TecnicBasicas Colif Tot Fecales Ecoli NMP 6529 2

Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. !!".
#$cnicas %ara el
Anlisis Micro&iol'gico (e Alimentos.
a
e(. )aculta( (e *u+mica, ,-AM. M$.ico.
Mtodo para la determinacin de bacterias conformes,
coliformes fecales y Escherichia coli por la tcnica de
diluciones en tubo mltiple (Nmero ms Probable o NMP)
OBJ!"#O$
Diferenciar los organismos coliformes totales de los microorganismos
coliformes fecales.
Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua o alimentos mediante la
bsqueda de microorganismos coliformes totales, coliformes fecales y
Escherichia coli .
Organizar e interpretar los resultados.
%N&'(")')$
Debido a que un gran nmero de enfermedades son transmitidas por va
fecal-oral utilizando como vehculo los alimentos y el agua, es necesario
contar con microorganismos que funcione como indicador de contaminacin
fecal. Estos deben de ser constantes, abundantes y e!clusivos de la materia
fecal, deben tener una sobrevivencia similar a la de los patgenos
intestinales y debe de ser capaces de desarrollarse e!traintestinalmente.
El grupo coliforme es constante, abundante y casi e!clusivo de la materia
fecal, sin embargo, las caractersticas de sobrevivencia y la capacidad para
multiplicarse fuera del intestino tambi"n se observan en aguas potables, por
lo que el grupo coliforme se utiliza como indicador de contaminacin fecal en
agua# conforme mayor sea el nmero de coliformes en agua, mayor ser$ la
probabilidad de estar frente a una contaminacin reciente.
%uando los coliformes llegan a los alimentos, no slo sobreviven, sino que se
multiplican, por lo que en los alimentos el grupo coliforme adquiere un
signi&cado distinto al que recibe en el agua. En productos alimenticios que
han recibido un tratamiento t"rmico 'pasteurizacin, horneado, coccin,
etc.(, se utilizan como indicadores de malas pr$cticas sanitarias.
)os microorganismos coliformes constituyen un grupo heterog"neo con
h$bitat primordialmente intestinal para la mayora de las especies que
involucra.
El grupo de bacterias coliformes totales comprende todos los bacilos *ram-
negativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan
la lactosa con produccin de gas en un lapso m$!imo de +, h. a -./% 0 1/%.
Este
Versin %ara A(ministra(or (e Manuales y / 001 mentos 2AMy/3. )aculta( (e *u+mica,
,-AM
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. !!". #$cnicas %ara el
a
grupo esta conformado por + g"neros principalmente2 Enterobacter,
Escherichia, Citrobacter y Klebsiella.
El grupo de coliformes fecales, est$ constituido por bacterias *ram-
negativas capaces de fermentar la lactosa con produccin de gas a las +, h.
de incubacin a ++.. 0 3.1 /%. Este grupo no incluye una especie
determinada, sin embargo la m$s prominente es Escherichia coli.
)a demostracin y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse
mediante el empleo de medios de cultivo lquidos y slidos con
caractersticas selectivas y diferenciales.
Escherichia coli es un bacilo corto *ram negativo que se encuentra
clasi&cado dentro de la familia Enterobacteriaceae 'bacterias ent"ricas(,
e!iste como comensal en el intestino delgado de humanos y animales. 4in
embargo, hay algunas cepas de E. coli patgenas que provocan
enfermedades diarreicas. Estas E. coli se clasi&can con base en las
caractersticas que presentan sus factores de virulencia nicos, cada grupo
provoca la enfermedad por un mecanismo diferente. )as propiedades de
adherencia a las c"lulas epiteliales de los intestinos grueso y delgado son
codi&cadas por genes situados en pl$smidos. De manera similar las to!inas
son mediadas por pl$smidos o fagos.
Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas2 E.
coli enteroto!ig"nica 'E5E%(, E. coli enteropatgena 'E6E%(, E. coli
enterohemorr$gica 'E7E%(, E. coli enteroinvasiva 'E8E%(, E. coli
enteroagregativa 'E9E%( E. coli enteroadherente difusa 'D9E%(. E!isten otras
cepas que no han sido perfectamente caracterizadas# de las cepas
anteriores, las + primeras est$n implicadas en into!icaciones causadas por el
consumo de agua y alimentos contaminados.
