Tecnicas Analiticas para Vinos

Juan Garca Barcel
TECNICAS
ANALITICAS
PARA VINOS
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GAB Sistemtica Analtica S.L.
Sant Jordi, 30. Moja-Olrdola 08734, BCN
tel. +34 938 171 842 fax. +34 938 171 436
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TECNICAS ANALITICAS PARA VINOS
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TECNICAS ANALITICAS
PARA VINOS
Juan Garca Barcel
Publicado por:
GAB
C/ Sant Jordi, 30 - Tel. (+34) 93 817 18 42 - Fax. (+34) 93 817 14 36
08734 MOJA-OLRDOLA (Barcelona}
1 Edicin - Octubre 1990
ISBN 84-404-7827-5
Depsito Legal B-36.850/90
Diseo:
NEXOS I. &S.
Fotocomposicin y montaje:
Peneds Edicions, S.A. - Vilafranca del Peneds
Impreso por:
Romany/Valls, S.A. - Capellades
Presentacin
Todas las obras deben ser fruto de una experiencia, de un conoci-
miento y de una reflexin. En esta ocasin el lector tiene en sus manos
un libro que rene los tres requisitos apuntados. Adems tiene como
mrito que ha sido elaborado para servir a un profesional que hace de
su quehacer diario un arte: el enlogo.
Con el inters, por consiguiente, que fuera til en la bodega, este libro
posee la ventaja de haber sido escrito por un enlogo que ha prestado
servicio a un buen nmero de bodegas, que ha vivido vendimias y
vinificaciones, y conocido la utilidad del control analtico sobre un
producto en periodo de evolucin.
Una obra como esta, no se escribe sin un buen bagaje de conoci-
mientos. El autor que ha desarrollado sus conocimientos como tcnico
analista durante muchos aos, en una Estacin de Viticultura y
Enologa, concretamente en la de Vilafranca del Peneds, es claro
ejemplo del servicio que estas instituciones, repartidas por todo el
territorio espaol, ofrecen al sector vitivincola.
En las Estaciones Enolgicas la funcin de los tcnicos, como el
autor, no se circunscribe tan solo en realizar su trabajo de analista,
debe tambin ejercer otras funciones: estar debidamente informado de
las novedades analticas, de los problemas que vive el sector y de sus
posibles soluciones, transmitir la informacin a la institucin, colaborar
en los proyectos de investigacin o experimentacin y tambin, en la
medida de lo posible, crear escuela.
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La personalidad del autor de este libro, le ha permitido cumplir con
creces muchos de estos encargos tcitos, siendo adems evidente su
inquietud por ampliar conocimientos y transmitirlos, hecho que todos
los que con l nos relacionamos podemos constatar.
Este minucioso trabajo es tambin consecuencia de la reflexin que
conlleva el conocer, profundamente, a quin va dirigido. Es fcil
localizar en la memoria del lector, tres obras de este autor que han
formado parte de la biblioteca de numerosos laboratorios enolgicos.
Debe hacerse mencin tambin que esta obra adquiere un nivel
ptimo, en cuanto a metodologas actuales en anlisis de control
rutinario y de investigacin. Es decir sirve al enlogo en su labor diaria y
permite, a l y a otros estudiosos, penetrar en trabajos de control
mucho ms sofisticados y con tcnicas ms fiables.
Se recogen en esta obra, los mtodos analticos de la mayora de
compuestos que pueden formar parte de una caracterizacin enol-
gica, tanto aquellos que se encuentran tras un proceso normal de
vinificacin como aquellos que son contaminantes, bien sean acci-
dentales (estireno, residuos antocriptogmicos, etc.) o voluntarios (ci-
do saliclico, edulcorantes sintticos, etc.).
No estn contemplados todos los componentes del vino porque ello
supondra entrar dentro del mbito de la investigacin, utilizando el
anlisis como finalidad ms que como herramienta para el apoyo a la
produccin. Aunque la componente prctica de la obra resalta en
cualquiera de sus pginas, hace despertar en las personas ms
receptivas, la inquietud hacia el mundo de la enologa y les introduce en
la complejidad de los productos vitivincolas, cuyo mximo exponente
es el vino, y siempre en constante evolucin bioqumica.
Con relacin a sus trabajos anteriores el autor en esta obra da en-
trada a mtodos instrumentales: cromatografa de gases, espectro-
fotometra de absorcin atmica, espectrofotometra visible y ultra-
violeta, etc. Es decir, aquellas metodologas que ya comienzan a estar
presentes en laboratorios de grandes empresas y de todos los centros
oficiales. Otras tcnicas, incluida la cromatografa lquida de alta
resolucin, espectrofotometra de infrarrojo, etc. han sido soslayadas
por el autor y lmites de esta obra.
La situacin poltica en la que est inmersa nuestra comunidad vi-
tivincola, hace que las referencias a los mtodos oficiales, deban surgir
de su misma organizacin. Por ello, todo tratado como ste, que
se precie de actual, debe recoger la metodologa analtica de la Co-
munidad Econmica Europea, cuyos mtodos son en su mayor parte
propuestos o aprobados por la Oficina Internacional de la Via y el Vino
(O.I.V.).
Como toda obra de ste carcter es difcil decir que un trabajo ha
salido a la luz totalmente a gusto del autor y actualizado al mximo. Sin
embargo, este libro aporta una de las recopilaciones ms exhaustivas
que sobre anlisis de productos vincolas se han realizado en los
ltimos tiempos. Es a mi modo de entender un buen trabajo, un buen
servicio a la enologa y a la analtica y un magnfico nexo de unin entre
ambas.
Santiago Mnguez Sanz
Estacin de Viticultura y Enologa
Institut Catal de la Vinya i el Vi
Vilafranca del Peneds, mayo de 1990.
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Introduccin
Este libro pretende ser una ayuda al analista de vinos, enlogo y
bodeguero, al presentar una serie de metdicas que han sido esco-
gidas, de las mltiples que existen, pensando en la exactitud y sencillez
de trabajo. Se ha procurado evitar las tcnicas instrumentales ms
complejas, como: Resonancia Magntica Nuclear, Espectrofotometra
en Infrarrojo, Radioqumica y en ella se incluiran las tcnicas con el
carbono radioactivo (C ), etc. Apesar de ello, es de esperar que cumpla
con la idea en la que fue concebido este libro: ser til.
La disposicin de los captulos se ha efectuado por orden alfabtico
de temas globales de anlisis. En cada uno de ellos se describen varias
tcnicas analticas que pueden ser aplicadas segn las dispo-
nibilidades de equipo y personal.
En cuanto se refiere a la distribucin de cada anlisis, se ha procu-
rado separar perfectamente el principio del mtodo, los reactivos ne-
cesarios, la tcnica operativa y los clculos. En algunas tcnicas, se ha
introducido un apartado de comentarios, para ampliar el tema tratado.
Tambin se resumen algunas notas aclaratorias del autor, en el
apartado de observaciones.
En lo referente a reactivos, los productos que se indican debern ser
de la calidad: reactivo para anlisis. Cuando se hace referencia al agua,
para diluciones u otras aplicaciones, siempre se refiere a: agua
destilada.
14
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Todos los volmenes que deben medirse con exactitud, en el libro
se expresan con dos decimales, por ejemplo: 10.00 mL.
Al final del texto, se recogen una serie de tablas que pueden ser
de gran ayuda para el lector.
He de agradecer, sobremanera, a D. Santiago Minguez Sanz, Doc-
tor Ingeniero Agrnomo, Director de la Estacin de Viticultura y Eno-
loga de Vilafranca del Peneds, el aceptar presentar esta humilde
aportacin, a la ardua labor del analista.
El Autor
INDICE GENERAL
ACIDEZ
ACIDOS
ADITIVOS QUIMICOS
ALCOHOLES
AZUCARES
CARACTERISTICAS CROMATICAS
COMPUESTOS CARBONILICOS
COMPUESTOS FENOLICOS
COMPUESTOS NITROGENADOS
CAPITULO 1
CAPITULO 2
CAPITULO 3
CAPITULO 4
CAPITULO 5
CAPITULO 6
CAPITULO 7
CAPITULO 8
CAPITULO 9
ESTERES CAPITULO 10
GASES CAPITULO 11
METALES CAPITULO 12
OTROS COMPUESTOS CAPITULO 13
REGLAS ENOQUIMICAS CAPITULO 14
SOLIDOS SOLUBLES CAPITULO 15
UNIDADES INTERNACIONALES CAPITULO 16
PESTICIDAS Y FUNGICIDAS CAPITULO 17
TABLAS
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1. ACIDEZ
ACIDEZ TOTAL 1.5
METODO CEE, referencia 1.6
METODO CEE, usual 1.7
M ETODO DE LAA.O.A.C 1.9
METODO INSTRUMENTAL 1.11
METODO RAPIDOAPROXIMADO 1.11
TABLA DE EQUIVALENCIAS DE ACIDOS 1.13
ACIDEZ VOLATIL 1.14
METODO UNICO DE LA C.E.E 1.15
METODO GAB 1.19
METODO GARCIA-TENA 1.20
METODO A.O.A.C 1.21
METODO GAS CROMATOGRAFICO 1.24
METODO ENZIMATICO 1.27
METODO CON AUTOANALIZADOR 1.28
MEDICION DEL pH 1.30
METODO UNICO DE LA CEE 1.31
ACIDEZ FIJA 1.34
1.3
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Acidez total
COMENTARIOS
La acidez total es la suma de todas las acideces valorables que
contiene el mosto o el vino. Debe excluirse de ella las acideces de
adicin, como son: el dixido de carbono (carbnico) y el dixido de
azufre (sulfuroso).
En el vino se hallan los cidos procedentes del mosto, adems de
muchos ms, formados durante el proceso de fermentacin, como son:
actico, propinico, lctico, succnico, pirvico, gliclico, galacturnico,
fumrico y otros. El contenido en cido mlico es considerablemente
mayor en los mostos de uva no madura.
Los cidos que se valoran son los siguientes: tartrico, mlico, lc-
tico, succnico, actico, etc. Todos estos cidos orgnicos citados son
relativamente dbiles, por ello la neutralizacin con una base fuerte,
como lo es el hidrxido sdico, debe hacerse a valores de pH supe-
riores al 7.00. La ha fijado el valor en pH = 8.2 como punto final
en la determinacin de la acidez total y ste corresponde al viraje de
color de la fenolftalena.
Sin embargo la O.I.V., define la acidez total, como suma de los ci-
dos valorables, hasta pH 7.0, por adicin de solucin de hidrxido
s-
AOAC'
1. ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS.
1.5
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dico. El cido carbnico y el dixido de azufre no se deben incluir en
la expresin de la acidez total.
Valoracin potenciomtrica.
1. Se eliminar, previamente, el gas carbnico y el dixido de
azufre que se halle en el vino o mosto.
2. Colocar 100 mL de la muestra en un matraz de 500 mL, pro-
visto de un refrigerante de reflujo.
3. Se hace pasar una corriente de gas nitrgeno por el interior,
para la eliminacin del aire.
4. El matraz se calienta hasta ebullicin, que se mantendr
durante una hora, con una circulacin lenta de nitrgeno.
5. Djese enfriar hasta la temperatura ambiente, sin interrum-
pir el paso del gas nitrgeno.
6. En un vaso de precipitados de 100 250 mL, se colocan
20.00
7. Se procede a la valoracin, con hidrxido sdico 0.1 M, con-
tenido en una bureta, midiendo simultneamente el pH de la
solucin con un electrodo sumergido en la misma, y co-
nectado a su correspondiente medidor.
8. Cuando se alcance el valor de pH 7.0 a la temperatura de
20C, se detendr la adicin del reactivo. Sean el volumen de
reactivo gastado.
METODO CEE, referencia
Principio del mtodo
Tcnica operativa
mL de la muestra desgasificada.
3
2. Journal officiel des Communauts europennes, Todas
las metdicas CEEque se citan en este libro, han sido tomadas de la Revisin indicada.
3. En este manual, los volmenes de lquido que deben ser medidos exactamente sern
presentados con dos decimales (ejemplo 20.00).
Revisin 1 de 17 de diciembre de 1987.
1.6
Clculos
Observaciones
Principio del mtodo
La frmula para el clculo, en miliequivalentes por litro es:
Acidez = 10
Para expresar la acidez en gramos de cido tartrico por litro, la
frmula a aplicar es:
Acidez = 0.75 x n
x n
La adicin del lquido de valoracin (hidrxido sdico 0.1 M), deber
hacerse lentamente y mantener la solucin en constante agitacin. El
tiempo de valoracin debe durar, por lo menos, unos 5 minutos
aproximadamente.
Se elimina el gas carbnico del vino, por agitacin de 50 mL en un
matraz de un litro, al propio tiempo que se procede a un vaco con una
trompa de agua. La agitacin debe durar de 1 a 2 minutos, hasta que el
desprendimiento de gas disuelto, haya cesado. De este vino se
tomarn 10.00 mL para la determinacin de la acidez total y 20.00 mL
para la acidez voltil .
La acidez total del vino, medida a pH 7.00, se efecta con el empleo
de azul de bromotimol como indicador. Un ensayo previo, permite
establecer un patrn de color ajustado a pH7.00. La acidez del dixido
de azufre libre y combinado, viene corregida por la frmula establecida,
utilizando los volmenes de de iodo 0.005 M gastados para la
oxidacin del dixido de azufre libre y combinado, obtenidos al valorar
el destilado de la acidez voltil, a partir de 20.00 mLde vino.
METODO CEE, usual
4
y n" , n'
4. Vase la tcnica en el anlisis correspondiente a este mtodo de CEE.
1.7
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Reactivos
Tcnica operativa
HIDROXIDO SODICO 0.05 M,
INDICADOR DE AZUL DE BROMOTIMOL. Se
SOLUCION TAMPON de pH 7.00.
mL
Preparacin del patrn de coloracin
Anlisis propiamente dicho
exento de CO .
prepara disol-
viendo 4 gramos de indicador, colocndolos en un matraz de
un litro, con 200 mL de alcohol etlico neutro, aadindole
hidrxido sdico 1 M hasta coloracin azul-verde (sta ser la
del pH7.00) y enrasando a volumen con agua destilada exenta
de C0 .
Preparada con 107.3 gra-
mos de fosfato monopotsico, 500 de hidrxido sdico 1 M
y agua destilada hasta un litro. Puede utilizarse un tampn
comercial.
1. En un cristalizador de 12 cm de dimetro, se colocan 25 mL de
agua destilada hervida, 1 mL de la solucin de azul de
bromotimol y 10.00 mLde la muestra desgasificada.
2. Neutralizar, mediante el empleo de la solucin de hidrxido
sdico 0.1 M, en cantidad suficiente, para que adquiera una
coloracin verde azulada.
3. Aadir a continuacin 5 mL de la solucin tampn de pH 7.0.
4. En un cristalizador de 12 cm de dimetro, colocar 30 mL de
agua destilada hervida.
5. Se aade 1 mL de azul de bromotimol y 10.00 mL de la
muestra desgasificada.
6. A continuacin se procede a la valoracin, con la solucin de
hidrxido sdico 0.1 M contenida en la bureta, hasta que se
alcance una coloracin idntica a la obtenida en el ensayo
precedente y en las mismas condiciones de observacin.
7. El volumen de reactivo gastado de la bureta, se asigna como:
n.
2
2
1.8 1.9
Clculos
Observaciones
Principio del mtodo
Reactivos
Tcnica operativa
La acidez total, se expresa en miliequivalentes por litro, segn la
siguiente frmula:
Acidez= 10 x n
o bien en gramos de cido tartrico por litro de muestra, segn:
Acidez = 0.75 x n
Si se analizan varios vinos del mismo origen, es suficiente un solo
patrn de color. Si existen dudas sobre el viraje de la valoracin, puede
comprobarse que no se producir cambio de color, al aadir algunos
mililitros de la solucin tampn de pH7.0.
La valoracin se efecta con el indicador de fenolftalena. La pre-
sencia de gran cantidad de agua caliente minimiza el error debido al
contenido de dixido de carbono. Se procede sin desgasificar la
muestra, si sta corresponde a un vino tranquilo.
1%, preparada con al-
cohol del 70%.
Si el vino contiene apreciable cantidad de C0 , conviene eli-
minarlo por cualquiera de los dos mtodos siguientes:
METODO DE LAA.O.A.C.
5
SOLUCION DE FENOLFTALEINA al
HIDROXIDO SODICO 0.0667 M.
Desgasificacin de la muestra
2
5. Assoc. Off. Analytic Chemists, nmero 962.12, pgina 744, (1990).
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1.10 1.11
(1) Colocar 25 mL de la muestra en un pequeo erlenmeyer y
conectarlo a una trompa de succin por agua. Agitar 1 minuto
bajo vaco. (2) En un erlenmeyer de 100 mL, colocar 25 mL de
muestra. Calentar a incipiente ebullicin y dejarlo as durante
30 segundos, agitar y esperar a que alcance la temperatura
ambiente.
1. En un erlenmeyer de 500 mL, se hierven 200 mL de agua
destilada.
2. Se detiene la ebullicin y, todava caliente, se aade 1 mL
de la solucin indicadora de fenolftalena.
3. Con la solucin de hidrxido sdico, se neutraliza hasta al-
canzar un color rosado.
4. A continuacin se aaden 5.00 mL de la muestra de vino o
mosto.
5. Desde una bureta, se adiciona la solucin de hidrxido sdico,
que se ha utilizado anteriormente, hasta lograr mismo color
inicial.
El clculo de la acidez total, expresada en gramos de cido tartrico
por litro de vino, es igual al nmero de mililitros de reactivo de hidrxido
sdico, gastados en la valoracin.
Si se utiliza una solucin de hidrxido sdico 0.1 M, la acidez se
halla por la siguiente frmula:
Acidez = mL lcali x 0.1 x 0.075 x 1000/5 g tartrico/L
abreviadamente, acidez total, en g/L= mL lcali x 1.5.
a) Se procurar efectuar la valoracin en lugar bien iluminado y
sobre fondo blanco.
b) Los cidos orgnicos presentes en el vino (tartrico, mlico, lc-
tico, actico, etc.) son, relativamente, cidos dbiles frente al reactivo
de valoracin (hidrxido sdico), por ello el empleo de fenolftalena
como indicador.
c) Cuando estos cidos son neutralizados con lcali, como el em-
pleado en este anlisis, el verdadero punto final de la neutralizacin es
mayor que pH7.00, generalmente se halla entre el 7.80 y el 8.30.
.
el
Clculos
Observaciones
La American Society of Enologists, han aceptado como punto final de
valoracin de los vinos y mostos, el valor de pH = 8.20.
d) Por lo tanto, si se efecta una valoracin potenciomtrica, el
punto final deber situarse en el valor 8.20 de pH.
a la calibracin y contraste de los electrodos del
medidor.
2. Efectese la adicin del lcali de la bureta, con agitacin de la
muestra, hasta alcanzar la lectura de pH 8.2 en el medidor.
Esteser el punto final de la reaccin.
3. Caso de emplear un valorador automtico, el procedimiento
es muy similar, debindose fijar en el aparato, el valor de punto
final de la reaccin.
Es un mtodo muy rpido, aunque de resultado aproximado. Es,
tal vez, la metdica que se emplea en toda bodega por su facilidad.
METODO INSTRUMENTAL
METODO RAPIDO APROXIMADO
COMENTARIOS
Principio del mtodo
Reactivos
Tcnica operativa
Valoracin potencimetrica a pH = 8.20.
1. Se seguirn las instrucciones del instrumento empleado, en lo
que se refiere
6
6. J. Garca Barcel, Metodologa de anlisis de vinos y derivados (1976).
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1.12 1.13
Principio del mtodo
Reactivos
Tcnica operativa
Clculos
De hecho es una alcalimetra realizada directamente sobre el vino y,
en muchos casos, si el vino es tranquilo, sin eliminacin del carbnico
presente ni del sulfuroso. La solucin alcalina est preparada de forma,
que operando sobre 10.00 mL de la muestra, cada mililitro de reactivo
gastado equivale a un gramo de acidez, expresada en cido sulfrico.
1. Colquese en un vaso de 100 mL, 10.00 mL de la muestra de
vino o mosto, medidos con una pipeta limpia y seca, o lavada
con el propio vino.
2. Si el vino es blanco se aaden dos o tres gotas de
fenolftalena. Si el vino es tinto, no es necesario aadir el
indicador.
3. Se vierte, gota a gota, la solucin de hidrxido sdico 0,204 M
contenida en una bureta, procurando imprimir al vaso un
movimiento giratorio, hasta alcanzar una coloracin rosa. En
los vinos tintos el color es verdoso.
4. Se apreciar el viraje definitivo, por toque con un papel de
tornasol azul, dejando de aadir reactivo cuando dicho papel
deja de enrojecer.
La cantidad de mililitros y dcimas de reactivo gastados, nos indicar
el nmero de gramos y dcimas, de acidez total expresada en cido
sulfrico.
S se desea expresar la acidez hallada en tartrico, se multiplicar el
volumen gastado por 1.53. Si el valor quiere expresarse en milie-
quivalentes/litro, se multiplica la acidez sulfrica por 20.4.
a) En algunos vinos blancos, no se destaca netamente el color rosa
cuando se emplea la fenolftalena; es preferible controlar el punto
SOLUCION DE HIDROXIDO SODICO 0.2041 M.
SOLUCION DE FENOLFTALEINA al 2%.
Observaciones
final de la neutralizacin con la ayuda de papel de tornasol.
b) La inmersin de estos papeles reactivos en el vino, no debe ser
instantnea, prximo al final de la operacin, requieren permanecer en
el vino 10 20 segundos.
TABLA DE EQUIVALENCIAS DE ACIDOS
Expresado como: Tartrico Mlico Ctrico Lctico Sulfrico Actico
7. Los valores de este cido corresponden al ctrico monohidrato, no al anhidro.
Tartrico
1.000 0.893 0.943 1.200 0.650 0.800
Mlico 1.119 1.000 1.055 1.343 0.731 0.896
Ctrico
7
1.071 0.957 1.000 1.286 0.766 0.938
Lctico 0.833 0.744 0.777 1.000 0.544 0.667
Sulfrico 1.530 1.367 1.428 1.837 1.000 1.224
Actico 1.250 1.117 1.166 1.500 0.817 1.000
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1.14 1.15
Acidez voltil
COMENTARIOS
En los vinos, se define como acidez voltil al contenido de cidos
grasos, cmo: actico, frmico, propinico, butrico, etc. No deben
consignarse en este dato los cidos que son arrastrables por el vapor,
cmo: lctico, succnico, srbico, ni tampoco el dixido de carbono y
dixido de azufre. La determinacin precisa de la acidez voltil en los
vinos es de gran importancia en la industria enolgica.
Si los valores de la acidez voltil son elevados, indica que el vino ha
sufrido la accin de los microorganismos, principalmente por el
Cantidades de 0.3 a 0.8 g/L, expresado en cido actico, pueden
considerarse normales. La legislacin actual no permite valores su-
periores a 1 g/L. La bacteria que provoca la fermentacin malolctica,
puede tambin producir pequeas cantidades de cido actico. Los
vinos procedentes de mostos con elevado contenido de azcar tienen,
en general, mayor acidez voltil.
El constituyente principal de la acidez voltil es el cido actico,
aunque algunas veces estn presentes pequeas cantidades de los
cidos propinico, butrico y valrico. Estos cidos son tambin arras-
trables con el vapor. Las metdicas analticas eluden las interferencias
de los cidos lctico y srbico, principalmente, as como los dixidos de
carbono y azufre.
Acetobacter.
METODO UNICO DE LA C.E.E.
Principio del mtodo
La separacin de los cidos voltiles se efecta por el arrastre con el
vapor de agua y la rectificacin de los vapores. La muestra de vino
se acidifica con cido tartrico (aproximadamente 0.5 gramos para
20 mL de vino, antes del arrastre). Se deben tomar todas las precau-
ciones necesarias, para evitar la presencia del gas carbnico en el
destilado. El indicador empleado es la fenolftalena. La acidez del di-
xido de azufre libre y combinado, destilado, no debe figurar en el
valor de la acidez voltil y se restar de la misma, as como tambin
la acidez debida al cido srbico, eventualmente presente.
Se compone de un generador de vapor de agua,
de un borboteador en donde se coloca el vino, de una columna
rectificadora y de un refrigerante. Dada la gran variedad de aparatos
propuestos para tal finalidad, y ante la dificultad que presenta la
adopcin obligatoria de un mismo aparato para los usuarios de todos
los pases, es preferible y racional fijar de la forma siguiente las
condiciones mnimas que debe reunir un aparato, que permita efectuar
la tcnica de la acidez voltil con exactitud. Estas condiciones son:
1. El vapor de agua producido por el generador debe estar lo sufi-
cientemente exento de CO , como para que 250 mL del vapor con-
densado, adicionado de 0.1 mL de hidrxido sdico 0.1 M y dos gotas
de fenolftalena al 1 %, presente una coloracin rosada estable, por lo
menos durante 10 segundos.
2. En las condiciones normales de empleo, como mnimo el 99.5%
del cido actico en solucin acuosa, colocado en el borboteador en
lugar del vino, debe encontrarse en el destilado.
3. Si se coloca una solucin normal de cido lctico en lugar del vino,
solamente el 5 por mil, como mximo, se debe encontrar en el destilado
obtenido en las mismas condiciones que en el caso anterior.
Todo aparato o toda tcnica que cumpla los tres requisitos citados,
constituye un aparato o tcnica oficial internacional. Los dos aparatos
que a continuacin se describen, cumplen con las condiciones
descritas.
Aparato y su control.
2
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1.16 1.17
Aparato pequeo. El vapor se produce en un baln de 1500 mL. El
borboteador est constituido por un tubo cilndrico de 3 cmde dimetro
y 27 cm de largo. Este tubo se calienta elctricamente o con una llama
de gas, que incida sobre un disco de hierro de 15 cm de dimetro, con
un orificio central de 29 mm de dimetro, que es donde se apoya el
tubo. Este dispositivo evita la pirogenacin de materias extractivas
del vino. Este calentamiento debe ser regulado de forma tal que, el
volumen de vino en su interior, ni aumente ni disminuya en unos mL
durante el curso del arrastre de vapor. El tubo interior de entrada del
vapor debe hallarse a un cmdel fondo del tubo exterior.
El vapor, con los cidos voltiles, pasa a la columna rectificadora,
formada por un tubo cilndrico de 20 mm de dimetro y 50 cm de
longitud, en cuyo interior hay una hlice de acero inoxidable con un
paso de 15 mm. Un refrigerante de West de 40 cm de longitud, com-
pleta el aparato.
las
Reactvos
ACIDO TARTARICO.
ACIDO CLORHIDRICO concentrado.
INDICADOR FENOLFTALEINA al 1 %.
INDICADOR DE ALMIDON.
IODO 0.005 M.
SOLUCION DE BORAX saturada.
Tcnica operativa
1. Colocar en el generador de vapor, agua de cal o de barita,
filtrada.
2. En el borboteador se colocan 20.00 mL de vino, previamente
desprovisto de gas carbnico, por agitacin al vaco a la
temperatura ambiente.
3. Se adiciona 0.5 gramos aproximadamente de cido tartri-
co a la muestra de vino.
4. Se inicia la destilacin y se recogen 250 mL del destilado, en
un tiempo que debe oscilar alrededor de 12 a 15 minutos como
mximo.
5. Se valora la acidez del destilado, con solucin de hidrxido
sdico 0.1 M, en presencia de 2-3 gotas de fenolftalena al 1 %.
6. El volumen gastado en esta primera valoracin se designa
como n.
7. Terminada la anterior valoracin, se aade al lquido una gota
de cido clorhdrico concentrado, para pasar del medio neutro
al cido.
8. Seguidamente se aaden 2 mL de indicador de almidn, un
pequeo cristal de ioduro potsico y se valora el dixido de
azufre libre, con una solucin de iodo 0.005 M.
9. Sea n' el volumen empleado en esta segunda valoracin.
10. Se aaden a continuacin 20 de solucin saturada de
brax (el color de la solucin se vuelve rosa) y se valora de
nuevo con iodo 0.005 M, hasta el viraje del almidn.
11. El volumen del lquido gastado en esta ltima valoracin se le
asigna como n'', que corresponde al S0 combinado.
mL
2
system
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1.18 1.19
Clculos
Observaciones
La acidez voltil se expresa en miliequivalentes por litro, de
acuerdo a la siguiente frmula:
5 (n - 0.1n' - 0.05n")
La acidez voltil expresada en gramos de cido actico por litro de
vino, se calcula por la frmula:
0.300 (n - 0.1n' - 0.05n")
a) En el caso de que las muestras de vino estn estabilizadas con
cido saliclico, este cido, que tambin es arrastrado, se deber de-
terminar por colorimetra a pH3 y con precisin de 0.5. Debe restarse
de la cifra hallada anteriormente.
b) En los vinos adicionados de cido srbico, es conveniente de-
terminar este cido en una parte alcuota del destilado obtenido, antes
de efectuar toda la valoracin, ya que prcticamente destila si-
multneamente con el cido actico.
c) Se describe la determinacin del cido srbico: Se toma 0.5 mL
del destilado, se coloca en una cubeta de cuarzo de 10 mmde paso de
luz y se sita en el espectrofotmetro; se aaden 1.5 mLde la siguiente
solucin cuya composicin es: bicarbonato sdico 0.5 g, sulfato de
cobre pentahidrato 0.001 g y agua destilada hasta un litro. Se deja la
cubeta al aire durante unos minutos y luego se mide la absorbancia a
256 nm, en comparacin con el agua destilada. El espectrofotmetro
ha sido previamente calibrado con una solucin de cido srbico de 20
mg por litro.
d) Este mtodo es vlido para concentraciones de cido srbico
entre 10 y 300 miligramos por litro. El error en esta determinacin es del
1 %aproximadamente. Un gramo de cido srbico corresponde a 8.92
mLde solucin molar de hidrxido sdico y a 0.438 g de cido sulfrico.
