Tcnicas de separacin de biomolculas

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TCNICAS DE SEPARACIN DE BIOMOLCULAS
BIOMOLECULES SEPARATION TECNHIQUES
Cely, Angela Carolina*; Alvarez, Brandon Steeven.**
Fecha de entrega del informe: 05-11-13
Resumen: Se procedi a identificar distintos tipos de aminocidos (triptfano, leucina, acido glutmico y una
muestra problema) por medio de 3 tcnicas de separacin; la cromatografa en papel y la cromatografa en capa
fina permiti medir su Rf, el cual es nico para cada compuesto y la electroforesis que mediante el uso de
corriente elctrica permiti diferenciar los aminocidos debido a la diferencia de su carga neta. Se determin que
dependiendo de la fase mvil, el aminocido que ms se desplaza es aquel cuya polaridad sea afn con sta y en
la electroforesis, el aminocido que ms se desplaza hacia alguno de los electrodos es porque esta polarizado
debido a la diferencia de carga neta a distintos pH.
Palabras clave: Cromatografa en papel CCF electroforesis aminocidos
Abstract: Proceeded to identify different types of amino acids (tryptophan, leucine, glutamic acid and a test
sample) using three separation techniques, paper chromatography and thin layer chromatography to measure its
Rf

allowed, which is unique for each compound and electrophoresis using electric current allowed to differentiate
amino acids due to its net charge difference. Is determined depending on the mobile phase, the amino acid more
shifts is one whose polarity is akin to this and the electrophoresis, the amino acid that is moved over one of the
electrodes is because this polarized due to the difference in net charge at different pHs.
Key words: Paper chromatography FCC electrophoresis amino acids
Introduccin
En 1903, el botnico ruso Milkhail Tswett describi la separacin
de pigmentos de hojas vegetales en solucin por medio de
slidos adsorbentes, llamando a este proceso cromatografa (del
griego chroma, color + graphein, escribir). Los mtodos
modernos de separacin cuentan en gran parte de procedimientos
cromatogrficos. En todos ellos, una mezcla de sustancias a ser
fraccionadas es disuelta en un fluido lquido o gaseoso conocido
como la fase mvil. La solucin resultante es filtrada a travs de
una columna que consiste de una matriz solida porosa conocida
como la fase estacionaria, que en ciertos tipos de cromatografa
puede ser asociada con un lquido confinado. Las interacciones
de los solutos individuales con la fase estacionaria actan en
retardar su progreso a travs de la matriz en una manera que varia
con las propiedades de cada soluto. Si la mezcla a ser fraccionada
inicia su recorrido por medio de la columna en una banda
estrecha, las diferentes fuerzas ralentizantes en cada componente
que causan que ellas migren a diferentes proporciones que
eventualmente causar que la mezcla sea separada dentro de
bandas de sustancias puras.
Facultad de Ciencias Bsicas
Escuela de Qumica
Programa de Qumica
*angelac-13@hotmail.com
** roqui.li93@hotmail.com

El poder de la cromatografa deriva de la naturaleza continua de
los procesos de separacin. Un paso simple de purificacin puede
tener muy poca tendencia a separar una mezcla en sus
componentes. Sin embargo, desde que este proceso sea aplicado
de una manera continua, en efecto, repetido cientos o miles de
veces, la segregacin de la mezcla en sus componentes
finalmente ocurre. Los componentes separados pueden luego ser
recolectados dentro de fracciones separadas para su anlisis y/o
posterior fraccionamiento.
La cromatografa de papel desarrollada en 1941 por Archer
Martin y Richard Synge, desempeo un rol indispensable en los
anlisis bioqumicos debido a su habilidad de separar
eficientemente molculas pequeas como aminocidos,
oligopptidos, nucletidos y oligonucletidos y su requerimiento
es el ms simple de los equipamientos.
En la cromatografa en papel, unas pocas gotas de solucin
contiene una mezcla de los componentes a ser separados son
aplicados 2 cm por encima del borde de una tira de papel de
filtro. Despus de estar seco, el borde del papel es introducido
dentro de una mezcla de solvente consistente de componentes
acuosos y orgnicos. El papel debera entonces estar en contacto
con los vapores en equilibrio del solvente. El solvente empapa al
papel por accin de la capilaridad debido a la naturaleza fibrosa
del papel. Los componentes acuosos del solvente se ligan a la
celulosa del papel y de este modo forma una fase gel-estacionaria
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que es afn con ste. Los componentes orgnicos del solvente
continan migrando, entonces formando la fase mvil.
Las proporciones de migracin de varias sustancias a ser
separadas son gobernadas por sus solubilidades relativas en la
fase estacionaria polar y la fase mvil apolar. En un primer paso
del proceso de separacin, un soluto dado es distribuido entre las
fases mviles y estacionarias de acuerdo a sus coeficientes de
particin, una constante de equilibrio definida como:

