IDENTIFICACION DE COCOS GRAM POSITIVOS

UNIVERSIDAD DE CARTAGENA
Facultad de Ingeniera
Programa de Ingeniera de Alimentos
Cartagena de Indias
18 de septiembre del 2014

D. Aparicio
1
; C. Gutierrez
2
; K. Rodriguez
2
; K. Pedraza
2
; J. Yate
2
.
1. Docente Universidad de Cartagena; 2.Estudiantes Universidad de Cartagena

RESUMEN
En la siguiente prctica se realizan la identificasion de los cocos gram positivos los cuales
se hizo con pruebas bioqumicas; para empezar se realiz una prueba de catalaza a las tres
bacterias que se encuentran en las cajas de Petri de la cual se tomo una de cada muestra las
cuales son la escherichia coli, escherichia fecal y la staphylococcus que fue
depositada en un porta objeto para luego adicionar unas gotas de agua
oxigenada, de acuerdo a la efervescencia establecida se pudo determinar si era
negativa o positiva ,posterior mente se utiliz la glucosa en el cual se le saco
al tubo de ensayo el oxgeno contenido y luego de ser atemperados, se
inoculo con ayuda de una pipeta, para dejar gelificar, uno de ellos se incubo a
37C, Por ltimo se realiz la prueba de coagulasa de tubo en la cual se realiz
la suspensin de las colonias de un cultivo pura ya encubado al cual se le
agrego plasma fresco y se encubo para observar la coagulacin.

PALABRAS CLAVES: cocos gram positivos, catalasa, coagulasa, glucosa,colonias
ABSTRACT:
KEYWORDS: Agar culture medium, microorganisms

I. INTRODUCCION

Los cocos gram positivos excluyendo las enterobacterias, son los microorganismos ms
frecuentemente aislados de muestras de pacientes y se han involucrado como agentes
importantes en procesos de enfermedades infecciosas desde el ao 1836. Se encuentran
ampliamente distribuidos en la naturaleza y forman parte de la flora microbiana normal de
la piel y las mucosas del hombre y de animales. Las infecciones en el hombre se producen
por contacto directo con individuos infectados o portadores sanos, o por penetracin a
travs de piel y mucosas mediante objetos corto punzantes por heridas, trauma o
procedimientos quirrgicos o por la accin de toxinas producidas por cepas de algunas
especies.
Staphylococcus
Los estafilococos son clulas esfricas gram positivas dispuestas en grupos semejantes a
racimos de uvas en medios slidos o en pares, cadenas o ttradas, en medios lquidos.
Crecen bien en medios simples y de acuerdo a la especie producen diferentes pigmentos:
blanco, amarillo y dorado y algunas de ellas producen beta hemlisis. Son catalasa positiva,
inmviles, no esporulados, con raras excepciones, no encapsulados y son aerobios o
anaerobios facultativos.
Streptococcus
Los estreptococos son clulas esfricas u ovaladas gram positivas dispuestas en pares o
cadenas cortas o largas. Son ms exigentes que los estafilococos, no crecen en medios
simples, por el contrario requieren de factores de crecimiento como la sangre y sus
derivados. Producen diferentes tipos de hemlisis, caracterstica que permite clasificarlos
en beta hemolticos, alfa hemolticos o no hemolticos. No forman pigmentos, son catalasa
negativa, inmviles, no esporulados, con formacin de cpsula variable. Son aerobios y
anaerobios facultativos.
Enterococcus
Los enterococos clasificados anteriormente como una especie de estreptococos, son clulas
esfricas gram positivas dispuestas en pares o cadenas cortas. Al igual que los
estreptococos, requieren de factores de crecimiento como la sangre y sus derivados. Son
capaces de desarrollarse en medios que contienen altas concentraciones de NaCl (6.5%) y
de bilis (40%). Pueden producir hemlisis de tipo alfa, beta o ser no hemolticos. No
forman pigmentos, son catalasa negativa
[1]