Escherichia coli enteroto*i+nica !, es reconocida como el agente
causal de la diarrea del via:ero, la cual se caracteriza por diarreas acuosas
con o sin &ebre. Este tipo de infecciones es muy frecuente en pases
subdesarrollados y afecta principalmente a los ni;os.
6atog"nesis2 El microorganismo es capaz de producir dos tipos de to!ina.
<na to!ina termol$bil de apro!imadamente ,= >Da cuya secuencia,
antigenicidad y funcin es similar a la to!ina del clera, la otra to!ina que
produce es termoestable y es de ba:o peso molecular '+ >Da( y es capaz de
resistir temperaturas de ebullicin hasta por -3 minutos.
)a infeccin puede ser adquirida por el consumo de alimentos como
vegetales frescos 'lechuga en ensaladas( y agua. )a dosis infectiva para
adultos ha sido calculada en apro!imadamente 13
,
bacterias, por otra parte
en :venes y ancianos la dosis infectiva puede ser m$s ba:a.
,-AM
a
Escherichia coli enteropat+ena ,P- Es causa importante de diarrea
en los lactantes particularmente en los pases en vas de desarrollo. )a E%E6
se adhiere a las c"lulas de la mucosa del intestino delgado. 4us factores de
virulencia favorecen la adhesin y en ocasiones penetra a las c"lulas
mucosas. )a infeccin por E%E6 provoca diarrea acuosa generalmente
autolimitada aunque en ocasiones puede ser crnica.
6atog"nesis. El microorganismo produce dos protenas2 la intimina que es
codi&cada por el gen eae y un factor de adherencia que es codi&cado por un
pl$smido, ambas protenas permite su unin a los enterocitos y la
destruccin de las microvellosidades intestinales.
)as epidemias causadas por este microorganismo se deben al consumo de
agua contaminada y productos c$rnicos. En estudios con voluntarios se
encontr que la dosis infectiva es de 13
?
microorganismos. )a diarrea por
E%E6 se ha vinculado con mltiples serotipos espec&cos de E. coli los cuales
pueden ser identi&cados mediante la tipi&cacin del antgeno O 'som$tico( y
en ocasiones del antgeno 7 '@agelar(.
Escherichia coli enteroin.asi.a ",- Este microorganismo se
encuentra estrechamente relacionado con el g"nero Shigella, produce una
enfermedad similar a la shigelosis. )a enfermedad se presenta comnmente
en ni;os de pases subdesarrollados y en personas que via:an a dichos
lugares. )a E8E% provoca la enfermedad 'diarrea disent"rica invasiva( al
invadir las c"lulas epiteliales de la mucosa intestinal.
9 pesar de que la dosis infectiva para 4higella es de 13 a 133
microorganismos, en el caso de E8E% la dosis infectiva es de
apro!imadamente 13
?
bacterias. 9lgunas caractersticas importantes de este
microorganismo que permiten diferenciarlo de la cepa tpica de E. coli son2
Ao utiliza la lactosa como fuente de carbono, no descarbo!ilan la lisina, es
inmvil y anaerogenicos.
)a patogenicidad de este organismo se debe a su capacidad para invadir y
destruir el epitelio del colon debido a que es capaz de evadir la lisis en los
fagolisosomas.
Escherichia coli entero/emorr+ica 0, produce veroto!ina,
denominada as por su efecto citot!ico sobre las c"lulas Bero, una lnea de
c"lulas renales de monoverde africano. E!isten al menos dos variantes
antig"nicas de la to!ina. )a E%E7 se ha asociado con colitis hemorr$gica,
una variedad grave de diarrea# y con el sndrome ur"mico hemoltico,
enfermedad capaz de producir insu&ciencia renal aguda, anemia hemoltica
microangiop$tica y trombocitopenia. )a veroto!ina tiene muchas
propiedades similares a la to!ina shiga producida por algunas cepas de
4higella dysenteriae tippo 1# De los serotipos de E. coli que producen la
,-AM
a
veroto!ina el m$s comn y el nico que puede identi&carse en muestras
clnicas es el O1.C27C. )a E. coli O1.C27C no emplea sorbitol y es negativa a
la prueba de D<*.
