Lipoblastoma es un raro tumor benigno de tejido blando _ _ parecido a tejido adiposo

fetal que afecta principalmente a los nios menores de tres aos de edad (Sciot y
Mandahl, 2002). Histo-lgicamente, este tipo de tumor es relativamente fcil de
diagnosticar, pero en casos raros, el lipoblastoma puede imitar liposarcoma mixoide
histolgicamente (Mentzel et al., 1993). Los anlisis citogenticos han demostrado
que las varias entidades diagnsticas de tumores lipognicos se basan en distintas
anomalas citogenticas.

Lipoblastomas se caracterizan por cariotipos diploides cercanas con aberraciones
estructurales del cromosoma 8, mientras que los liposarcomas se caracterizan por la
translocacin t (12; 16) (q13; p11) (Dei Tos y Dal Cin, 1997; Fletcher et al, 2002;.
Sandberg , 2004). En el lipoblastoma, los cambios tpicos son los reordenamientos
clonales citogenticas que implican regin cromosmica 8q11] q13 (para una revisin
Sandberg, 2004; Somers et al, 2004;. Morerio et al, 2005;.. Brandal et al, 2006).
Cambios numricos se encontraron slo en pocos casos, especialmente al ganancia del
cromosoma 8 (Sandberg et al, 1986;. Bata-nian et al, 2001;.. Gisselsson et al, 2001). El
gen de adenoma pleomrfico 1 (PLAG1; 8q12) se encuentra en la regin cromosmica
8q12 los dentro de la regin crtica de 8q11] q13 (Kas et al, 1997a.). PLAG1 codifica
un factor de transcripcin y se ha demostrado estar implicado en la tumurognesis del
lipoblastoma como un supesto objetivo oncognico.
Curiosamente, PLAG1 ha sido implicado como un activador de la transcripcin para el
gen IGF2. Entonces IGF2 estimula la proliferacin de las clulas progenitoras de los
adipocitos que subyacen en el importante papel de PLAG1 en lipoblastoma (Voz et al.,
2000).
Hibbard et al. (2000) han descrito los hallazgos genticos de los rearreglos
moleculares que involucran la regin crtica del 8q11] q13. En tres casos, los
rearreglos que unen la regin cromosmica 8q12 con 8q24.1 dieron como resultado
un gen de fusin de la sintasa 2 (HAS2) gen de cido hialurnico y el gen PLAG1. La
fusin de la HAS2 y el gen PLAG1 conduce a 'promotores de intercambio (promoter
swaping)' que se traduce en una activacin de la expresin del PLAG1 . En otro caso,
una t(7, 8) (p22; q12) result en una fusin del gen colgeno 1 alfa 2 (COL1A2) y gen
PLAG1 (Hibbard et al, 2000.). strm et al. (2000), la presentacin de un caso de
lipoblastoma con una translocacin t (1; 6) (q42; p22), han demostrado que PLAG1
tambin se puede activar sin anormalidades citogenticas observables del cromosoma
8.
De acuerdo con Gisselsson et al. t(2001), PLAG1 tambin se activa a travs de
amplificaciones de bajo nivel, especialmente en los casos con cromosomas 8
adicionales . Este tipo de activacin PLAG1 fue identificado recientemente en el
hepatoblastoma t(Zatkova et al., 2004). Anlisis de hibridacin genmica comparada
(CGH) de los hepatoblastomas han revelado una ganancia del brazo largo del
cromosoma 8, que subyace en el fondo de la citogentica molecular que puede
conducir a la activacin de PLAG1 t(Weber et al., 2000).
En este informe se demuestra que la amplificacin de bajo nivel del cromosoma 8 es
un nuevo mecanismo en la activacin de PLAG1 en lipoblastoma.


Materiales y mtodos

reporte de un caso

Se presentan en una nia de cuatro aos de edad que presentaba una inflamacin
indolora del muslo izquierdo. La resonancia magntica (RM) mostr un gadolinium
(Magnevist )mejorada del tumor entre los msculos del muslo dorsal y sin
infiltracin u otros signos de malignidad (Fig. 1A). Despus de la biopsia, el tumor fue
resectado mediante una intervencin quirrgica. Macroscpicamente, el tumor
encapsulado (6 cm de dimetro mximo) mostr como un tejido graso con reas
gelatinosas. Microscopa revel lbulos irregulares de las clulas de grasa inmaduras
sin atipia nuclear en diferentes etapas de desarrollo en un estroma mixoide con un
patrn vascular plexiforme, separadas por septos fibrosos, en consonancia con
lipoblastoma (Fig. 1B, C). No se observo recidiva del tumor en un perodo de tres aos
de seguimiento.