Un vino adicionado con 200 mg de cido srbico por litro, deber
restarse del valor de la acidez voltil hallada la cantidad de 1.7
miliequivalentes por litro.
METODO GAB
Principio del mtodo
Reactivos
Tcnica operativa
Se fundamenta en la metdica nmero 11.047 de la A.O.A.C. con la
modificacin de sustituir el destilador de arrastre de vapor por una placa
calefactora elctrica y destilacin directa. El calefactor est previsto
para la destilacin de pequeos volmenes y el conjunto destilador y
refrigerante, proyectado igualmente para la misma finalidad. La adicin
de sulfato mercrico, bloquea totalmente el dixido de azufre presente.
SOLUCION SULFATO MERCURICO al 1 %.
SOLUCION DE FENOLFTALEINA al 1%.
1. Se deber conectar el aparato a la red y accionar el interruptor,
para que se ponga en marcha, 15 minutos antes del primer
anlisis, con objeto de que el calefactor alcance la tem-
peratura adecuada.
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METODO GARCIA-TENA
Principio del mtodo
Reactivos
Se basa en una destilacin fraccionada del vino, y valoracin se-
parada de las fracciones recogidas. El primer volumen se recoge en
una probeta de 5.1 mLy el segundo en probeta de 3.2 mL. Se emplea el
mismo aparato destilador del mtodo GAB, con placa calefactora
elctrica.
SOLUCION DE FENOLFTALEINA al 1 %.
1.20 1.21
2. Se miden 10.00 mL de vino y se colocan en el matraz de
destilacin.
3. Con una pipeta Pasteur de plstico, se toman 2 mL de la so-
lucin mercrica y se vierten en el matraz, adems de uno o
dos trozos de piedra pmez.
4. Se coloca el matraz en el destilador y la probeta de 10 mL a
la salida del refrigerante.
5. Se coloca la placa calefactora bajo el matraz, procurando
que el fondo del mismo, asiente perfectamente.
6. Cuando se hayan recogido los 10 mL de destilado, se retira
la placa, sin desconectarla, si deben realizarse otros
anlisis.
7. El lquido de la probeta se coloca en un vaso y se valora con
solucin de hidrxido sdico, en presencia de unas gotas de
fenolftalena.
Cada mililitro de solucin de hidrxido sdico, equivale a 0.10 gra-
mos de cido actico, por litro de vino. Este valor equivale a la acidez
voltil real
Clculos
Tcnica operativa
Clculos
Principio del mtodo
1. En el matraz de destilacin se colocan 11.00 mL de la
muestra de vino y un trozo de piedra pmez.
2. Se colocar a la salida del refrigerante, la probeta de 5.1
mL.
3. Supuesto caliente el calefactor, se coloca bajo el matraz,
procurando que asiente perfectamente.
4. Cuando el lquido alcance el trazo superior de la probeta, se
retira, e inmediatamente se sustituye por la probeta ms pe-
quea (3.2 mL).
5. Una vez el lquido llegue al trazo superior de la probeta, se
retira la placa calefactora y se da por terminada la
destilacin.
6. El lquido de la probeta se vierte en un vaso y se valora con la
solucin alcalina, en presencia de unas gotas de fenolftalena,
hasta obtener un color ligeramente rosado. Se toma nota del
volumen gastado y se asigna como N.
7. A continuacin se valora el lquido de la probeta pequea,
como se ha indicado anteriormente, y se asigna como N'.
El nmero de mililitros gastados para valorar el lquido de la probeta
pequea nos dar el valor de la acidez voltil real segn la frmula:
Actico = N' x 0.366 en g/L
Para hallar la acidez voltil aparente, se suma a la real el valor ha-
llado multiplicando N x 0.122.
Puede tambin utilizarse la tabla I.
El mismo que el anterior, empleando el vapor de agua para el
arrastre de los cidos.
METODO A.O.A.C.
8
8. Ass. Off. Analyt. Chemists, nmero 964.08. pgina 744, (1990).
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1.22 1.23
2. El aparato destilador se carga con agua destilada, hasta
que cubra la resistencia calefactora.
3. Por el grifo se adicionan 25.00 mL del vino previamente
desgasificado.
4. El aparato se conecta y se inicia la ebullicin, con el grifo de
doble paso comunicado con el exterior. Se mantiene sta
durante 3 minutos. De esta forma se eliminar el carbnico que
se halla disuelto en el agua.
5. Se cierra el grifo y el vapor de arrastre borbotear a travs
de la muestra.
6. Durante la destilacin se recogen unos 300 mL en el erlen-
meyer situado a la salida del refrigerante.
7. Se desconecta el aparato, se vaca el destilador, y se lava la
cmara interior con agua destilada, y automticamente tendr
lugar el vaciado del aparato.
8. Al destilado, contenido en el erlenmeyer, se aade 1 mL de
solucin alcohlica de fenolftalena al 1 %.
9. Se valora seguidamente con solucin de hidrxido sdico
0.1 M, hasta coloracin rosada, persistente.
Para expresar los resultados en gramos de cido actico por litro de
vino, se multiplicarn los mililitros gastados de solucin de hidrxido
sdico 0.1 M, por 0.006 y por 40 (factor global igual a 0.24).
Este anlisis representa la acidez voltil aparente, ya que no se ha
hecho ninguna correccin del dixido de azufre presente en la muestra
de vino.
Clculos
Aparato destilador
Reactivos
Tcnica operativa
Consiste en un matraz de aproximadamente 1.500 mL, con una
cmara interior en donde se sita la muestra, una trampa de vapores,
un grifo de dos pasos, una resistencia elctrica en el interior del matraz
y un grifo de descarga. Todo ello construido en una sola pieza en vidrio
Pyrex. El residuo de vino que queda en la cmara interior, es eliminado
automticamente por accin del vaco, cuando se desconecta el
aparato. Al aadir agua por un grifo que comunica con el borboteador,
sirve para lavarlo y dejarlo de nuevo dispuesto para una nueva muestra
a analizar. El grifo de dos pasos, sirve para la entrada de la muestra y
para la salida del aire y CO , cuando se inicia la ebullicin, segn la
posicin de la misma.
Es necesario eliminar el CO de la muestra, mediante agitacin
con aspiracin, o bien, por incipiente ebullicin, con columna
condensadora y enfriado inmediato.
2
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INDICADOR FENOLFTALEINA, al 1%
1.
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METODO GAS CROMATOGRAFICO
COMENTARIOS
9
Los mtodos comunmente usados en el anlisis de la acidez voltil
de los vinos, incluyen la destilacin con arratre de vapor de agua y
posterior valoracin alcalimtrica. Influyen en estas metdicas, la
presencia de otros cidos voltiles, cmo: srbico, fctico, sulfuroso y
carbnico, que luego hay que deducir del valor hallado.
Dado que el componente mayoritario de la acidez voltil, es el cido
actico, es a este compuesto donde la mayora de las tcnicas deben
dirigirse, procurando prescindir de todas las sustancias interferentes.
Ya que la cromatografa es una tcnica de separacin por excelencia,
es perfectamente posible su aplicacin a ste anlisis del cido actico.
Lo ms destacable de este mtodo descrito a continuacin, es que el
vino objeto de anlisis, no se somete a ningn tratamiento, por el cual
podran existir contaminaciones o transformaciones. Slo es necesario
una dilucin del mismo, con el propio patrn interno empleado en la
determinacin.
El vino, por su compleja constitucin, presenta problemas en el
anlisis cromatogrfico cuando se utiliza la inyeccin directa de la
muestra. Estos problemas se refieren solamente a deterioro de la co-
lumna, pero nunca en el resultado del anlisis. La fase estacionaria de
la columna, se hidroliza a causa de las inyecciones acuosas, san-
grados del cido fosfrico y por la temperatura elevada de la misma.
Tambin los componentes no voltiles del vino, como son: azcares,
materias colorantes, protenas, etc., tienen un efecto perjudicial sobre
el relleno de la columna. En esta tcnica se soslayan estas dificultades,
por la dilucin de la muestra, por el escaso volumen de inyeccin (0.5
microlitros) y por la mezcla adecuada de las fases estacionarias.
La resolucin del pico de cido actico es perfecta y, por ello, la
exactitud de esta determinacin. Comparativamente con los mtodos
de arrastre por vapor de agua, cabe destacar que el cido acti-
9. B. Trombella Ribeiro, yA. Amer. J. Enol, Vitic., 31, 3, pginas 294-297, (1980).
1.24 1.25
co no es arrastrado en su totalidad en los mtodos por destilacin,
adems de las interferencias de otros compuestos voltiles, problemas
que no presenta el mtodo gas cromatogrfico que se describe a
continuacin.
Se analiza el cido actico contenido en el vino, por cromatografa
gas-lquido. La separacin tiene lugar en una columna rellena de
Carbowax 20 M y cido fosfrico, como fases estacionarias combi-
nadas. Se emplea cido propinico como patrn interno. El mtodo es
muy fcil de realizar y se presta a la automatizacin. El tubo de vidrio del
bloque de inyeccin del cromatgrafo, es conveniente cambiarlo cada
70 inyecciones aproximadamente. Con esta precaucin, la columna
permite hasta 16 000 determinaciones, sin prdida apreciable de la
fase estacionaria. El tiempo de anlisis es de unos 6 minutos.
Es necesario un cromatgrafo de gases, equipado con detector
F.I.D. y con tubo de vidrio de reducido volumen en el bloque de in-
yeccin. La columna para el anlisis, ser un tubo de vidrio de 2 m de
longitud y 2 mmde dimetro, rellena de Carbopack Cde 60/80 mallas,
con 0.3% de Carbowax 20 M y 0.1 % de cido fosfrico (H P0 ), Se
emplea helio como gas portador.
pesa 1 g
de cido propinico puro, para anlisis, y se coloca en un
matraz de 100 mL, se disuelve con agua destilada y se com-
pleta a volumen.
preparado por mezcla de 5.00 mL de la
solucin de stock de propinico, 2 mL de cido fosfrico al
70%y agua destilada hasta un volumen de dos litros.
Procdase al ajuste de los parmetros del cromatgrafo, de
acuerdo a los siguientes datos:
Temperatura del inyector, 175 C.
Temperatura de la columna, 90 C.
Principiodel mtodo
Aparato y materiales
Reactivos
Tcnica operativa
3 4
SOLUCION DE ACIDO PROPIONICO de stock. Se
PATRON INTERNO,
1.
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1.26 1.27
Temperatura del detector, 200 C.
Flujo de gas portador, 32 mL/min.
Flujo de hidrgeno y aire, los necesarios para una llama
correcta.
Volumen de la muestra a inyectar, 0.5 microlitros.
2. Se toman 0,15 mLdel vino a analizar y se diluyen con solucin
de patrn interno hasta 2 mL. Esta dilucin se realiza con
suma facilidad con un aparato diluidor Fisher o similar. Esta es
toda la preparacin que requiere la muestra.
3. De la dilucin anterior, se toma con la microjeringa 0.5 mi-
crolitros y se inyecta en el cromatgrafo o se colocan mues-
tras en el dispensador automtico del cromatgrafo.
Con el empleo del integrador, es muy fcil la cuantificacin del an-
lisis, efectuando comparacin con un patrn de cido actico puro,
para anlisis, en cantidad adecuada para la determinacin. Es acon-
sejable una solucin patrn, cuya concentracin sea de 0.5 gramos de
actico por litro. El diluyente utilizado para este patrn, ser alcohol
etlico al 10%en volumen.
a) Es muy interesante, para mejorar la metdica, que la columna de
vidrio, antes de efectuar el relleno con el soporte indicado, se mantenga
durante una noche totalmente llena de una solucin de cido fosfrico
al 1 %y secarla antes del uso, sin enjuague posterior.
b) Si el gas portador, helio, se satura de cido frmico, mejora sen-
siblemente el anlisis
c) Seguidamente a una determinacin, puede inyectarse de nuevo
otra muestra, tan pronto haya salido el pico del patrn interno de
propinico, con ello se proporciona un gran ahorro de tiempo.
Clculos
Observaciones
10
10. S.A. Kupina, J.L. Kutschinski y otros, Am. J. Enol. Vitic., 33, 2, pginas 67-74 (1982).
METODO ENZIMATICO
COMENTARIOS
11
Todo lo explicado en los comentarios del anlisis anterior, son per-
fectamente aplicables a sta tcnica enzimtica, con ventajas muy
superiores al mtodo gas cromatogrfico.
Dado que el anlisis enzimtico es muy especfico, se presta, con gran
exactitud, a la determinacin del cido actico en el vino, eliminando
totalmente las interferencias y por ello el resultado exclusivo del
componente indicado. Presenta la ventaja sobre el mtodo gas
cromatogrfico, en la mayor economa de instrumentacin, ya que el
espectrofotmetro necesario para las determinaciones enzimticas, es
mucho ms barato que el cromatgrafo, aparte la facilidad de su
mantenimiento.
El cido actico (acetato) se transforma, en presencia de la enzima
acetil-CoA-sintetasa (ACS) con adenosina-5-trifosfato (ATP) y
coenzima A (CoA), en acetil-CoA. Esta reacciona con el oxalacetato a
citrato, en presencia de citrato sintetasa (CS).
La determinacin se basa en la formacin de NADH, medida por el
aumento de la absorbancia a 340 mm. La cantidad de NADH formada,
es la que sirve para medir la concentracin de cido actico. La
presencia del alcohol retarda la reaccin del acetato, por ello, la lectura
de la absorbancia se efecta despus de 20 minutos.
para 30 anlisis. Contiene 4 frascos con
reactivos, alguno de los cuales se deben reconstituir con agua
destilada. La conservacin de estos reactivos, as como su
reconstitucin, se indican en el folleto que acompaa a cada
test analtico.
-
Principio del mtodo
Reactivos
Test-combinacin de la firma Boehringer Mannheim, nmero
de catlogo 148261,
11. Boehringer Mannheim, Anlisis enzimticos de los alimentos, 1989
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1.28 1.29
Tcnica operativa
Clculos
Principio del mtodo
1. Se preparan las cubetas de 10 mm de paso de luz, que se
recomiendan sean de plstico para un slo uso, con objeto de
evitar contaminaciones. El espectrofotmetro con lmpara de
tungsteno, se sita a 340 mmde longitud de onda.
2. Se efectuar una dilucin del vino, colocando 10.00 mL en un
matraz aforado de 100 mL y completando el volumen con
agua destilada. Si el vino tiene una acidez actica superior a
1.5 g/L, se efectuar una dilucin mayor, empleando 1.00 mL
de muestra de vino, en lugar de los 10 mL indicados
anteriormente.
3. Seguir paso a paso las indicaciones del folleto adjunto al
test de anlisis.
El clculo de la concentracin de cido actico se determina por la
diferencia de las absorbancias ledas, siguiendo las instrucciones
detalladas en el folleto.
La diferencia de absorbancias, se indica por Ac y la concentracin
en gramos de cido actico por litro, se deduce por la frmula:
c = 0.308
el resultado deber multiplicarse por el factor de dilucin, o sea por
primer caso de la muestra que no supere los 1.5 g/L en actico, y
por 100 en el segundo caso.
Los cidos grasos de la serie actica, se separan del vino por des-
tilacin, bajo corriente de nitrgeno. La acidez del destilado, se mide
por la coloracin del indicador de pH, azul de bromofenol. Las
determinaciones colorimtricas, se efectan a la longitud de onda de
460 mm.
x Ac g/L
10
en el
METODOCONAUTOANALIZADOR
Reactivos
Tcnica operativa
Observaciones
SOLUCION DE ACIDO TARTARICO a/ 2.5%,
SOLUCIONDE BORATOSODICO0.1 M.
SOLUCIONDE FOSFATOPOTASICO0.1 M,
SOLUCION DE INDICADOR.
AGUAOXIGENADA,
preparada
por disolucin de 25 gramos de cido tartrico, reactivo
para anlisis y agua destilada hasta un litro.
Disolver con agua
destilada, en un matraz aforado 100 mL, 3.814 gramos de
tetraborato sdico.
disolviendo en
un matraz de un litro, 123.6 gramos de fosfato monopotsico,
reactivo anlisis y completar con agua.
En un matraz de 1 litro, se in-
troducen 330 miligramos de azul de bromofenol, 100 mL de
solucin de fosfato potsico 0.1 M y se completa con agua
destilada.
de 0.1 volmenes.
Se detallan en el manual de instrucciones del aparato.
a) Permite el anlisis de un buen nmero de muestras por hora, de
forma automatizada. El lmite de concentracin permitida por el
anlisis va desde 0 a 1 g/L, expresado en cido sulfrico, o sea un
mximo de 1.23 gramos de cido actico por litro.
b) Con esta metdica, las interferencias son muy pequeas. El di-
xido de azufre, se oxida fcilmente con el agua oxigenada. Las can-
tidades de S0 empleadas en enologa no influyen en el anlisis.
Tampoco interfiere el gas carbnico. El cido lctico se elimina por
rectificacin, durante la destilacin de la muestra.
de
2
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1.30 1.31
Medicin del pH
COMENTARIOS
La medicin del pH en el vino o mosto, tiene un marcado inters,
pues este dato es importante por su efecto sobre: microorganismos,
matiz del color, sabor, potencial redox, relacin entre el dixido de
azufre libre y combinado, quiebras debidas al fosfato de hierro y, otros
ms.
El valor de pH de los mostos destinados a los vinos de mesa, oscila
entre 2.7 y 3.8 dependiente principalmente, del grado de madurez de la
uva de que proceden. No existe una relacin directa entre el pH y la
acidez total valorable. Sin embargo, s existe una dependencia
emprica, entre el pHy la relacin bitartrato potsico/cido tartrico. No
hay correlacin entre el pHy el cido mlico.
La impresin organolptica de la astringencia y acidez, es ms de-
pendiente del pH, que de la acidez total. La tonalidad y vivacidad del
color de los vinos tintos, depende de su pH. Los ataques bacterianos
son posibles cuanto ms elevado es el pH. Por ejemplo, la des-
composicin del cido tartrico tiene lugar a valores superiores a pH
3.6. Las precipitaciones o quiebras metlicas, son ms difciles de
suceder, cuanto ms bajo es el pH. El poder antisptico del sulfuroso
aumenta, cuando el pH es bajo, debido a que el SO libre es mayor. El
pH ptimo para la precipitacin de bitartrato potsico, genera una
disminucin de la acidez total y un aumento de la concentracin de
iones hidrgeno, o sea una disminucin del pH.
,
2
De las bebidas naturales, el vino es la que tiene el valor de pH ms
prximo al jugo gstrico.
Es la medicin de la diferencia de potencial entre dos electrodos,
sumergidos en el vino. Uno de los electrodos adquiere un potencial,
que es una funcin definida del pH del lquido a medir, ste es el
electrodo de vidrio. El otro electrodo, tiene un potencial fijo y de ah su
nombre de electrodo de referencia. La precisin en la medida del pH
debe ser de 0.05 unidades.
Medidor de pH de lectura digital, con precisin de 0.01 unidades.
Electrodo de vidrio, en general se utiliza el electrodo combinado, por
contener en una sola pieza el electrodo de vidrio y el de referencia. Se
deber conservar sumergido en una solucin 3 M o bien una saturada
de cloruro potsico.
parada por disolucin de 20.42 gramos por litro, en agua
destilada.
1) Solucin saturada de bitartrato potsico, preparada con
una cantidad mnima de 5.7 g/L a 20 C. Se conserva esta
solucin unos dos meses, con el empleo de 0.1 g de timol
para 200 mL.
METODO UNICO DE LA CEE
Principio del mtodo
Aparatos
Reactivos
SOLUCION 0.1 M DE FTALATO ACIDO DE POTASIO pre-
SOLUCION DE ACIDO CLORHIDRICO 0.1 M.
SOLUCIONES PATRON:
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1.32 1.33
Los valores de este patrn son:
3.57 a 20 C.
3.56 a 25 C.
3.55 a 30 C.
2) Solucin 0.05 M de ftalato cido de potasio, pesando
exactamente 10.211 gramos del producto puro y seco, en un litro
de agua destilada. Se conserva unos dos meses.
Los valores de pH son:
3.998 a 10 C
3.999 a 15 C
4.003 a 20 C
4.008 a 25 C
4.015 a 30 C
3) Solucin preparada de la siguiente forma: 3.402 gramos de
fosfato monopotsico, 4.354 gramos de fosfato dipotsico y
agua destilada hasta completar un litro.
Este patrn tiene los siguientes valores de pH.
6.90 a 15 C
6.88 a 20 C
6.86 a 25 C
6.85 a 30 C
A pesar de lo indicado anteriormente, se recomienda adquirir
del mercado, las soluciones patrn ya preparadas, pues se
conservan en muy buenas condiciones y son de valores muy
fiables.
1. Puesta a cero del aparato, de acuerdo a las instrucciones
que lo acompaan.
2. Contrastado del medidor. Se sumergen los electrodos en la
solucin patrn de pH 7.00 a 20 C. Con el mando corres-
pondiente de calibracin, se sita el valor de pHdel patrn en
la pantalla del aparato.
3. Se retira la solucin patrn y se lavan los electrodos con
agua destilada.
Tcnica operativa
4. Se cambia el patrn por otro de 3.00 4.00, a la misma tem-
peratura y se comprueba si el medidor indica correctamente ste
valor, en caso contrario con el mando corrector de la pendiente del
electrodo, se lleva al valor terico del patrn.
5. El electrodo se lava con agua destilada.
6. Se sumergen los electrodos en el vino o mosto a la temperatura
comprendida entre 20 y 25 C. Es importante que la temperatura sea
lo ms prxima posible a la que se tena en el calibrado con los
patrones.
7. El display del aparato indicar el valor de pHde la muestra.
8. Los medidores de pH que incorporan en su circuito micro-
procesadores, efectan el calibrado y control de los electrodos,
automticamente. Se recomienda el empleo de ste tipo de
aparatos.
9. El resultado se expresa con dos decimales.
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Acidez fija
COMENTARIOS
El dato analtico de la acidez fija, puede tener inters en la legislacin
de algunos pases europeos, con objeto de detectar la adicin de agua
al vino. Aunque durante la fermentacin y posterior a ella, suceden
transformaciones profundas, el valor de la acidez fija se aproxima al de
la acidez total del mosto original.
En algunas regiones, existen limitaciones legales a los valores de la
acidez fija. Por ejemplo, en California, para los vinos de postre existe un
nivel mnimo de 2.5 g/L.; 3.0 g/Lpara los vinos blancos y 4.0 g/Lpara los
tintos. Estas cantidades son expresadas como cido tartrico.
Se halla el valor de la acidez fija, por diferencia entre la acidez total y
la acidez voltil, expresadas las dos en cido tartrico. Esto quiere
decir, que la acidez voltil, que generalmente est expresada en cido
actico, deber calcularse en cido tartrico, multiplicando su valor
actico por el factor 1.25.
Clculo
1.34
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2. ACIDOS
TARTARICO 2.5
METODO C.E.E., referencia 2.6
TEST VOLUMETRICO DE COMPARACIN 2.7
METODO REBELEIN 2.9
METODO REBELEIN modificado 2.10
METODO RAPIDO O.I.V 2.12
METODO COLORIMETRICO 2.14
CITRICO 2.16
METODO UNICO DE LA C.E.E 2.16
METODO SCHNEYDER 2.21
MALICO 2.24
METODO AMERICAN SOCIETY OF ENOLOGISTS 2.25
METODO O.1 V (Af 33) 2.26
LACTICO 2.31
METODO AMERICAN SOCIETY OF ENOLOGISTS 2.31
ASCORBICO 2.35
METODO C.E.E. ascrbico total 2.35
METODO C.E.E., rpido 2.39
SUCCINICO 2.43
METODO PEYNAUD-LAFON 2.43
METODO CASTINO 2.45
ACIDO GLUCONICO 2.50
METODO PEYNAUD Y CHARPENTIE 2.50
VARIOS ACIDOS A LA VEZ 2.56
METODO KUNKEE 2.56
METODO DE CAPA FINA 2.58
M.
2.3
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Tartrico
COMENTARIOS
La mayor parte de la cantidad de los cidos contenidos en la uva y en
el vino, corresponde al cido tartrico. Ms de la mitad de la acidez
total, es debida a este cido y a sus sales. Concretamente, a un pH de
2.98, de la totalidad del in tartrato presente, el 50% se halla en forma
de cido libre.
Es el ms fuerte de los cidos existentes en las uvas, y por ello,
tampona el valor de pH del mosto o vino. Esta propiedad, es de gran
importancia para la resistencia a las enfermedades, en el color y, en el
sabor cido del vino.
El contenido de tartratos en la uva o en el mosto, es muy variable y
depende de la variedad, estado de madurez y regin geogrfica o
climatolgica de su cultivo. Los lmites extremos, pueden oscilar entre 2
y 9 gramos por litro, expresados como cido tartrico.
-
2.5
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METODO CEE, referencia
Principio del mtodo
Reactivos
El cido tartrico, es valorado por pesada del racemato clcico pre-
cipitado. Esta determinacin, puede completarse por otra volumtrica
de comparacin. Deben existir ciertas condiciones para la pre-
cipitacin, como son: pH, volumen total empleado, y concentracin de
iones precipitantes, de tal manera, que la precipitacin del racemato
sea total y, el levotartrato de calcio, permanezca en solucin. Si el vino
ha sido adicionado de cido metatartrico, ser necesaria una hidrlisis
previa.
que contenga 10 gramos
de calcio por litro. Se prepara con 25 gramos de carbonato
clcico, 40 mL de cido actico, reactivo anlisis y suficiente
agua destilada hasta el volumen de un litro.
Se colocan en un
vaso de 400 mL, 20 mL de una solucin de cido tartrico
dextro de 5 g/L, 20 mLde una solucin de tartrato amnico levo
a 6.126 g/L y 6 mL de solucin de acetato clcico de 10 g de
calcio por litro. Dejar en reposo, para que precipite, durante
dos horas. Recoger el precipitado en un embudo filtrante de
vidrio poroso nmero 4, lavar por tres veces consecutivas con
30 mLde agua destilada. Secar a la estufa a 70 C, hasta peso
constante. Con las cantidades de reactivo indicadas, se
obtienen aproximadamente 340 mg de racemato clcico
cristalizado. Conservar en frasco tapado.
prepara con
150 miligramos de tartrato amnico levo, que se disuelven en
900 mL de agua, se aaden 8.8 mL de solucin de acetato de
calcio de 10 g de Ca por litro y completar a un litro con agua.
Dado que el racemato es ligeramente soluble en esta solucin,
se procede a saturarlo de la siguiente forma: aadir 5
miligramos de racemato de calcio al volumen anterior, agitar y
dejar reposar 12 horas y filtrar.
SOLUCIONDEACETATOCALCICO
RACEMATO DE CALCIO CRISTALIZADO.
SOLUCION DE PRECIPITACION (pH.= 4.75). Se
2.6
Tcnica operativa
Clculos
Reactivos
1. Se colocan en un vaso de vidrio de unos 600 mL, 500 mL
de solucin de precipitacin y 10.00 mL de la muestra del vino
a analizar.
2. Con el extremo de una varilla de vidrio, frtense las paredes
del vaso. Se deja en reposo durante 12 horas.
3. Filtrar sobre filtro de vidrio poroso nmero 4, previamente
tarado y situado en un erlenmeyer Kitasato, para poder filtrar al
vaco, por succin con una trompa de agua. Lavar el vaso con el
mismo lquido filtrado, repetidamente, hasta que todo el
precipitado se haya pasado al filtro.
4. Secar en estufa a 70 C, hasta peso constante.
5. Pesar el precipitado y sea P el peso del racemato de calcio
(CaC O H ), cristalizado con 4 molculas de agua.
Una molcula de racemato clcico, corresponde a media molcula
de cido tartrico dextro, en el vino.
La cantidad de cido tartrico presente en el vino, viene determinada
por las siguientes frmulas:
384.50 x P se expresa en miliequivalentes del cido tartrico por
litro de vino.
28.84 x P se refiere en gramos de cido tartrico por litro de vino.
36.15 x P expresado en gramos de bitartrato potsico por litro de
vino.
equivalente apro
ximadamente a 82 g/L.
4 6 4
TEST VOLUMETRICO DE COMPARACION
ACIDO CLORHIDRICO DILUIDO 1:5 (v/v),
2.7
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SOLUCION DE EDTA 0.05M.
SOLUCION DE HIDROXIDO SODICO a/ 40% (p/v).
INDICADORACIDOCALCONCARBONICO,
n
Se emplea la sal disdica del
cido etilendiamino tetractico o complexon III. Se pesan
18.61 gramos y se disuelven en agua destilada hasta un litro.
preparado con 1
gramo de 2-hidroxi-4sulfo-1-naftilazo-3-naftoico y 100 gramos
de sulfato sdico anhidro. Mzclese ntimamente en el
mortero.
