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DEPARTAMENTO DE BIOLOGA 1. INTRODUCCIN
Las bacterias son organismos supremamente adaptables a diferentes sustratos. Con base
a sus requerimientos nutricionales se consideran como exigentes y no exigentes. Su
estudio se ha hecho posible gracias a la implementacin de los medios de cultivos que le
suministran al organismo los elementos necesarios para su crecimiento. Los medios de
cultivo son preparaciones utilizadas para muchos propsitos, como: aislamiento e
identificacin de microorganismos, prueba de esterilidad, anlisis de agua, ambientales,
alimentos y productos bacteriolgicos y prueba de sensibilidad a los antibiticos.
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DEPARTAMENTO DE BIOLOGA Las bacterias auttrofas pueden utilizar el nitrgeno libre, amoniaco o nitrato, de tal
manera que los medios pueden ser muy simples! los hetertrofos con una capacidad
sint"tica ms limitada requieren compuestos ms comple#os debido a que las c"lulas no
pueden obtener sus requerimientos de nitrgeno directamente de las prote$nas, "stas
deben estar hidrolizadas en compuestos nitrogenados ms disponibles! estos hidrolizados
son conocidos como peptonas, derivados de las prote$nas por medio de cidos, lcalis o
enzimas y son solubles en agua.
1.1. COMPOSICIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
%unque los diferentes medios contienen gran cantidad de sustancias dependiendo del
microorganismo que se desee aislar, bsicamente estn compuestos de:
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Peptona: &ar$an de pureza y calidad dependiendo del tipo de hidrlisis realizada. Los
lcalis tienden a destruir el contenido vitam$nico de la prote$na y tambi"n hacen perder
parte de los aminocidos! la hidrlisis enzimtica conserva las vitaminas y aminocidos! la
!ae"na pura no contiene carbohidratos y tiene alto contenido vitam$nico y de t#$pt%&ano.
'#. (na peptona, case$na digerida por la tripsina no sirve para las pruebas de
fermentacin, pero si para detectar produccin de indol, la case$na hidrolizada por cido
no tiene triptfano ni carbohidratos y puede utilizarse en ensayos de contenido vitam$nico
en suero por no tener vitaminas! la peptona de la gelatina obtenida por accin enzimtica
no tiene carbohidratos ni triptfano puesto que no estn presentes en la gelatina pura. Las
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DEPARTAMENTO DE BIOLOGA peptonas de leche, carne y levaduras contienen los carbohidratos respectivos, presentes
en el material original y por lo tanto no deben utilizarse en pruebas de fermentacin.
In&'$%n ( e)t#a!to: Son de carne y otros te#idos! se trata del material de origen
proteico, soluble en agua, sin accin enzimtica. Las prote$nas mismas se coagulan por el
calor, afortunadamente la accin enzimtica microbiana y el tiempo de incubacin
aumentan la facilidad de utilizacin.
A*ente o+$,$&$!ante- %gar, )elatina, %garosa, %gar noble.
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DEPARTAMENTO DE BIOLOGA A*ente e+e!t$.o: Son generalmente colorantes, tales como Cristal violeta o verde
brillante, que inhiben bacterias )ram positivos o como *aCl, %zida de sodio, Citrato de
Sodio, +elurito de potasio y Lauryl sulfato de sodio que inhiben )ram negativos.
'l p, tambi"n se emplea como agente selectivo. -or e#emplo, un p, de ../01./ es
selectivo para bacterias como Vibrio chlolerae.
A*ente ant$/$!#o0$ano. %lgunos medios contienen agentes tales como antibiticos o
biocidas, que act2an como agentes antimicrobianos.
1.1. CUIDADO Y RECOMENDACIONES:
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DEPARTAMENTO DE BIOLOGA Los medios de cultivo pueden prepararse a partir de sus componentes o seg2n las
recomendaciones del fabricante, cuando este se consigue comercialmente hay varias
reglas que se deben guardar para asegurar la buena calidad del medio preparado.
'l agua utilizada debe ser destilada, bidestilada o desmineralizada, proveniente de un
sistema adecuado de destilacin! su medida debe ser exacta y en ning2n momento con
aproximaciones que generalmente se traducen en una alteracin de la consistencia del
medio, especialmente cuando se trata de agares, cuyos agentes solidificantes requieren
tratamiento exacto.
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DEPARTAMENTO DE BIOLOGA Si los ingredientes necesarios para preparar el medio de cultivo son deshidratados deben
permanecer en remo#o durante 34 minutos, con la finalidad de permitir una hidratacin
total de las mol"culas, lo cual evita el calentamiento excesivo que conduce generalmente
a evaporacin y descomposicin del medio.
%ntes de someterse a la accin del autoclave el medio debe estar completamente
disuelto. *o disolverlo con la temperatura del autoclave, pues generalmente el exceso de
calor produce un medio con grumos debido a una deficiente disolucin.