El anlisis cromosmico

El anlisis cromosmico se realiz en 12 clulas en metafase con bandeo
GTG obtenidos despus del cultivo de tejido tumoral de acuerdo con los protocolos
estndar (Barch et al., 1997). Tejido tumoral fresco se tritur manualmente, y las
pequeas muestras de tejido se cultivaron con DMEM/HamsF12 (EnInvitrogen,
Karlsruhe, Alemania), 10% de suero fetal de bovino (Invitrogen) y 0,05 mg / ml de
gentamicina (Biochrom, Berln, Alemania). Los cromosomas fueron bandeados con
GTG y el cariotipo se establecen de acuerdo con las recomendaciones de ISCN (1995).

El anlisis cromosmico

Interfase hibridacin fluorescente in situ (IP- FISH)
Se llev a cabo IP - FISH en ncleos extrados de fijado con formalina , embebido en
parafina ( FFPE ) secciones de tejido de la lipoblastoma y el tejido normal adyacente
de la paciente como se describe anteriormente ( Rpke et al . , 2004 ) . IP- FISH se
realiz utilizando clones BAC RP11 - 144N16 ( PLAG1 ; 8q12 ) , RP11 - 442A17 (
8q12.3 ) , RP11 - 453N18 ( 8q13.2 ) , RP11 - 35O6 ( 8q21.11 ) , RP11 - 379N22 ( 8q21.
3 ) y RP11 - 299I14 ( HAS2 ; 8q24.12 ) , as como las sondas de translocacin LSI
comerciales ETO/AML1 ( 8q21.3 / 21q22 ) y LSI IGH/MYC/CEP8 (
14q32/8q24/8p11.1-q11.1 ) . Como control , se utiliz una sonda centromrica para
el cromosoma 8 ( CEP8 , espectro verde ) . Las sondas de translocacin y la sonda
centromrica del cromosoma 8 se dispone comercialmente (Abbott , Wiesbaden ,
Alemania ), mientras que todos los clones BAC fueron amablemente proporcionados
por el Prof. M. Rocchi (Universidad de Bari , Italia). BAC ADN se aisl utilizando el kit
de Nucleo - bond - AX ( Machery & Nagel , Dren , Alemania ) . Todos los clones de BAC
fueron etiquetados con SpectrumOrange - dUTP ( Abbott ) por desplazamiento de la
mella utilizando el kit de traduccin Nick ( Abbott ) . Los productos marcados se
purificaron mediante co - precipitacin con 1 ug Cuna de ADN ( Roche , Mannheim,
Alemania ) y 1 ug de ADN de esperma de salmn ( Invitrogen ) . Los pellets se
resuspendieron entonces en LSI / PMC tampn de hibridacin ( Abbott ) .

T-PCR
El ARN total fue extrado a partir del tumor fresco congelado y como un tejido graso
normal usando la ARN QIAamp Blood Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con el
protocolo del proveedor para el aislamiento de ARN del tejido despus de la
homogeneizacin del tejido. Dos muestras diferentes de ARN se aislaron a partir del
tejido tumoral (muestra 1 y 2). Como control, se utiliz ARN de tejido de la placenta
que mostraron PLAG1 (Kas et al., 1997a). Para la sntesis de ADNc, 2 ug de ARN total
fue transcrito reversa utilizando Superscript II (Invitrogen) como se ha descrito
anteriormente (Wieland et al., 1999). 2 l resultante del gen primer captulo de cDNA
se amplific utilizando el juego de primers para el 5` regin del gen PLAG1 5 ` -
CGGAGGGAGGA-TGTTAAAGC- 3` y 5 ` -TGATTACTGATGGAAAAAGCCTCAG-3 ` .
Debido a la variante de splicing alternativo del exn 2, los cebadores de PCR
amplificado dos productos de 124 y 229 pb. Como control de ARN intacto y de ADNc,
la Housekeeping gen GAPDH fue amplificado (Wieland et al., 1999).