)a causa m$s comn de esta infeccin es el consumo de carne sin cocinar o
poco cocinada, particularmente carne picada procesada en grandes
cantidades. )os casos de colitis hemorr$gica y sus complicaciones
asociadas pueden prevenirse mediante la coccin completa de la carne
En la siguiente tabla se resumen algunas propiedades y sntomas causados
por las cepas de Escherichia coli antes descritas.
Propiedades y s1ntomas causados por al+unas cepas de
Escherichia coli
pat+enas
E5E% E6E% E7E% E8E%
5o!ina )$bilEestable - 4higa o vero -
8nvasiva - - F
8ntiminas - F -
Enterohemolisina - - -
9specto de las
heces
9guadas 9guadas
sanguinolenta
s
9guadas muy
sanguinolentas
Ducoides y
sanguinolenta
s
6resencia de
leucocitos en
heces
- - F
Giebre ba:a F F
8ntestino
involucrado
Delgado Delgado %olon %olon y parte
ba:a del
delgado
Dosis infectiva 9lta 9lta ba:a 9lta
4erotipos varios OH?, O111 y O1.C27C, OH?, Barios
,-AM
a
otros O111 y otros
23N)'MN!O
)a determinacin de microorganismos coliformes totales por el m"todo del
Amero m$s 6robable 'AD6(, se fundamenta en la capacidad de este grupo
microbiano de fermentar la lactosa con produccin de $cido y gas al
incubarlos a -./% 0 1/% durante +, h., utilizando un medio de cultivo que
contenga sales biliares. Esta determinacin consta de dos fases, la fase
presuntiva y la fase con&rmativa.
En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril
sulfato de sodio el cual permite la recuperacin de los microorganismos
da;ados que se encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de
utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la fase con&rmativa
se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el
cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos
capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante.
)a determinacin del nmero m$s probable de microorganismos coliformes
fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se
fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y
producir gas cuando son incubados a una temperatura de ++.. 0 3.1 /% por
un periodo de H+ a +, h.
)a bsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de
caldo E%, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y
diferenciales '9gar Dac %on>ey, 9gar eosina azul de metileno( y
posteriormente realizando las pruebas bioqumicas b$sicas '8DBi%( a las
colonias tpicas.
M)"O$ ) ,3(!"#O 4 )"(34N!$
5- Para anlisis de a+ua
6ara la preparacin del medio de cultivo utilizado en la prueba presuntiva de
muestras de agua o hielo, consultar el cuadro 1.
,-AM
a
. 13 tubos de HH ! 1C. mm con 13.3 m) de caldo lauril sulfato de sodio
o caldo lactosado concentracin doble o triple con campana de Durham
a
. 13 tubos de 1? ! 1.3 mm con 13.3 m) de caldo bilis verde brillante
con campana de Durham
b
.
. 13 tubos de 1? ! 1.3 mm con 13.3 m) de caldo E% y campana de
Durham o caldo E% D<* con campana de Durham
b
.
H ca:as 6etri con agar para m"todos est$ndar
d
H ca:as 6etri con agar Eosina azul de metileno
c
? tubos de 1- ! 133 con -.3 m) cEu de caldo ID-B6
e
- tubos de 1- ! 133 con -.3 m) cEu de caldo triptona o agar 48D
'opcional(
,
- tubos de 1- ! 133 con -.. m) cEu de caldo citrato de Joser o citrato de
4immons 'opcional(
e
6- Para anlisis de alimentos
1 matraz de H.3 m) con =3.3 m) de agua peptonada 3.1 K o solucin
amortiguadora de fosfatos
a
H tubos de 1? ! 1.3 mm con =.3 m) de agua peptonada 3.1 K o solucin
amortiguadora de fosfatos
a
1. tubos de 1? ! 1.3 mm con 13.3 m) de caldo lauril sulfato de sodio
concentracin sencilla o caldo lactosado concentracin sencilla con
campana de Durham
a
1. tubos de 1? ! 1.3 mm con 13.3 m) de caldo bilis verde brillante con
campana de Durham
b
.