Los medios de cultivo que contienen yema de huevo, carbohidratos, urea o cualquier
nutriente, no pueden ser esterilizados en autoclave! estos medios se preparan
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DEPARTAMENTO DE BIOLOGA esterilizando por separado lo que conocemos como base 5se esteriliza en autoclave6 y los
suplementos por filtracin o vapor fluente! la mezcla de los componentes se realiza
cuando la base se ha enfriado entre 74 y 4/ 8C.
Los medios %gar SS y bismuto de sulfito, entre otros, no pueden ser esterilizados en
autoclave. 'n todo caso, deben leerse detenidamente las recomendaciones del
fabricante, las cuales vienen especificadas en el embase del medio de cultivo.
+odos los medios de cultivo despu"s de preparados y vertidos en la ca#a de petri est"riles,
deben ser secados, con la finalidad de eliminar el exceso de agua que queda en la
superficie para evitar la coalescencia y mezcla de las colonias cuando se hace la siembra.
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DEPARTAMENTO DE BIOLOGA 'l secado de la superficie tambi"n previene la contaminacin! se lleva a cabo en la estufa
incubadora a 9: 8C durante ;/ minutos aproximadamente, quitando la tapa de la ca#a y
colocando el medio con la superficie hacia aba#o. <espu"s del secado las ca#as se
pueden guardar en refrigeracin envueltas en bolsas plsticas hasta por tres meses,
dependiendo del medio de cultivo. Los medios que contienen antibiticos deben utilizarse
en corto tiempo.
1. OB2ETIVOS
%plicar t"cnicas para la preparacin de los medios de cultivo y reconocer la importancia
de sus componentes para el crecimiento bacteriano.
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'nsayar los m"todos bacteriolgicos ms usuales para el crecimiento y aislamiento de
microorganismos.

3. CONSULTAS PRELIMINARES
Los estudiantes debern consultar en cualquier texto de microbiolog$a aspectos generales
sobre los medios de cultivo.
4. MATERIALES
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DEPARTAMENTO DE BIOLOGA -or grupo de traba#o se emplearn los siguientes materiales:
'rlenmeyer ;4/ ml 1
+ubos de ensayo con tapa rosca =
Ca#as de -etri 9
%sa bacteriolgica 3
'sptula 3
-apel aluminio 5porcin6 3
Cultivo bacteriano 3
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%gar nutritivo 3// ml
-eptona =/ ml
%gua destilada ;4/ ml
*o hay restriccin de seguridad por el uso de estos medios de cultivo. >emitirse al
protocolo de preparacin recomendado por el proveedor en el embase del medio de
cultivo.
6. E7UIPOS
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?alanza de precisin 3
@ncubadora 3
%utoclave 3
La incubadora estar previamente calibrada a la temperatura requerida por el %uxiliar de
Laboratorio. Aavor no manipular el equipo y mantenerlo cerrado. %brir solamente para
incluir el cultivo a incubar.
8. PROCEDIMIENTO
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DEPARTAMENTO DE BIOLOGA -ara cada uno de los medios de cultivos deshidratados o de otros componentes que
estn dispuestos en exhibicin, anote los siguientes datos: *ombre, composicin, usos,
preparacin. <estape el envase y determine 5sin tocar su contenido6: color, olor, textura
5cristales, grnulos, polvo6. >ealice esta observacin del medio lo ms rpido posible,
pues los medios de cultivo son altamente higroscpicos 5absorben humedad6.
8.1 PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVOS COMERCIALES
'fect2e los clculos correspondientes para preparar 4/ mL de agar nutritivo comercial.
Siga las instrucciones de la etiqueta del frasco. 'sta cantidad ser distribuida de la
siguiente forma:
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DEPARTAMENTO DE BIOLOGA : mL en tubo inclinado
9 mL en tubo en columna
=/ mL en 3 'rlenmeyer.
'sterilice los medios de cultivo en la autoclave. . <espu"s de que los medios de cultivo
salgan del autoclave de#e enfriar hasta aproximadamente 4/8C y vierta el contenido del
erlenmeyer en dos ca#as de petri 5;/ mL en cada una6 e incube el resto en baBo mar$a a
74
o
C, incline uno de los tubos y ponga el otro verticalmente, de#e enfriar y rotule.
'fect2e los clculos para preparar 9/ mL de caldo nutritivo. Siga las instrucciones de la
etiqueta, vierta porciones de 4 mL en = tubos de ensayo, rotule, esterilice y de#e enfriar.
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-repare 3// mL de %gua -eptonada, vi"rtalos en = tubos de 1.1 mL y esterilice.
'stos medios se guardarn para ser empleados en el siguiente procedimiento.
8.1 AISLAMIENTO Y SIEMBRA DE MICROORGANISMOS 9BACTERIAS:
La observacin e interpretacin de los cultivos primarios despu"s de la incubacin es el
paso definitivo en la decisin de continuar o no con la identificacin de los
microorganismos aislados.