CGH

Para el anlisis de CGH, se uso diana metafsica de un cariotipo masculino normal
fueron preparados de acuerdo con protocolos estndar (Barch et al., 1997). ADN
genmico se aisl de secciones de FFPE de la lipoblastoma y el tejido normal
adyacente de la paciente utilizando el QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen). ADN masculino
de alto peso molecular genmico se prepar a partir de EDTA-sangre segn Miller et
al. (1988). ADN El paciente s (ADN prueba) a partir de tejido tumoral y normal fue
etiquetado por separado con SpectrumOrange-dUTP (Abbott), y el ADN masculino
normal (ADN de referencia) se marc con SpectrumGreen-dUTP (Abbott) utilizando el
kit de traduccin Nick (Abbott). Para cada hibridacin de 300 ng de ensayo marcada y
200 ng de DNA de referencia marcado se purificaron mediante co-precipitacin de
etanol con 10 g Cuna de ADN (Roche) y 10 g de ADN de esperma de salmn
(Invitrogen). Los Pellets se resuspendieron en 10 l LSI / PMC tampn de hibridacin
(Abbott) y se aplican a metafases varones normales. Despus de tres das a 37 C en
una cmara hmeda, los portaobjetos se lavaron durante 2 min en 0,4! SSC/0.3% NP-
40 a 73 C y despus durante 1 min en 2! SSC/0.1% de NP-40 a temperatura
ambiente. Despus del lavado, los portaobjetos se contratieron con DAPI y montado
con una solucin antifading (Vectashield, Vector Laboratories, Burlingame, CA,
EE.UU.). Metafsica se analizaron usando un microscopio de epifluorescencia
(Axioplan2, Zeiss, Alemania) equipado con diferentes conjuntos de filtros de paso de
banda individuales para DAPI, SpectrumGreen y SpectrumOrange de fluorescencia, y
una cmara CCD refrigerada para la adquisicin de imgenes. Imgenes digitales
multicolores se registraron utilizando el sistema Cytovision (Applied Imaging, Santa
Clara, CA, EE.UU.). Las metafases fueron evaluados de acuerdo a los criterios de Du
Manoir et al. (1995). Umbrales de diagnstico utilizados para la identificacin del
cromosoma bajo representaciones (deleciones) y sobre representaciones
(duplicaciones) fueron de 0,75 (lmite inferior) y 1,25 (lmite superior),
respectivamente. Coeficiente medio de perfiles se determinaron sobre la base del
anlisis de 25 metafsica.

Resultados

Citogentico y anlisis citogentico molecular

El anlisis citogentico convencional por bandeo GTG revel el cariotipo 48 -50, XX,
del (8) (q13q21.2), + DEL (8) (q13q21.2)x 4 [CP12] (Fig. 2). En la mayora de las _, se
identificaron cuatro copias derivativas del cromosoma 8 derivado, pero algunas
metafases mostraron _ tres o cinco copias derivativas del cromosoma 8. Estos
cromosomas adicionales condujeron a la amplificacin de bajo nivel de la regin
cromosmica 8pter] 8q13 y 8q21.2] 8qter, respectivamente. En contraste con esta
amplificacin, una monosoma parcial se observ para la regin cromosmica 8q13]
8q22. Para analizar si esta amplificacin es un artefacto de la cultura, se aislaron los
ncleos a partir de tejido FFPE de la muestra del tumor y el tejido normal adyacente
para IP-FISH. Los anlisis IP-FISH, usando ocho sondas diferentes para el brazo largo
del cromosoma 8 y una sonda centromrica para el cromosoma 8, confirmaron los
resultados del anlisis citogentico convencional. Como se observa en el anlisis
citogentico convencional, la muestra tumoral demostr cinco seales con la sonda
centromrica (CEP8) de cromosoma 8 en la mayora de los ncleos (Fig. 3A).
En contraste con el tejido del tumor, la muestra no tumoral analizada mostraron dos
seales para el centrmero del cromosoma 8 en la mayora de los ncleos (Fig. 3B). El
IP-FISH, utilizando las sondas de locus especficos para el brazo largo del cromosoma
8, revel la amplificacin de bajo nivel con hasta ocho seales con clones BAC RP11-
144N16 (PLAG1; 8q12), RP11-442A17 (8q12.3), RP11-379N22 (8q21.3), RP11-
299I14 (HAS2; 8q24.12), as como las sondas para el ETO y el gen cMYC (fig. 3C). En la
mayora de los ncleos clones BAC RP11-453N18 (8q13.2) y RP11-35O6 (8q21.11)
demostraron slo una seal, mientras que cinco seales especficas con la sonda
centromrica para el cromosoma 8 eran observables (Fig. 3D).

No hay diferencia entre el tejido tumoral y no tumoral fue visto utilizando la sonda
locus especficas para el gen IgH en el cromosoma 14 y el gen AML1 en el cromosoma
21.
Utilizando el anlisis de CGH, la ganancia del cromosoma 8 se confirm en el tejido
tumoral. Adems, no hay otras prdidas o ganancias podran ser identificados en el
tejido tumoral utilizando el anlisis de CGH (fig. 4). El tejido no tumoral no mostr
anomalas, especialmente en el cromosoma 8 (datos no mostrados).

Anlisis de la expresin de la expresin del PLAG1

la expresin del PLAG1 se evalu mediante anlisis de RT-PCR. la expresin del PLAG1
puede ser detectada en el tejido del tumor de los lipoblastoma, pero ninguna
expresin la expresin del PLAG1 se observ en los tejidos normales adultos de grasa.
Esto est de acuerdo con los datos anteriores (strm et al., 2000). Ambas variantes
de los splicing alternativo del exn 2 se pudo demostrar en el tejido tumoral como se
ve en los ARN de control a partir de tejido de la placenta (Fig. 5).