1. tubos de 1? ! 1.3 mm con 13.3 m) de caldo E% o E%-D<* con
campana de Durham
b
.
H ca:as 6etri con agar para m"todos est$ndar
d
H ca:as 6etri con agar Dac %on>ey
c
? tubos de 1- ! 133 con -.3 m) cEu de caldo ID-B6
e
,-AM
a
- tubos de 1- ! 133 con -.3 m) cEu de caldo triptona o agar 48D
e
- tubos de 1- ! 133 con -.. m) cEu de citrato de 4immons, o caldo citrato
de Joser
e
$O(3,"ON$, &',!"#O$ "N)",')O&$
Grascos gotero con reactivo de Erlich o Jovac
e
Grascos gotero con indicador ro:o de metilo
,
Grascos gotero con reactivo alfa naftol B61
e
Grascos gotero con solucin de hidr!ido de potasio al +3 K B6H
e
%O)OI9A5E4 69I9 58A%8LA DE *I9D
d
M'!&"'( 4 73"PO
Dechero,
a
M
bc
M
de
.
6ropipeta
a
.
*radilla
abce
. Nalanza
granataria
a
4tomacher
a
Nolsas para stomacher .
)$mpara de luz ultravioleta de longitud amplia + Oatts. '-??
nm(
c
)entes de seguridad
c
6ipetas de 13.3 m) est"riles con tapn de
algodn
a
. 6ipetas de 1.3 m) est"riles con tapn
de algodn
a
. 6ipetas 6asteur est"riles
a
M
b
M
c
M
d
9sa bacteriolgica
b,c,d,e
6ortaob:etos
d
Dicroscopio ptico
d
5ermmetro calibrado
b
Na;o de agua a ++../ 0 3,1 /%.
b
8ncubadora a -./ 0 H,3/%
a
7orno para esterilizar material de vidrio a 1?3-1,3/%
a
9utoclave
a
AO594
a
Dateri
al
necesari
o
a
l
ini
,-AM
a
b
Dateri
al
necesari
o
a la
s
c
Dateri
al
necesari
o
a la
s
d
Dateri
al
necesari
o
a la
s
e
Dateri
al
necesari
o
a la
s
,-AM
Dio de la pr$ctica. +, h. de iniciada la pr$ctica. =? h. de iniciada la pr$ctica. 1H3 h. de
iniciada la pr$ctica. 1++ h. de iniciada la pr$ctica.DE5EID8A9%8LA DE) AD6 DE %O)8GO
IDE4 EA 9*<9 P 78E)O 6O59N)E4

5ub os c o n 1 3 . 3 m ) d
e c al d o l a u r i l s u
l f ato de s odio
'%)44( triple
concentracin '-Q(
4iembra con asa
bacteriolgica de los
tubos positivos
'produccin de gas(
en
caldo lactosa verde
brillante bilis HK y
caldo E

5
H a - asadasEtubo
88-9:,
H+ - +,

5ubos con
13.3 m) de
%aldo )actosa
verde brillante
bilis HK
)ectura de
tubos
positivos en
tablas. NMP
de
coliformes
totales ;5<< ml
de muestra
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. !!". #$cnicas %ara el Anlisis Micro&iol'gico (e Alimentos. a e(.
)aculta( (e *u+mica, ,-AM. M$.ico.
=>:,
68 ? 8@ /
%
(
=>:,
h
5ubos con 13.3
m) de %aldo
E% o E%-D<*
)ectura de tubos
positivos en
tablas. NMP de
coliformes
fecales ;5<<
ml de
muestra-

Versin %ara A(ministra(or (e Manuales y /o4umentos 2AMy/3. )aculta( (e *u+mica, ,
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. !!". #$cnicas %ara el Anlisis Micro&iol'gico (e Alimentos. a e(.
)aculta( (e *u+mica, ,-AM. M$.ico.