Las molculas son adems separadas de acuerdo a sus
polaridades, donde las molculas apolares se mueven ms rpido
que las polares.
Despus el frente del solvente ha migrado una distancia
apropiada, el cromatograma es removido del solvente y es
secado. Los materiales separados, si no son coloreados, pueden
ser detectados por medios tales como su radioactividad, su
fluorescencia o su habilidad para reprimir la fluorescencia normal
del papel bajo luz UV o rociando el cromatograma con una
solucin de una sustancia que forme un producto coloreado en
reaccin con las sustancias bajo estudio.
La proporcin de migracin de una sustancia puede ser expresada
de acuerdo al cociente R
f
:

Para un sistema de solvente dado y tipo de papel, cada sustancia
tiene un valor de R
f
caracterstico.
En la electroforesis, la migracin de iones en un campo elctrico,
es ampliamente usada para la separacin analtica de molculas
biolgicas. En la electroforesis en papel, la muestra es aplicada
en un punto de una tira de papel de filtro o acetato de celulosa
humedecido en una solucin buffer. Los bordes de las tiras son
inmersos en depsitos separados de buffer en el que los
electrodos son colocados. En contacto de corriente directa
(frecuentemente de 20 V cm
-1
), los iones de la muestra migran
hacia los electrodos de polaridad opuesta en proporciones
caractersticas que eventualmente formas bandas discretas. Una
proporcin de la migracin de los iones es influenciada, por su
interaccin con el soporte de la matriz pero es en gran parte una
funcin de su carga. Al finalizar el electroforetograma (que
usualmente toma varias horas), la tira es secada y los
componentes de la mezcla son localizados usando los mismos
mtodos de deteccin empleados en la cromatografa en papel.
La electroforesis en papel y la cromatografa en papel son
superficialmente similares. Sin embargo, la electroforesis en
papel separa iones en su mayora en base a su carga inica,
mientras que la cromatografa en papel separa molculas en base
a su polaridad [1].

Resultados y discusin
Se us 3 tipos de separacin para el reconocimiento de 3
aminocidos y una muestra problema a identificar:
Cromatografa en papel: los resultados arrojados por este
mtodo de separacin se reportan en la tabla 1:
Distancia
recorrida
triptfano leucina
Acido
glutmico
muestra
solvente 3 cm 2,7 cm 3,2 cm 2,7 cm
aminocido 2,5 cm 2,5 cm 2,4 cm 2,4 cm 2 cm
R
f
0,833 0,926 0,75 0,926 0,74

Tabla 1. Muestras analizadas por cromatografa en papel con sus
respectivas distancias recorridas y factor de reparto Rf.
Se observ que los aminocidos apolares recorrieron mas
distancia frente a los aminocidos polares debido a la fase mvil
usada (en mayor parte solventes orgnicos). As los aminocidos
leucina y triptfano presentan los mayores valores de Rf frente al
acido glutmico que es menor debido a su polaridad. Para la
muestra problema se determin que era una mezcla de 2
aminocidos: leucina y acido glutmico al coincidir sus
respectivos Rf frente a dichos aminocidos. Las muestras fueron
reveladas con ninhidrina -al no absorber stos aminocidos en la
franja visible- que en cada caso produjo un aducto de color
violeta; la reaccin de sta con cada aminocido analizado se
encuentran en las figuras 1, 2 y 3 respectivamente.