1. El embudo filtrante del anlisis anterior, despus de haber
tomado nota de su peso, se coloca sobre un erlenmeyer y se
aaden 10 mL de cido clorhdrico diluido, para disolver el
precipitado.
2. Se lava el filtro con 50 mL de agua destilada. Se aaden 5 mL
de solucin de hidrxido sdico al 40% y 30 miligramos del
indicador.
3. Valorar con la solucin de EDTA 0.05 M, hasta viraje del in-
dicador. Sea n el nmero de mililitros gastados.
La cantidad de cido tartrico por litro de vino, se halla
por las siguientes frmulas:
5 x si se expresa en miliequivalentes por litro.
0.375 x n expresado en gramos de cido tartrico/L.
0.470 x n expresado en gramos de bitartrato potsico
por litro de vino.
Tcnica operativa
Clculos
2.8 2.9
METODO REBELEIN
1
Principio del mtodo
Reactivos
Tcnica operativa
Puede utilizarse tanto para mostos, como para vinos. Al vino se aade
directamente: nitrato de plata, vanadato amnico, carbn decolorante y
subsiguiente filtracin. Se eliminan as las sustancias colorantes y el
exceso de vanadato. No se perjudica en absoluto la coloracin rosa,
debida a la reaccin entre el cido tartrico y el vanadato. La reaccin
coloreada se mantiene estable durante algunas horas. La gran ventaja
de este mtodo, aparte la rapidez, es que los azcares, alcohol, cidos
orgnicos e inorgnicos presentes en el vino, no interfieren en la
determinacin. Es muy especfico del cido tartrico. Esta tcnica se
recomienda como mtodo de control, dada su rapidez, exactitud y
facilidad de realizacin.
en cido acti-
co al 30%.
preparada con
10 gramos de vanadato amnico, disueltos en 150 mL de
hidrxido sdico 1 M, 200 mL de acetato sdico al 27% y
completar el volumen a un litro, con agua destilada.
1. En un erlenmeyer de 200 mL se vierten 10.00 mL del vino a
ensayar o 3.00 mL si es mosto. A continuacin 15.00 mL de
solucin de nitrato de plata 0.1 M y 0.5 g de carbn
decolorante.
2. Agtese unos 15 segundos. A continuacin, sin dejar de agi-
tar, se aaden 15 mL de solucin de vanadato amnico.
3. Filtrar a travs de un filtro de papel, despreciando los 5 mL
primeros, luego se recogen 10 mL y se dejan reposar 30
minutos.
SOLUCION DE NITRATO DE PLATA 0.1 M,
SOLUCIONDEVANADATOAMONICOal 1 %,
1. H. Rebeiein, Chem. Mikrobiol. Technol. Lebensm., 2, pginas 33-38, (1973).
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2.10 2.11
4. Se prepara el espectrofotmetro, para determinar la densidad
ptica en una cubeta de 10 mmde paso de luz, a la longitud de
onda de 530 nm.
5. Se realiza un ensayo en blanco, con el empleo de agua des-
tilada en vez de vino.
6. Deber confeccionarse una curva patrn, con soluciones de
cido tartrico, reactivo anlisis, de concentraciones
conocidas.
7. Se coloca el lquido a analizar en una cubeta y se mide la
densidad ptica. El valor se compara con la grfica obtenida
con las soluciones patrn.
Slo es necesario comparar las lecturas de la densidad ptica y
pasarlas a la grfica patrn, leyendo la concentracin del cido
tartrico.
Clculos
METODO REBELEIN modificado
2
Principio del mtodo
Reactivos
Es un perfeccionamiento del mtodo anterior, para eliminar las in-
terferencias debidas a la presencia de antocianinas en los vinos tintos.
Esencialmente es una correccin del color del vino, con lo que se evita
el empleo del carbn, para eliminar el color.
Se pesan 270 gra-
mos de acetato sdico para anlisis y se disuelve con agua
hasta completar un litro.
Acido actico al 30 por ciento.
SOLUCION ACETATO SODlCO al 27%.
SOLUCION 1.
2. M. Vidal y J. Blouin, Ref. Fr. Oenol., 70, pginas 39-46, (1978).
SOLUCION2.
SOLUCION 3.
Solucin de metavanadato. Disolver 10 gramos
de metavanadato amnico en 150 mL de hidrxido sdico 1 M.
aadir 200 mL de solucin de acetato sdico al 27% y
completar con agua destilada hasta un litro.
Disolver 4.5 gramos de cloruro amnico en 150
mL de hidrxido sdico M y 200 mL de solucin de acetato
sdico al 27% y agua destilada hasta un litro. Mzclense
volmenes iguales de esta solucin y la de cido actico al
30%. Se corrige el pH al mismo valor que el que tenga una
mezcla de volmenes iguales de cido actico al 30% y
solucin 2, mediante el empleo de una solucin de hidrxido
sdico 1 M.
1. Se preparan cuatro tubos de ensayo, asignados como A, B, C
y D.
2. A cada uno de los tubos se aaden los volmenes que se
indican en el siguiente cuadro:
3. Mzclese bien cada tubo y djese reposar durante 15 minutos.
Se procede a la determinacin de la densidad ptica en el
espectrofotmetro, en la longitud de onda de 530 nm y con
cubetas de 10 mmde paso de luz.
4. Preparacin de las soluciones patrn para el trazado de la
grfica. Se prepara una solucin standard con 10 gramos de
cido tartrico, reactivo anlisis, disueltos en un litro de agua
destilada. En 10 matraces aforados de 100 mL, se vierten en
cada uno de ellos 5.00, 10.00, 20.00, 30.00....90.00 mL de la
solucin standard, completando con agua hasta el enrase. La
solucin de cada matraz tendr una concentracin
Tcnica operativa
Cantidad en mL
A B C D
Vino o mosto 1 0 1 0
Agua 0 1 0 1
Solucin 1 10 10 0 0
Solucin 2 10 10 0 0
Solucin 3 0 0 20 20
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2.12 2.13
de cido tartrico de: 0.5, 1.0, 2,....9 gramos por litro. La so-
lucin standard sin diluir, corresponde a una concentracin de
tartrico de 10 gramos por litro.
5. Se prepara una curva con patrones desde 0 a 5 gramos de
cido tartrico por litro. Las soluciones de los tubos B y D no
son necesarias, si el vino es blanco o, cuando se emplean los
patrones.
Para el clculo de la absorbancia, hay que anotar la diferencia entre
las absorbancias A y C (o sea A - C), en el caso de vinos blancos. En
vinos tintos, la absorbancia o densidad ptica a considerar ser:
(A-B)-(C-D).
Se puede determinar el cido tartrico, por precipitacin en forma de
tartrato cido de potasio, en condiciones tales, que se reduzca al
mnimo su solubilidad.
obtenida colocando en un
matraz aforado de un litro, 300 g de cloruro potsico puro, 5.75
g de sal de Seignette (tartrato de sodio y potasio) 1.25 g de
oxalato potsico, disolver con agua destilada y completar a
volumen. Si la temperatura es baja, pueden aparecer cristales
en el fondo del envase, que debern redisolverse calentando
ligeramente, antes del uso.
Clculos
Principio del mtodo
Reactivos
METODO RAPIDO O.I.V.
3
ACIDO ACETICO CONCENTRADO.
SOLUCION DE PRECIPITACION,
ALCOHOLETILICO96%.
3. P. G. Garoglio, Enc. Vitic. Mond., vol. 5, pgina 63, (1973).
SOLUCION DE LAVADO,
AZUL DE BROMOTIMOL,
preparada en un matraz aforado
de un litro, disolviendo 150 g de cloruro potsico, 200 mide
alcohol etlico y completar a volumen con agua destilada.
disolviendo 1 g del indicador en
100 mL de alcohol etlico.
1. En un tubo de centrfuga, se colocan 10.00 mL de vino, 0.4 mL
de cido actico, 7.5 mLde solucin de precipitacin y 2 mLde
etanol.
2. Con un agitador de vidrio, se agita hasta que aparezca un
enturbiamiento cristalino. Esto requiere aproximadamente
unos 10 minutos.
3. Dejar el tubo en reposo durante una hora, a la temperatura
de 8 C, aproximadamente.
4. Despus de transcurrido el tiempo, se agita con un agitador de
vidrio, teniendo cuidado de mezclar el precipitado con el
lquido. Esta agitacin es indispensable para obtener una
precipitacin completa.
5. Dejarlo una hora en el frigorfico.
6. A la salida del refrigerador, se centrifuga y se decanta el
lquido que sobrenada, que debe estar perfectamente
lmpido.
7. Lavar el precipitado, dos veces, con aproximadamente 2 mL
de la solucin de lavado.
8. Centrifugar otra vez y despreciar el lquido.
9. Pasar el precipitado, con ayuda de un chorro de agua desti-
lada, a un vaso.
10. El bitartrato potsico se analiza por alcalimetra, con la so-
lucin 0.1 M de hidrxido sdico, en presencia de unas gotas
de indicador de azul de bromotimol (cambio de color de
amarillo a azul).
Tcnica operativa
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2.14 2.15
Clculos
Principio del mtodo
Reactivos
Tcnica operativa
Si el volumen gastado de hidrxido sdico 0.1 M es n, la cantidad
de cido tartrico se halla por las frmulas:
1.5 x n - 2 en gramos tartrico por litro.
13.33 (1.5 x n - 2) en miliequivalentes por litro.
1.254 (1.5 x n - en bitartrato potsico.
Es esencialmente un mtodo colorimtrico, fundamentado en el
mtodo de Matchett y otros por reaccin del cido tartrico y el
metavanadato. Estamodificacin presenta un mtodo que mejora
su precisin.
1. Preparar una columna de vidrio Pyrex de 500 mm de longi-
tud y 12 mm de dimetro.
2. Cargar la columna utilizando mL de la resina, mezclada
con 20 veces su volumen de cido actico al 30%.
2)
RESINA ANIONICA DUOLITE A101D.
ACIDO ACETICO CONCENTRADO.
SOLUCION ACIDO ACETICO a/ 30%.
SOLUCION SULFATO SODICO 0.5 M.
SOLUCION METAVANADATO SODICO al 3 %.
20
METODO COLORIMETRICO
4
5
4. G. Hill y A. Caputi Jr., Am. J. Enol. Vitic., 21, pginas 153-161, (1970).
3. Preparar el grifo de salida de la columna, de modo que el flujo
de salida del lquido sea de 2.5 a 5 mL por minuto. Lavar la
resina con 30 mL de cido actico al 0.5%y finalmente con 50
mLde agua destilada.
4. Colocar en la cabeza de la columna, 10.00 mLde vino y arras-
trar la muestra con mLde cido actico al 0.5%.
5. Lavar con 50 mLde agua destilada.
6. Eluir los cidos adsorbidos con solucin de sulfato sdico 0.5
M.
7. El cido lctico eluye en los primeros 30 mLy el cido tartrico
en la fraccin comprendida entre los mL.
8. Recoger las muestras en probetas graduadas.
9. Colocar en un matraz aforado de 50 mL, 25.00 mL de la frac-
cin recogida entre mLbien mezclada, que contiene el
cido tartrico.
10. Aadir 0.5 mL de cido actico concentrado y 2 mL de la
solucin de metavanadato sdico y completar a volumen con
agua destilada.
11. Se mezcla bien y se deja en reposo durante unos 80 minutos a
la temperatura ambiente.
12. Se mide la absorbancia a travs de una cubeta de 10 mm de
paso de luz y en el espectrofotmetro a la longitud de onda de
480 nm.
13. Realcese un ensayo en blanco, con 25.00 mL de solucin de
sulfato sdico 0.5 M, 0.5 mL de cido actico concentrado y 2
mL de solucin de metavanadato, diluido con agua hasta
mL.
14. Se prepara una grfica con soluciones patrn de cido tar-
trico y la absorbancia de la muestra se compara con los
valores de la grfica.
25
46 y 75
46 y 75
50
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2.16 2.17
Ctrico
COMENTARIOS
La presencia de este cido en las uvas es muy escasa, de un orden
mximo de 0.08%. En los vinos normales, es muy extrao hallar valores
superiores a 0.5 g/L. En general oscilan entre 0.1 a 0.3 gramos por litro.
En algunos pases, est limitada la cantidad de cido ctrico presente
en los vinos. La legislacin espaola y la de la CEE, no permiten
cantidades superiores a un gramo de cido ctrico por litro de vino. El
cido ctrico, es un producto que se aade a los vinos para aumentar la
acidez y para complejar el hierro presente, evitando con ello posibles
enturbiamientos.
El cido ctrico, es precipitado por el in bario, en medio
hidroalcohlico y alcalino. Despus de la decoloracin de la solucin
acuosa del precipitado brico, por el carbn activo, se oxida con el
acetato de
Principiodel mtodo
plomo IV, formndose en presencia del cido diazosulfanlico, un
compuesto amarillo, que se cuantifica colorimtricamente a 420 nm.
(densidad =0.910).
preparada por
disolucin de 20 gramos de cloruro de bario, reactivo anlisis, en
agua destilada, enrasando a volumen de 100 mL.
Mezclar 140 mL de agua destilada
con 300 mL de alcohol de 96%.
por disolucin de
71 gramos de sulfato sdico anhidro, reactivo anlisis, en agua
destilada hasta un litro.
obtenida por di-
solucin de 270 gramos de acetato sdico anhidro, reactivo
anlisis, en agua destilada hasta el volumen de un litro.
por disolucin de 2
gramos de nitrito sdico cristalizado, reactivo anlisis, en agua
hasta 100 mL (sta solucin se conserva por algn tiempo en
frascos de color topacio).
Disolver 1.5 gramos de
cido sulfanlico, en 50 mL de cido actico concentrado y llevar
a volumen de 250 mL con agua destilada. Agitar frecuentemente
despus de la preparacin, y dejar en reposo durante una noche.
Mantngase en frascos oscuros y en estas condiciones su
conservacin es ilimitada.
locan en un erlenmeyer de 500 mL unos 50 gramos, apro-
ximadamente, de acetato de plomo IV (plomo tetracetato
humectado en cido actico cristalizable) y se aaden 250 mLde
cido actico tambin cristalizable. Se deja en reposo hasta que
aparezca un lquido claro sobrenadante. Esta solucin
mantenida en frasco oscuro, se conserva indefini-
Reactivos
AMONIACOCONCENTRADO
SOLUCION DE CLORURO BARICO al 20%,
SOLUCION DE LAVADO.
SOLUCION DE SULFATO SODICO al 7.1 %,
CARBON ACTIVO.
SOLUCION DE ACETATO SODICO al 27%,
SOLUCION DE NITRITO SODICO al 2%,
SOLUCION DE ACIDO SULFANILICO.
SOLUCION SATURADA DE ACETATO DE PLOMO IV. Se co-
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2.18 2.19
damente. En el anlisis slo se emplea el lquido claro, por ello
se deber aadir, cuando sea necesario, una cantidad de
cido actico, con objeto de mantener la solucin saturada,
disponible para el anlisis.
preparada
con 5 mL de la solucin anterior, que se colocan en un er-
lenmeyer de 250 mL, al que se aadirn, con rapidez, 50 mL
de una solucin de ioduro potsico al 10%. Valorar inme-
diatamente, con una solucin 0.05 M de tiosulfato sdico, en
presencia de engrudo de almidn, como indicador. Sea el
nmero de mililitros gastados.
Tomar un volumen de la solucin saturada de acetato de
plomo IV, igual a la cifra resultante de la siguiente frmula:
y colocarlo en un matraz aforado de 1 litro, completando el
volumen con cido actico puro. Guardada en frascos os-
curos, esta solucin se conserva indefinidamente.
1. Introducir en un tubo de centrfuga, de una capacidad de 40 a
50 mL. 5.00 mL del vino o mosto a analizar, 1 mL de amonaco
concentrado y 1 mL de solucin de cloruro brico al 20%.
Mezclar bien, mediante el empleo de una varilla de vidrio.
Despus de aproximadamente dos minutos de agitacin, se
aaden 15 mLde alcohol de 96%, mezclar bien de nuevo con la
varilla y dejar reposar 5 minutos.
2. Centrifugar durante 3 a 4 minutos. Despreciar el lquido so-
brenadante y lavar el precipitado de la forma siguiente: tomar 2
mL de solucin de lavado con una pipeta de 2 mL, apoyar la
punta de la misma en la parte superior interior de la pared del
tubo y verter el lquido soplando por la pipeta, imprimiendo al
mismo tiempo un movimiento de rotacin del tubo alrededor de
su eje. Poner en suspensin el precipitado, empleando una
varilla de vidrio con goma en la punta. Lavar la varilla por dos
veces con 2 mL de solucin de lavado cada vez, de forma, que
no quede ninguna partcula del precipitado adherido a la goma
de la varilla. Centrifugar de nuevo.
SOLUCION DE ACETAT DE PLOMO IV al 1 %,
n
2.25 x 1000/n en mL
Tcnica operativa
3. Tirar el lquido y efectuar un segundo lavado del precipitado
de igual forma.
4. El precipitado, todava hmedo, del lquido de lavado, se re-
cubre con unos 10 mLde la solucin de sulfato sdico al 7.1 %.
Se coloca el tubo en un bao de agua hirviente, durante 10
minutos, agitando con una varilla, de manera que no se
formen grumos en el precipitado.
5. Todava caliente, el contenido del tubo se pasa cuantitati-
vamente a un matraz de 50 mL, con la ayuda de la solucin de
sulfato sdico al 7.1 %. Se deja enfriar y se lleva a volumen
con la misma solucin. Se mezcla bien.
6. Se pasa el lquido a un erlenmeyer de 100 mL, que contiene
0.2 gramos de carbn activo. Agitar. Se deja en reposo du-
rante 5 minutos y se filtra sobre papel tupido.
7. Esta es la solucin que se emplea para el anlisis, que re-
presentar el cido ctrico del vino o del mosto, diluida diez
veces.
8. Se emplean dos erlenmeyers de 50 mL, asignados como A
que contienen cada uno, 10 mL de solucin de acetato
sdico al 27%. Aadir a cada uno de ellos, 2.00 mL de la
solucin a analizar.
9. Preparar en un tubo, la solucin de diazoacin, aadiendo,
con agitacin, 5 mLde la solucin de cido sulfanlico y 1 mLde
la solucin de nitrito sdico. Con agitacin, verter en el
erlenmeyer A, 2 mL de esta solucin recin preparada y 5 mL
de cido actico cristalizable. En el erlenmeyer B, se vierten 2
mL de la solucin de diazoacin y 5 mL de solucin de acetato
de plomo IV al 1 % y poner en marcha, inmediatamente, un
reloj avisador para 13 minutos.
10. Aproximadamente a los 5 minutos, filtrar el contenido de los
erlenmeyers, sobre filtro de papel plegado. Poco tiempo antes
de los 13 minutos, verter los lquidos filtrados en las cubetas
espectrofotomtricas de 30 mmde paso de luz y colocarlas en
el espectrofotmetro a la longitud de onda de 420 nm. Cuando
se cumpla el tiempo de 13 minutos, se toma la lectura de la
densidad ptica de la cubeta B, actuando la cubeta A cmo
ensayo en blanco.
y
B,
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11. Si la solucin a analizar es muy concentrada en cido ctrico y
la absorbancia es elevada, diluirla con solucin de sulfato
sdico al 7.1 %. Las lecturas se contrastan con la curva de
calibrado, que indicar la cantidad de cido ctrico en gramos
por litro de vino.
12. En un matraz de 100 mL, se disuelven 273.4 miligramos de
cido ctrico monohidrato (equivalente a 250 mg de cido
ctrico anhidro) con solucin de sulfato sdico al 7.1 %, llevar a
volumen con la misma solucin. Tomar 10.00 mL de esta
solucin obtenida, pasarla a un matraz de 100 mL y enrasar a
volumen con solucin de sulfato sdico. Con esta solucin
preparar las siguientes diluciones, empleando el sulfato
sdico al 7.1 %cmo disolvente:
5.00 mL se completan a volumen de 200 mL
Estas diferentes diluciones, corresponden a las soluciones a
analizar, equivalentes a vinos que contengan 0.065, 0.125,
0.250, 0.500 y 1 gramos por litro.
13.Tmense 2.00 mL de cada una de estas diluciones, que se
colocan en los erlenmeyers marcados A y B, procediendo al
anlisis tal como se ha indicado anteriormente. El punto cero
de la curva de tarado, se obtiene colocando en los citados
erlenmeyers, solamente solucin de sulfato sdico. La
representacin grfica de las absorbancias, en funcin de la
concentracin de cido ctrico, no es lneal y presenta una
ligera curvatura.
2.20 2.21
METODO SCHNEYDER
6
Principio del mtodo
Reactivos
Tcnica operativa
El vino tratado con una solucin acuosa de bromuro potsico y otra
cida de bromato, forma un precipitado que se elimina por cen-
trifugacin. Al lquido claro, se vuelven a aadir de nuevo, las solu-
ciones anteriores ms una de anhdrido vandico. En caliente, se forma
una opalescencia, que se mide con el espectrofotmetro a 590 nm.
Mediante una grfica de tarado, se halla la concentracin de cido
ctrico.
Disolver 10 g de bromuro potsico en agua
destilada, contenida en un matraz aforado de 100 mL y
enrasar.
En un matraz de 100 mL, se disuelven 2.5 gra-
mos de bromato potsico, con unos 50 mL de agua destilada,
se aaden 2.5 mL de cido sulfrico concentrado y se
completa, cuando est fro, con agua destilada.
Disolver 1 gramo de anhdrido vandico, en 25 mL
de cido sulfrico concentrado. Verter esta solucin, poco a poco
y con agitacin, sobre 75 mLde agua destilada.
1. En un tubo de centrfuga, se vierten 10.00 mL de vino, 2.5
mL de solucin A y 2.5 mL de solucin B.
2. Se tapa el tubo y se agita durante minutos. Durante este
tiempo tiene lugar la reaccin.
3. Se centrifuga a 2000 r.p.m., durante 10 minutos.
4. Se toman mL del lquido claro y se introducen en un tubo de
ensayo, con adicin de 1 mLde la solucinA, 1 mLde la
mL de la solucin C, agitando despus de cada adicin. Se
tapa y se sumerge en un bao de agua a 25 C.
SOLUCION A.
SOLUCION B.
SOLUCION C.
20
2
By 2.5
6. J. Schneyder, Mitt. Robe Wein Obstau, Fruechteverwert. (Klosterneuburg), 19, pginas 122-
123, (1955).
5.00mL id id 100 mL
5.00 mL id id 50 mL
10.00 mL id id 50 mL
20.00 mL id id 50 mL
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2.22 2.23
de evitar contaminaciones. El espectrofotmetro con lmpara
de tungsteno, se sita a 340 nmde longitud de onda.
3. Efectuar una dilucin del vino de diez veces, si la concen-
tracin de cido ctricosobrepasa 0.4 g/L.
4. Seguir paso a paso las indicaciones del folleto adjunto al test
de anlisis.
El clculo de la concentracin de cido ctrico, se determina por la
diferencia de las absorbancias ledas, siguiendo las instrucciones
dadas en el folleto.
Puede expresarse el cido ctrico hallado como, anhidro o
monohidrato, para ello las frmulas a aplicar sern:
c = 0.460xAc g/L anhidro
c = 0.503 g/L monohidrato
siendo la diferencia de absorbancias ledas.
a) Para determinar el cido ctrico total, en el que se incluye el cido
salificado, se procede como sigue: En un matraz provisto de re-
frigerante de reflujo, se colocan 20.00 mL de vino y 6 mL de solucin
alcohlica de hidrxido potsico, aproximadamente 2 M, y se hierve
durante 10 minutos. Se deja enfriar a temperatura ambiente y se
neutraliza con cido sulfrico 2 M. Cuantitativamente se pasa a un
matraz de 50 mL y se enrasa con agua. De este lquido se toman 10.00
mL y se llevan a volumen de 100 mL con agua destilada. Esta dilucin
es la que se emplea en el anlisis. En caso de que sea muy
concentrada, se diluyen 5.00 mL a 100 mL. Los clculos son los
mismos, que en la determinacin del cido ctricolibre.
b) Esta metdica, como todas la enzimticas, son muy especficas y
por ello el gran inters de su aplicacin en la determinacin del cido
ctrico en el vino. La laboriosidad del mtodo qumico, hace
problemtico el resultado, dada la gran cantidad de manipulacin ne-
cesaria para llevarlo a cabo.
Clculos
Observaciones
xAc
Ac
5. La opalescencia formada, se mide en el espectrofotmetro a
la longitud de onda de 590 nm, en comparacin con agua
destilada.
6. Se prepara una grfica de tarado, empleando soluciones pa-
trn entre 0.1 a 0.5 gramos de cido ctrico por litro. La den-
sidad ptica medida en el anlisis del vino, se compara con los
valores de la curva patrn.
7. El vino a analizar, no debe contener una cantidad mayor de
0.5 gramos de cido ctrico por litro.
El cido ctrico, o sus sales, se convierten en oxalacetato, reaccin
que es catalizada por la enzima citrato liasa (CL). La cantidad de NADH
oxidada, se corresponde cuantitativamente, con la cantidad de citrato.
Se mide a la longitud de onda de 340 nm.
para 30 determinaciones, que contiene lo
siguiente: 2 frascos con reactivos, que debern reconstituirse
con agua destilada. La conservacin de estos reactivos, as
como su reconstitucin, se indica en el folleto que acompaa a
cada test.
1. La determinacin del cido ctrico libre, que es la forma normal
en que se encuentra el cido en el vino, puede realizarse en
vinos blancos o tintos sin dilucin ni decoloracin alguna.
recomiendan sean de plstico para un solo uso con objeto
METODO ENZIMATICO
Principio del mtodo
Reactivos
Tcnica operativa
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Mlico
COMENTARIOS
Por su concentracin, es el segundo cido de importancia en la uva.
En el fruto verde, su presencia es elevada y disminuye a medida que
avanza la maduracin, principalmente durante los meses de julio y
agosto. En la madurez, la cantidad presente puede ser de un 10 al 35%,
mientras que cuando est verde, alcanza hasta un 65%de la acidez.
Peynaud considera que la desaparicin del cido mlico durante la
fermentacin es debida a la separacin de los dos tomos de hidrgeno
y, posterior decarboxilacin del cido oxalactico a etanal, que acta
como acceptor de hidrgeno y se transforma en alcohol.
El cido mlico es de importancia en el vino, ya que es el ms f-
cilmente atacable por microrganismos, en comparacin con el tartrico
o succnico. En los vinos que han sufrido la fermentacin malolctica,
puede darse el caso de total ausencia de este cido. Puede suceder
tambin que, en vinos obtenidos de cosechas verdes, la concentracin
de cido mlico alcance los 6 gramos por litro.
7
7. E. Peynaud Mauri, yA. Ann. Inst. natl. recherche agran., serE4, pginas 111-139,
(1956).
2.24 2.25
METODO AMERICAN SOCIETY
OF ENOLOGISTS
8
Principio del mtodo
Reactivos
Tcnica operativa
Se utiliza la enzima L-mlico dehidrogenasa, para catalizar la reac-
cin entre el cido mlico y la NAD(nicotinamida adenina dinucletido),
formando cido oxalactico y la forma reducida del dinucletido
(NADH). El cido oxalactico se fija por la hidracina, en solucin
alcalina. La reaccin se mide por el cambio en el coeficiente de ex-
tincin a 340 nm, debido a la reduccin del NADa NADH.
En un matraz aforado de 100 mL, se
colocan 7.5 gramos de glicina, 5.2 gramos de sulfato de hi-
dracina y 0.2 gramos de EDTA, un poco de agua para que
queden en suspensin y luego se aaden 51 mL de hidrxido
sdico 2 M, enrasando al volumen con agua destilada. Esta
solucin es estable durante una semana, si se mantiene a una
temperatura inferior a 4 C.
disolver 420 miligramos de NAD en 12 mL
de agua destilada. Esta solucin se conserva cuatro semanas
a 5 C.
por disolucin de
10 miligramos en 2 mL de agua. Esta suspensin es estable
durante un ao a 5 C.
1. En un tubo de ensayo pequeo, se colocan 0.9 mL del tampn
de pH9.5. Se aade 1 mLde agua destilada y 1.00 mLdel vino o
mosto a analizar, con un contenido de cido mlico entre 10 y
40 microgramos. Para ello hay que diluir la muestra de 100 a
200 veces.
2. Se aaden a continuacin, 0.1 mL de NAD (35
miligramos/mL) y se mezcla bien.
TAMPON DE pH 9.5.
SOLUCION NAD,
SOLUCION DEHIDROGENASA MALICA,
8. B. Gump, S. Saguandeekui y otros, Am. J. Enol. Vitic., 36, 3, pginas 248-251, (1985).
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2.26 2.27
3. En el espectrofotmetro se colocar una cubeta con paso de
luz de 10 mmcon la muestra anterior y se leer la absorbancia
a 340 nm. Estevalor de absorbancia se asigna con la letra .
4. Se aaden seguidamente 4 microlitros de la solucin de
dehidrogenasa mlica y se mezcla. Se coloca en la estufa a 37
C, durante 30 minutos.
5. Transcurrido el tiempo indicado, se enfra a 25 C durante 6
minutos y se lee la absorbancia de nuevo. Sea el valor
ledo.
6. Se prepara una grfica con soluciones patrn de cido mlico,
a partir de una solucin standard que contenga 40 gramos por
litro.