I
4iembra de tubos positivos
en placas de 9gar EDN
para la bsqueda de
Escherichia coli
)!&M"N',"ON )( NMP ) ,O("2O&M$ N M3$!&'$ $O(")'$ O
'("MN!O$

Iealizar H diluciones decimales m$s en tubos con =.3 m) de solucin
diluyente
4embrar por triplicado cada dilucin en tubos de caldo lauril sulfato de sodio '1Q

"O
?5

=9:,
H+ - +,

5<
?5

5u bos con 13.3 m) de %)44
concentracin sencilla '1Q( F 1.3 m)
de muestra
4iembra con asa bacteriolgica de
los tubos positivos 'produccin de
gas( en caldo lactosa verde
brillante bilis HK y caldo E

5<
?
6esar 13.3 g de muestra
en condiciones de
asepsia
(
?=
5<A 5<
h
?= ?=
5<A
5
?6
5<
5<
5<
?
5<
%
88-9:,
?5
5<

5ubos con 13.3
m) de %aldo
)actosa verde
brillante bilis
HK
)ectura de
tubos positivos
en tablas. NMP de
coliformes .
totales ;+ de
muestra
5ubos
con 13.3
m) de
%aldo E% o
E%-D<*
y /o"umentos 2AMy/3. )aculta( (e
*u+mica, ,
)ectura de tubos positivos
en tablas. NMP de
coliformes
fecales ;+ de
muestra-
4iembra de tubos
positivos en agar Dac
%on>ey para
bsqueda de
Escherichia col
a
i P&O,)"M"N!O
5- '+ua y /ielo
5-5 Prueba presunti.a
R 9gitar la muestra y transferir volmenes de acuerdo con el cuadro 1, a cada
uno de los tubos con caldo lauril sulfato de sodio que se hayan seleccionado.
9gitar los tubos para homogeneizar la muestra.
,3')&O 5- Preparacin de inoculo con caldo lauril sulfato de sodio
8AO%<)O
'm)(
%9A58D9D DE
DED8O 6OI
5<NO 'm)(
BO)<DEA DE
DED8O D94
8AO%<)O 'm)(
%9)DO )9<I8)
5I865O49
IES<EI8DO gE)
%OA%EA5I9%8LA
1 13 o m$s 11 o m$s -.,? 1 Q
13 13 H3 C1,H H Q
13 H3 -3 .-,+ 1.. Q
H3 13 -3 13?,, - Q
133 .3 1.3 13?,, - Q
133 -. 1-. 1-C,1 -.. Q
133 H3 1H3 H1-,? + Q
8ncubar los tubos a -. 0 3,./%. E!aminar los tubos a las H+ h. y observar si
hay formacin de gas 'desplazamiento del medio en la campana de Durham(#
si no se observa produccin de gas, incubar H+ h. m$s.
Versin %ara A(ministra(or (e Manuales y / 001 mentos 2AMy/3. )aculta( (e *u+mica, ,-AM
a
5-6 Prueba conBrmati.a de microor+anismos coliformes totales
5ransferir de H a - asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba
presuntiva, a otro tubo de 1? !1.3 mm que contiene caldo de bilis verde
brillante 'brila(, con campana de Durham.
9gitar los tubos para su homogeneizacin.
8ncubar a -. 0 H/% durante H+ a +, h..
Iegistrar como positivos aquellos tubos en donde se observe turbidez
'crecimiento( y produccin de gas despu"s de un perodo de incubacin de H+ a +,
h..
%onsultar la tabla 1 H de AD6 para conocer el nmero m$s probable de
organismos coliformes totalesE133 m).
1.3 Prueba conBrmati.a de microor+anismos coliformes fecales-
presuntiva 'caldo lauril sulfato de sodio( a un tubo de 1? ! 1.3 mm, con caldo E%
conteniendo campana de Durham.
8ncubar a ++.. 0 3.1 /% en incubadora o un ba;o de agua durante H+ a +, h.
Iegistrar como positivos todos los tubos en donde se observe crecimiento y
produccin de gas despu"s de un perodo de incubacin de H+ a +, h.