Figura 1. Reaccin del triptfano con ninhidrina formando un
aducto de color violeta.

Figura 2. Reaccin de leucina con ninhidrina formando un
complejo de color violeta.
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Figura 3. Reaccin de cido glutmico con ninhidrina formando un
aducto de color violeta.
Cromatografa en capa fina (CCF): para este tipo de
cromatografa se us como fase estacionaria una lmina de
aluminio con almina como agente adsorbente. Los datos
obtenidos por este procedimiento se observan en la tabla 2:
Distancia
recorrida
triptfano
leucina Acido
glutmico
muestra
solvente 5,8 cm
aminocido 4,7
cm
4,9 cm 3,6 cm 3,6
cm
4,9cm
R
f
0,810 0,844 0,62 0,62 0,844

Tabla 2. Muestras analizadas por cromatografa en capa fina con
sus respectivas distancias recorridas y facto de reparto Rf.
Al igual que en la cromatografa en papel se observ que los
aminocidos apolares recorrieron mayor distancia frente a los
aminocidos polares debido a la diferencia de polaridades y
tambin por la fuerza de adsorcin que presenta con la fase
estacionaria haciendo ms rpidos a los aminocidos apolares
que a los polares debido a que los primeros no son retenidos
fuertemente por la almina frente a los apolares. La muestra
problema analizada por este procedimiento determin que era
compuesta por 2 aminocidos: leucina y acido glutmico; esto se
identific por los valores R
f
obtenidos en el cromatograma que se
compararon con los aminocidos puros. La placa cromatogrfica
se revel con ninhidrina dando productos de tonalidad violeta
como se indican en las figuras 1, 2 y 3 respectivamente.
Se observa que este tipo de tcnica es til en la separacin de
molculas de menor tamao y la tcnica se fundamenta en la
solubilidad y polaridad de las molculas teniendo mayores
valores de Rf las sustancias apolares en comparacin a las
polares debido a que las ultimas tienden a ser adsorbidas por la
fase estacionaria utilizada lo cual ralentiza su desplazamiento a
travs de la placa cromatogrfica.
Una de las aplicaciones importantes de la CCF es la
identificacin de la fenilcetonuria, la cual se refiere a niveles de
fenilalanina en la sangre superiores de forma persistente a 2,5
mg/mL, y que son secundarios a una alteracin en la reaccin
enzimtica de hidroxilacin de fenilalanina, en la que el
individuo afectado no puede metabolizar la fenilalanina, la cual
se va acumulando en el torrente sanguneo produciendo a su vez
daos cerebrales y retraso mental. Los primeros sntomas de esta
enfermedad suelen observarse los primeros aos de vida donde
suelen perder inters de su entorno con posterior evidencia de un
retraso en el desarrollo. Si la enfermedad no es tratada se
observan problemas de conducta, suelen aparecer lesiones
drmicas semejantes a un eczema y, la orina y el sudor suele
tener un olor semejante a la orina de ratones (debido a la excreta
de cido fenilactico). La deteccin de esta enfermedad se hace
mediante cromatografa unidimensional en capa fina para
aminocidos en sangre, donde la muestra de sangre se compara
con un patrn estndar a concentraciones normales. Despus del
revelado de la placa cromatogrfica, el indicio positivo de la
fenilcetonuria se observa por un aumento franco en la banda
correspondiente a la fenilalanina [2], en comparacin al estndar
de 4 mg/mL (figura 4).