La absorbancia causada por el cido mlico, se calcula segn la
frmula siguiente: Este valor se lleva a la grfica y de ella se
deduce la concentracin de cido mlico, que deber ser multiplicada
por el factor de dilucin que haya tenido lugar.
El cido mlico, separado mediante el empleo de una columna cam-
biadora de aniones, se determina colorimtricamente en el eludo que
tambin contiene cidos tartrico y lctico. Por la accin del cido
sulfrico concentrado y el cido cromotrpico, se forma una coloracin
amarilla. La intensidad de este color depende en gran manera de la
concentracin del cido sulfrico, por ello es necesario regularla con
mucha precisin. El cido lctico y el cido mlico provocan, junto con
el cido tartrico, una reaccin interferente que colorea de azul-violeta
el cido cromotrpico debido al metanal formado. El resultado de la
medi da deber corregi rse, previ a determi naci n de l as
concentraciones del cido tartrico y lctico.
A1
A2
A2-A1.
Clculos
Principio del mtodo
METODO O. I. V. (Af 33)
Reactivos
Tcnica operativa
SOLUCION ACIDO CROMOTROPICO al 5%.
ACIDOSULFURICOal 96%.
SOLUCION DE SULFATO SODICO al 7.1%
SULFATO SODICO 0.5 M.
ACIDO ACETICO al 30%. ACIDO ACETICO al 0.5%.
RESINA ANIONICA FUERTE, 11/ MERCK.
Es necesario
prepararla en el momento del uso, disolviendo 500 miligra-
mos de cromotropato sdico, en 10 mLde agua destilada.
Se parte del cido del 98%, pre-
via valoracin y de ste se prepara exactamente, la solucin
del 96%de cido sulfrico.
preparada con
71 gramos de sulfato sdico anhdro y agua destilada hasta
el volumen de un litro.
1. Colocar la resina en una columna de vidrio. La resina debe
estar en suspensin en cido actico al 30%.
2. Se lava con cido actico al 0.5% varias veces.
3. Despus del lavado, se vierten en la columna 10.00 mL de
vino, se abre el grifo de la columna y se deja fluir el lquido a
una velocidad de 1-1.5 gotas por segundo.
4. Se lava la resina con agua.
5. Con la solucin de sulfato sdico, se eluyen los cidos fija-
dos en la resina.
6. En un tubo con tapn esmerilado, de una cabida aproximada
de 50 a 60 mL, se coloca 1.00 mL del lquido eludo de la
resina.
7. En un tubo igual, se prepara un ensayo en blanco, colocan-
do en l, 1 mL de solucin de sulfato sdico.
8. Acada uno de los tubos se aade 1 mL de cido cromotrpico
y 10 mL de cido sulfrico. Tapar y agitar, de forma que se
obtenga una homogeneidad perfecta, pero sin que el lquido
llegue a mojar el tapn.
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2.28 2.29
9. Sumergir los tubos en un bao de agua, en enrgica ebulli-
cin, manteniendolos as durante 20 minutos exactos.
10. Enfriar los tubos a 20 C. Despus de 90 minutos exactos,
desde el enfriamiento, medir la densidad ptica con respecto
al ensayo en blanco. La longitud de onda de trabajo del
espectrofotmetro, en 429 nm.
Leer en la grfica de tarado, el valor del cido mlico en bruto y
asignado como M. El valor real de cido mlico, se deduce por la
siguiente frmula:
en la que T igual a la concentracin de cido tartrico en la muestra
y L igual al cido lctico de la misma.
Para preparar la grfica patrn, se disolvern 250 miligramos de
cido mlico puro, racmico o levgiro, (los dos dan la misma reac-
cin), en solucin de sulfato sdico 7.1 %, llevando el volumen a 500
mL. Tomar 5.00, 10.00, 15.00,... 35.00 mL de esta solucin, verterla en
matraces de 50 mL y completar a volumen con la solucin de sulfato
sdico. Las soluciones obtenidas, corresponden a un eluado de vino
que contiene 0.5, 1.0, 1.5,... 3.5 gramos de cido mlico por litro.
En presencia de I-malato dehidrogenasa, el cido l-mlico o sus
sales, es oxidado por el NADa oxalacetato. La reaccin, catalizada por
la enzima glutamato-oxalacetato-transminasa (GOT), el oxalacetato se
convierte en I-aspartato, en presencia de I-glutamato.
Clculos
Principio del mtodo
METODO ENZIMATICO
La cantidad de NADH formada, es esteoquimtrica con la concen-
tracin de I-malato. La NADH es la que provoca la absorbancia en la
longitud de onda de 340 nm.
para 25 determinaciones. Contiene 4
frascos con reactivos, alguno de los cuales se debe recons-
tituir con agua destilada. La conservacin de estos reacti-
vos, as como su reconstitucin, se indica en el folleto que
acompaa a cada test analtico.
1. Se preparan las cubetas de 10 mm de paso de luz, recomen-
dndose que sean de plstico de un solo uso, con objeto de
evitar contaminaciones. El espectrofotmetro, con lmpara de
tungsteno, se sita a 340 nmde longitud de onda.
2. Si la concentracin del cido mlico en el vino o mosto, no
sobrepasa los 2 g/L, se diluye de la siguiente forma: 10.00 mL
de vino en un matraz aforado de 100 mL y se completa el
volumen con agua destilada. Si la concentracin del cido en
la muestra es superior a los 2 g/L se efecta una dilucin de
1.00 mLa 100 mL.
3. Como lo importante es la determinacin del cido libre, se
efecta el anlisis sobre la dilucin.
4. Seguir paso a paso, las indicaciones del folleto adjunto al
test analtico.
A partir del dato de la absorbancia, se calcula la concentracin del
cido mlico, de acuerdo a la frmula:
c=0.472xAm en g/L
deber tenerse en cuenta el factor de dilucin, efectuado al iniciar el
anlisis.
Para determinar cido mlico total, en el que se incluyen sus
sales, procede de la siguiente forma: En un matraz provisto de
Reactivos
Tcnica operativa
Clculos
Observaciones
de catlogo 139068,
el
se
(0.15xTL)
1-(0.02xT)
M=
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2.30 2.31
refrigerante de reflujo, se colocan 20.00 mL de vino y 6 mL de solucin
acuosa de hidrxido sdico 2 M, se hierve durante 30 minutos. Djese
enfriar a la temperatura ambiente y seguidamente se neutraliza con
cido sulfrico 1 M, empleando papel indicador. Cuantitativamente se
traspasa a un matraz aforado de 50 mL y se completa al volumen con
agua destilada. Esta solucin es la que se emplear para el anlisis,
considerando siempre la dilucin efectuada.
Lctico
COMENTARIOS
METODO AMERICAN SOCIETY
OF ENOLOGISTS
No existe este cido en la uva, y es slo un subproducto minoritario
de la fermentacin alcohlica, cuya concentracin puede oscilar entre
0.02 y 0.8 gramos por litro. Cantidades mayores de cido lctico, son
consecuencia de la transformacin del cido mlico por la fermentacin
malolctica o, por una excesiva actividad bacteriana.
En el caso de la accin biolgica anteriormente indicada, en un vino
tinto pueden alcanzarse valores variables entre 3 y 6 gramos de cido
lctico por litro.
Es una reaccin colorimtrica, que tiene lugar por oxidacin del
cido lctico a etanal, por la presencia de p-hidroxifenilo. Este mto
9
Principio del mtodo
9. G.J. Pilone y R.E. Kunkee, Am. J. Enoi. Vitic., 21, pginas 12-18, (1970).
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2.32 2.33
do es sensible para concentraciones de cido lctico comprendidas
entre 1 y 10 microgramos por mL(equivalentes a 1 y 10 mg por litro).
La presencia de los cidos tartrico, mlico, ctrico, actico, etanol,
glucosa, fructosa y dixido de azufre, no producen interferencia en el
anlisis.
Preparada por
disolucin en agua, de 20 gramos de sulfato cprico crista-
lizado con cinco molculas de agua, hasta 100 mL.
En un matraz de
100 mL, se colocan 4 gramos de sulfato cprico pentahidrato.
Se lleva a volumen con agua destilada.
en solucin de
hidrxido sdico al 0.5%.
1. Se diluye el vino con agua, de forma que la concentracin de
cido lctico en la muestra est comprendida entre 10 y 100
microgramos/mL(10 a 100 miligramos por litro).
2. En un tubo de ensayo de 20 x 180 mm, se coloca 1.00 mLde la
muestra diluida, 1 mLde solucin de sulfato de cobre al 20%y
8 mLde agua destilada.
3. Mezclar. Aadir 1 gramo, aproximadamente, de hidrxido
clcico en polvo. Agitar vigorosamente y dejar en reposo du-
rante 30 minutos.
4. Despus de transcurrido el tiempo indicado, se centrifuga.
5. En otro tubo de ensayo igual, se coloca 1.00 mL del lquido
claro centrifugado y 0.05 mL de sulfato de cobre al 4%. Con
agitacin del tubo, se aaden 6 mL de cido sulfrico
concentrado.
6. Se coloca el tubo de ensayo en un bao de agua hirviente y se
deja 7 minutos. Se enfra a temperatura inferior a 20 C, en un
bao de hielo y agua.
Reactivos
Tcnica operativa
SOLUCIONDE SULFATODE COBRE al 20%.
HIDROXIDO CALCICO EN POLVO.
SOLUCIONDESULFATODECOBREal 4%.
ACIDOSULFRICOCONCENTRADO.
SOLUCION DE p-HIDROXIFENILO al 1.5%,
7. Al lquido fro, se aade, 0.1 mLde la solucin de phidroxifenilo
y se agita. Se coloca el tubo en estufa a 30 C durante 15
minutos, despus de este tiempo se agita, y de nuevo se
coloca en la estufa 15 minutos ms.
8. Se retira de la estufa y se sumerge en un bao de agua hir-
viente, durante 1.5 minutos, para disolver el precipitado. Lue-
go se enfra el tubo al chorro del agua.
9. Cuando fro, se lleva al espectrofotmetro, para leer la den-
sidad ptica a 560 nm en cubeta de 10 mm de paso de luz.
Para preparar la curva patrn, se emplearn soluciones de lactato de
litio en agua, con concentraciones equivalentes a 0, 10, 20, 30, 50 y 70
miligramos de cido lctico por litro.
El cido lctico, en presencia de I-lactato-dehidrogenasa (l-LDH), es
oxidado por la nicotinamida-adenina dinucletido (NAD) a piruvatos. La
cantidad de NADH formada, es proporcional a la concentracin de
cido I-lctico. Este aumento de la NADH se determina por su
absorbancia a 340 nm.
para 25 determinaciones. Contiene 4
frascos con reactivos, alguno de los cuales se debe recons-
tituir con agua destilada. La conservacin de estos reactivos,
as como su reconstitucin, se indica en el folleto que
Clculos
Principio del mtodo
Reactivos
METODO ENZIMATICO
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Tcnica operativa
Clculos
Observaciones
dndose que sean de plstico de un slo uso, con objeto de
tungsteno, se situa a 340 nmde longitud de onda.
2. Si la concentracin de cido lctico en el vino o mosto no
sobrepasa los 2 gramos por litro, se diluye de la siguiente
forma: 10.00 mL de vino en un matraz aforado de 100 mL y se
completa el volumen con agua destilada. Si la concentracin
del cido en la muestra es superior a los 2 g/L, se efecta una
dilucin de 1.00 mLa 100 mL.
3. Se efecta el anlisis de estas diluciones, siguiendo los de-
talles indicados en el folleto que acompaa los tests
analticos.
A partir del dato de la absorbancia, se calcula la concentracin del
cido lctico, de acuerdo a la frmula:
c= 0.320 xA/ en g/L
deber tenerse en cuenta el factor de dilucin, efectuado al iniciar el
anlisis.
Para la determinacin del cido lctico total, incluidas sus sales, se
prepara un matraz con refrigerante de reflujo y se introducen 20.00 mL
del vino y 2 mL de solucin de hidrxido sdico 2 M. Se hierve durante
15 minutos, se deja enfriar a temperatura ambiente y se neutraliza con
cido sulfrico 1 M. Se pasa cuantitativamente a un matraz de 50 mL y
se completa con agua destilada el volumen. Se utiliza esta muestra
para el anlisis, siempre considerando la dilucin efectuada. Vinos con
alto contenido de azcar, se debern hervir con agua en vez de la
solucin de hidrxido sdico, y el tiempo de ebullicin el mismo.
2.34
Ascrbico
COMENTARIOS
METODO CEE. Ascrbico total
Como sucede con el cido ctrico, slo se encuentran pequeas
cantidades de cido ascrbico en el mosto (de 1 a 18 mg por 100
gramos de uvas). En los vinos, el nivel normal es de unos 2 miligramos
por litro.
Las cantidades pueden ser muy superiores en muchos vinos, pero
en tal caso, ha sido por adicin como agente antioxidante. Es in-
teresante hacer notar que, cantidades del orden de 25 a 50 mg/L,
mantienen el potencial redox (o valor ITT), durante un perodo de 15 a
20 meses. Este producto no puede sustituir al dixido de azufre, por no
bloquear el etanal, como efecta el sulfuroso.
Principio del mtodo
Anlisis del cido ascrbico total. Este cido, se oxida por el iodo,
a cido dehidroascrbico, que se precipita por la 2,4-
dinitrofenilhidracna en bis (2,4-dinitrofenilhidrazona). Despus,
separacin por cromatografa en capa fina y solubilizacin en medio
2.35
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actico. Este ltimo compuesto se colorea en rojo y se determina
espectrofotomtricamente a 500 nm.
Pesar
en un mortero, 30 gramos de cido metafosfrico. Lavar
rpidamente con agua destilada, con agitacin. Tirar el agua
de lavado. Disolver el cido lavado, en agua destilada, con
ayuda de agitacin. Pasar a un matraz de 100 mL y completar
a volumen con agua destilada. Esta solucin es aproxi-
madamente del y su conservacin mxima es de una
semana, mantenida en el refrigerador.
Esta solucin
se prepara extemporneamente, a partir de la dilucin de la
solucin del 30%.
Tambin se
prepara en el momento del uso, a partir de la solucin del 30%.
Se pesan 10 gramos de pol-
vo de poliamida para cromatografa. Se mezclan con 60 mLde
agua destilada y se dejan en reposo durante 2 horas. Esta
cantidad es suficiente para 4 determinaciones.
en
una mezcla a partes iguales de cido actico y cido sulfrico.
La 2,4-fenilhidracna se pone en suspensin, en 50 mL de
cido actico cristalizable. La solubilizacin se obtiene por
adicin del mismo volumen de cido sulfrico concentrado.
adicionado de 2% (v/v) de cido ac-
tico cristalizable.
para cromatografa.
en solucin al 0.5%.
Reactivos
SOLUCION ACIDO METAFOSFORICO al 30% (p/v).
SOLUCION ACIDO METAFOSFORICO al 3%.
SOLUCION ACIDO METAFOSFORICO al 1%.
SUSPENSION DE POLIAMIDA.
TIOUREA.
SOLUCION 0.05 M DE IODO.
SOLUCION DE 2,4-DINITROFENILHIDRACINA al 6%,
ACETATO DE ETILO
CLOROFORMO.
GEL DE SILICE G, ALMIDON
SOLUBLE,
30%
DISOLVENTE: Preparado con 50 partes (en volumen) de ace-
tato de etilo, 60 partes de cloroformo, y 5 partes de cido
actico cristalizable. Antes del empleo, hay que dejarlo re-
posar un mnimo de 12 horas.
1. En un matraz de 100 mL, se colocan 50.00 mL de vino al que
se aaden 15 mLde suspensin de poliamida y se enrasa con
la solucin de cido metafosfrico al 3 %. Se deja en reposo
durante 1 hora, agitando frecuentemente.
2. Filtrar sobre papel de filtro plegado. Colocar 20 mL del filtrado
en un tubo de centrfuga, de unos 50 mL de capacidad con
tapn esmerilado. Aadir 1 mL de solucin 0.05 Mde iodo. Se
mezcla bien y despus de 1 minuto, se reduce el exceso de
iodo, por adicin de unos 25 mg de tiourea.
3. Colocar el tubo en un bao de agua a una temperatura com-
prendida entre 5 y 10 C. Aadir 4 mL de solucin de 2,4-
dinitrofenilhidracina. Mezclar suavemente, evitando mojar el
tapn. Dejar de inmediato el tubo, bien tapado, en un bao de
agua a 20 C, durante 16 horas (una noche).
4. Introducir 15 mL de acetato de etilo con actico, en el tubo.
Tapar bien y agitar enrgicamente, durante 30 segundos.
Inmediatamente centrifugar 5 minutos a 1000-2000 revolucio-
nes por minuto.
5. Tomar con una pipeta, 10.00 mL del acetato de etilo
centrifugado y colocarlo en un erlenmeyer pequeo, con
tapn esmerilado.
6. Se introducen en el tubo, 5 mL de acetato de etilo con actico,
agitar de nuevo durante 30 segundos y centrifugar otra vez a la
misma velocidad. Se toman 5.00 mL del acetato de etilo de
extraccin y colocarlos en el erlenmeyer en donde se hallan
los 10 mLanteriores. Mezclar bien.
ACIDO ASCORBICO.
Oxidacin a cido dehidroascrbico
Formacin y extraccin de la bis (2,4-dinitrofenilhidrazona) del
cido dicetogulnico
Tcnica operativa
2.36 2.37
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Separacin de la bis (2,4-dinitrofenilhidrazona) por cromatografa
en capa fina
7. Sobre una placa Merck o equivalente de gel de slice y a 2 cm
del borde, colocar a lo largo de la lnea de partida, 0.2 mL del
acetato de etilo de extraccin.
8. En la cuba de cromatografa, se coloca el disolvente hasta una
altura de 1 cm. Una vez tapada la cubeta, dejar que la
atmsfera interior se sature de los vapores.
9. Se coloca luego la placa cromatogrfica en el interior y, una
vez tapado, se deja ascender el disolvente hasta casi el borde
superior de la placa. Esta separacin cromatogrfica debe
realizarse dentro de las dos horas de efectuada la extraccin.
10. Se seca la placa en medio bien ventilado, durante 1 hora. Se
coloca la placa en posicin vertical, sobre un papel satinado o
parafinado, y con una esptula, se raspa la zona coloreada en
rojo por la bis (2,4- difenilhidrazona), de tal manera, que se
recoja todo el polvo cuantitativamente, por lo tanto debern
evitarse las corrientes de aire.
11. Colquese el polvo recogido, en un pesa muestras de tapn
esmerilado, que contendr 4 mLde cido actico cristalizable.
Dejar en reposo durante 30 minutos, con agitacin frecuente.
12. Se filtra directamente sobre la cubeta espectrofotomtrica de
10 mm de paso de luz, con papel de filtro plegado, repasando
el filtrado, hasta que el lquido est perfectamente lmpido.
13. Medir la absorbancia a 500 nm, empleando cido actico co-
mo lquido de referencia.
Trazado de la curva de referencia. Preparar una disolucin de cido
I-ascrbico al 1 %, empleando cido metafosfrico al 1 %, cmo
disolvente. De esta solucin, se toman 5.00, 10.00 y 15.00 mL que se
colocarn en sendos matraces de 100 mL, completando el volumen
con cido metafosfrico al 1 %, como diluyente.
Clculos
Con 50.00 mL de cada una de las soluciones anteriores, que con-
tienen 50, 100 y 150 mg de cido ascrbico por litro, se efectan las
reacciones indicadas anteriormente, para trazar la grfica correspon-
diente. Estaresulta ser una recta que pasa por el origen.
La cantidad de cido ascrbico activo, todava reductor, puede ser
determinada aproximadamente, por iodometra directa sobre el vino,
en el cual, el dixido de azufre ha sido bloqueado mediante la adicin
de etanal o propanal.
Obtenida por destilacin de
metaldehdo o paraldehdo, en presencia de cido sulfrico,
valorada por el mtodo del sulfito sdico. Se ajusta esta
solucin al 6.9%, de forma que 1 mL se combine con 10
miligramos de dixido de azufre.
en volumen (180 g/L).
que se ha aadido 200
gramos de cloruro sdico por litro, para su conservacin. Esta
solucin debe hervirse durante 10 minutos, para su
preparacin.
1. En un erlenmeyer de 250 mL, se vierten 50.00 mL de vino y 5
mL de la solucin de etanal. Tapar y dejar en reposo 30
minutos, previa agitacin.
2. Aadir 3 mL de cido sulfrico al 1/10, valorando con solucin
de iodo, hasta viraje del engrudo de almidn.
METODOCEE, rpido
Principiodel mtodo
Reactivos
Tcnica operativa
SOLUCIONDE ETANAL al 6.9%.
ACIDO SULFURICO 1/10
ENGRUDO DE ALMIDON a 5 g/L, al
SOLUCIONDEIODO0.025 M.
2.38 2.39
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3. Sea el volumen de solucin de iodo gastado en la valoracin.
Un mililitro de la solucin de iodo 0.025 M, oxida a 4.4 miligramos de
cido ascrbico. El clculo de la concentracin de cido ascrbico, se
halla por la frmula: 88 x n, expresado en miligramos de cido
ascrbico por litro de muestra.
a) Ciertas sustancias del vino son tambin oxidadas por el iodo en
medio cido, pero el volumen gastado de iodo 0.025 M, para esta
oxidacin es del orden de unos 0.3 mL. Este mtodo permite reconocer
los vinos que han sido adicionados de cido ascrbico en cantidad
superior a los 20 mg/L y que no ha sido transformado en productos de
oxidacin.
b) Para los vinos tintos, es interesante iluminarlos adecuadamente,
para la valoracin, con una luz amarilla, obtenida por interposicin
frente a una lmpara blanca, de una solucin de cromato potsico o
bien una lmpara de vapor de sodio.
c) Es ms fcil preparar la solucin de aldehdo, mediante el empleo
del aldehdo proplico. Para ello, basta pesar exactamente, 10 gramos
de propanal y llevarlo al volumen de un litro, con agua destilada.
El cido ascrbico y algunas sustancias reductoras, actan sobre la
sal de tetrazolio (MTT) en presencia del reductor PMS a pH 3.5, para
obtener formazan. En el ensayo en blanco, slo la fraccin ascorbato,
como parte de todas las materias reductoras, es eliminado por
oxidacin con la oxidasa del cido ascrbico (AAO), en presencia
n
Clculos
Observaciones
Principiodel mtodo
METODOENZIMATICO
de oxgeno. El dehidroascorbato formado no reacciona con MTT/PMS.
La absorbancia leda, es proporcional a la cantidad de ascorbato
presente en la muestra. El parmetro de medicin es el MTT/formazan
formado, que se mide a 578 nm.
para 20 determinaciones. Contiene 3 frascos con
reactivos, que se usarn tal como vienen en el test. La con-
servacin de estos reactivos es de un ao, si se mantienen
a la temperatura de 4 C.
2. Si la concentracin de cido ascrbico no sobrepasa los 200
mg/L, no es necesario efectuar dilucin alguna, pero s se
seguir lo indicado en 3). Si es mayor, la dilucin deber ser de
10 veces y efectuada en las siguientes condiciones: Tratar
primeramente como en 3) y emplear como diluyente una
solucin de cido m-fosfrico al 1.5% (p/v) ajustada previa-
mente a pH3.5-4.0 con KOH(5 mol/L).
3. El dixido de azufre presente en el vino deber ser tratado
cmo sigue: Mezclar 10.00 mL de vino con una gota de formol
(aproximadamente 5%p/v), mezclar y dejar reposar 5 minutos
a la temperatura ambiente.
4. Seguir las instrucciones del folleto que se adjunta al test,
para la realizacin del anlisis.
El contenido de cido ascrbico, se calcular de acuerdo a la si-
guiente frmula:
c = 0.2814 x Aa en g/L
Si la muestra ha sido diluida durante la preparacin, ser necesario
multiplicar el resultado por el factor de dilucin.
Reactivos
Tcnica operativa
Clculos
409677,
2.40 2.41
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Observaciones
Despus de la adicin de la solucin 3, contenida en el test, la reac-
cin es sensible a la luz, por ello es necesario que las cubetas no estn
expuestas a la luz diurna u otra luz intensa.
Succnico
COMENTARIOS
METODO PEYNAUD-LAFON
Este es un cido producto de la fermentacin, por ello aparece ex-
clusivamente en el vino. Como regla general, el contenido normal en
cido succnico, es del orden de 1 %del alcohol presente en el vino. As,
un vino con un contenido alcohlico del 10%, la cantidad aproximada
de cido succnico es de 1 g/L.
Durante la fermentacin, la cantidad formada de este cido, de-
pender del tipo de levadura y clase de mosto. Es un cido muy re-
sistente al ataque bacteriano.
Se procede a la extraccin directa del vino con ter, y luego se
procede a una oxidacin de los cidos extrados. Una vez elimina-
10
Principio del mtodo
10. E. Peynaud otros, y Trait d Oenologia, vol 1, Analyse et Contrle des Vins, (1977).
2.42 2.43
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dos los cidos voltiles, el cido succnico se valora potenciomtri-
camente. Parte del cido cetoglutrico, tambin viene valorado por
este procedimiento.
al tercio en volumen.
solucin
saturada.
1. Verter 20.00 mL de vino en un vaso de 100 mL y colocarlo
en un bao de vapor, para reducir el volumen a unos 10 mL.
2. Enfrar y verter el contenido a un extractor lquido-lquido,
lavando el vaso con 1 mL de cido sulfrico al 1/3 y 9 mL de
agua destilada.
3. Aadir 10 mLde agua y extraer con ter, durante 5 horas. Este
tiempo depende de la eficiencia del extractor y deber ser
establecido de antemano.
4. Evaporar el ter.
5. Aadir 1 mL de cido sulfrico al 1/3, 10 mL de solucin de
permanganato y dejar hervir durante 15 minutos.
6. Enfriar la solucin y aadir unas gotas de solucin saturada
de sulfito, para eliminar el exceso de permanganato.
7. Para eliminar los cidos voltiles, se destila con arrastre de
vapor, hasta recoger 300-400 mL de destilado. Ahora la so-
lucin residual, slo contiene cido sulfrico y succnico.
8. Con un medidor de pH se ajusta a pH 4.18, con adicin, en
primer lugar, de solucin saturada de hidrxido de bario y
luego con la solucin de bario 0.05 M.
Reactivos
Tcnica operativa
ACIDO SULFRICO
SOLUCION DE HIDROXIDO SODICO 0,05 M.
SOLUCION SATURADA DE PERMANGANATO
POTASICO.
SOLUCION DE HIDROXIDO DE BARIO, 0.05 M.
SOLUCION DE HIDROXIDO DE BARIO saturada.
SOLUCION SULFITO ACIDO DE SODIO,
ETER ETILICO.
9. Alcanzado el valor de pH 4.18, se procede a la valoracin
con hidrxido de bario 0.025 M, hasta llegar al valor de pH
7.50.
La cantidad de cido succnico, se halla por aplicacin de la
siguiente frmula:
33.734
V
en donde:
V= volumen gastado de hidrxido de bario 0.025 M.
M= molaridad de la solucin de hidrxido de bario.
v= volumen de la muestra.
Separacin mediante una resina aninica, oxidacin permangnica
de las sustancias orgnicas extraas, extraccin con ter y deter-
minacin colorimtrica del complejo formado, con el cloruro frrico e
hidroxilamina.
al 6%
aproximadamente.
preparada por dilucin de la
solucin al 6%, de forma que neutralice exactamente a una
solucin de cido sulfrico 0.15 M.
solucin saturada.
Clculos
Principio del mtodo
Reactivos
VxMx
SOLUCION ACUOSA DE CARBONATO AMONICO,
CARBONATO AMONIO 0.15M,
PERMANGANATO POTASICO,
METODO M. CASTINO
11
11. M. Castino, Vini ltal., 11, pginas 509-521, (1969).
2.44 2.45
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SOLUCION SULFATO FERROSO al 40 % (p/v).
ETER ETILICO,
ETILENGLICOL.
ACIDOSULFRICODILUIDO1:1,
SOLUCIONCLORHIDRATOHIDROXILAMINAal 10%(p/v).
SOLUCIONHIDROXIDOSODICO, 4.5 M.
REACTIVO FERRICO,
recientemente destilado sobre hidrxido
sdico.
(v/v) con agua destilada.
preparado con 20 gramos de cloruro
frrico cristalizado con 6 molculas de agua, disueltos en
aproximadamente 500 mL de agua destilada. Se aaden 20
mL de cido sulfrico concentrado y se completa a volumen
de un litro con agua.
Extractor lquido-lquido para disolventes ms ligeros que el agua.
Dos columnas de vidrio iguales, unidas entre ellas y colocadas una
sobre la otra, de 65 mm de longitud y 8 mm de dimetro interior cada
una. Una de las columnas se rellena con resina cambiadora catinica
fuerte, en ciclo cido, Dowex 50W-X8 (o equivalente) de 50/100 mallas
y la otra columna con resina aninica fuerte, Dowex 1X8, de 100/200
mallas, en ciclo carbonato.
1. Se diluye la muestra de vino, tomando 2.00 mL y llevando a
volumen de 20 mL con agua destilada. La muestra de vino o
mosto debe estar perfectamente filtrada.
2. Se hace pasar esta dilucin, por la columna catinica, que es
la que est situada en la parte superior, y seguidamente
circula tambin por la resina aninica. En la primera columna
quedan retenidos los aminocidos y los cationes, mientras
que en la segunda quedan fijados los cidos del vino.