%onsultar la tabla 1 H de AD6 para conocer el nmero m$s probable de
organismos coliformes fecalesE 133 m).
,ontrol de calidad
1. 8nocular a dos tubos con caldo E% una cepa de E. coli como control positivo y una
de
Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar con las muestras.
a
1.4 Prueba conBrmati.a para Escherichia coli
5omar una asada de cada uno de los tubos positivos en caldo E% y sembrar por
estra cruzada en agar eosina azul de metileno para su aislamiento.
8ncubar las placas invertidas a -./% por 1,-H+ h.
4eleccionar dos colonias de cada placa con la siguiente morfologa colonial2
%olonias con centro negro, planas con o sin brillo met$lico. 4i no hay colonias con
morfologa tpica, probar una o m$s colonias lo m$s parecido E. coli de cada placa
y sembrarlas en agar cuenta est$ndar para realizar las pruebas de morfologa
microscpica y pruebas bioqumicas.
8ncubar las placas a -./% por 1,-H+ h.
7acer un frotis y te;irlo por *ram. Observar al microscopio la presencia de bacilos
cortos o cocobacilos *ram-negativos.
5-8-5 "dentiBcacin bioCu1mica de Escherichia coli mediante pruebas
("M#i,)-
a. Produccin de indol (")
8nocular un tubo en caldo triptona e incubarlo a -./% por H+ 0 H h.
9dicionar entre 3.H y 3.- m) de reactivo de Jovacs.
)a presencia de una coloracin ro:a en la super&cie del tubo se considera una
prueba positiva.
b. Produccin de cidos mi*tos (&oDo de metilo, &M)
8nocular un tubo adicional con caldo ID-B6 e incubar a -./% por +, 0 H h.
a
9dicionar . gotas de solucin de ro:o de metilo.
4e considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color ro:o. <n color
amarillo es una prueba negativa.
c. Produccin de metabolitos neutros (#o+es?ProsEauer #P)
8nocular un tubo con caldo ID-B6 e incubar a -./% por +, 0 H h.
9dicionar 3.? m) de solucin B61 y 3.H m) de solucin B6H y agitar.
De:ar reposar durante 13 minutos sin agitar el tubo# se considera una prueba
positiva cuando se desarrolla un color rosa en la super&cie.
d. 3tiliFacin del citrato (,)
8nocular un tubo con caldo citrato de Joser o 4immons un inculo ligero para evitar
turbiedad en el tubo 'opcional2 puede utilizarse citrato de 4immons(
8ncubar a -./% por =? h.
El desarrollo del cultivo que se observa con la turbiedad del medio, se considera
una prueba positiva.
NO!'$
6ara determinar la produccin de indol, en lugar del caldo triptona puede utilizarse al
agar 48D. Este medio se inocula por picadura con el asa bacterioogca de forma recta.
4e incuba a -./% por H+0 H h. Ginalizado el periodo de incubacin se adiciona el
reactivo de Jovac o Erlich cuyo fundamento es el mismo.
6ara determinar la utilizacin del citrato de sodio como nica fuente de carbono,
tambi"n se puede utilizar el agar citrato de 4immons en forma inclinada, el cual se
inocula en la super&cie 'pico de @auta(. 4e incuba a -./% de H+ a +, h. )a presencia
de una coloracin azul debida al vire del indicador que contiene el medio, indica
prueba positiva
a
5-8-6 Prueba conBrmati.a opcional para Escherichia coli utiliFando caldo
,?M3% (8 metil?umbeliferil?G?)?+lucuronido)
23N)'MN!O
9lrededor del =+K de las cepas de Escherichia coli incluso las cepas no productoras de
gas producen la enzima beta-glucuronidasa '*<D(, la cual rompe el sustrato
espec&co +-metilumbeliferil-beta-D-glucurnido 'D<*( en +-metilumbeliferona 'D<(#
el cual al ser e!puesto a una fuente de luz ultravioleta '<B( de onda larga '-?. nm(
produce una @uorescencia azul f$cil de observar. %uando el D<* es incorporado al
caldo E% se puede identi&car Escherichia coli.
a- Prueba conBrmati.a
9 partir de la fase presuntiva 'inciso 1.1.( y de cada tubo que muestre formacin
de gas , tomar una asada y sembrar en un nmero igual de tubos con medio de
con&rmacin E%-D<*.