Discusin

Lipoblastoma usualmente demostr cariotipos casi diploides con reordenamientos
estructurales de 8q11] q13 (Sand-berg, 2004). El dedo de zinc PLAG1 gen de
desarrollo regulado est localizado dentro de esta regin crtica (Kas et al, 1997a.), Y
este gen se considera un objetivo oncognico supuesto en lipoblastoma (strm et al,
2000;.. Hibbard et al, 2000). En pleomrfico adenomas del gen PLAG1 de glndulas
salivales se activan por translocaciones, dando lugar a nuevos genes de fusin, lo que
lleva a "promotor de intercambio '.

Debido a esta "promotor intercambio ', el gen PLAG1 normalmente Regulado hacia
abajo se activa (Kas et al, 1997b;. Voz et al, 1998;.. strm et al, 1999). En
lipoblastoma, dos genes de fusin quimricas, HAS2/PLAG1 y COL1A2/PLAG1, fueron
identificados como la causa de la activacin PLAG1 (Hibbard et al., 2000). En
lipoblastoma, se describieron otros reordenamientos citogenticas que implican los
regin cromosmica 8q12, que conduce a la hiptesis de que PLAG1 tambin puede
ser activado a travs de otros promotores.
Las regiones citogenticas caractersticos de puntos de ruptura en el cromosoma 8 se
encuentran entre 8q11 y 8q13 y, en casos raros, en 8q22 o 8q24 (Gisselsson et al,
2001;. Sciot et al, 2003;. Para su revisin Sandberg, 2004; Somers et al. , 2004; Morerio
et al, 2005;. Bourelle et al, 2006;. Brandal et al, 2006).. Estos hallazgos demuestran
que otros genes pueden apoyar la tumorignesis lipoblastoma.
En el lipoblastoma, una delecin de la regin cromosmica del (8) (q13q22) se
observ en dos casos publicados y una delecin del (8) (q11.2q13) en otro caso
(Fletcher et al, 1993;.. Brandal et al, 2006; Craver et al, 2006).. Adems, los cambios
numricos del cromosoma 8 se han descrito slo en unos pocos casos (Sandberg et al,
1986;. Batanian et al, 2001;.. Gisselsson et al, 2001). Gisselsson et al. (2001) plante la
hiptesis de estos resultados que PLAG1 tambin puede ser activado a travs de
amplificaciones de bajo nivel. Recientemente, este tipo de activacin oncognica de
PLAG1 fue identificado en el hepatoblastoma (Zatkova et al., 2004). En este informe,
hemos podido demostrar la activacin de PLAG1 en un caso de lipoblastoma travs de
la amplificacin de bajo nivel de un cromosoma derivado 8 con una delecin del (8)
(q13q21.2).
El anlisis citogentico del tejido del tumor revel el cariotipo 48 50, XX, del ()
(q13q21.2), + DEL () (q13q21.2)! 4 [CP12], con un mximo de cinco copias del
cromosoma 8 derivativo . Anlisis IP-FISH en ncleos aislados de una muestra FFPE
de la lipoblastoma confirmaron los resultados del anlisis citogentico. La
amplificacin y la regin de la delecin se confirmaron con IP-FISH utilizando _ Clones
BAC y Sondas comerciales del brazo largo del cromosoma 8 .
El anlisis de CGH tambin confirm la amplificacin de las regiones parciales del
cromosoma , mientras que la delecin no es claramente detectable. Este resultado
CGH podra ser debido al menor tamao de la delecin en combinacin con la
amplificacin y los distintos nmeros del cromosoma 8 derivativo .
Sin embargo, el CGH no pudo demostrar mayores ganancias y prdidas. Por otra parte,
una amplificacin del cromosoma 8 no fue detectable en el tejido normal del paciente.
Este resultado demuestra que en este caso, del cromosoma 8 derivtivo y su
amplificacin constituyen la nica razn de citogentica para el desarrollo de esta
lipoblastoma.
La amplificacin gnica es un mecanismo frecuente de activacin de oncogenes. Aqu,
mostramos que la amplificacin de PLAG1 es un evento crtico an ms en la
tumorignesis lipoblastoma. El anlisis citogentico demostr una translocacin en la
mayora lipoblastoma.
Sin embargo, del puntos de quiebre no siempre se encuentran en el gen PLAG1 en
8q12. Por lo tanto, es necesario obtener ms informacin sobre los antecedentes
genticos de lipoblastomas, especialmente mediante el uso de tecnologa de CGH
array-based. Puede ser posible que la amplificacin del gen PLAG1 tuvo una mayor
influencia en la tumorignesis lipoblastoma de lo esperado.
En conclusin, hemos podido demostrar que la amplificacin del cromosoma conduce
a la activacin de PLAG1. Adems, nuestras observaciones hacen hincapi en la
importancia de PLAG1 en el desarrollo de lipoblastoma.