3. Se separan las dos columnas, y se eluye el cido succnico de
la columna aninica, con el empleo de 35 mL de carbonato
amnico 0.15 M.
4. El eluado, recogido en un matraz de 100 mL, se lleva a ebu-
llicin durante unos minutos, tiempo necesario para descom-
poner la mayor parte del carbonato amnico.
Aparatos
Tcnica operativa
5. Se acidifica con 2 mL de cido sulfrico 5 My se aade gota a
gota, la solucin de permanganato potsico, hasta un
abundante precipitado, persistente, de meta-hidrxido
mangnico.
6. Se concentra la solucin, por ebullicin, hasta unos 7-8 mL.
Despus de fro se elimina el exceso de permanganato, con
algunas gotas de solucin de sulfato ferroso.
7. Se pasa cuantitativamente la solucin al tubo del extractor,
lavando el matraz con una pequea cantidad de agua
destilada.
8. Se pone en marcha el extractor y al cabo de unas 12 horas,
puede suspenderse la extraccin.
9. El extracto etreo, se pasa en pequeas porciones a un cris-
talizador de 4 cm de dimetro, colocado sobre una placa li-
geramente caliente, para ir eliminando el ter, lavando el ba-
ln del extractor, por tres veces, con unos 2 mL de ter cada
vez.
10. Evaporado el disolvente, se coloca el cristalizador en una
estufa regulada de 70 C, durante 30 minutos.
11. El residuo se disuelve con 2 mL de hidrxido sdico 0.25 M
(el succinato sdico es ms soluble que el cido succnico).
12. La solucin as obtenida es la que se emplea para la deter-
minacin colorimtrica. La cantidad de muestra, permite
efectuar el anlisis por duplicado.
13. En un tubo de ensayo, con tapn esmerilado, se introducen
0.5 mL de la solucin, (que contendr de 0.4 a 1.5 gramos de
cido succnico por litro), 1.5 mL de etilenglicol y 0.2 mL de
cido sulfrico 1:1. Se mezcla bien y se sumerge el tubo en un
bao de agua hirviente, durante 20 minutos.
14. Cuando fro, se aade 0.5 mLde la solucin de hidroxilamina y
2 mLde la solucin de NaOH4.5 M. Se agita durante 1 minuto
y despus se adicionan 10 mL del reactivo frrico y se agita
enrgicamente. Se pone el tubo al chorro de agua fra.
15. Transcurridos 5 minutos, se hace la lectura en el espectro-
fotmetro a la longitud de onda de 500 nm. Se efecta una
prueba en blanco, con todos los reactivos.
2.46 2.47
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16. Las cubetas espectrofotomtricas, tendrn un paso de luz de
20 mm. Si la concentracin de cido succnico es baja, podr
hacerse uso de cubetas de 40 a 50 mmde paso de luz.
Se prepara una grfica, con el empleo de cido succnico puro, reac-
tivo para anlisis, contrastando las lecturas de absorbancia de las
muestras, con la curva obtenida con soluciones patrn.
La columna de resina catinica, se regenera con 50 mL de cido
clorhdrico 2 M. La aninica, con 50 mL de solucin de carbonato
amnico al 6%, lavadas despus con agua destilada, hasta neutralidad
del eluyente. Con el uso, la resina aninica cambia de color, debido a
las sustancias polifenlicas del vino, pero ello no modifica de ninguna
forma, su propiedad de trabajo. Se recomienda sustituir las resinas,
despus de unas 30 determinaciones.
En presencia de succinil-CoA sintetasa (SCS), inosina-5'-trifosfato
(ITP) y la coenzima A (coA), el cido succnico se convierte a succinil-
CoA, con formacin simultnea de inosina-5'-difosfato (IDP). Este l-
timo se transforma a piruvato y es reducido por la NADH. La cantidad de
NADHoxidada es estequiomtrica con la cantidad de cido succnico.
para 10 determinaciones, que contiene
cuatro frascos con reactivos, algunos de los cuales debern
reconstituirse con agua destilada. La conservacin de estos
reactivos, as como su reconstitucin, se indica en el folleto
que acompaa a cada test.
Clculos
Observaciones
Principio del mtodo
Reactivos
METODO ENZIMATICO
de catlogo 176281,
Tcnica operativa
Clculos
1. Para el anlisis, no es necesaria la dilucin ni la decolora-
cin de la muestra de vino.
2. Se preparan cubetas de plstico de 10 mm de paso de luz. El
espectrofotmetro con lmpara de tungsteno, se sita a 340
nmde longitud de onda.
3. Seguir las instrucciones del anlisis, en el folleto que se
Para hallar la concentracin del cido succnico en la muestra, de
acuerdo a las instrucciones, deber anotarse la diferencia de absor-
bancias y aplicarla a la siguiente frmula:
Acido succnico = 0.613 en g/L x As
2.48 2.49
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Acido glucnico
COMENTARIOS
METODO PEYNAUD Y CHARPENTIE
Este cido aparece, principalmente, cuando la uva ha sido atacada
Esto es debido a la enzima glucosa-oxidasa, que provoca
la oxidacin de la funcin aldehdica de la glucosa, con formacin de
cido glucnico. Esta enzima, tambin puede ser aportada por el
Es muy importante disponer de un mtodo analtico, aplicable a los
mostos adems de los vinos, pues de esta forma puede tenerse
conocimiento de si la uva ha sido atacada por la Si ste anlisis
se efecta en los vinos y, el resultado es positivo, indica que ha sido
obtenido de uvas podridas.
Se basa en la produccin de metanal, por oxidacin peridica del
cido glucnico. Es necesario efectuar una defecacin previa, para eli-
por Botrytis.
Acetobacter, Penicillium, Aspergillus, Mucor y Fusarium.
Botrytis.
12
Principiodel mtodo
12. E. Peynaud Charpenti, y Y. Ann. Falsif. Fraudes., 46, 14, (1953).
minar polifenoles, gomas y pectinas, tanto de los vinos como en los
mostos. El cido glucnico, se precipita en forma de sal clcica. Hay
que eliminar cualquier traza de azcar, que sera una causa importante
de error y, por ello, se procede a una segunda precipitacin. Este
segundo precipitado, es el que se oxida con el cido peridico,
efectuando luego, el anlisis colorimtrico del metanal.
de fuerte poder decolorante.
preparada con: 100 mL de amonaco
concentrado, 40 gramos de hidrxido sdico y agua destilada
hasta un litro.
gramo por litro.
preparado con: 50 gramos de
cido cromotrpico (cido dihidro-1-3-naftalendisulfnico-3-
6) y agua destilada suficiente para un litro. Este reactivo se
conserva unos diez das en lugar oscuro y a una temperatura
de 0 C.
1. Se decolora un volumen de vino o mosto, con la cantidad
necesaria de carbn activo de enrgico poder decolorante. De
esta forma se separan las antocianinas, hetersidos, flavonas
y taninos, que por la accin oxidante del cido peri-
Reactivos
Tcnica operativa
CARBON ACTIVO,
ACIDO CLORHIDRICO.
ALCOHOL ETILICO de 96% y 72%.
FENOLFTALEINA al 1%.
SOLLICION CLORURO CA LCICO al 20%.
SOLUCIONALCALINA,
SOLUCION AZUL DE BROMOTIMOL.
ACIDO SULFRICO CONCENTRADO. ACIDO
SULFRICO al 1/3.
ACIDO PERIODICO N/50.
SOLUCIONDIOXIDODEAZUFRE, a 1
REACTIVOCROMOTROPICO,
Defecacin de la muestra
2.50 2.51
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dico, produciran pequeas cantidades de metanal. El cido
glucnico no es absorbido, aunque se utilice un exceso de
carbn activo.
2. Se toman 5.00 mLdel vino decolorado y se colocan en un tubo
de centrfuga de unos 50 mL de cabida. Se acidifica con 2
gotas de cido clorhdrico, para liberar los cidos. Se aaden
25 mL de alcohol de 96%. Se mezcla y se deja en nevera 24
horas. Las gomas y materias pcticas se precipitan durante
este tiempo.
3. Se centrifuga y decanta el lquido a un pequeo erlenmeyer. Al
residuo del tubo se aaden nuevamente 5 mL de alcohol de
96%, se pone en suspensin el residuo y de nuevo se
centrifuga, reuniendo el alcohol que sobrenada con el primer
lquido.
4. Se aade a la solucin alcohlica anterior, que contiene el
cido glucnico de la muestra, algunas gotas de solucin de
fenolftalena, 1 mL de solucin de cloruro clcico y solucin
alcalina, gota a gota, hasta viraje de la fenolftalena. Se
mezcla bien y se deja en la nevera.
5. El precipitado que se obtiene, se separa por centrifugacin, y
lavado por dos veces con 10 mLde alcohol del cada vez.
El residuo centrifugado, se trata con 5 mL de cido clorhdrico
0.5 M, aproximadamente. El precipitado se disuelve completa
y rpidamente.
6. De nuevo se vuelve a precipitar, por adicin de 1 mL de so-
lucin de cloruro clcico. Se aade solucin alcalina, lenta-
mente, hasta cambio de color de la fenolftalena. Se aaden
25 mL de alcohol de 96%. La coloracin rosa desaparece,
pero el pH debe permanecer con el valor de 8.0 (se com-
prueba el toque con la solucin de bromotimol, que debe
permanecer azul). Se mezcla y se deja en reposo de nuevo en
la nevera, durante 4 horas.
7. El precipitado formado durante el reposo se lava con 10 mL
de alcohol de 72%.
8. Con un chorro de agua destilada se traslada, con la ayuda
de un embudo, a un matraz de 50 mL.
Precipitacin doble del cido glucnico
72 %,
Oxidacin peridica del cido glucnico
Dosado colorimtrico del metanal
9. Antes de completar el volumen en el matraz anterior, se aci-
difica con 5 mL de cido sulfrico al 1/3 y se completa el
volumen con agua destilada. Se agita bien.
10. Segn el contenido de cido glucnico en la muestra, la oxi-
dacin se lleva a cabo con 1 2 mLdel lquido del matraz, que
representa un volumen de muestra de 0.1 0.2 mL.
11. Se aade 1 mL de cido peridico N/50, en tubos de ensayo
provistos de tapn esmerilado o matraces aforados de 25 mL.
Se deja que la oxidacin acte por unos 20 minutos a la
temperatura ambiente. El rendimiento de metanal es cuan-
titativo, trabajando en las anteriores condiciones.
12. Al matraz se introduce una solucin sulfurosa de 1 g/L de
dixido de azufre, gota a gota, para reducir el exceso de cido
peridico y los iodatos formados en la reaccin. Se libera el
iodo y el lquido toma un color amarillo. Se van aadiendo las
gotas de solucin sulfurosa, hasta que una ltima gota
decolore definitivamente el lquido. Se debe evitar un exceso
de sulfuroso que modificara posteriormente la coloracin
final.
13. Se aade ahora al tubo o matraz, 5 mL de reactivo cromo-
trpico y se completa con cido sulfrico concentrado, reac-
tivo para anlisis.
14. Despus de la adicin del reactivo, se calienta en bao mara
hirviente, durante 30 minutos. Se formar una coloracin
violeta, cuya intensidad depender de la cantidad de metanal
en la muestra. Es necesario efectuar cada vez un anlisis en
blanco, con agua destilada en vez de la muestra y un ensayo
con cido sulfrico, sin cido cromotrpico.
15. Transcurrido el tiempo anterior, se enfra y se completa a 25
mL con agua destilada, agitando bien.
16. El lquido se lleva a la cubeta de 10 mm de paso de luz del
espectrofotmetro, midiendo la absorbancia a la longitud de
onda de 540 nm.
2.52 2.53
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Clculos
Principio del mtodo
Reactivos
Tcnica operativa
Se necesita preparar una curva patrn, empleando soluciones co-
nocidas de cido glucnico puro, con el que se proceder a la oxidacin
peridica directamente. La absorbancia obtenida, con la correccin
debida a los ensayos en blanco, se compara en la grfica y, de ella, se
deduce la cantidad de cido glucnico en la muestra.
En presencia de la enzima gluconato kinasa, el cido glucnico y
gluconatos son fosforilados por la adenosina-5'-trifosfato (ATP) a
gluconato-6-fosfatasa. En la reaccin se forma nicotinamida-adenina
dinucletido fosfato, en forma reducida (NADP-H). La cantidad de este
ltimo compuesto es proporcional al gluconato o cido glucnico
presente en la muestra de vino o mosto. Se mide a la longitud de onda
de 340 nm, con cubetas de paso de luz de 10 mm.
reactivos, uno de los cuales debe reconstituirse con agua destilada. La
conservacin de estos reactivos, as como su reconstitucin, se indica
en el folleto que acompaa a cada test.
2. En un matraz de 100 mL, se colocan 10.00 mL de vino y
unos 25 mL de agua destilada.
METODO ENZIMATICO
Test-combinacin de la firma Boehringer Mannheim, nmero de
catlogo 428191,
3. Con una solucin de hidrxido potsico 2 M, se lleva a pH 10-
11. Se deja en reposo 10 minutos a la temperatura ambiente.
Se comprueba si el pH es el mismo y en caso contrario, se
corrige. Durante este tiempo, la glucono-5-lactona se
transforma en cido glucnico libre, que se valora.
4. Se ajusta la solucin a pH 7.5-8.0 con cido clorhdrico 1 M y
se diluye con agua hasta el volumen de 100 mL. Con esta
dilucin pueden analizarse muestras con un contenido entre
0.6 y 6.0 gramos de cido glucnico por litro.
5. Seguir las instrucciones que se indican en el folleto adjunto
al test analtico.
La concentracin de cido glucnico se halla por la frmula:
c = 0.9462 x Ag en g/L
Deber considerarse la dilucin que se haya realizado durante la
preparacin de la muestra, para tenerla en cuenta cuando se calcula la
concentracin.
Clculos
2.54 2.55
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Varios cidos a la vez
COMENTARIOS
METODO KUNKEE
Una tcnica para separar los cidos no voltiles del vino o mosto es
la cromatografa en papel o capa fina. Esta aplicacin puede hacerse
semicuantitativa, midiendo la intensidad y tamao de la mancha. Con el
uso meticuloso, pueden obtenerse cromatogramas para poder situar
varios cidos conjuntamente.
Es una autntica cromatografa de reparto. El papel o capa de gel de
slice es el que sirve de soporte. En el caso del papel, ste est formado
por numerosas fibras de celulosa que contienen un porcentaje de
humedad. Se puede considerar que las partes individuales de cada
fibra, junto con su humedad, son clulas elementales. Tiene
13
Principio del mtodo
13. R.E. Kunkee, Wines Vines, 49, 3 pginas 23-24, (1968).
lugar la separacin de los componentes, por reparto entre la humedad y
el disolvente que fluye. Se puede designar como fase estacionaria el
papel de filtro, y fase mvil al disolvente.
En la cromatografa de papel, el movimiento del compuesto objeto de
anlisis viene determinado por la solubilidad relativa entre la fase mvil
y la estacionaria. Si los componentes a analizar son solubles en el
disolvente, emigrarn a la misma velocidad que ste, y si son
totalmente insolubles, permanecern en el lugar donde se coloc la
muestra. En la velocidad de migracin, hay otros factores que influyen
en la misma, principalmente la adsorcin.
La propiedad, por la que tanto la cromatografa en papel como en
capa fina tiene su gran aplicacin, es la siguiente: en un sistema dado,
en igualdad de condiciones, la migracin de un compuesto en relacin
con el frente de avance del disolvente es una propiedad caracterstica y
reproducible. El movimiento de un compuesto es un valor que se
designa como Rf, que corresponde a la relacin entre la distancia
recorrida por el compuesto, y la recorrida por el disolvente.
Se prepara en un embudo de decantacin, de
500 mL de cabida, al cual se aaden: 100 mL de n-butanol,
reactivo anlisis, 100 mL de agua destilada, 10.7 mL de cido
frmico y 15 mL de solucin acuosa al 1 % de verde de
bromocresol. Se agita enrgicamente y se deja en reposo,
hasta que se separen perfectamente las dos fases lquidas, no
miscibles. Se elimina la fase inferior, acuosa, y se utiliza la
capa alcohlica superior, perfectamente lmpida.
1. Se prepara una hoja de papel para cromatografa de 20 x 30
cm, Whatman nmero 1, o bien Schleicher and Schull Nm.
2043-B.
2. A 2.5 cm del borde de mayor longitud, se traza una lnea con
lpiz de grafito, que servir de gua para depositar las
muestras.
3. Con una micropipeta o jeringuilla, se colocan 10 microlitros de
la muestra y sta adicin se repite cinco veces, con la
precaucin de que antes de cada adicin se haya secado per-
Reactivos
Tcnica operativa
FASE MOVIL..
2.56 2.57
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fectamente la anterior. Si se efectan varios anlisis simul-
tneamente, la separacin entre las manchas ser de 3 cm.
4. En la cubeta cromatogrfica, se coloca la solucin de fase
mvil, de forma que haya una altura de lquido entre 12 a 15
mm.
5. Se introduce el papel, en forma de cilindro, se tapa la cubeta y
se deja que el disolvente ascienda por el papel, hasta casi
llegar a unos 2-3 cmdel borde superior. Segn la temperatura
ambiente, el tiempo empleado es de unas seis horas.
6. Se retira el papel de la cubeta cromatogrfica y se seca en un
ambiente bien ventilado y ausente de vapores cidos. Se
observarn en el papel diversas manchas amarillas, reparti-
das diferentemente a lo largo de cada muestra colocada en la
lnea de origen. Pueden identificarse segn el
a) A continuacin se indican algunos valores de de distintos
cidos:
b) Puede hacerse una comprobacin, empleando soluciones pa-
trn de los cidos que interesen, mediante preparacin de solucio-
nes al 0.3%, a partir de los productos qumicamente puros.
Prcticamente es el mismo que en la metdica anterior, con la ex-
cepcin de que el soporte se ha sustituido por una lmina de mate-
Rf.
Rf
Observaciones
Principio del mtodo
METODO DE CAPA FINA
rial plstico, sobre la cual se ha depositado una capa fina de gel
de slice u otro soporte.
se prepara utilizando la mezcla de 400 mL de n-
butanol, 200 mL de cido frmico y 500 mL de agua destilada,
se mezcla bien y se deja en reposo el tiempo suficiente para
que se separen perfectamente las dos capas. Se emplea la
capa alcohlica superior, cuando est lmpida.
1. Se coloca sobre la placa, colocada horizontalmente, un mi-
crolito de la muestra.
2. Se efecta la separacin, colocndola en una cubeta ade-
cuada para la medida de la placa, en la que se habr colocado
el disolvente en una altura de unos 15 mm.
3. El tiempo de separacin es mucho ms rpido que en el
papel.
4. Se retira la placa y se procede a su secado en un ambiente
exento de vapores cidos.
5. A continuacin se efecta el revelado, pulverizando sobre la
placa una disolucin de acridina al 0.02% en alcohol al 50%
con agua.
6. Las manchas de los distintos cidos se observan con luz ul-
travioleta de longitud de onda de 254 nm.
a) Los Rf de los distintos cidos se indican a continuacin: Tartri-
co 0.13, ctrico 0.23, mlico 0.35, lctico 0.76 y succnico 0.86.
b) Con esta tcnica, se tiene la ventaja de que los dos cidos: lctico
y succnico, que en la metdica anterior eran coincidentes, con la
utilizacin de placa con gel de slice, existe suficiente separacin para
no confundirlos.
c) Puede tambin emplearse la fase mvil del mtodo anterior.
Reactivos
Tcnica operativa
Observaciones
FASE MOVIL,
2.58 2.59
Acido tartrico 0.28
Acido ctrico 0.45
Acido mlico 0.51
Tartrato cido de etilo 0.59
Acido lctico 0.78
Acido succnico 0.78
Malato cido de etilo 0.80
Frente del disolvente 0.87
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3. ADITIVOS
QUIMICOS
DIOXIDO DE AZUFRE 3.5
METODO USUAL DE LA C.E.E. 3.6
METODO CEE referencia 3.9
METODO SCHNEYDER Y VLCEK 3.12
METODO REBELEIN destilacin 3.13
METODO HEIKE Y KREISEL 3.15
SORBICO Y SORBATOS 3.18
METODOS C.E.E. 3.19
CEE. Espectrofotometra ultravioleta 3.19
CEE. Anlisis colorimtrico 3.21
CEE. Cromatografa en capa fina 3.23
METODO BERTRAND Y SARRE 3.25
METODO RAPIDO 3.26
SALICILICO 3.28
METODO BERTRAND Y SARRE 3.28
METODO DE LAA.O.A.C 3.30
TEST DE JORRINSEN 3.31
ACIDO BENZOICO 3.32
METODO JAULMES 3.32
VARIOS ACIDOS 3.37
CLOROPICRINA 3.40
METODO POR CROMATOGRAFIA DE GAS 3.40
FERROCIANURO Y CIANURO 3.43
METODO DE LA CEE 3.43
METODOS USUALES CEE 3.45
METODO ADDEO, NOTA Y CHIANESE 3.49
BETAINA 3.53
METODO CENCI Y CREMONINI 3.53
ANTIFERMENTOS 3.56
METODO BIOLOGICO GAROGLIO STELLA 3.56
ISOTIOCIANATO DE ALILO 3.58
METODO UNICO DE LA CEE 3.58
3.3
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Dixido de azufre
COMENTARIOS
Desde muy antiguo, se emplea el dixido de azufre como antisptico
en los vinos. Su utilizacin se inici con la combustin del azufre. En la
prctica, para poder efectuar una perfecta dosificacin, se hace uso del
metabisulfito potsico, dixido de azufre comprimido en tubos o
soluciones acuosas de sulfuroso.
La aplicacin de este producto en enologa, no es slo por su accin
antisptica, sino tambin por su fuerte poder reductor. Algunas
levaduras son muy sensibles al S0 , otras pueden resistirlo. Las
bacterias del vino, no lo toleran y son eliminadas totalmente. En vinos
tintos, la presencia de 80 mg de S0 , por litro, son suficientes para
inhibir el crecimiento de las bacterias malolcticas.
Al aadir el dixido de azufre al vino, aquel reacciona con el etanal,
para formar un complejo de bisulfito. Tambin reacciona con la funcin
aldehdica de los azcares, principalmente la glucosa, y con
compuestos fenlicos, como los cidos cafico y cumrico.
Los lmites legales del dixido de azufre, son distintos segn los
pases y tambin segn tipos de vino. Espaa permite para vinos blan-
cos y rosados, con menos de 5 g de azcares/L, 210 mg/ L de dixido
de azufre total. Vinos tintos y claretes con azucar inferior a 5 g/L, 160
mg/L, de S0 . Vinos con ms de 5 g azcares por litro: blancos y
rosados, 260 mg/L; tintos y claretes, 210 mg/L.
2
2
2
3.5
CUMARINA 3.63
METODO DYER Y MARTIN 3.63
EDULCORANTES SINTETICOS 3.66
METODO CROMATOGRAFICO EN CAPA FINA 3.66
ASARONA 3.70
METODO WOJTOWICZ 3.70
METODO A.O.A.C 3.72
ESTIRENO 3.74
METODO BRUN Y GIFFONE 3.74
METODO POR ABSORCION EN EL UV 3.76
METATARTARICO 3.78
ACIDO OXALICO 3.80
METODO HENNING Y LAY 3.80
-
3.4
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En el momento de embotellar, son suficientes de 20 a 30 mg de SO
por litro, en forma libre. Cuando se aade sulfuroso a un vino, con el
tiempo, hay un progresivo aumento de la acidez fija, por esta razn, se
recomienda el empleo de metabisulfito potsico, en vez del S0
procedente de tubos o de soluciones acuosas, para evitar tal defecto.
El cuidado con la muestra y la toma de la misma, es de extrema
importancia para su anlisis. El dixido de azufre es una sustancia muy
voltil que se elimina o transforma muy fcilmente a la temperatura
ambiente, si la muestra est expuesta al aire. La recogida de la muestra
debe hacerse, previa una buena mezcla en el recipiente que la
contiene, y conservarla en un frasco perfectamente tapado hasta el
momento del anlisis. Pocos minutos de exposicin al aire, de la
muestra pipeteada, pueden causar importantes prdidas de SO .
Ciertas sustancias del vino son tambin oxidadas por el iodo, en
medio cido, como tiene lugar en la determinacin directa sobre el vino.
El volumen de iodo 0.025 M (0.05 N), gastado para oxidar estas
sustancias, es del orden de 0.3 mL para los vinos blancos, esta cifra es
mayor en los tintos.
Valoracin iodomtrica directa.
Valoracin iodomtrica, despus de la
hidrlisis alcalina sobre el vino. Este valor, aadido al dixido de azufre
libre, indica el dixido de azufre total de la muestra.
(160 g / L)
en volumen.
2
2
2
METODO USUAL DE LA CEE
Principio del mtodo
Reactivos
Dixido de azufre libre.
Dixido de azufre combinado.
SOLUCION HIDROXIDO SODICO 4 M,
ACIDO SULFURICO AL 1/10
3.6
ENGRUDO DE ALMIDON a 2.5g/L.
SOLUCION DE IODO 0.025 M (0.05 N).
EDTA
n
n'
n"
n,
(n - n"')
(n' +n)
(n +n'' n''')
En un mortero, se mez-
clan ntimamente, 2.5 gramos de almidn y 10 miligramos de
ioduro mercrico y una pequea cantidad de agua, de manera
que quede una pasta fluida. Introducirla en un litro de agua en
plena ebullicin y mantenerla durante 10 minutos. Cuando
est frose filtra.
1. En un erlenmeyer de 500 mL, se colocan 50.00 mL de vino, 3
mLde cido sulfrico al 1/10, 5 mLde engrudo de almidn y 30
mg de EDTA.
2. Valorar inmediatamente, con la solucin de iodo 0.025 M,
hasta que la coloracin azul persista durante 10 a 15 segun-
dos. Sea el nmero de mililitros de solucin de iodo
gastados.
3. Se aaden 8 mL de solucin de hidrxido sdico 4 M, agitar
una sola vez y dejar en reposo 5 minutos.
4. Verter con rapidez y agitando enrgicamente, 10 mL de cido
sulfrico al 1 /10, que se tenan preparados en un pequeo
vaso. Valorar inmediatamente con iodo 0.025 M. Sea el
volumen de iodo empleado.
5. Aadir 20 mL de solucin de hidrxido sdico 4 M, dejar re-
posar 5 minutos, previa agitacin una sola vez. Diluir con 200
mL de agua destilada muy fra. Con agitacin enrgica, verter
con rapidez 30 mL de cido sulfrico 1/10, contenidos en un
vaso.
6. Valorar con el iodo 0.025 M. Sea el volumen gastado de
iodo.
El valor de se halla segn se indica en la observacin a).
SO libre =32 en mg/L.
SO combinado =32 en mg/L.
SO total =32 en mg/L.
Tcnica operativa
Clculos
2
2
2
3.7
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Observaciones
a) Ya que ciertas sustancias son oxidadas con el iodo en medio
cido, es necesario, para efectuar un anlisis ms preciso, determinar
la cantidad de iodo empleado en estos productos. Para ello, se combina
el dixido de azufre libre, con un exceso de etanal o propanal, antes de
la valoracin con iodo como se indica a continuacin:
A50 mLde vino, colocados en un erlenmeyer de unos 250 mL, aadir
5 mL de solucin de etanal a 7 g/L 5 mL de solucin de propanal a 10
g/L. Tapar y dejar en reposo 30 minutos, por lo menos. Aadir 3 mL de
cido sulfrico al 1/10 y valorar con iodo 0.025 M, en cantidad necesaria
para hacer virar el engrudo de almidn. Sea el volumen de iodo
empleado.
El volumen es pequeo, del orden de 0.2 a 0.3 mL de iodo 0.025
M. Si el vino ha sido adicionado de cido ascrbico, es mucho ms
elevado y se puede medir, aunque aproximadamente, la cantidad de
este producto. Debe tenerse en cuenta que 1 mL de iodo 0.025 M
equivale a 4.4 miligramos de cido ascrbico. Con la medicin de se
puede evaluar si un vino ha sido adicionado de cido ascrbico en
cantidad superior a 20 mg/L.
b) Para el anlisis en los vinos tintos, con bajo contenido de sulfu-
roso, es interesante emplear la solucin de iodo ms diluida, por ejem-
plo una de 0.01 M. En este caso, hay que reemplazar el factor 32 por
12.8, en las frmulas anteriores.
c) En el anlisis de los vinos tintos, es ventajoso iluminar el vino por la
parte inferior, con una luz amarilla procedente de una lmpara de vapor
de sodio. Colocar en una cmara oscura y observar la transparencia del
vino, ya que cuando ha virado el engrudo de almidn, aparece opaco.
La forma de comprobar el punto final de la valoracin, es el empleo de
un electrodo de platino y un medidor de pH, en la posicin de milivoltios,
y efectuar la lectura del cambio de redox. Tambin, y ms perfecto es la
utilizacin de un titulador electrnico.
d) Cuando la cantidad obtenida en el anlisis, se acerca o sobrepasa
el lmite legal, es necesario determinar el dixido de azufre por el
mtodo de referencia.
n'''
n'''
n"'
n"',
3.8 3.9
e) Si el inters particular se centra en el contenido del dixido de
azufre libre, se ha convenido determinarlo en una muestra manteni-
da tapada durante cuatro das a la temperatura de 20 C, antes del
anlisis. Este ser efectuado a la misma temperatura.