8ncubar a ++,. 0 3,H/% en ba;o de agua durante H+ h., observar si hay formacin
de gas# si no se observa la formacin de gas continuar la incubacin H+ h. m$s.
8rradiar los tubos con una fuente de luz <B, observar @uorescencia y hacer
la lectura.
<tilizar estos resultados para calcular el nmero m$s probable 'AD6( de E. coli.
,ontrol de calidad
8nocular en dos tubos con caldo E%-D<* una cepa de E. coli como control positivo y J.
pneumoniae como control negativo.
6- 'limentos
2.1 Preparacin de la muestra-
Doler 13.3 gramos de la muestra en un picador H veces o con cubiertos est"riles y
mezclar.
9dicionar el alimento a =3.3 m) de agua peptonada al 3.1 K, licuar y de:ar en
reposo de H-- minutos.
a
Iealizar diluciones hasta 13
- -
gEm) con agua peptonada al 3.1 K. En caso de
traba:ar con muestras congeladas, descongelarlas previamente entre H/ y . / %.
6-5-5 Prueba presunti.a-
9;adir 1.3 m) de la dilucin 13
- 1
gEm) a cada uno de - tubos con 13.3 m) de caldo
lauril sulfato de sodio.
9;adir 1.3 m) de las diluciones 13
- H
gEm) y 13
- -
gEm) a dos series de - tubos cada
una con caldo lauril sulfato de sodio.
8ncubar a -.--C/% durante H+-+, h.
)os tubos despu"s de la incubacin, se registrar$n como positivos si presentan
crecimiento y produccin de gas.
2.2 Prueba conBrmati.a de microor+anismos coliformes totales
presuntiva a otro tubo de 1? ! 1.3 mm que contiene caldo de bilis verde brillante
'brila(, con campana de Durham.
8ncubar a -. 0 H/% durante H+ a +, h.
Iegistrar como positivos aquellos tubos en donde se observe crecimiento y
produccin de gas, despu"s de un perodo de incubacin de H+ a +, h.
%onsultar las tablas de AD6 que se encuentran en el ane!o para conocer el
nmero m$s probable de organismos coliformes totales por m).
2.3 Prueba conBrmati.a de microor+anismos coliformes fecales-
presuntiva 'caldo lauril sulfato de sodio( a un tubo de 1? ! 1.3 mm, con caldo E%
conteniendo campana de Durham.
8ncubar a ++.. 0 3.1 /% en incubadora o un ba;o de agua durante H+ a +, h.
a
Iegistrar como positivos todos los tubos en donde se observe turbidez y
produccin de gas despu"s de un perodo de incubacin de H+ a +, h.
%onsultar la tabla de AD6 '9AEQO( para conocer el nmero m$s probable de
organismos coliformes fecales por m).
,ontrol de calidad
"nocular a dos tubos con caldo , una cepa de E. coli como control
positi.o y una de Enterobacter aerogenes como control ne+ati.o e
incubar con las muestras-
6-8 Prueba conBrmatoria de Escherichia coli.
%on&rmar la presencia de Escherichia coli en por lo menos el 13K de las pruebas
con resultados positivos de coliformes fecales# sembrar en placas de agar
Dc%on>ey a partir de los tubos que demostraron la presencia de gas en la prueba
con&rmativa.
8ncubar las placas a -. 0 3../% durante H+ 0 H h., observar las colonias tpicas
fermentadoras de color ro:o rodeadas de un halo opaco de precipitacin de sales
biliares.
7acer tincin de *ram para observacin de la morfologa de las bacterias.
4eleccionar 1 o m$s colonias aisladas para realizar pruebas 8DBi%.
5odos los cultivos que2
Germenten la lactosa con produccin de gas dentro de las +, h. a -./%.