La catalasa es una enzima perteneciente a la categora de las oxidorreductasas que cataliza
la descomposicin del perxido de hidrgeno (H
2
0
2
) en oxgeno y agua. Esta enzima utiliza
como cofactor al grupo hemo y al manganeso.
2 H2O2 2 H2O + O2
El perxido de hidrgeno es un residuo del metabolismo celular de muchos organismos
vivos y tiene entre otras una funcin protectora contra microorganismos patgenos,
principalmente anaerobios, pero dada su toxicidad debe transformarse rpidamente en
compuestos menos peligrosos. Esta funcin la efecta esta enzima que cataliza su
descomposicin en agua y oxgeno. Adems la catalasa se usa en la industria textil para la
eliminacin del perxido de hidrgeno, as como en menor medida se emplea en la
limpieza de lentes de contacto que se han esterilizado en una solucin de perxido de
hidrgeno. La ausencia congnita de catalasa es causante de una acatalasemia (o
acatalasia), la enfermedad de Takahara que se manifiesta por la ausencia de actividad de la
catalasa en los glbulos rojos y con severas infecciones gangrenosas de la boca, pudiendo
producir la prdida de los dientes y graves destrucciones de los maxilares y regiones
blandas que los cubre. Enfermedad congnita del Japn (2 de 100.00 habitantes sufren de
este trastorno).
[2]

El mecanismo completo de la catalasa no se conoce, aun as la reaccin qumica se produce
en dos etapas:
H2O2 + Fe(III)-E H
2O + O=Fe(IV)-E
H2O2 + O=Fe(IV)-E H
2O + Fe(III)-E + O2
Donde Fe-E representa el ncleo de hierro del grupo hemo unido a la enzima que actan
como cofactores.
La enzima se presenta en forma de homotetrmero y se localiza en los peroxisomas.
Esta enzima puede actuar como una peroxidasa para muchas sustancias orgnicas,
especialmente para el etanol que acta como donante de hidrgeno. Las enzimas de muchos
microorganismos, como el Penicillium simplicissimum, que exhiben actividad de catalasa y
peroxidasa, son frecuentemente llamadas catalasas-peroxidasas.
[3]
La coagulasa es una protena producida por varios microorganismos que permite la
conversin del fibringeno en fibrina. En el laboratorio, se usa para distingir entre
diferentes tipos de Staphylococcus. Un resultado de coagulasa positivo indica que la
muestra contiene Staphylococcus aureus. Esta protena tambin es producida por Yersinia
pestis
La coagulasa reacciona con la protrombina en la sangre. El complejo resultante se llama
estafilotrombina, y permite que la enzima proteasa convierta el fibringeno en fibrina. Esto
hace que se coagule la sangre. La coagulasa est estrechamente relacionada con la
superficie de la bacteria S. aureus y puede revestir su superficie con fibrina al entrar en
contacto con la sangre. Se cree que esta cubierta de fibrina del estafilococo es capaz de
resistir la fagocitosis haciendo esta bacteria tenga un factor de virulencia mayor.
[4]



II. MATERIALES
Cultivo de bacterias de 24-48 horas
Agua oxigenada
Portaobjetos
Pipeta Pasteur
Tubos con vaselina estril
Gradillas
Asas bacteriolgicas
Incubadora
Coloracin de Gram: cristal violeta, lugol, alcohol acetona, fucsina
Solucin salina estril
Medios: agar Baird Parker y Manitol

PROCEDIMIENTO
-Prueba de la catalasa:
En un portaobjetos se depositan una o dos gotas de agua oxigenada de 30 volmenes y se
pone en contacto con cada una de las colonias (Staphylococcus, scherichia coli, fecal) con
ayuda del asa de siembra.
Utilizacin de Glucosa
Se utilizan dos tubos de medio de cultivo, que se hierven brevemente antes de utilizarlos
para eliminar el oxigeno disuelto. Una vez atemperados, se inoculan con ayuda de una
pipeta Pasteur, llegando al fondo y ascendiendo hacia la superficie. Dejar solidificar ambos
tubos y recubrir uno de ellos con vaselina estril. Incubar a 37 C durante 48 horas.
Prueba de coagulasa en tubo
realice una suspensin de varias colonias de un cultivo puro de 18-24 horas de incubacin
en caldo nutritivo e incubar 18-24horas a 37C
transcurrido el tiempo de incubacin, adicione en un tubo seco 0,1mL de la suspensin
anterior
agregue 0,2mL de plasma fresco e incubar a 37C
observe a partir de las 4 horas siguientes la formacin del coagulo
nota: generalmente el Staphylococcus aureus puede coagular el plasma en un tiempo de 4
horas, en ocasiones puede demorar de 8 a 16 horas. Si el tiempo de incubacin se prolonga
por ms de 24 horas debe tenerse en cuenta que la produccin de estafiloquinasas por
algunas cepas de Staphylococcus aureus puede lisa el coagulo formado, dando resultados
falsos negativos.