El dixido de azufre es arrastrado por una corriente de aire o de
nitrgeno, fijado y oxidado, por borboteo, sobre una solucin diluda y
neutra de perxido de hidrgeno. El cido sulfrico formado, se
neutraliza con una solucin valorada de hidrxido sdico. El dixido de
azufre libre se extrae del vino, por arrastre en fro (10 C). El sulfuroso
total se extrae igualmente, pero a la temperatura de 100 C
aproximadamente.
El aparato debe estar formado de acuerdo al esquema que se ad-
junta, en particular en lo que se refiere al refrigerante. El tubo de des-
prendimiento de gas en el borboteador, debe estar terminado con
METODO CEE referencia
Principio del mtodo
Aparato
system
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3.10 3.11
un vidrio poroso, con objeto de que se formen un gran nmero de
pequeas burbujas, para lograr un contacto ntimo entre la fase ga-
seosa y la lquida.
La velocidad del paso de gas o aire, debe estar regulado a 40 litros
por hora. El frasco de la derecha, est destinado a limitar la depresin
de la trompa de agua a unos 20-30 cm.
g de
por litro (3 volmenes).
preparado en un matraz aforado
de 100 mL con 100 mg de rojo de metilo, 50 mg de azul de
metileno y alcohol al hasta completar el volumen.
1. El vino debe estar en un frasco lleno y tapado, a la tempera-
tura de 20 C, durante cuatro das antes del anlisis.
2. En el matraz de 250 mL del aparato de arrastre, se colo-
can 50.00 mL de la muestra y 15 mL de cido fosfrico.
3. Se coloca el matraz en el conjunto del aparato.
4. En el borboteador B, se colocan 2 3 mL de la solucin de
perxido de hidrgeno, dos gotas del indicador y neutralizar la
solucin del agua oxigenada con hidrxido sdico 0.01 M.
5. Se adapta el borboteador al aparato.
6. Hacer pasar el aire o nitrgeno, durante 15 minutos.
7. Retirar el borboteador del aparato y valorar el cido formado,
con el hidrxido sdico 0.01 M. Sea el nmero de mililitros
gastados.
Para hallar el contenido de dixido de azufre libre, se aplica la fr-
mula: 6.4x miligramos por litro.
Reactivos
Tcnica operativa
Clculos
ACIDO FOSFORICO al 85%.
SOLUCION DE PEROXIDO DE HIDROGENO a 9.1
H O
SOLUCIONDEINDICADOR
50%
Anlisis del dixido de azufre libre
A
n
n
2 2
Tcnica operativa
Clculos
Anlisis del dixido de azufre total.
A
B
A
B
n
n
1. En el caso de que la concentracin de SO en la muestra sea
igual o menor de 50 mg/L, se toman 50.00 mL de la muestra y
15 mLde cido fosfrico.
2. Si la concentracin de la muestra es superiora 50 mg/L, en el
matraz de 100 mLse colocan 20.00 mLde la muestra y 5 mi-
de cido fosfrico.
3. Colocar en el borboteador , 2 3 mL de perxido de hidr-
geno, se neutraliza como se ha indicado anteriormente.
4. Llevar a ebullicin el vino contenido en el matraz , por la
accin de una llama de unos 4 cm de altura que toque en el
fondo del matraz. Se recomienda colocar un disco metlico
con un orificio de 30 mm, para evitar la pirogenacin de las
materias extractivas del vino, en las paredes del matraz.
5. Mantener la ebullicin y el paso del gas, durante 15 minutos.
En este tiempo todo el dixido de azufre ha sido extrado y
oxidado.
6. Valorar el cido formado en el borboteador , con hidrxido
sdico 0.01 M. Sea el volumen gastado de reactivo.
En el caso de que se haya empleado un volumen de muestra de
50.00 mL, la frmula es la siguiente: 6.4x . Si la toma de muestra ha
sido de 20 mL, se aplicar el factor 16 en vez de 6.4.
2
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3.12 3.13
METODO SCHNEYDER Y VLCEK
1
Principio del mtodo
Reactivos
Tcnica operativa
Clculos
Exclusivamente para el dixido de azufre libre. Es una metdica muy
similar al mtodo de Ripper, pero emplea solucin de iodato potsico
para la valoracin, en vez del iodo, por su mayor estabilidad. Se aade
al vino un exceso de ioduro potsico y entonces se valora con iodato.
Tan pronto como exista un exceso de iodo, el engrudo de almidn
presente lo pone de manifiesto, por su cambio de color.
Comparativamente con el mtodo de Ripper, se le considera mejor.
preparada por
disolucin de 10 gramos de ioduro potsico y 2.5 gramos de
almidn soluble, con agua destilada hasta un litro.
Disolver 0.11135 gra-
mos de iodato potsico en 200 mL de cido sulfrico 1 M y
llvese a volumen de un litro con agua destilada. Es una
solucin 0.0005203 M.
1. En un erlenmeyer de 250 mL, se colocan unos 50 mL de agua
destilada, 10.00 mLde la muestra de vino o mosto a analizar y
2 mL de la solucin de almidn-ioduro y se valora con la
solucin de iodato, hasta persistencia azul del almidn.
El contenido en miligramos de sulfuroso libre, por litro de vino, es
igual al volumen de iodato gastado, multiplicado por 10 (1 mL= 10
mg/L).
SOLUCION ALMIDON-IODURO POTASICO,
SOLUCION DE IODATO POTASICO.
1. J. Schneyder y G. Vicek. Versuchsanst Wein-Obstbau (Klosterneuburg), 27 pginas 87-88,
(1977).
Si se emplea otra molaridad del iodato potsico, se puede hallar el
contenido de sulfuroso libre, de acuerdo a la siguiente frmula:
x x 32 x 1000
en donde: =volumen de la muestra empleada para el anlisis.
= normalidad de iodato potsico. Debe tenerse en cuenta
la equivalencia de la molaridad y normalidad (1 M=6 N).
=volumen de la solucin de iodato gastada.
Se fundamenta en la destilacin del dixido de azufre total conte-
nido en la muestra, recogiendo el destilado en una solucin de ioda-
V N
V
v'
N
V
METODO REBELEIN destilacin
2
Principio del mtodo
2. H. Rebelein, Chem. Mikrobiol. Technol. Lebensm., 2, pginas 112-121, (1973).
system
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3.14 3.15
to potsico. La destilacin del SO total se desarrolla ms rpidamente
en cido sulfrico, que en cido fosfrico. Con la ayuda de un destilador
con fraccionamiento, es posible destilar cuantitativamente el dixido de
azufre total, en un tiempo de 3 a 4 minutos.
Una modificacin del aparato, introducida por GAB, permite disponer
en una sola unidad, el destilador y la placa calefactora proyectada para
este fin.
al 1 %.
1.5512 g disueltos en
un litro de agua.
1. El aparato destilador GAB, deber estar dispuesto para el
trabajo, no es necesaria agua de refrigeracin. Previamente la
placa calefactora se tendr conectada, con objeto de que
alcance la temperatura de trabajo (unos 20 minutos).
2. En un erlenmeyer de 250 mL se vierten 50.00 mL de la
solucin de iodato.
3. En el erlenmeyer de 100 mL, se colocan 2 mL de metanol, un
poco de piedra pmez, 10.00 mL de la muestra de vino,
procurando que la punta de la pipeta se halle apoyada en la
pared del erlenmeyer (para que la muestra resbale por la
misma) y 10 mLde cido sulfrico.
4. Se monta en el destilador y se coloca el erlenmeyer sobre el
calefactor, con el tubo de salida sumergido en el erlenmeyer
que contiene la solucin de iodato.
5. Iniciada la ebullicin, se cuenta un tiempo de cinco minutos.
6. Transcurrido el tiempo, se levanta el destilador y se enjuaga
con agua destilada la punta del mismo.
2
Reactivos
Tcnica operativa
SOLUCION DE IODATO POTASICO, 111.4 mg en agua
hasta un litro.
ME TANOL.
INDICADOR DE ALMIDON,
ACIDO SULFRICO al 20%.
SOLUCION TIOSULFATO SODICO,
7. Se enfra rpidamente el erlenmeyer al chorro de agua.
8. Cuando fro, se aaden 10 mL de solucin de indicador de
almidn y 10 mL de solucin de cido sulfrico.
9. Se valora con la solucin de tiosulfato, hasta desaparicin
del color azul-violceo.
10. El contenido se lee directamente de la bureta que ha sido
graduada en mg de dixido de azufre por litro.
a) Es absolutamente necesario seguir el orden de adicin de los
reactivos, tal como se indican en la tcnica operativa.
b) Como en toda valoracin, es recomendable la adicin del lquido
de la bureta con cierta lentitud al acercarse al punto de equivalencia,
con el fin de detener la misma en el momento exacto.
Es un mtodo para determinar el sulfuroso total. Comparativamente
es tan exacto como el mtodo oficial alemn, con la ventaja de permitir
el automatismo en su aplicacin. Se basa en la combinacin
reacciona con la
pararrosanilina, en medio cido y formaldehdo, para dar un producto
coloreado, cuya medicin puede realizarse a 570 nm con el
espectrofotmetro.
Se pre-
para disolviendo 27.2 gramos de cloruro mercrico y 11.7
gramos de cloruro sdico, en agua destilada, completando el
volumen a un litro.
Observaciones
Principio del mtodo
Reactivos
METODO HEIKE Y KREISEL
3
del SO
con cloruro mercrico, para formar un compuesto, que
SOLUCION TETRACLOROMERCURATO SODICO.
2
3. E. Heike y A. Kreisel, Z Anal. Chem., 285, pginas 39-42, (1977).
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3.16 3.17
SOLUCION FORMALDEHIDO,
SOLUCION DE PARARROSANILINA,
mL
preparada con 5 mL de for-
mol del 40%, diluido a un litro de agua destilada.
por disolucin de 100
mg de pararrosanilina, disueltos en 40 mLde cido clorhdrico
concentrado. Se lleva a volumen de 250 mL con agua
destilada y se deja en reposo durante una noche.
1. En un matraz de 100 mL, se aaden 5.00 mL de la muestra de
vino, 1 de solucin de tetracloromercurato, 10 mL de
hidrxido sdico 0.1 M y se completa a volumen con agua
destilada.
2. Se toman 5.00 mL de esta disolucin y se pasan a un matraz
de 50 mL, al que se aaden 5 mLde solucin de formaldehdo
y 5 mL de solucin de pararrosanilina, se completa a volumen
con agua destilada y se deja 8 minutos en bao de agua a 20
C.
3. Se mide la absorbancia, en una cubeta espectrofotomtrica de
10 mm de paso de luz, a 570 nm de longitud de onda, en
comparacin con un ensayo en blanco, con todos los reac-
tivos menos el vino. El color de la muestra es estable durante
30 minutos.
Se prepara una curva de calibracin, frente a la que se comparan
las lecturas de las absorbancias de las muestras.
El sulfito (cido sulfuroso) se oxida a sulfato en presencia de ox-
geno, a travs de sulfito-oxidasa. El perxido de hidrgeno formado en
esta reaccin se reduce en presencia de la nicotinamid-adenin-
Tcnica operativa
Clculos
Principio del mtodo
METODO ENZIMATICO
dinucletido (NADH) por la enzima NADH-peroxidasa. La cantidad de
NADH consumida, en esta reaccin, es equivalente a la cantidad de
sulfito libre o tambin al sulfito combinado con el aldehdo.
reactivos, que se usarn, algunos previa reconstitucin con
agua destilada. La conservacin y forma de reconstituir, se
indica en el folleto que acompaa a cada test analtico.
1. Se preparan las cubetas de 10 mmde paso de luz, de plstico
para un solo uso. El espectrofotmetro con lmpara de
tungsteno, se prepara para leer a la longitud de onda de 340
nm.
2. Si la cantidad de dixido de azufre no sobrepasa los 300 mi-
ligramos/L, no es necesario efectuar dilucin alguna de la
muestra de vino.
3. El anlisis se efecta siguiendo las instrucciones detalladas
en el folleto explicativo, que acompaa a cada test.
Una vez hallada la diferencia de absorbancias, la concentracin de
dixido de azufre se calcula por:
SO = 0.3213 x en gramos por litro
deber tenerse en cuenta el factor de dilucin, en el caso que haya sido
hecha.
En el caso de analizar vinos tintos, es necesario efectuar el siguiente
tratamiento: Se colocan en un matraz aforado de 50 mL, 25.00 mL de
vino y se neutralizan a pH 7.5-7.8 con hidrxido sdico 2 M y se
completa a volumen con agua destilada (factor de dilucin = 2). Man-
tenerlo durante 10 minutos a la temperatura ambiente. Utilcese 0.1 mL
para el anlisis.
Reactivos
Tcnica operativa
Clculos
Observaciones
725854,
As
2
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3.18 3.19
Srbico y sorbatos
COMENTARIOS
Este cido ha sido aceptado como aditivo al vino, para inhibir el
crecimiento de las levaduras. El cido srbico no tiene accin contra las
bacterias, antes bien, a las dosis normales de empleo, favorece
apreciablemente, el desarrollo de las bacterias acticas. Debe ser em-
pleado en cantidad suficiente, para actuar como antifermento, ya que si
no es as, es totalmente intil su adicin. No es eficaz cmo anti-
fermento, en los mostos o zumos de uva. Su utilidad principal, se
destina a vinos embotellados, empleado en concentraciones de 150 a
200 mg/L, ya que existe una accin sinrgica con el alcohol del vino,
ms acentuada en los vinos con bajo pH. En la prctica se hace uso de
la sal potsica, ya que el cido es muy poco soluble en agua.
El cido srbico, como tal, no tiene olor, sin embargo, s aparece
lentamente un olor cuando hay una accin bacteriana y, en este caso,
es un olor desagradable. Favorece el fenmeno de oxidacin, conocido
por maderizado del vino. Para evitarlo, siempre debe emplearse
conjuntamente con dixido de azufre y cido ascrbico.
La cantidad mxima permisible, para su aplicacin al vino, difiere
segn los pases. En Espaa y la CEE, la concentracin mxima ad-
mitida es de 200 miligramos de cido srbico por litro de vino.
METODOS CEE
CEE. Espectrofotometra ultravioleta
Principio del mtodo
Reactivos
El cido srbico (constante de volatilidad = 0.59), arrastrado por el
vapor de agua, se determina en el destilado. La eliminacin de las
sustancias que puedan enmascarar el anlisis, se efecta por eva-
poracin a sequedad del destilado, ligeramente alcalinizado por el
agua de cal. Tanto es aplicable para la espectrofotometra de absorcin
en el ultravioleta, como para la colorimetra despus de la oxidacin a
aldehdo malnico, que se condensa con el cido tiobarbitrico, para
dar una coloracin rosa. Valores inferiores a 20 mg/L, deben
confirmarse con la cromatografa en capa fina, cuya sensibilidad es de
5 mg/L.
Se prepara el destilado como se ha indicado
para la determinacin de la acidez voltil, recogiendo 320-330 mL, a
partir de 20.00 mililitros de muestra de vino, adicionado de 1 a 2 gramos
de cido tartrico, con el objeto de efectuar la extraccin total del cido
srbico.
aproximadamente 0.02 M.
preparada por disolu-
cin de 50 miligramos de sulfato de cobre pentahidrato, reac-
tivo anlisis, 0.1 mL de cido sulfrico concentrado puro, y
agua destilada hasta completar un litro.
preparada di-
solviendo en un matraz de un litro, 20 miligramos de cido
srbico puro, con unos 900 mL de agua caliente, agitar. Enfriar
y completar a volumen con agua destilada. Tambin puede
prepararse por disolucin de 26.8 miligramos de sorbato
potsico, en un litro de agua fra.
Obtencin del destilado.
AGUA DE CAL,
SOLUCION DE SULFATO DE COBRE,
SOLUCION DE ACIDO SORBICO a 20 mg/L,
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Tcnica operativa
Clculos
1. En una cpsula de 55 mm de dimetro, colocar 5.00 mL del
destilado, aadir 1 mL de agua de cal lmpida y una gota de
solucin de sulfato de cobre.
2. Evaporar a sequedad en bao mara hirviente. Tomar el re-
siduo con agua destilada y llevarlo a un matraz de 20 mL y
completar a volumen con agua.
3. Medir la absorbancia, con cubetas de cuarzo, de paso de luz
de 10 mm, a 256 nm, comparativamente con un ensayo en
blanco, Este se prepara con 1 mL de agua de cal, una gota de
solucin de sulfato de cobre y agua hasta 20 mL.
4. Las lecturas se comparan frente a una grfica obtenida por
soluciones patrn, de concentraciones: 0.5, 1.0, 2.5 y 5.0 mi-
ligramos de cido-srbico por litro. La absorbancia se mide en
comparacin con agua destilada. Estas soluciones se ob-
tienen, por dilucin adecuada de la solucin base de 20 mg/L.
Sea , la cantidad en miligramos/litro de cido srbico que contiene
la solucin colocada en la cubeta, por comparacin espectro-
fotomtrica con la grfica. Si mLes el volumen (prximo a 330 mL) del
destilado obtenido a partir de 20.00 mL de la muestra de vino, el
contenido ser:
miligramos de cido srbico por litro. En el supuesto de que se recojan
exactamente 330 mL de destilado, la frmula para el clculo es 66x
miligramos por litro.
Si la concentracin en cido srbico es igual o inferior a 20 mg/L, es
necesario proceder a una cromatografa en capa fina de la muestra. Si
la presencia viene confirmada, proceder de la siguiente forma:
Tomar 50.00 mLdel destilado. Colocar ste volumen en una cpsula
con 3 mL de agua de cal lmpida y 5 gotas de solucin de sulfato de
cobre. Evaporar a sequedad en bao mara. Tomar el residuo con agua
destilada y llevarlo a volumen de 20.00 mL. Agitar y continuar el
anlisis, como se ha indicado anteriormente, sobre 5.00 mL
e
V
0.2 x e x V
e
3.20 3.21
del destilado concentrado. Sean los miligramos de srbico que con-
tiene
0.02 x e x V
AGUADECAL
ACIDOSULFRICO0.5 M.
SOLUCIONDICROMATOPOTASICO0.05 M.
ACIDO TIOBARBITURICO
SOLUCION DE ACIDO SORBICO
V
0.02 M
a 20 mg/L.
e
la solucin del destilado, concentrado 2.5 veces, que se han
colocado en la cubeta. Si es el volumen (casi 330 mL del destilado
obtenido, a partir de 20.00 mLde muestra, la concentracin en el vino ser:
miligramos de cido srbico por litro.
aproximadamente.
solucin al 0.2% (p/v). Se disuel-
ven, en un matraz de 100 mL, 200 mg de cido tiobarbitrico con
agua, a temperatura de 60-80 C. Cuando fro enrasar con agua
destilada a volumen. La solucin debe estar perfectamente
lmpida. En caso contrario filtrarla. Debe prepararse
extemporneamente.
En un matraz
aforado de un litro, con 900 mL de agua destilada caliente, se
vierten 20 miligramos de cido srbico puro. Agitar hasta disolver
perfectamente. Se deja enfriar y se lleva a volumen con agua.
Puede tambin prepararse con 26.8 mg de sorbato potsico.
1. Colocar en una cpsula, 5.00 mL del destilado, aadir despus 1
mLde agua de cal lmpida. Evaporar a bao mara hirviente.
2. Tomar el residuo con agua destilada y llevarlo a volumen de 10
mL, con las aguas de lavado de la cpsula. Agitar.
CEE. Anlisis colorimtrico
Reactivos
Tcnica operativa
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3.22 3.23
lado y se colocan en una cpsula, a la que se aaden 3 mL de agua
de cal lmpida y se evapora a sequedad a bao mara hirviente. Se toma
el residuo con agua y se completa el volumen a 20 mL.
En un tubo se introducen: 1 mL del destilado concentrado 2.5 veces,
1 mL de agua destilada, 1 mL de cido sulfrico 0.5 M y 0.2 mL de
solucin de dicromato potsico 0.05 M. Se contina el anlisis como
antes se ha indicado.
El cido srbico se extrae con ter, del vino previamente acidificado.
Luego tiene lugar una separacin cromatogrfica, en capa fina, con
polvo de poliamida. Se pone de manifiesto la presencia del cido
mediante radiacin ultravioleta.
Preparado con 20 partes de pentano, 20 par-
tes de exano y 3 partes de cido actico.
0.1 gramos de cido srbico en 100 mL
de alcohol de 96%.
CEE. Cromatografa encapa fina
Principio del mtodo
Reactivos
ETERETILICO. METANOL.
ALCOHOLETILICO 96%.
SOLUCIONDEACIDOSULFURICOal 20 %(v/v).
SULFATOSODICOANHIDRO.
POLVO DE POLIAMIDA CROMATOGRAFICO, Merck.
INDICADORFLUORESCENTEF254, Merck.
DISOLVENTE.
SOLUCIONPATRON,
3. En un tubo de ensayo, colocar: 1 mL de este ltimo lquido
obtenido, 1 mL de agua destilada, 1 mL de solucin de cido
sulfrico 0.5 M y 0.2 mL de solucin 0.05 M de dicromato
potsico.
4. Colocar este tubo en un bao mara hirviente, durante 5 mi-
nutos exactamente. Enfriar bruscamente el tubo en un bao
de agua con hielo, aadir seguidamente 2 mL de solucin de
cido tiobarbitrico al 0.2%.
5. Llevar de nuevo al bao mara durante 10 minutos exactos.
Enfriar en agua con Aparecer una coloracin rosa, cu-
ya absorbancia debe medirse dentro de los 10 minutos si-
guientes a la salida del bao mara y con el lquido
tamente fro.
6. El tiempo de calentamiento y el empleo del agua con hielo,
debe observarse escrupulosamente, ya que, en caso con-
trario, la intensidad de la coloracin se modifica. Tambin a la
temperatura ordinaria, la coloracin va evolucionando
continuamente. Medir la absorbancia de la solucin a 532 nm,
en comparacin a un testigo preparado con 2 mL de agua
destilada, adicionada de las mismas cantidades de los
reactivos indicados anteriormente.
7. Se compara la absorbancia, con la grfica preparada con so-
luciones de cido srbico puro, de las siguientes concentra-
ciones: 0.5, 1.0, 2.5 y 5 miligramos de cido srbico por litro,
preparadas a partir de la solucin de cido srbico de 20 mg/L.
Un mililitro de estas diluciones, se trata exactamente igual
como el lquido destilado.
Sean miligramos de cido srbico por litro que contiene la
solucin situada en la cubeta espectrofotomtrica. Si es el volumen
(cercano a 330 mL) del destilado obtenido a partir de 20.00 mL de vino,
ste contendr: 0.1 miligramos de cido srbico por litro. Si se
han recogido exactamente 330 mL de destilado, el clculo ser: 33xe
miligramos de cido srbico.
En el caso de que la concentracin de cido srbico sea igual o
inferior a 20 mg/L, se comprobar, por cromatografca en capa fina, la
presencia de cido srbico. Si es as, se toman 50.00 mL del desti-
hielo.
comple-
e los
V
x e x V
Clculos
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Aparatos
Tcnica operativa
Dispositivos para colocar las placas cromatogrficas.
Placas de vidrio de 20 x 20 cm
Preparacin de las placas: Mezclar ntimamente en seco, 12 g de
polvo de poliamida con 0.3 g del indicador fluorescente, aadir agitando
continuamente, 60 mL de metanol. Colocar sobre las placas de forma
muy uniforme, con un espesor de 0.3 mm. Secar a temperatura
ambiente.
Preferible a la preparacin indicada anteriormente, se recomienda el
empleo de cromatoplacas de plstico de la firma Merck, de 20 x 20 cm,
que incorporan la poliamida y el indicador, estando ya dispuestas para
la colocacin de las muestras.
1. Se colocan en un tubo de decantacin de unos 200 mL, 50 mL
de la muestra de vino.
2. Se acidifica con cido sulfrico al 20%, y se extrae por tres
veces con ter, empleando cada vez 20 mL.
3. Reunir las soluciones etreas en otro embudo de decantacin
y lavar con unos 10 mLde agua destilada.
4. Secar el extractoetreo con sulfato sdico anhidro.
5. Evaporar el ter a sequedad, a baja temperatura. Si la eva-
poracin se efecta en bao mara, conviene ayudar con una
corriente de aire hasta casi un residuo de unos 3 mL, y ter-
minar luego, la evaporacin en fro.
6. El residuo se disuelve con 1 mLde etanol.
7. Se colocan en las placas, de 3 a 5 microlitros de esta solucin.
8. Las placas se colocan en la cubeta cromatogrfica, saturada
de vapores del disolvente, tapar y dejar ascender el disolvente
hasta una altura de 15 cm. Aproximadamente se necesitan
unas dos horas, dependiente de la temperatura ambiente.
9. Se retira la placa y se deja secar. De inmediato se observa a la
radiacin ultravioleta, en la longitud de onda de 254 nm.
3.24 3.25
10. El cido srbico presenta una mancha oscura sobre fondo
verde-amarillo, fluorescente. Esta tcnica permite la detec-
cin de 5 miligramos de cido srbico por litro de muestra.
Es una tcnica gas cromatogrfica, que presenta la ventaja de la
rapidez, automatizacin e incluso, la inyeccin directa del vino. Se
efecta una determinacin cuantitativa, en comparacin con un patrn
interno.
Es necesario disponer de un cromatgrafo de gases con detector F. I.
D., conjuntamente con registrador integrador. Las columnas sern de
acero inoxidable, de 4 metros de longitud y 1/8 de pulgada de dimetro.
El relleno se prepara con succinato de dietilenglicol (DEGS) 5% ms 1
% de cido fosfrico, sobre Gaschrom Q de 80-100 mallas. Tambin
puede sustituirse este relleno por otro con la siguiente fase
estacionaria: 1 % adipato de dietilenglicol ms 1 % de cido fosfrico
sobre el mismo soporte. Purgar la columna a 200 C, durante una
noche.
1. Se emplear un patrn interno, con objeto de obtener mayor
precisin en las determinaciones. Este patrn interno es el
cido undecanoico, cuyo tiempo de retencin es vecino al del
cido srbico. Se prepara dicho patrn con 1 gramo, disuelto
en un litro de alcohol de 96%.
2. En un tubo de ensayo de un volumen aproximado de 40 mL, se
colocan 20.00 mL de vino, 2 mL de la solucin de patrn
interno y 1 mLde cido sulfrico al tercio. Se agita.
METODOBERTRANDYSARRE
4
Principio del mtodo
Aparatos
Tcnica operativa
4. A. Bertrand y C. Sarre, Connaiss. Vigne Vin, 9, pginas 267-272, (1975).
system
tel. +34 938 171 842 fax. +34 938 171 436
3.26 3.27
3. Se aaden 10 mL de ter etlico. La extraccin se efecta por
agitacin del tubo, durante 5 minutos. Se deja en reposo para
que se separen las dos fases liquidas.
4. De la fase superior, etrea, se toman 2 microlitros para in-
yectar en el cromatgrafo.
5. Los parmetros de trabajo del cromatgrafo, son los siguien-
tes: temperatura de la columna, isotrmica, 175 C; inyector y
detector, 200 C, flujo de nitrgeno 30 mLpor minuto.
6. Para poder efectuar el anlisis cuantitativo, es necesario pre-
parar un patrn de referencia. Para ello se emplea un vino
totalmente exento de cido srbico, al que se aaden 100
miligramos de cido srbico puro (134 mg de sorbato pot-
sico), a un litro.
7. Este patrn se trata como se ha indicado anteriormente para la
muestra de vino y, el rea del pico, ser la que servir de
comparacin con las muestras analizadas.
Vienen dados por el integrador, una vez efectuado el anlisis cro-
matogrfico. El tiempo total empleado en el anlisis, es de unos 20
minutos
Anlisis espectrofotomtrico en el ultravioleta.
concentrado.
Clculos
Principio del mtodo
Reactivos
METODORAPIDO
5
ACIDO FOSFORICO
ISOOCTANO.
5. R. Viader Guix, Viader Anlisis, 08770 Sant Sadurn d'Anoia (Barcelona).
Tcnica operativa
Observaciones
1. En un tubo de ensayo se colocan 0.100 mLde vino y 0.050 mL
de cido fosfrico concentrado. Agitar bien.
2. Se aaden 4 mL de isooctano y se agita bien durante un
minuto.
3. Dejar en reposo durante 10 minutos, para que se separen las
capas.
4. La capa de isooctano es la que se coloca en la cubeta de
cuarzo de 10 mm de paso de luz, y leer la absorbancia en el
espectrofotmetro a 254 nm.
5. Efectuar un anlisis en blanco y con dos patrones de 10 mg/L
de cido srbico.
Si el vino supera los 100 mg/L, es necesario diluirlo a la mitad con
agua destilada, antes de efectuar el anlisis.
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3.28 3.29
Saliclico
METODO BERTRAND Y SARRE
6
Principio del mtodo
Reactivos
Aparato y columna
Las condiciones de extraccin son las mismas que las del cido
srbico. Estos cidos son extrados por el ter etlico, despus de la
acidificacin del vino. El extracto etreo, es el que se emplea en la
cromatografa.
preparada con 500 miligra-
mos de cido olico puro, disueltos en una mezcla hidroal-
cohlica al 60%, hasta el volumen de un litro.
al 1/3 en volumen, con agua.
