u
savremenoj vinskoj industriji. Od sutinske vanosti je neophodno znati koji su parametri
vina i osobine starter kultura kako bi se odabrao odgovarajui soj kvasca, bakterije i
odgovarajui nain ishrane u cillju pogaanja groa, fermentacionih uslova i zadatih stilskih
ciljeva.

Razliiti komercijalni sojevi Saccharomyces cerevisiae su do sada primenjivani u proizvodnji
vina, u nastojanju da se postigne dominanta populacija eljenog soja za poetak fermentacije
i da se osigura potpuno iskorienje eera (Carrau i sar. 2010). U budunosti moemo se
susresti sa zahtevima za primenu drugih sojeva kvasaca, pored Saccharomyces cerevisiae ili
kultura bakterija mlene kiseline koje nisu Oenococcus oeni.

24

5. Literatura

Osnovna literatura:

Knig H., Unden G., Frhlich J. (editors), 2008. Biologyo f Microorganisms on Grapes, in
Must and in Wine, Springer, Heidelberg, Germany, pp. 489-510.

Dopunska literatura:

Azzolini M., Tosi E., Vagnoli P., Krieger S., Zapparoli G., 2010. Evaluation of technological
effects of yeastbacterial co-inoculation in red table wine production. Italian Journal of
Food Science 3 (22), 257-263.
Bartowsky E.J., Borneman A.R., 2011. Genomic variations of Oenococcus oeni strains and
the potential to impact on malolactic fermentation and aroma compounds in wine.
Applied Microbiology and Biotechnology, 92, 441-447.
Borneman A.R., McCarthy J.M., Chambers P.J., Bartowsky E.J., 2012. Comparative analysis
of the Oenococcus oeni pan genome reveals genetic diversity in industrially relevan
pathways. BioMed Central Genomics 13: 373.
Caas P. M. I., Prez-Martn F., Romero E. G., Prieto S. S., Herreros M. L. P., 2012.
Inuence of inoculation time of an autochthonous selected malolactic bacterium on
volatile and sensory prole of Tempranillo and Merlot wines. International Journal of
Food Microbiology, 156, 245-254.
Capone S., Tufariello M., Siciliano P., 2013. Analytical characterization of Negroamaro red
wines by Aroma Wheels. Food Chemistry, 141, 2906-2915.
Cappello M. S., De Domenico S., Logrieco A., Zapparoli G., 2014. Bio-molecular
characterisation of indigenous Oenococcus oeni strains from Negroamaro wine. Food
Microbiology, 42, 142-148.
Carrascosa A. V., Muoz R., Gonzlez R. G. (editors), 2011. Molecular Wine Microbiology,
Acadamic Press, Madrid, Spain, pp. 279-302.
Carrau F., Medina K., Faria L., Boido E., Dellacassa E., 2010. Effect of Saccharomyces
cerevisiae inoculum size on wine fermentation aroma compounds and its relation with
assimilable nitrogen content. International Journal of Food Microbiology, 143, 81-85.
Franco M., Peinado R. A., Medina M., Moreno J., 2004. Off-vine grape drying effect on
volatile compounds and aromatic series in must from Pedro Ximnez grape variety.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52, 3905-3910.
Gerbaux, V., Gerland, C., Villa, A., 1998. Le Lysozyme: Nouvel outil biotechnologique pour
matriser les bactries lactiques. Revue des nologues, 93, 44-46.
Gomez-Mguez J. M., Cacho J. F., Ferreira V., Vicario I. M., Heredia F. J., 2007. Volatile
components of Zalema white wines. Food Chemistry, 100, 1464-1473.
Izquierdo P.M., Ruiz P., Sesea S., Palop M. L., 2009. Ecological study of lactic acid
microbiota isolated from Tempranillo wines of Castilla-La Mancha. Journal of
Bioscience and Bioengineering, 108, 220-224.
25

Jussier D., Morneau A.D., Mira de Ordua R., 2006. Effect of simultaneous inoculation with
yeast and bacteria on fermentation kinetics and key wine parameters in cool-climate
Chardonnay. Applied and Environmental Microbiology, 72, 221-227.
Knoll C., Fritsch S., Schnell S., Grossmann M., Rauhut D., du Toit M., 2011. Inuence of pH
and ethanol on malolactic fermentation and volatile aroma compound composition in
white wines. LWT - Food Science and Technology, 44, 2077-2086.
Loureiro V., Malfeito-Ferreira M., 2003. Spoilage yeasts in the wine industry. Review of
International Journal of Food Microbiology, 86, 23-50.
Massera A., Soria A., Catania C., Krieger S., Combina M., 2009. Simultaneous inoculation of
Malbec (Vitis vinifera) musts with yeast and bacteria: effects on fermentation
performance, sensory and sanitary attributes ofwines. Food Technology and
Biotechnology, 47, 192-201.
Muoz D. M., Penaido R. A., Medina M., Moreno J. 2007. Biological aging of sherry wines
under periodic and controller microaerations with Saccharomyces cerevisiae var.
capensis: effect of odorant series. Food Chemistry, 100, 1188-1195.
http://www.chaikenvineyards.com/http:/www.chaikenvineyards.com/archives/category/vinne
z-newsletter (pristup 06.09.2014.)
http://www.pavin.hr/clanak/kontrola-malolakti%C4%8Dne-fermentacije-prakti%C4%8Dni-
pristup (pristup 05.09.2014.)
Ocn E., Gutirrez A. R., Garijo P., Lpez R., Santamara P. 2010. Presence of non-
Saccharomyces yeasts in cellar equipment and grape juice during harvest time. Food
Microbiology, 27, 1023-1027.
Olgun N., Bordons A., Reguant C., 2009. Inuence of ethanol and pH on the gene
expression of the citrate pathway in Oenococcus oeni. Food Microbiology, 26 (2), 197-
203.
Peinado R. A., Mauricio J. C., Moreno J. 2006. Aromatic series in sherry wines with gluconic
acid subjected to different biological aging conditions by Saccharomyces cerevisiae var.
Capensis. Food Chemistry, 94 (2), 232-239.
Ruiz P., Izquierdo P. M., Sesea S., Palop M. L., 2010. Selection of autochthonous
Oenococcus oeni strains according to their oenological properties and vinification
results. International Journal of Food Microbiology, 137, 230-235.

Starter Kulture Bakterija I Kvasaca U Proizvodnji Vina

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Starter Kulture Bakterija I Kvasaca U Proizvodnji Vina

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

TEHNOLOKI FAKULTET, NOVI SAD

You might also like