Figura 4. Cromatograma para aminocidos en sangre donde la
banda derecha corresponde a un resultado positivo para
fenilcetonuria.
Electroforesis en papel: este procedimiento no logr ser
realizado en el laboratorio por lo cual se describe tericamente.
Esta tcnica se basa en la migracin de los iones hacia alguno de
los electrodos de carga opuesta a stos por accin de una
corriente elctrica. Dependiendo del pH al cual se realiza el
electroforetograma, el desplazamiento vara debido a la carga
inica que presentan los aminocidos. Se plante realizar la
electroforesis en papel a 3 pH distintos; 3, 6 y 12.
A pH igual a 3, el pH de la leucina est por debajo de su punto
isoelctrico (6,035) por lo que su forma inica predominante es
la protonada tendiendo a migrar hacia el ctodo. El triptfano, al
igual que la leucina, su pH est por debajo de su punto
isoelctrico (5,935) por lo que tambin se encuentra en forma
protonada en gran proporcin por lo cual migra hacia el ctodo.
El pH del acido glutmico es similar a su pI (3,085) por lo cual se
encuentra en mayor parte como zwitterin por lo que no migra
hacia alguno de los electrodos. La muestra problema al estar
compuesta por leucina y acido glutmico tiende a separarse en
stos y su desplazamiento es similar a la migracin de los
aminocido que la componen; por tanto tambin presentan las
mismas formas inicas (figura 5).

Figura 5. Formas inicas predominantes a un pH igual a 3 del
triptfano, leucina y cido glutmico respectivamente.
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A un pH igual a 6, el pI del triptfano tiende a ser semejante a
este pH por lo cual la forma inica predominante es en su gran
mayora la de un zwitterin por lo cual no migra o migra muy
poco en relacin a su posicin inicial. Este mismo hecho ocurre
para la leucina cuyo pI se asemeja al pH del medio por lo cual
tambin tiende a estar en su sitio inicial o realizar un
desplazamiento muy corto de ste. El cido glutmico al ser un
aminocido cido, su valor de pI est por debajo del pH del
medio por lo cual su forma inica predominante es en forma de
anin por lo cual tiende a desplazarse hacia el nodo. La muestra
problema al estar constituida por leucina y acido glutmico, solo
se desplaza el acido glutmico hacia el nodo por tener su valor
de pI menor al pH del medio y la leucina continua en su posicin
de siembra o realiza un desplazamiento muy corto al tener el
valor del pH y su pI similares (figura 6).

Figura 6. Formas inicas predominantes a un pH igual a 6 del
triptfano, leucina y cido glutmico respectivamente.
A un pH igual a 12, el pI del triptfano est por debajo del pH del
medio por lo cual la forma inica predominante es la aninica por
lo cual la muestra tiende a migrar hacia el nodo. La leucina y el
acido glutmico tiene tambin su pI por debajo del pH del medio,
luego las muestras tienden a desplazarse hacia el nodo. La
muestra problema al estar constituida por leucina y acido
glutmico tambin tiende a migrar de manera anloga a los
aminocidos anteriormente descritos (figura 7).

Figura 7. Formas inicas predominantes a un pH igual a 12 del
triptfano, leucina y acido glutmico respectivamente.
A diferencia de la cromatografa en papel, la electroforesis en
papel se fundamenta en la carga inica de los aminocidos donde
los desplazamientos de los iones a travs del papel estn
marcados por las diferencias entre el pH del medio y su pI. As,
cuando la diferencia entre el pH del medio y el pI de cada
aminocido es mayor, la migracin de los iones a travs del papel
hacia uno de los electrodos es mayor y esto constituye una
manera importante para la separacin de una muestra en sus
componentes (figura 8).
Otros tipos de electroforesis comnmente usados en separacin
de biomolculas son:
Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE): el mtodo ms
ampliamente usado para determinar la pureza de una protena es
la SDS-PAGE, electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia

Figura 8. (a) un diagrama del aparato usado. La muestra es
aplicada en un punto del papel humedecido con buffer.los bordes
del papel son sumergidos dentro de depsitos de buffer en el que
los electrodos son inmersos, y un campo elctrico es aplicado. (b)
el electroforetograma en papel culminado. Note que los iones
positivos (cationes) han migrado hacia el ctodo y los iones
negativos (nodos) han migrado hacia el nodo. Las molculas no
cargadas permanecen en el punto de la aplicacin de la muestra.
Del detergente aninico dodecil sulfato de sodio (SDS). La
electroforesis separa biomolculas cargadas con base en los
ndices a los cuales migran en un campo elctrico aplicado; en
cuanto a la SDS-PAGE, la acrilamida se polimeriza y se
entrecruza para formar una matriz porosa. La SDS se
desnaturaliza y se une a protenas a una proporcin de una
molcula de SDS por cada 2 enlaces peptdicos. Cuando es
utilizada en forma conjunta con 2-mercaptoetanolo ditiotreinol
para reducir enlaces disulfuro y romperlos, la SDS-PAGE separa
los polipptidos componentes de protenas multimricas. El gran
numero de molculas de SDS aninicas, cada una de las cuales
porta una carga de -1, abruma las contribuciones de carga de los
grupos funcionales aminocido endgenos a los polipptidos.
Dado que la proporcin entre carga y masa de cada complejo de
SDS-polipptido es ms o menos igual, la resistencia fsica que
cada pptido encuentra a medida que se mueve por la matriz de
acrilamida determina el ndice de migracin. Dado que los
complejos grandes encuentran mayor resistencia, los polipptidos
se separan con base en su masa molecular relativa. Es factible
visualizar polipptidos individuales atrapados en el gel de
acrilamida mediante tincin con colorantes como azul de
Coomassie.
Enfoque isoelctrico: se usan amortiguadores inicos llamados
anfolitos y un campo elctrico aplicado para generar un gradiente
de pH dentro de una matriz de poliacrilamida. Las protenas
aplicadas migran hasta que llegan a la regin de la matriz donde
el pH coincide con su pI. Este mtodo se usa de forma conjunta
con SDS-PAGE para la electroforesis bidimensional, que separa
polipptidos con base en el pI en una dimensin y con base en la
masa molecular relativa en la segunda. La electroforesis
bidimensional resulta idnea para separar los componentes de
mezclas de protenas complejas [3].
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Conclusiones
Las cromatografas son usadas especialmente para
separar molculas de menor tamao en comparacin
con la electroforesis la cual se usa en la separacin de
biomolculas de gran tamao.
El fundamento de la cromatografa se basa en las
diferencias de polaridad y solubilidad de la muestra
donde los componentes apolares tienen mayores
migraciones frente a los componentes polares.
La electroforesis se basa en la interaccin de la muestra
con un campo elctrico aplicado donde solo las
partculas cargadas (iones) se desplazan a travs del
papel hacia uno de los electrodos con carga opuesta.
La leucina y el triptfano al ser aminocidos apolares
recorrieron mayores distancias frente al acido
glutmico que es una aminocido polar.
En la electroforesis, en tanto que los pI de los
componentes de la mezcla estn ms alejados del pH
del medio, mayor ser la migracin a travs del papel.
Una aplicacin importante de la CCF se encuentra en la
deteccin de fenilcetonuria a travs de una muestra de
sangre donde se determina la proporcin de la banda
correspondiente a la fenilalanina y el tamao de sta,
determina la positividad de la prueba.
[1] DONALD VOET, Judith. VOET, Charlotte. Biochemistry. 4 ed. John
Wiley and Sons. USA. 2011. Pg. 140-152.
[2] Comienzos de la tria neonatal en Espaa. Fenilcetonuria. [En lnea].
[Consultado el 03 nov. 2013] Disponible en
<http://ub.edu.ar/centros_de_estudio/ceegmd/documentos/Tesina
_Ivana.pdf>
[3] MURRAY, Robert K., BENDER, David A., et al. HARPER:
Bioqumica ilustrada. 28 ed. McGraw-Hill. Mxico. 2006. Pg. 20-45
[4] Cromatograma en capa fina para deteccin de fenilcetonuria. [En
lnea]. [Consultado el 03 nov. 2013]. Disponible en
<http://www.scielo.edu.uy/scielo.php?pid=S0004-
05842001000400010&script=sci_arttext>