El cromatgrafo, equipado con detector de ionizacin de llama. Co-
lumna con tubo de acero inoxidable de 1/8 de pulgada y 1 metro de
longitud. La fase estacionaria se compone de una mezcla de succi-
SOLUCION PATRON INTERNO,
ACIDO SULFURICO ETER
ETILICO.
6. A. Bertrand y C. Sarre, Cannaiss. Vigne Vin, 11, pginas 345-350, (1977).
nato de dietilenglicol (DEGS) y cido fosfrico, en la proporcin de
5% y 1 % respectivamente, sobre soporte de Gaschrom Q de 80/100
mallas.
1. En un tubo de ensayo, con tapn esmerilado, se introducen
20.00 mLde vino objeto de anlisis, 2.00 mLde patrn interno
y 1 mLde cido sulfrico diluido. Se mezcla bien.
Se aaden 10 mL de ter. Se agita durante 5 minutos.
3. La fase etrea se separa y se evapora hasta reduccin del
volumen a 0.5 mL. De este lquido se toma 1 microlitro, para
inyectar en el cromatgrafo.
4. La temperatura de la columna debe estar a 170 C, en pro-
gramacin isotrmica.
5. El inyector y detector deben estar a 300 C.
6. El gas portador, nitrgeno con un flujo de 44 mLpor minuto.
La concentracin ( ) en la muestra problema, viene dada por la
siguiente frmula:
donde =superficie del pico del patrn interno en el anlisis de
referencia.
=superficie del pico del patrn interno en la muestra del
vino.
=superficie del pico de cido saliclico en la muestra de
vino.
superficie del pico de cido saliclico en el anlisis de
referencia.
Las superficies de los picos vienen calculadas por el integrador del
registrador.
Tcnica operativa
Clculos
2.
C
SI
si
sh
SH=
C = 60 x
SI x sh
si x SH
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3.30 3.31
METODO DE LAA. O. A. C.
7
Principio del mtodo
Reactivos
Tcnica operativa
Se fundamenta en la reaccin coloreada, que tiene lugar entre el
cido saliclico y el cloruro frrico. La coloracin es sensible y muy
visible por el intenso color rojo-violeta.
con agua destilada.
eutralizada.
1. Se toman 200 mL de vino y se alcalinizan al tornasol, con
solucin de hidrxido sdico al 10%.
2. En un bao maria de agua hirviente, se evaporan a un tercio
de su volumen inicial. Se diluye de nuevo a su volumen
original con agua destilada y se filtra si es necesario.
3. Se colocan en un embudo de decantacin, 50 mL de la so-
lucin anterior, se aaden 5 mLde cido clorhdrico diluido, 50
mLde ter etlico y se mezcla bien.
4. La capa acuosa se decanta, se lava con dos porciones de 5
mLcada una de agua destilada y se evapora a sequedad. Este
residuo se destina a la prueba colorimtrica.
5. Si interfieren materias colorantes u otras sustancias, se pu-
rifica de la forma siguiente: Se disuelve el residuo obtenido en
el nmero 4), con 25 mL de ter etlico, se pasa a un embudo
de decantacin y se aaden 25 mL de agua destilada, que
previamente se habr hecho alcalina, con algunas gotas de
hidrxido amnico diluido (1 + 9 de agua). Se deja en reposo.
Se decanta el agua, se filtra sobre papel hmedo y se evapora
a sequedad.
ACIDO CLORHIDRICO al 1/3 v/v,
ETER ETILICO.
ETER DE PETROLEO.
SOLUCION DE CLORURO FERRICO al 0.5%,
n
7. A.O.A.C., 14 edicin, nmero 20.110, (1984).
6. Al residuo seco, se le aade una gota de solucin de cloruro
frrico. Un color violeta, indica la presencia de cido
saliclico.
se colocan 10 gra-
mos de nitrito potsico, en un matraz de 100 mLy se completa
con agua destilada hasta el volumen.
disuelto con igual volumen de agua
destilada.
pesa 1 gra-
mo de sulfato cprico pentahidrato, reactivo para anlisis y
se coloca en un matraz de 100 mL, se disuelve con agua
destilada y se completa a volumen.
1. Al residuo seco obtenido en el anlisis anterior (AOAC, ope-
racin 6), se le aade un poco de agua destilada caliente y se
deja enfriar.
2. Se toman 10 mL de la solucin anterior, pasndolos a un tubo
de ensayo.
3. Se adicionan 4-5 gotas de la solucin de nitrito, 4-5 gotas de la
solucin de cido actico y 1 gota de solucin de sulfato de
cobre.
4. Mezclar bien y se hierve durante 30 segundos, se deja en
reposo 2 minutos.
5. En presencia de cido saliclico, aparece un intenso color rojo.
TEST DE JORRINSEN
8
Reactivos
Tcnica operativa
SOLUCION NITRITO POTASICO al 10%,
ACIDO ACETICO,
SOLUCION DE SULFATO DE COBRE al 1 %, se
8. A.O.A.C., 14 edicin, nmero 20.112, (1984).
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3.32 3.33
Acido benzoico
COMENTARIOS
METODO JAULMES
Raramente se emplea este cido como antisptico, se utiliza casi
siempre la sal sdica, pues el cido es muy difcilmente soluble en
agua. Fue empleado en el vino, hace aos, y actualmente se halla
prohibido su uso en enologa. Algunos mostos se mantenan estriles
con la adicin de benzoato sdico, en dosis de un gramo por litro.
Cantidades superiores, alteran las condiciones organolpticas.
Se miden las absorbancias en la regin del ultravioleta y a partir de
ellas se deduce la concentracin en cido benzoico.
9
Principio del mtodo
9. P. Jaulmes y otros, Ann. Falsif. Fraudes, 54, 326, pgina 84, (1961)
Reactvos
Tcnica operativa
ETER ETILICO.
SOLUCION DE ACIDO SULFURICO al 1/3 v/v
HIDROXIDO SODICO 1 M.
SOLUCION DICROMATO POTASICO,
A 272 nm (B) y 276 nm
(C).
en agua.
disolviendo 34
gramos de este reactivo en agua destilada hasta un litro.
1. En un embudo de decantacin, se colocan 20 mL de vino y 25
mLde ter etlico, se agita.
2. La capa etrea se separa colocndola en un vaso.
3. De nuevo se aade al mismo vino, 25 mL de ter y se vuelve a
efectuar la extraccin de la misma forma anterior.
4. Se renen los extractos etreos y se tratan rpidamente con 5
mL de solucin de hidrxido sdico, por dos veces y al final
con 5 mLde agua destilada.
5. Estas soluciones acuosas alcalinas, se evaporan a bao ma-
rapara eliminar el ter.
6. Se pasa la solucin, una vez fra y cuantitativamente, a un
matraz de 100 mL con tapn, se aaden 20 mL de cido sul-
frico diluido y 20 mL de solucin de dicromato. Se tapa, agita
y deja en reposo durante una hora como mnimo.
7. En el caso de que la coloracin amarilla, provocada por la
adicin del dicromato, desapareciera, convendr una nueva
adicin de este producto.
8. Se aaden por dos veces, 20 mL de ter y se renen los l-
quidos etreos. Se lavan con agua destilada y se decantan.
9. Cuantitativamente y con la ayuda de ter, se pasan a travs de
un filtro a un matraz de 50 mL, se lava el filtro con un poco de
ter y se completa a volumen.
10. La solucin etrea, se coloca en el espectrofotmetro en cu-
beta de 20 mmde paso de luz y provista de tapa, comparando
las absorbancias con ter puro.
11. La medicin se efecta a 267 nm ( ),
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Clculos
Principio del mtodo
Reactivos
Se calcula la concentracin de acuerdo a la siguiente frmula:
este valor se compara con la grfica patrn, preparada con solucio-
nes que contienen 10, 15, 20, 25, 30 y 40 miligramos de cido ben-
zoico por litro y bajo las mismas condiciones. Con esta tcnica se
pueden determinar hasta 4 mg/L.
Extraccin por el ter, del cido benzoico presente en el vino. Tra-
tamiento del extracto por la mezcla nitro-sulfrica y formacin del cido
3,5-dinitrobenzoico, que es extrado con ter y despus recogido por la
mezcla acetona-alcohol. La adicin de hidrxido sdico, da origen a
una coloracin violeta. Esta reaccin es sensible, especfica y
cuantitativa, medible con espectrofotmetro a la longitud de onda de
570 nm.
volmenes a partes
iguales, alcohol absoluto y acetona.
aadir a 10 g de nitrato pot-
sico, 100 mL de cido sulfrico 96%.
10
ETER ETILICO.
MEZCLA ACETONA - ALCOHOL,
MEZCLA NITROSULFURICA,
10. B.O.E., de 26 de julio de 1977.
3.34
SOLUCIONDE HIDROXIDOSODICO-ALCOHOL,
Tcnica para vinos secos o dulces (<100 g/L)
aadir a 5
g de hidrxido sdico, 50 mL de agua destilada, despus de
fra la solucin, se aade alcohol etlico 96% hasta completar
el volumen de 100 mL.
1. En un embudo de decantacin, se colocan 10.00 mL de vino,
al que se aaden 2 mL de cido sulfrico al 25% y 25 mL
ter, dos veces seguidas. Agitar.
2. Decantar y filtrar el ter, por papel de filtro seco, colocar en un
matraz aforado de 50 mLy enrasar.
3. Poner 20.00 mLde la solucin etrea en erlenmeyer de 50 mL.
Evaporar aspirando los vapores mediante el vaco, per-
manenciendo el erlenmeyer sumergido en bao de agua fra.
4. Aadir al residuo, 5 mL de la mezcla nitrosulfrica, cuidando
de empapar bien todo el residuo.
5. Llevar despus al bao mara hirviente durante 35 minutos,
agitando de cuando en cuando.
6. Enfriar en agua fra, aadir 5 mL de agua destilada, seguir
enfriando y verter el contenido en una ampolla de decantacin
de 250 mL. Enjuagar el erlenmeyer con 5 mL de agua y volver
a verter el contenido en la ampolla y aadir 30 mLde ter.
7. Agitar cinco minutos.
8. Eliminar la fase acuosa, despus de cuidadosa decantacin, y
lavar el ter con 5 mLde agua.
9. Decantar con cuidado. Un lavado ms prolongado originara
prdidas de dinitrobenzoico en la fase acuosa, por lo que es
preferible decantar bien, que volver a lavar.
10. Filtrar el ter por filtro revestido con sulfato sdico anhidro,
lavar el filtro enseguida con 10 mLde ter.
11. Evaporar el filtrado en una pequea cpsula a 35 C, arrastrar
con tres adiciones de 5 mL de acetona-alcohol, cada vez
(previamente enfriado en la nevera). Recoger todos estos l-
Tcnica operativa
de
3.35
d = B -
A + C
2
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quidos en un tubo de ensayo de tapn esmerilado y aforado
a 20C.
12. En un tubo de ensayo de tapn esmerilado y con trazo de aforo
de 15 mL, poner de 0.5 a 5.0 mL de la anterior mezcla. Este
volumen debe variar con la riqueza supuesta para obtener la
reaccin coloreada con el cido dinitrobenzoico originado por
0.1 a 0.5 mg de cido benzoico.
13. El mtodo es vlido entre 0.03 y 1 mg, si se utiliza aparato
capaz de medir absorbancias superiores a 1.5.
14. Diluir el volumen de lquido puesto en el tubo, con la mezcla
acetona-alcohol fra, hasta 14.7 mL y aadir despus 0.3 mL
de sosa al 5%, agitar y sumergir en hielo fundente.
15. La determinacin, en cubeta de 10 mm de paso de luz a la
longitud de onda de 570-580 nm. Despus de 30 minutos y
antes de 60 minutos a partir del momento de la mezcla.
16. Utilizar como solucin compensadora para comparacin una
mezcla de 14.5 mL de acetona-alcohol con 0.3 mL de sosa al
5%.
17. Para obtener la curva patrn, preparar una solucin valora-
da de 50 mg de cido benzoico puro en 100 mL de ter.
18. Diluir esta solucin a 1/10 con ter y tratar 10 mL de esta
solucin de 50 mg/L, como se ha indicado antes para la
muestra.
19. La densidad ptica vara linealmente con la cantidad de ci-
do benzoico.
Llevar la absorbancia obtenida a la curva patrn y expresar el co-
rrespondiente contenido de cido benzoico en mg/L.
Clculos
Varios cidos
COMENTARIOS
METODO GAS CROMATOGRAFICO
Se presenta una tcnica por cromatografa de gas, que simult-
neamente pueden identificarse los siguientes cidos a la vez: MO-
NOCLORACETICO, BENZOICO, SALICILICO, p-HIDROXI y p-
CLOROBENZOICOS. Tcnica muy interesante para el anlisis de an-
tifermentos en vinos, por la simultaneidad en determinar estos com-
puestos antispticos.
Extraccin de los cidos, mediante el empleo del ter etlico, previa
la acidificacin de la muestra de vino. El extracto etreo, despus de
deshidratado, es utilizado para el anlisis.
11
Principio del mtodo
11. D. Revuelta, G. Revuelta y F. Armisen, An. Quim., 71, pginas 179-182, (1975).
3.36 3.37
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Reactivos
Aparato columnas
Tcnica operativa
ETER ETILICO.
SULFATO SODICO ANHIDRO.
ACIDO SULFURICO,
ACIDO CLORHIDRICO
METANOL.
CLOROFORMO.
y
en solucin acuosa al 10% en
volumen.
concentrado.
Cromatgrafo de gas, con detector de ionizacin de llama. Columna
en tubo de acero inoxidable de 1/8 de pulgada y 1 metro de longitud. La
fase estacionaria, es silicona SE-30 al 1 %, sobre Chromosorb W-AW,
de 80-100 mallas.
Temperatura isoterma del horno a 155 C. Gas portador, nitrge-
no, con un flujo de 40 mL por minuto.
1. En un embudo de decantacin de 500 mL, se vierten 10 mLde
vino, 100 mL de ter etlico y 20 mL de cido sulfrico diluido.
Se agita durante 5 minutos y se deja despus, en reposo, para
que se separen las dos fases lquidas.
2. Se elimina la capa acuosa, y la fase etrea se deseca con
sulfato sdico anhidro.
3. Se inyectan en el cromatgrafo, 2 microlitros de la solucin
anterior, para efectuar las determinaciones del cido mono-
cloractico y el ester etlico del cido p-hidroxibenzoico.
4. El resto del extracto etreo, se evapora hasta sequedad. Al
residuo seco se le aaden 10 mLde metanol y 0.5 mLde cido
clorhdrico.
5. Se coloca la mezcla en un matraz para reflujo y se mantienen
durante 4 horas a suave ebullicin (unos 60 C). Se deja
enfriar.
6. Al lquido anterior, colocado en un embudo de decantacin, se
extraen los esteres metlicos, con cloroformo.
5. De la capa clorofrmica, se toman 2 microlitros y se inyectan
en el cromatgrafo, para determinar los cidos: saliclico, ben-
zoico, p-clorobenzoico y p-hidroxibenzoico.
6. Para la identificacin, se prepara una solucin con los cidos
citados, para poder determinar los tiempos de retencin de
cada uno de ellos y poderlos identificar en el cromatograma de
la muestra objeto del anlisis.
Observaciones
Podra efectuarse un anlisis cuantitativo, pero en este caso deber
operarse con volmenes medidos, durante las extracciones. Fun-
damentalmente este anlisis es cualitativo, pero a la vista de la su-
perficie de los picos, puede darnos una idea de cual es el componente
ms destacable, para luego aplicar una metdica especfica para el
anlisis.
3.38 3.39
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Cloropicrina
COMENTARIOS
METODO POR CROMATOGRAFIA DE GAS
La cloropicrina (tricloronitrometano), se emplea en la desinfeccin
de suelo, cereales y como desinfectante en envases de gran volumen.
Por su efecto antisptico, ha sido utilizada, fraudulentamente, en vinos
de baja calidad. La cloropicrina aadida al vino, se degrada con el
tiempo en los siguientes compuestos: mono y dicloronitrometano.
Pequeas cantidades de estos degradados, as como el producto
original, son fcilmente detectables por cromatografa de gas, con la
ayuda del detector de captura electrnica.
Extraccin del tricloronitrometano y sus compuestos de degradacin
di y monocloronitrometano, con ciclohexano, en el vino. Determinacin
por cromatografa de gas, con detector especfico de cap
12
Principio del mtodo
12. INCAVI, Diari Oficial Generalitat de Catalunya, n 277, pgina 2.675, (1982).
tura de electrones. La presencia de los picos de los dos metabolitos,
en los vinos analizados, indican la adicin de cloropicrina.
Cromatgrafo de gases, equipado con detector de captura de elec-
trones con Ni o bien H . Integrador, para registrar y valorar los tiempos
de retencin y superficie de los picos. Columna en acero inoxidable, de
2 metros de longitud y 118 de pulgada de dimetro exterior. Relleno con
DEGS al 10%, sobre un soporte de Chromosorb W-AW-HMDS, de
80/100 mallas.
Fluka Ref. 91320.
1. Las condiciones de trabajo del cromatgrafo, son las siguien-
tes: gas portador, nitrgeno a 35 mLpor minuto. Temperaturas
del inyector y detector 200 Cen cada uno. Temperatura de la
columna 80 C.
2. En un embudo de decantacin de 250 mL, se extraen 50 mLde
vino, con 50 mL de ciclohexano. Se deja en reposo para que
se separen las dos fases lquidas. Pueden emplearse vo-
lmenes menores, pero siempre manteniendo la relacin 1/1
entre el vino y el disolvente.
3. La fase orgnica, se deseca con sulfato sdico anhidro y se
inyecta en el cromatgrafo un volumen comprendido entre 1 y
5 microlitros, de acuerdo a la sensibilidad del aparato.
4. Para la preparacin de la solucin de referencia, se emplea un
vino que no contenga ningn producto interferente. La mejor
comprobacin, es efectuar una extraccin e inyectar en el
cromatgrafo. No debe aparecer ningn pico, aparte el del
disolvente.
5. El ciclohexano tambin es indispensable comprobarlo, de la
misma forma que en el procedimiento anterior, para asegu-
rarse que no contenga algn pico coincidente con los que se
van a determinar.
Aparatos y columnas
Reactivos
Tcnica operativa
63 3
CICLOHEXANO.
CLOROPICRINA PURA,
3.40 3.41
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6. Con el vino comprobado, se prepara un patrn con 4 ppm
de cloropicrina pura.
7. El patrn, recin preparado y analizado, presenta solamente
el pico del tricloronitrometano. Con el tiempo, unos seis
meses, se hidroliza la cloropicrina en sus metabolitos. Al cabo
de este tiempo podrn fijarse los tiempos de retencin de los
compuestos de degradacin.
a) Para evitar posible contaminacin de las muestras, por causa de
deficiencia en la limpieza del embudo de decantacin, se aconseja
operar de la siguiente forma:
Emplear tubos de ensayo de vidrio, nuevos para cada anlisis. El
tubo de ensayo puede ser de dimensiones 16 x 160 mm. Se colocan en
el mismo partes iguales de vino y ciclohexano, se agita enrgicamente
durante 2 minutos y luego se centrifugan, para separar las dos fases.
Parte de la fase orgnica se vierte a otro tubo que contiene una
pequea cantidad de sulfato sdico anhidro, en polvo, se agita y se
toma 1 microlitro para inyectar en el cromatgrafo.
b) Se recomienda sustituir el nitrgeno, como gas portador, por la
mezcla de argn con 10% de metano, ya que este gas es ms idneo
para el detector de captura electrnica.
Observaciones
Ferrocianuro y cianuro
COMENTARIOS
METODO DE LA CEE
En los vinos naturales, se hallan cantidades muy insignificantes, del
orden del microgramo, de cianuro. Niveles ms altos de este com-
ponente, proceden, con toda seguridad, del tratamiento excesivo de los
vinos con exacianoferrato (II) potsico, para la eliminacin del hierro,
cobre y/o protenas. Modernamente se hace casi innecesario este
tratamiento, debido al perfeccionamiento en las tecnologas em-
pleadas en las bodegas. De todas formas, en agricultura, se emplean
fungicidas coloreados fuertemente con azul de Prusia y pueden, ac-
cidentalmente, contaminar los vinos.
Se necesitan tcnicas sensibles y rpidas, para detectar el cianuro
en los vinos.
Control de los vinos tratados por el exacianoferrato (II) potsico.
Verificacin de la ausencia de precipitado de exacianoferrato (Il) f
Principio del mtodo
3.42 3.43
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rrico, en suspensin o formando un depsito. Comprobacin de la
ausencia de exacianoferrato (II) frrico por adicin de una sal frrica, al
vino acidulado. Comprobacin de la presencia de hierro, precipitndolo
por una mezcla de exacianoferrato (II) y exacianoferrato (III) alcalinos,
aadidos al vino acidulado.
1. Antes de tomar la muestra del vino, se proceder a una agi-
tacin del envase que lo contiene, para mezclar el sedimento
que pudiera existir.
2. Se toman 20 mLdel vino y se colocan en un tubo de centrfuga,
cnico, de 30 mL de capacidad. Se centrifuga durante 15
minutos a 3500 rpm.
3. Al observar el fondo del tubo en donde se halla la muestra,
debe hallarse exento de partculas azules.
Investigacin
1. En un tubo cnico de centrfuga de 30 mL, se vierten 20 mLde
vino lmpido, 1 mL de cido clorhdrico al 50% y una gota de
solucin de sulfato frrico-amnico. Se agita y se deja en
reposo, como mnimo, 24 horas.
2. Centrifugar durante 15 minutos a 3500 rpm.
3. El fondo del tubo debe estar exento de partculas azules de
Reactivos
Tcnica operativa
ACIDO CLORHIDRICO al 50%
SOLUCION DE SULFATO FERRICO-AMONICO al 15%
SOLUCIONDEEXACIANOFERRATO(II) POTASICOal 10%.
SOLUCIONDEEXACIANOFERRATO(III) POTASICOal 10 %.
en volumen, exento de hierro.
Se obtiene fcilmente la ausencia de hierro, mezclando el cido
con una cantidad igual de agua destilada. Esta mezcla se
destila y el lquido obtenido est exento de hierro.
en
agua destilada.
Investigacin de trazas de exacianoferrato (II) frrico en suspensin
de trazas de iones ferrociangenos en solucin
exacianoferrato (Il) frrico.
Comprobacin de la presencia de iones hierro en el vino
Anlisis del cianhdrico total
1. En un tubo de ensayo, se colocan 20 mLde vino, 1 mLde cido
clorhdrico al 50%, 1 gota de solucin de exacianoferrato (II)
potsico y una gota de solucin de exacianoferrato (III)
potsico. Agitar.
2. Una coloracin o un precipitado de color azul, debe aparecer
antes de 30 minutos.
3. Filtrar el lquido sobre el papel de filtro sin pliegues y lavando el
filtro 2 veces con 5 mLde agua destilada, no se debe observar
ningn color azul sobre el filtro.
Se pueden reemplazar y, con ventaja, la centrifugacin por la fil-
tracin sobre papel de filtro exento de hierro, o mejor todava, en un
filtro de membrana de 0.45 micras de porosidad.
Dosado argentimtrico del cido cianhdrico total, liberado por hi-
drlisis cida y posterior destilacin. Determinacin del cido cian-
hdrico libre, destilado al vaco y arrastre por una corriente de aire a la
temperatura ambiente. Los derivados cianurados se expresarn en
miligramos de cido cianhdrico por litro y determinados con una
sensibilidad de 0.1 mg.
Un matraz de fondo esfrico de unos 500 mL, se coloca, con el cuello
inclinado, sobre una placa de hierro de 20 x 20 cm, con un orificio
central de 50 mmde dimetro. El baln se une a un refrige-
Observaciones
Principio del mtodo
Aparato
METODOS USUALES CEE
3.44 3.45
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rante de West de 350 mm de longitud. La extremidad inferior de este
refrigerante, en posicin vertical, termina en un tubo de vidrio afinado,
que conduce el destilado al fondo de un matraz receptor de 50 mL.
Estematraz se halla sumergido en una mezcla de hielo y agua.
Mezclar 200 mLde cido con-
centrado en una cantidad de agua, suficiente para obtener un
volumen de un litro.
cristalizado.
Se pesan 0.05 gramos de ro-
jo fenol y se disuelven en 1.4 mL de una solucin 0.1 M de
hidrxido sdico. Se completa a volumen de un litro con agua
destilada.
Disolver 250 gramos
de ioduro potsico, reactivo anlisis, en agua destilada hasta
obtener un litro.
Se toman 10
mLde solucin de nitrato de plata 0.1 My se diluyen con agua
hasta un litro, previa adicin de 0.5 mL de cido ntrico
concentrado.
puro y exento
de hierro.
1. En el matraz de fondo esfrico del aparato, se introducen
100.00 mL de vino filtrado (o sin filtrar, si se desea determinar
tambin el cido cianhdrico contenido en el eventual
enturbiamiento azul), aadir 0.005 gramos, aproximadamen-
te, de cloruro cprico y 10 mLde cido sulfrico diluido.
2. En el matraz receptor, se vierten 5 mL de solucin 1 M de
hidrxido sdico, exenta de hierro.
3. Se destila hasta obtener 50 mL.
4. El destilado se vierte en un vaso de 400 mLsituado en un bao
mara hirviente. Este bao mara debe estar calentado
elctricamente, ya que si se emplea gas para calentar, ste
Reactivos
Tcnica operativa
ACIDOSULFURICODILUIDO.
CLORURO CPRICO
SOLUCIONDE ROJOFENOL.
SOLUCION DE IODURO POTASICO.
SOLUCION 0.001 M DE NITRATO DE PLATA.
SOLUCION DE HIDROXIDO SODICO 1 M,
puede contener cianhdrico. Tampoco se debe fumar cuando
se efecta este anlisis, pues el humo del tabaco tambin
contiene cianhdrico. Para acelerar la evaporacin, se puede
dirigir una corriente de aire fro, sobre la superficie.
5. Se reduce el volumen por evaporacin hasta unos 5-7 mL, lo
que tiene lugar en unos 30 minutos (no se debe reducir el
volumen a menos de 5 mL).
6. La solucin, una vez fra, se filtra sobre un pequeo filtro,
recogiendo el filtrado en un tubo de 20 x 180 mm. Se lava bien
el filtro y el vaso, con algunos mililitros de agua.
7. El tubo de vidrio se coloca sobre un fondo negro y se ilumina
lateralmente, con luz blanca. El lquido debe estar per-
fectamente lmpido.
8. Aadir dos gotas de solucin de rojo fenol, para apreciar mejor
la turbidez. Algunas personas observan mejor la aparicin del
enturbiamiento, en una solucin rosa que en una incolora.
9. Luego se aade una gota de solucin de ioduro potsico.
Valorar con la solucin de nitrato de plata, hasta aparicin de
un ligero enturbiamiento estable. Sea el volumen de
solucin necesaria para obtener este resultado.
10. Por otro lado, se prepara un tubo parecido al anterior, con 5 mL
de solucin 1 Mde hidrxido sdico, dos gotas de solucin de
rojo fenol, una gota de solucin de ioduro potsico y una
cantidad de agua destilada suficiente para obtener un
volumen idntico a la del ensayo con vino.
11. Aadir solucin de nitrato de plata 0.001 M, en cantidad su-
ficiente para obtener el mismo enturbiamiento. Sea n' el vo-
lumen gastado.
Tngase en cuenta que un mililitro de solucin de nitrato de plata
0.001 M, se corresponde a 54 microgramos de cido cianhdrico. La
cantidad de cido cianhdrico total, contenida en el vino y expresada en
miligramos por litro, se halla por la frmula:
n
C = 0.54 (n - n')
Clculos
3.46 3.47
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Solamente se tendr en cuenta una cifra decimal, despus de la
coma.
Se considerarn significativos, los ensayos cuya diferencia antes
indicada, sea superior a 0.5 mL.
Cuando la diferencia es superior a 10 mL, investigar y determinar el
cido cianhdrico libre, por la metdica que se indica en el siguiente
anlisis.
Si la diferencia superior a 10 mL, comenzar de nuevo el
anlisis y emplear una solucin de nitrato de plata 0.01 M.
El aparato est formado por dos matraces de un litro, provistos
de un tubo recto de 30 mm de dimetro y de 300 mm de longitud, con
unin esmerilada que permita la separacin. Uno de los matraces ,
est provisto de un grifo que puede unirse a una bomba de vaco o
tambin adaptar un pequeo embudo a travs de un racor de plstico.
El tubo recto, reposa sobre un mecanismo, que permite girar sobre su
eje a una velocidad moderada.
1. En el matraz se introducen 5 mL de solucin de hidrxido
sdico. En el matraz , 5 mLde agua destilada. Dejar girar los
dos matraces y efectuar el vaco. Mientras, se calienta
ligeramente para vaporizar un poco de agua, con objeto de
eliminar el aire de su interior.
2. Se cierra el grifo y se elimina la unin con la bomba de vaco.
Se coloca el matraz en agua fray luego en agua con hielo.
3. Se introducen, con precaucin, 100 mL de vino en el matraz
, evitando todo lo posible la entrada de aire.
4. Colocar ahora el matraz en un recipiente con agua tibia. El
vino entra en ebullicin. Se activa la destilacin haciendo girar
el matraz alrededor de su eje.
n - n' es
Anlisis del cianhdrico libre
Ay B,
A
B,
A
B
A
A
Aparato
Tcnica operativa
5. Despus de haber destilado los dos tercios del matraz (lo
que se efecta en unos 20 minutos), invertir el aparato co-
locando el matraz en agua tibia y el en agua con hielo.