III. RESULTADOS










IV. ANLISIS DEL RESULTADO



V. CONCLUSION

VI. PREGUNTAS

1. Qu es una enzima?
R/=Protena soluble producida por las clulas del organismo, que favorece y regula
las reacciones qumicas en los seres vivos.
2. Cmo actan las enzimas?
R/=una enzima hace que una reaccin qumica que es energticamente posible
(ver Energa libre de Gibbs), pero que transcurre a una velocidad muy baja, sea
cinticamente favorable, es decir, transcurra a mayor velocidad que sin la presencia
de la enzima.
2

3
En estas reacciones, las enzimas actan sobre
unas molculas denominadas sustratos, las cuales se convierten en molculas
diferentes denominadas productos. Casi todos los procesos en las clulas necesitan
enzimas para que ocurran a unas tasas significativas. A las reacciones mediadas por
enzimas se las denomina reacciones enzimticas.
Que factores afectan su actividad?
R/=cofactores y coenzimas, concentracin de sustrato,inhibidores , mecanismos
reguladores, temperatura, pH.
3. En que se fundamenta y como se realizan las siguientes pruebas: CAMP, coagulasa,
catalasa,bilis esculina, resistencia a la novobiocina y optoquina

R/= PRUEBA CAMP: Se basa en que los estreptococos del grupo B producen un factor
llamado CAMP (factor de monofosfato de adenina cclica) que aumenta la zona de
hemlisis producida por un estafilococo productor de lisina.
Procedimiento: Se realiza estriando un cultivo de estreptococo -hemoltico en forma
perpendicular a una estra de un estafilococo productor de -lisina en agar sangre. Se
incuba 18-24 horas a 37C.
PRUEBACOAGULASA: se usa para diferenciar el Staphylococcus aureus del coagulase-
negative staphylococci.S.aureus produce 2 formas de coagualasa (por ejemplo, coagulasa
ligada y coagulasa libre). La coagulasa ligada tambin conocida como "factor de
Clumping " se puede detectar mediante la realizacin de una prueba de portaobjetos y la
coagulasa libre con una prueba de coagulasa de tubo.
Prueba de portaobjetos
Prueba del portaobjetos se hace conjuntamente con un control negativo para descartar auto
aglutinacin. Se ponen 2 gotas de solucin salina en el portaobjetos microescpico rotulado
con un nmero de muestra, Test (T) y control (C). Las 2 gotas son emulsionadas con la
prueba de organismo mediante el uso de un cable de lazo, cable recto, o un palo de madera.
Se pone una gota de plasma (plasma de conejo con anticoagulante (EDTA)1 ) en la gota de
solucin salina inoculada correspondiente a la prueba y se mezcla bien con un una varilla
de madera. Agitar el portaobjeto con cuidado unos 10 segundos.
Si es positivo: Se podr observar aglutinacin macroescopica en el plasma en los 10
segundos mientras que no se observara aglutinamiento en la gota de solucin salina.
Si es negativo: No se observara aglutinamiento.

Prueba del tubo de ensayo
La prueba se utiliza plasma que ha sido incoculado con una colonia de staphylococcal (por
ejemplo, con un coco gram positivocatalasa positivo). Luego el tubo se incuba a 37 grados
Celsius en 1 horas. Si es negativo entonces continuamos la incubacin por unas 18 horas.
Si sale positivo (por ejemplo, la colonia problema es S. aureus), el suero
coagular,2 dando como resultado un cogulo (a veces el cogulo esta tan desarrollado
que el lquido se solidifica completamente).
Si sale negativo, el plasma permanece lquido. Un resultado negativo podra indicar que
se podra tratar de S. epidermidispero solo con unas pruebas ms precisas se puede
confirmar este hecho, como por ejemplo el API o mtodos de BBL CRYSTAL.


PRUEBA CATALASA: La catalasa es una enzima que poseen la mayora de las bacterias
aerobias. Descompone el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno. El desprendimiento de
burbujas procedentes del oxgeno indica que la prueba es positiva.