4ean bacilos o cocobacilos *ram-negativos no esporulados
4e obtenga las siguientes combinaciones para el 8DB8%2 Niotipo 1 'FF--( o Niotipo H
'F--( son consideradas como Escherichia coli.
%alcular el AD6 de E. coli bas$ndose en la proporcin de los tubos positivos de
caldo E%.
a
,H(,3(O$ 4 IP&$"JN ) &$3(!')O$
%alcular la densidad microbiana con base en el nmero m$s probable conforme al
procedimiento se;alado en la tabla 1, 'que se muestra a continuacin y es utilizado
para el an$lisis de agua(, para estimar la poblacin de bacterias coliformes totales,
bacterias coliformes fecales y Escherichia coli de acuerdo con las diluciones
empleadas.
E!presar en AD6Eg o m) para alimentos y AD6E133 m) para agua. En el caso de usar
volmenes de H3 m) de muestras de agua en . tubos o 13 m) de muestras de agua
en 13 tubos, utilizar las siguientes tablas2
!'B(' 5- Kndice del NMP con L9M de l1mite de conBanFa para .arias
combinaciones de resultados positi.os y ne+ati.os cuando se usan 9 tubos
con 6< m( de muestra de a+ua o /ielo-
No- de !ubos L9M de (1mite de ,onBanFa
(apro*imado)
positi.os NMP;5<< m( "nferior $uperior
3 T1,1 3 -,3
1 1,1 3,3. ?,-
H H,? 3,- =,?
- +,? 3,, 1+,C
+ ,,3 1,C H?,+
. U,,3 +,3 8n&nito
a
!'B(' 6- Kndice del NMP con L9M de l1mite de conBanFa para .arias
combinaciones de resultados positi.os y ne+ati.os cuando se usan 5< tubos
con 5< m( de muestra de a+ua o /ielo-
No- de !ubos
Positi.os
NMP;5<<
m(
L9M de (1mite de ,onBanFa
(apro*imado)
"nferior $uperior
3 T1,1 3,3 -,3
1 1,1 3,3- .,=
H H,H 3,H? ,,1
- -,? 3,?= 13,?
+ .,1 1,- 1-,+
. ?,= H,1 1?,,
? =,H -,1 H1,1
C 1H,3 +,- HC,1
, 1?,1 .,= -?,,
= H-,3 ,,1 .=,.
13 UH-,3 1-,. 8n&nito
B"B("O%&'2K'
AOID9 OG8%89) DEQ8%9A9. AOD-1+.-4491-1==.. 6roductos c$rnicos troceados y
curados. 6roductos c$rnicos curados y madurados. Disposiciones y especi&caciones
sanitarias. 9p"ndice normativo N. De la estimacin de la densidad microbiana por la
t"cnica de nmero m$s probable.
a
%%9P9%-D-33+ 'H33?( VEstimacin de la densidad microbiana por la t"cnica del
nmero mas probable, deteccin de coliformes totales, cliformes fecales y Escherichia
coli por el nmero mas probableV
Good and Drug 9dministration 'H33-( VNacteriological 9nalytical DanualV. =
th
ed.
9rlington, B92 9O9%.
Dadigan, D 5 y Dartin>o, W D., Nroc>, Niology of Dicroorganisms, 11
a
ed. H33?, pp
=-.-=-?
Nroo>s, *eo G., Natel, Wanet 4. y Dorse, 4tephen 9., Dicrobiologa D"dica de WaOetz.
Danual Doderno 1Ca Edicin H33H, pp HC+-HC.
Jornac>i W.). X Wohnson W.). 'H331( AEnterobacteriaceae, ,oliforms, and
Escherichia coli as 7uality and $afety "ndicatorsA- 8n2 %ompendium of
Dethods for the Dicrobiological E!amination of Goods. +
th
ed. DoOns G.6. X 8to J. 'Eds.(
9679. Yashington. ?=-,H.
8nternational %ommission on Dicrobiological. 4peci&cations of Goods 'H33.(
AMicroor+anisms in 2oods NA %hapman X 7all. Hnd ed.
http2EEOOO.cfsan.fda.govEZebamEbam-1 .htm)

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