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DEPARTAMENTO DE BIOLOGA La decisin se basa en la observacin de las caracter$sticas y n2mero de cada tipo de
colonia, grado de pureza, coloracin de )ram y los cambios en el medio de cultivo que
rodea la colonia los cuales refle#an la actividad metablica de la bacteria aislada, elemento
importante en la identificacin.
Se debe tener en cuenta las caracter$sticas del crecimiento: tamaBo, elevacin, margen,
color, superficie, consistencia y forma 5puntiforme, circular, filamentosa, rizoide, etc.6.
@gualmente, los cambios en los medios de cultivo diferenciales! varios colorantes
indicadores de p, evidencian la actividad metablica y ayudan a identificar las colonias
aisladas.
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8.1. 1. CARACTERISTICAS DE LOS CULTIVOS BACTERIANOS
'sterilice el asa en la llama del mechero calentndola completamente hasta el ro#o.
Con el asa siembre separadamente una muestra del cultivo que le corresponda:
Proteus sp, E. coli, B. Cereus, Salmonella, S. aureus, Pseudomona sp, o Klebsiella
sp.; 'n un tubo de ensayo con agar nutritivo inclinado introduzca el asa en l$nea recta
e inocule la superficie del medio. Alamee la boca del tubo y tpelo. Alamee
nuevamente, esterilice nuevamente el asa.
>epita el anterior procedimiento con el tubo con agar nutritivo en columna.
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DEPARTAMENTO DE BIOLOGA Cbtenga otra muestra del cultivo bacteriano y raye suavemente de manera horizontal
sobre la superficie del agar contenido en una ca#a de petri. +ape y esterilice el asa. *o
olvide rotular.
@nocule de manera similar el cultivo disponible en caldo nutritivo, agitando bien el asa
dentro del caldo.
@ncube por 3. 0 ;7 horas, haga observaciones y esquemas, describa como crece el
microorganismo estudiado, ay2dese con las figuras anexas.
8.1.1. METODOS DE AISLAMIENTO
8.1.1.1. En 'pe#&$!$e:
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DEPARTAMENTO DE BIOLOGA Con el asa bacteriolgica tome una muestra de un tubo que contiene un cultivo
bacteriano mixto, $e/0#e po# et#"a sobre un tercio de la ca#a de petri que contiene
agar nutritivo, de la siguiente manera:
Alamee el asa.
'n un extremo de la ca#a con agar realice rayados suaves en forma horizontal sobre la
superficie del agar utilizando el asa 5formando estr$as6 para realizar el primer
aislamiento bacteriano, gire la ca#a 1/8 y flamee el asa! contin2e el aislamiento
realizando el mismo procedimiento en los tres extremos restantes de la ca#a. 'n el
2ltimo extremo, cuando este realizando la estriacin tenga cuidado de no tocar con el
asa el primer rayado que realiz.
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DEPARTAMENTO DE BIOLOGA 8.1.1.1. En p#o&'n,$,a,:
+"cnica utilizada para hacer recuento a partir de diluciones. Con este m"todo de
siembra es ms fcil observar reacciones metablicas bacterianas, tales como:
liplisis, protelisis y fermentaciones.
'l medio de cultivo preparado en el erlenmeyer debe estar fundido y a 74 8C.
+ome 3 mL del cultivo mixto y transfi"ralo al tubo con 1 mL de %gua -eptonada.
+ome 3 mL de la dilucin anterior y depos$telo en el centro de la ca#a de petri est"ril
vac$a.
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DEPARTAMENTO DE BIOLOGA &erter el medio de cultivo en la ca#a de petri y homogeneizar por movimientos
giratorios horizontales en varias direcciones, teniendo cuidado de no formar burbu#as.
<e#ar solidificar e incubar.
;. OBSERVACIONES< C=LCULOS Y RESULTADOS
%note las observaciones realizadas sobre los cultivos, enfatizando en las caracter$sticas
del crecimiento de las bacterias. -ara tales efectos, emplee los descriptores entregados
en la )u$a de -rctica *o. 9.
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DEPARTAMENTO DE BIOLOGA >. RECUPERACIN< DESACTIVACIN Y?O ALMACENAMIENTO TEMPORAL DE LOS
RESIDUOS.
Los residuos resultantes corresponden a cultivos bacterianos, los cuales se inactivan y
esterilizan en autoclave. (na vez terminado el proceso de esterilizacin, los residuos se
disponen en bolsas termoresistentes, se de#an enfriar hasta solidificacin y se almacenan
temporalmente ba#o congelacin, La disposicin final se hace mediante el servicio de
recoleccin de residuos biolgicos contratado por la (niversidad con la %dministracin
Dunicipal.
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1@. BIBLIOGRAFA
D%<@)%* D. +., D%>+@*EC F.D. y -%>E'> F. ?>CCE. ?iolog$a de los
microorganismos. Cctava edicin. -earson -rentice ,all, Dadrid,;//7.