METODO: 1-Poner un trozo de papel de filtro sobre una de las tapaderas de una placa de
Petri. 2-Aadir una gota del reactivo de oxidasa. 3-. Depositar sobre el reactivo masa
bacteriana (actuar de forma rpida y con un asa de platino nueva o con un palillo de
dientes)

PRUEBA BILIS ESCULINA: Se basa en la capacidad de los estreptococos del grupo D
de crecer en un medio de cultivo que contiene un 40% de bilis y de hidrolizar la esculina a
esculetina, la cual se combina con el citrato ferroso que posee el medio, dando un complejo
de color negro. La concentracin de bilis es fundamental, ya que existen estreptococos del
grupo Viridans que son capaces de crecer a concentraciones menores de bilis.
Procedimiento: Se realiza sembrando en superficie tubos de agar bilis esculina inclinado.

PRUEBA DE RESISTENCIA A LA NOVOBIOCINA:
Los estafilococos coagulasa negativos pueden dividirse en especies sensibles y resistentes a
la novobiocina. Staphylococcus saprophyticus es de las especies resistentes, la ms
frecuente en humanos, causante de infecciones de el tracto urinario. Por lo tanto esta prueba
proporciona una identificacin presuntiva confiable de esta especie.
Procedimiento
- Preparar una suspensin (equivalente al estndar 0.5 de McFarland) del microorganismo
en agua destilada.
- Sembrar con escobilln en forma masiva sobre la placa de Mueller Hinton
- Colocar con la pinza un disco de novobiocina en el centro
- Incubar a 35C durante por 24 horas

PRUEBA OPTOQUINA: Se basa en la sensibilidad de S.pneumoniae a una
concentracin menor o igual a 5g/ml de hidroxicuprina (optoquina).
Procedimiento: Estriar un cuadrante de una placa de agar sangre en varias direcciones con
una suspensin Mc Farland 0,5. Colocar luego un disco de optoquina en el centro del rea
estriada. Incubar 18-24 horas a 37C.


4. Diga el fundamento y composicin de los siguientes medios
a) Agar manitol: Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentracin
salina. Los estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio; las
colonias aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante. Los estafilococos coagulasa
negativos, presentan colonias rodeadas de una zona roja o prpura. Las colonias
sospechosas, se repicarn en un medio sin exceso de cloruro de sodio para efectuarles,
posteriormente, la prueba de la coagulasa.

El agar manitol salado suele tener la siguiente composicin:
5.0 g/L enzima digestiva de casena
5.0 g/L enzima digestiva de tejido animal
1.0 g/L extracto de carne de vaca
10.0 g/L D-manitol
75.0 g/L NaCl
0.025 g/L rojo de fenol
15.0 g/L agar
pH 7.4 0.2 at 25 C

b) Agar Baird Parker.
Fundamento
En el medio de cultivo preparado y completo la peptona y el extracto de carne constituyen
la fuente de carbono y nitrgeno, el extracto de levadura aporta vitaminas del complejo B,
la glicina y el piruvato estimulan el crecimiento de los estafilococos.
Este medio de cultivo es selectivo y diferencial debido al telurito de potasio y al cloruro de
litio, los cuales inhiben el desarrollo de la flora acompaante. La yema de huevo permite
demostrar la actividad lecitinsica. Los estafilococos coagulasa positiva reducen el telurito
a teluro y originan colonias de color grisceo-negro, y dan reaccin sobre la yema de huevo
produciendo alrededor de la colonia una zona opaca que a menudo tiene una zona clara mas
externa. Se pueden encontrar cepas no lipolticas, que presentan igual caractersticas de
colonias pero sin la zona opaca y clara. Se debe confirmar la presencia de S. aureus
mediante pruebas bioqumicas.
Composicin en gramos por litros
Peptona de casena 10.0.
Extracto de carne 5.0.
Extracto de levadura 1.0.
Cloruro de litio 5.0.
Glicina 12.0.
Piruvato de sodio 10.0.
Agar 17.0.
pH final: 6.8 0.2

VII. BIBLIOGRAFIA
[1] www.medicina.unal.edu.co
[2] www.ncbi.nlm.nih.gov/gene
[3] http://expasy.org/enzyme
[4] A. Forbes, Betty; Daniel F. Sahm, Alice S.Weissfeld. BAILEY& SCOTT'S Diagnostic
Microbiology (Tenth Edition edicin).
[5] http://www.britanialab.com/productos