Redestilar en sentido inverso un tercio del contenido de
6. El matraz Acontiene el alcohol, aldehdos, esteres y los iones
ferrociangenos combinados con el residuo del vino.
7. Se efecta ahora la determinacin del cido cianhdrco libre,
en el contenido del matraz tal como se ha indicado en el
mtodo anterior.
A
B.
B,
B A
METODO ADDEO, NOTA Y CHIANESE
13
Principio del mtodo
Aparato y columnas
El procedimiento se basa en la transformacin del in en
por tratamiento de la muestra, con agua de bromo. Despus de eli-
minado el bromo en exceso, las soluciones de vino se extraen con
cloroformo y los extractos son analizados por cromatografa de gas.
Cantidades tan pequeas como un microgramo por litro, pueden de-
tectarse selectivamente en el detector de captura electrnica. La sen-
sibilidad y precisin del mtodo, puede compararse con la metdica
colorimtrica.
Cromatgrafo de gas provisto con detector de captura de electrones,
utilizando Ni . Columna de vidrio de un metro de longitud y 3 mm de
dimetro interior. Esta columna se llena con Porapak Q. Gas portador
nitrgeno, a un flujo de 50 mL/min. Las temperaturas del inyector y del
detector, son respectivamente 120 y 150 C. La columna se mantiene a
la temperatura de 112 C.
CN BrCN,
s3
13. F. Addeo, G. Nota y L. Chianese, Am. J. Enol. Vitic., 29. pgins 7-10, (1978).
3.48 3.49
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Reactivos
Tcnica operativa
Clculos
Observaciones
SOLUCION DE ACIDO FOSFORICO al 20 %
AGUA SATURADA DE BROMO.
SOLUCION DE FENOL al 5% p /v.
CLOROFORMO.
BrCN,
BrCN
en peso.
1. Se vierten 10.00 mL de vino, en un tubo de centrfuga con
tapn esmerilado, de unos 30 mL y se aaden 5 mL cido
fosfrico y 2 mLde agua saturada de bromo. Agitar.
2. Transcurridos cinco minutos, se aaden 4 mL de fenol al 5%y
se agita manualmente. A continuacin se aade 1 mL de
cloroformo, se agita durante 1 minuto y luego se centrifuga
durante cinco minutos a 1500 rpm.
3. De la capa orgnica de cloroformo, se toman 5 microlitros que
se inyectan en el cromatgrafo.
Para la determinacin cuantitativa del in ciangeno, se prepara una
solucin de referencia de cido cianhdrico. La relacin entre la
concentracin y la altura del pico, es lineal entre valores de 25 a 100
microgramos de canhdrico por litro de vino.
a) Con objeto de no sobrecargar el detector con el disolvente, se
prevee en el aparato una vlvula de dos vas a la salida de la columna.
Despus de haber registrado el pico de se desva el gas de
salida al aire.
b) El pico del se separa perfectamente del cloroformo em-
pleado como disolvente, que sale un minuto despus.
14
Principio del mtodo
Reactivos
Tcnica operativa
Utiliza el reactivo Aquaquant de Merck, que forma una reaccin
coloreada violeta en presencia de cianuros, con la piridina y el cido
N,N'-dimetilbarbitrico, No es necesario tratamiento alguno de la
muestra de vino.
Este test con-
tiene tres reactivos: CN-1, CN-2 y CN-3. Debe comprobarse
antes del anlisis, pues tiene caducidad.
concentrado.
1. En un pequeo matraz de destilacin, se colocan 10.00 mL
de vino.
2. Se adicionan 5 mL de agua destilada y 0.5 mL de cido fos-
frico concentrado.
4. Destilar durante 4 minutos.
5. Se retira el tubo de ensayo y se aade una cucharadita de
reactivo CN-2 y se agita hasta disolucin completa.
6. A continuacin se aaden 10 gotas del reactivo CN-3 y se
agita.
7. Se deja en reposo durante 10 minutos y se lee la absorbancia
en cubeta de 10 mm de paso de luz a la longitud de onda de
585 nm, ajustado frenteal agua.
8. Paralelamente se destila un patrn de 0.10 mg de cianuro, o
un vino exento del producto a determinar, al que se ha aadido
0.1 m/Lde cianuro.
AQUAQUAQNT MERCK cianuros, ref. 14417.
ACIDO FOSFORICO
3. Se destila a fuego muy lento (sin llegar a la ebullicin),
haciendo borbotear el gas desprendido en un tubo de
ensayo que contenga una cucharadita del reactivo CN-1
disuelto en 10 mL de agua
14. R. Viader Guix, Semana Vitivincola, nmero 1923, Junio, (1983).
3.50 3.51
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Observaciones
a) Si no se observa la ms mnima coloracin violeta en la muestra,
se le considera negativo y ya no es necesaria la lectura en el
espectrofotmetro.
b) Es conveniente efectuar la comprobacin del reactivo, dado que
con el tiempo pierde su actividad.
Betana
COMENTARIOS
METODO CENCI Y CREMONINI
Este componente se halla en el azcar obtenido de la remolacha.
Detectando la betana en el vino, puede predecirse la adicin de sa-
carosa al mosto, en el momento de la fermentacin. En las uvas puede
hallarse betana y se ha podido comprobar la presencia en niveles de 0
a 5 mg/Lde mosto.
Separacin de la betana con resinas de cambio inico y separa-
cin por cromatografa en capa fina.
15
Principio del mtodo
Reactivos
RESINA CATIONICA DOWEX-50 W
CROMATOPLACAS MERCK DE SILICAGEL H.
15. P. Cerzci y B. Cremonini, Riv. Vit. En. (Conegliano), 5, pgina 195, (1973).
3.52 3.53
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ETANOL
n-BUTANOL.
SOLUCION DE BROMOFENOL al 0.05%,
SOLUCION DE EOSINA AZULADA MERCK,
ACIDOCLORHIDRICO0.1 M.
, para cromatografa.
en agua destilada,
adicionada de amoniaco al 5%en v/v.
al 0.05% en
agua destilada.
1. Se decoloran 1000 mL de vino, con carbn activo. Con cido
clorhdrico se lleva a pH 3.0. Esta operacin debe controlarse
con un medidor de pH.
2. En una columna de vidrio, se colocan 100 mLde resina inica,
llevada a la forma cida mediante el paso de cido clorhdrico
2 My lavada hasta eliminacin de la acidez residual.
3. Se pasa el vino decolorado, por esta resina.
4. Lavar la columna con dos porciones de 300 mL de agua des-
tilada y elur la betana con 1000 mL de hidrxido amnico al
2% y lavar con 300 mL de agua. Reunir el eluado y el agua, y
concentrar por ebullicin hasta unos 100 mL.
5. Cromatografiar sobre la placa.
6. Para el revelado se emplea: a) el azul de bromofenol amo-
niacal o bien, b) con la eosina azulada. Segn esta ltima
tcnica, pulverizar la placa con la eosina, hasta obtener un
color rosa uniforme.
7. Secar en corriente de aire caliente o en estufa a 125-130 C
durante unos veinte minutos.
8. La placa una vez seca, se observa a la luz ultravioleta de
366 nm o mejor todava a 254 nm.
9. La betana aparece como una mancha de color amarillo-
crema, intensamente fluorescente.
Tcnica operativa
Observaciones
a) La resina puede ser regenerada, tratndola con cido clorhdri-
co 1 M.
b) La sensibilidad del mtodo, permite poner de manifiesto la adi-
cin de azcar tal, que pueda aumentar el grado alcohlico en un
uno por ciento.
3.54 3.55
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Antifermentos
METODO BIOLOGICO GAROGLIO STELLA
16
Principio del mtodo
Reactivos
Tcnica operativa
Extraer el antifermento del vino, y partir del producto extractado, para
comprobar una refermentacin. Es una tcnica rpida y fiable.
(vitamina B ) cristalizada.
1. En un embudo de decantacin de 250 mL, se extraen 100 mL
de vino con 50 mL de ter, repitiendo igual extraccin por
segunda vez.
2. Se renen los extractos y se evaporan a sequedad sobre un
bao mara.
ETER ETILICO.
SACA ROSA.
TIAMINA
LEVADURA DE CERVEZA.
1
16. P.G. Garoglio y C. Stella, Enc. Vitivincola Mondiale, 7, pgina (1973).
36
3. Se toma el residuo con un sustrato preparado con. solucin
levadura y una siembra de levadura de cerveza.
4. Se coloca en una estufa a 28-30 C, para que tenga lugar la
fermentacin.
Los autores comentan, que el vino no es un medio adecuado para el
anlisis biolgico, por una serie de circunstancias, entre las que cabe
destacar las siguientes:
a) En pases en que est autorizado el empleo de resinas de cam-
bio inico, el vino tratado por este sistema, puede quedar
esterilizado.
b) En el vino ya existen productos que son antispticos de por s:
alcoholes, cidos, taninos, colorantes, esteres y otros ms.
c) En una mezcla de antispticos, se refuerza el poder inhibidor de
una sustancia; si se elimina el antisptico natural y el antisptico
fraudulento, no se beneficia de la accin sinrgica y queda sin poderse
hallar.
d) Es imposible obtener un sustrato vino o mosto patrn. La
sensibilidad del mtodo biolgico clsico (Tarantola), es variable segn
la muestra analizada.
e) El pH del medio de cultivo preparado, antes de la adicin del
extracto, es de 5.5 a 6. Cuando se adiciona el residuo del vino, el pHse
sita en 4.0 aproximadamente. Aunque la concentracin de sacarosa
es baja, es muy eficaz para reconocer la presencia del antifermento.
f) La levadura de cerveza, se prefiere a otras levaduras, por la
facilidad de pesar. Se obtienen magnficos resultados.
g) Por todas estas circunstancias, se ha pensado en la necesidad de
separar el antifermento del vino o del mosto, mediante la extraccin y,
aadirlo a un sustrato standard, para comprobar la fermentabilidad del
mismo.
de
sacarosa al 1 % adicionada de vitamina B , extracto de
1
Observaciones
3.56 3.57
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Isotiocianato de alilo
COMENTARIOS
Este antifermento ha sido utilizado en aos atrs. Su nombre vulgar
es el de esencia de mostaza y su empleo se destin a evitar el
picado del vino. En la actualidad est totalmente prohibido su uso.
El isotiocianato de alilo, eventualmente presente en el vino, y re-
cuperado por destilacin, se identifica por una tcnica de cromatografa
de gases.
preparada con 15 miligramos de iso-
tiocianato puro, en un litro de alcohol.
formada por alcohol y nieve car-
bnica (temperatura -60 C).
Principio del mtodo
Reactivos
ETANOL.
SOLUCION PATRON,
MEZCLA REFRIGERANTE,
Aparatos
Tcnica operativa
Aparato de destilacin por corriente de nitrgeno, segn la figura
adjunta.
Calefactor termorregulable, flujmetro y cromatgrafo de gas con
detector de espectrofotometra de llama, con filtro selectivo de 394 n
m.
Columna de acero inoxidable, de 3 m de longitud y de 3 mm de
dimetro interior. Relleno: Carbowax 20 M al 10%, sobre Chromosorb
WHPde 80/100 mallas.
1. Colocar 2 litros de vino en el matraz de destilacin. Introducir
algunos mililitros de alcohol en los dos tubos de recuperacin,
hasta completa inmersin de la parte porosa, para la
dispersin gaseosa.
2. Enfriar exteriormente los dos tubos, con la mezcla
refrigerante.
3. Unir el matraz a los tubos receptores y comenzar la intro-
duccin de una corriente de gas nitrgeno, de aproximada-
mente 3 litros por hora.
3.58 3.59
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3.60 3.61
4. Calentar el vino a 80 C, regulando la calefaccin de forma
adecuada para que se mantenga constante la temperatura.
Recuperar un total de destilado de 45 a 50 mL.
5. Las condiciones de trabajo del cromatgrafo son: inyector a
200 C, columna a 130 C, gas portador, helio a 20 mL/min.
6. Inyectar una cantidad de solucin patrn, de forma que el pico
del isotiocianato de alilo, pueda ser fcilmente identificado en
el cromatograma.
7. De igual forma inyectar una parte alcuota del destilado y
comprobar el tiempo de retencin y la altura del pico obtenido
con el patrn.
8. En las condiciones indicadas de trabajo, no hay interferencia
de otros compuestos que puedan hallarse en el vino.
Extraccin del isotiocianato de alilo, con cicloexano, en el vino. De-
terminacin por cromatografa de gas, con detector especfico de cap-
tura de electrones. La presencia de dos picos, prximos a los degra-
dados de la cloropicrina, es caracterstico de este compuesto.
Cromatgrafo de gases, equipado con detector de captura de elec-
trones, con Ni o H . Integrador, para registrar los tiempos de retencin,
as como la superficie de los picos. Columna en acero inoxidable, de 2
mde longitud y 118 de pulgada de dimetro exterior. Relleno con DEGS
al 10%, sobre Chromosorb W-AW-HMDS, de 80/100 mallas.
METODO POR CROMATOGRAFIA DE GAS
17
Principio del mtodo
Aparato y columnas
63 3
17. INCAVI, Diari Oficial de la Generalitat de Catalunya, n ,277, pgina 2.6715, (1982).
0
Reactivos
Tcnica operativa
Observaciones
CICLOEXANO.
ISOTIOCIA NATO DE ALILO.
1. Condiciones de trabajo del cromatgrafo: Gas portador ni-
trgeno a 36 mL/min. Temperaturas del inyector y del detector,
200 Cen cada uno. Temperatura de la columna 80 C.
2. En un embudo de decantacin de 250 mL, se extraen 50
mL de vino, con 50 mL de cicloexano.
3. La fase orgnica se deseca con sulfato sdico anhidro.
4. Se inyecta en el cromatgrafo un volumen comprendido en-
tre 1 y 5 microlitros, de acuerdo a la sensibilidad del
aparato.
5. Solucin de referencia. Se utiliza un vino que no contenga
ningn producto interferente. La mejor comprobacin, es
efectuar una extraccin e inyectar en el cromatgrafo; no debe
aparecer pico alguno, aparte el del disolvente.
6. El disolvente tambin se comprobar, de la misma forma que
en 5), para verificar que no contenga algn pico coincidente
con los que se van a determinar.
7. Se prepara un vino patrn, con 4 ppm de isotiocianato de
alilo puro.
a) Para evitar posible contaminacin de las muestras, por efecto de
deficiencia en la limpieza del embudo de decantacin, se aconseja
operar de la siguiente forma:
Emplear tubos de ensayo nuevos para cada anlisis. El tubo de
ensayo puede ser de dimensiones 16 x 160 mm. Se colocan en el
mismo partes iguales de vino y cicloexano, se agita enrgicamente
durante 2 minutos y luego se centrifuga, para separar las dos fases.
Parte de la fase orgnica, se vierte a otro tubo de iguales dimensiones,
que contiene sulfato sdico anhidro, se agita, y se toma el volumen para
inyectar al cromatgrafo.
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3.62 3.63
b) Se recomienda, sustituir el nitrgeno, como gas portador, por la
mezcla de argn con 10% de metano, ya que este gas es ms idneo,
para el detector de captura de electrones. Cumarina
COMENTARIOS
METODO DYER Y MARTIN
Este compuesto ha sido empleado en pocas ocasiones, como aro-
matizante en algunos tipos de vino. Dado que existe una legislacin
limitando los niveles mximos de este producto, es por ello el inters de
disponer de metdicas analticas adecuadas.
solucin clorofrmica, es la que se emplea para el anlisis
cromatogrfico.
Se emplea un cromatgrafo con detector de ionizacin de llama y
registrador-integrador acoplado al mismo. La columna de vidrio de
18
Principio del mtodo
Aparato y columna
Se aprovecha la solubilidad de la cumarina , en cloroformo. La
19
18. R.H. Dar y G.E. Martin, J.
19. Nombre qumico 1,2-benzopirona.
Assoc. Off Anal. Chem., 59, pginas 780-782, (1976).
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3.64 3.65
2 mmde dimetro interior y 1.8 metros de longitud, se halla llena de una
fase estacionaria, compuesta por el 10%de SP-1000 (Carbowax 20M-
TPA), sobre Chromosorb W-AWde 100/120 mallas.
Se colocan en un ma-
traz aforado de 200 mL, 100 miligramos de cumarina
disuelven con etanol, completando despus el volumen.
1. En dos embudos de decantacin de 250 mL, se vierten 100 mL
de vino en cada uno de ellos.
2. Auno de los embudos, se adiciona 1 mL de la solucin patrn
de cumarina y 1 mLde etanol, al otro embudo.
3. Se dispone as de una muestra con adicin del componente a
analizar y otra sin ella.
4. Se mezcla bien y a continuacin se aaden 20 mL de cloro-
formo y se agita vigorosamente durante 2 minutos. Se deja en
reposo para que las dos capas se separen.
5. Se toman 10-12 mL de la capa clorofrmica y se vierten en un
tubo de centrfuga. Se somete a centrifugacin para obtener
una solucin lmpida.
6. Se inyectan 5 microlitros en el cromatgrafo.
7. Se repite la inyeccin por tres veces y se toma el promedio de
los tres anlisis.
8. Los parmetros de trabajo del cromatgrafo, son: Horno iso-
trmico a 180 C, inyector y detector a 200 C. Gas portador,
helio a un flujo de 30 mL por minuto. El tiempo de retencin de
la cumarina, en las condiciones indicadas de trabajo, es de
unos 15 minutos.
Reactivos
Tcnica operativa
SOLUCION PATRON DE CUMARINA.
y se
CLOROFORMO
20
20. De la firma Eastman Kodak nm. 9 o similar.
Clculos
Observaciones
La concentracin de cumarina, se calcula con el empleo de la si-
guiente frmula
en donde,
= altura del pico de la muestra sin adicin de cumarina.
= altura del pico de la muestra con adicin de cumarina.
Los valores de que se emplean en la frmula, son
cifras promedio de las tres inyecciones.
Si se emplea el integrador, en lugar de la altura, se anotarn las
reas integradas de los picos correspondientes.
U
S
U y S,
cumarina = 5 x
U
S - U
en mg/L
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3.66 3.67
Edulcorantes sintticos
COMENTARIOS
METODO CROMATOGRAFICO
EN CAPA FINA
Dentro de la gama de los edulcorantes artificiales, los ms utilizados
son: el ciclamato, la sacarina y la dulcina. En el vino, y las bebidas
derivadas del mismo, no est permitida la adicin de cualquier tipo de
edulcorante artificial. La presencia de cualquiera de los citados, es una
adicin fraudulenta, y por tanto, interesa disponer de tcnicas
analticas que puedan poner de manifiesto la presencia de los mismos.
Los edulcorantes se separan mediante el empleo del cambiador
inico lquido y posterior cromatografa en capa fina. La identificacin
se efecta por pulverizacin con 2,7-diclorofluorescena.
Para investigar la dulcina en presencia de vanillina y esteres del
21
Principio del mtodo
21. Comm. Anal. Vini, FV/316, (1969)
cido p-hidroxibenzoico, se pulveriza con una solucin de 4-
dimetilaminobenzaldehdo. La dulcina, forma un compuesto de color
anaranjado; la vanillina y los esteres del cido p-hidroxibenzoico no dan
ninguna reaccin coloreada.
zona ebullicin entre 40 y 60 C.
Amberlite La-2 u otro
semejante.
al 10 %.
al 0. 2 % p/v
en etanol.
gramo en un matraz de 100 mLcon 50 mL etanol, 10 mLde
cido ntrico al 25%y enrasar a volumen con etanol.
Dulcina 0.1% en metanol; Sacarina
0.1 %en mezcla de metanol/agua 1/1; Ciclamato 1 %en dem;
vanillina 1 % en dem; ester del cido p-hidroxibenzoico
metanol.
Agitar enr-
gicamente, 5 mL del cambiador lquido, con 95 mL de ter de
petrleo y 20 mL de cido actico diluido. Se emplea la fase
lquida superior.
45 mL, n-propanol 6 mL, cido ac-
tico 7 mLy cido frmico 2 mL.
Reactivos
TERDEPETROLEO,
CAMBIADOR DE IONES LIQUIDO.
ACETONA.
XILOL.
n-PROPANOL.
METANOL.
ACIDOACETICOGLACIAL.
SOLUCIONACUOSAACIDOACETICO(1+4)
ACIDONITRICO, 1 M.
ACIDOSULFURICO
ACIDOFORMICO.
SOLUCIONACUOSAAMONIACO(1 +3).
SOLUCION DE 2,7-DICLOROFLUORESCEINA
SOLUCION DE 4-DIMETILAMINOBENZALDEHIDO, 1
de
SOLUCIONES PATRON:
1 %
en
TRATAMIENTO DEL CAMBIADOR DE IONES.
MEZCLA LIQUIDA: Xilol
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3.68 3.69
Aparatos y material
Tcnica operativa
Recipiente para poder efectuar la cromatografa en capa fina. Cro-
matofolios Merck, de celulosa y poliamida. Jeringa Hamilton de 10
microlitros. Lmpara ultravioleta de 254 mmo bien 360 nm. Dispositivo
de pulverizacin.
1. Acidificar 50 mLde vino con 10 mLde cido sulfrico diluido, y
extraer por dos veces cada una, con 25 mL del cambiador
lquido.
2. Se renen las fracciones, se lavan tres veces, cada vez con 50
mLde agua destilada.
3. Se renen las fracciones amoniacales y se evaporan a se-
quedad, a 50 Csobre bao maria o en evaporador rotativo.
4. El residuo se toma con 5 mL de acetona y dos gotas de cido
ntrico 1 M. Se filtra y de nuevo se evapora a sequedad sobre
bao de agua a 70 C. Es importante evitar un exceso de
calentamiento.
5. El residuo se toma con 1 mL de metanol. De este lquido, se
colocan de 5 a 10 microlitros, en la placa cromatogrfica, as
como tambin 2 microlitros de solucin patrn.
6. Se cromatografa hasta una altura de 15 cm, operacin que
requiere prcticamente una hora.
7. Se seca la placa al aire y se pulveriza con la solucin de 2,7-
diclorofluorescena. La presencia de sacarina y ciclamato, se
observa de inmediato a la luz del da, bajo forma de manchas
claras, sobre un fondo de color salmn.
8. Ala luz ultravioleta, se observan las dos anteriores y la dulcina,
como manchas de color azul sobre fondo amarillo. Apartir de
la base, se observan primero el ciclamato, luego la sacarina y
finalmente la dulcina.
9. La vanillina y los esteres del cido p-hidroxibenzoico, pre-
sentan el mismo , que la dulcina. Para identificar la dulcina
en presencia de estos dos, se pulveriza la placa con la
solucin de 4-dimetilaminobenzaldehdo. A la luz del da, la
dulcina aparece de color anaranjado, mientras que la vaniIlina
y esteres del p-hidroxibenzoico, no dan mancha alguna.
Rf
Observaciones
Pueden ser detectadas cantidades del orden de: 50 mg/L para el
ciclamato, 10 mg/Lpara la sacarina e igual cantidad para la dulcina.
system
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3.70 3.71
-Asarona
COMENTARIOS
La -asarona es un agente aromtico utilizado como tal, en algunos
vinos y sobre todo en vermuts. En este ltimo caso se empleaban en
sustitucin del aceite de clamo. Las dosis alcanzaban, desde los 5 a
30 miligramos por litro. Segn los resultados de estudios toxicolgicos
efectuados, la FDA estadounidense, ha prohibido su empleo, en
cualquiera de sus formas.
La -asarona es arrastrada por vapor de agua, en la muestra de vino
y posteriormente sometido a extraccin del destilado, con exano. Se
efecta una determinacin fluorimtrica.
22
METODO WOJTOWICK
23
Principio del mtodo
22. cis-2,4,5-trimetoxi-1-propenilbenceno.
23. E.J. Wojtowics, J. Agric. Foad. Chem., 24 Pginas 526-528, (1976).
Reactivos
Tcnica operativa
Clculos
SOLUCION SATURADA DE CLORURO SODICO.
EXANO.
SOLUCION DE HIDROXIDO SODICO 1 M.
ACIDOCLORHIDRICO1 M.
1. En un matraz de 500 mL, se vierten 100 mLde vino o 50 mLde
vermut.
2. Se aaden 40 mL de agua destilada y 10 mL de solucin sa-
turada de cloruro sdico.
3. Se destila y se recogen 100 mL del destilado, pasndolos
despus a un embudo de decantacin de 250 mL y se extraen
con 50 mLde exano, durante 4 minutos.
4. Se separa la capa del disolvente y se lava primero con 20 mL
de solucin de hidrxido sdico, y se decanta la capa acuosa.
5. A continuacin se aaden 20 mL de cido clorhdrico y des-
pus de decantada la capa de cido, se aaden 20 mL de
agua destilada.
6. De esta solucin de exano, se toma la cantidad suficiente para
medir en una cubeta fluorimtrica de 10 mmde paso de luz.
7. Se determina la emisin a 350 nm, con excitacin de 310 nm.
8. Deber preparase una curva patrn con soluciones de refe-
rencia de , -asarona, entre 0 y 20 mg por litro.
Se comparan las lecturas de la muestra problema, con la curva stan-
dard. La sensibilidad alcanza 0.1 a 0.2 mg/mLde muestra.
system
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3.72 3.73
METODO A.O.A.C.
24
Principiodel mtodo
Aparatoy columna
Reactivos
Tcnica operativa
Se separa por destilacin la -asarona, y el destilado se extrae con
exano y se inyecta en el cromatgrafo. Se compara con una solucin de
referencia, preparada con -asarona pura.
Se prepara el cromatgrafo con detector de ionizacin de llama. La
columna en acero inoxidable de 1/8 de pulgada de dimetro exterior o
bien de vidrio con 2 mm de dimetro interior por 1.8 m de longitud. La
fase estacionaria formada por 10%de SP-1000 sobre Chromosorb W-
HP de 80/100 mallas. Gas portador helio a 40 mL por minuto. Los
tiempos de retencin del palmitato de etilo y la -asarona, son
aproximadamente 5 y 6 minutos, respectivamente.
solucin acuosa al 20%
preparada con 0.1 g de pal-
mitato de etilo, disuelto en 100 mLde exano.
preparada por disolucin de
-asarona en alcohol a razn de 1 mg/mL.
filtrada.
1. En un matraz de destilacin, se vierten 100 mLde vino y 50 mL
de agua destilada. Destilar hasta haber recogido un volumen
de 100 mL.
2. Este volumen se pasa a un embudo de decantacin, al que se
aaden 100 mL de solucin saturada de cloruro sdico. Se
mezcla bien.
3. A continuacin se aaden 10 mL de exano, agitando vigo-
rosamente durante 2 minutos. Se deja en reposo para que se
separen las dos capas.
25
ALCOHOLETILICO
SOLUCION PATRON INTERNO,
SOLUCIONDEREFERENCIA,
SOLUCIONSATURADADECLORUROSODICO,
24. AOAC, 15 edicin, nmero 977.09, (1990).
4. Se separa la fase acuosa, dejando cuantitativamente el exano
en el embudo.
5. Este volumen se vierte en tubo de centrfuga. Se debe re-
cuperar practicamente el volumen de 10 mL, 0.5mL.
6. Se inyectan en el cromatgrafo, 5 microlitros.
7. Con esta primera inyeccin, se comprueba si aparecen los
picos de -asarona y palmitato de etilo. Si no se aprecia pico
del primer compuesto, puede considerarse que no se alcanza
la concentracin de 0.5 mg/L, ya que este es el lmite analtico
que puede medirse en las condiciones de trabajo indicadas.
8. Si el pico observado tiene el mismo tiempo de retencin, que el
palmitato, emplese la altura del pico, para determinar la
concentracin de -asarona.
9. En el caso de que ste producto est presente dentro de los
lmites de la curva patrn y no existe palmitato de etilo, se
aaden 200 microlitros de la solucin de patrn interno, mez-
clar bien y cromatografiar de nuevo.
10. Se utiliza la relacin de alturas de picos para determinarla -
asarona, de acuerdo a la curva de la solucin de referencia. Si
el pico de la -asarona sale del lmite de la escala, se diluye la
mezcla con exano, de forma que la concentracin oscile entre
1 y 5 mg por litro.
Se preparan las soluciones de referencia que contengan 1, 2, 3, 4 y 5
miligramos de -asarona por litro. A cinco matraces aforados de 100
mL, que contengan aproximadamente 90 mL de alcohol diluido, se les
aaden: 100, 200, 300, 400 y 500 microlitros de la solucin de
referencia de -asarona, se mezclan y se completan a volumen, con
alcohol diluido.
Cada una de estas soluciones patrn, se someten a destilacin y
extraccin, como la muestra problema. Al exano contenido en el tubo
de centrfuga, se aaden 200 microlitros de la solucin de patrn
interno de palmitato de etilo, se mezcla bien y se inyectan 5 microlitros
en el cromatgrafo. La relacin de picos de cada cromatograma de las
soluciones de referencia, son las que se emplearn para comparar con
el problema.
Clculos
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3.74 3.75
Estireno
COMENTARIOS
METODO BRUN Y GIFFONE
La determinacin de estireno en los vinos, es muy importante, ya que
este producto forma parte del material de construccin de los depsitos
de fibra de vidrio, tan empleados en la actualidad en las bodegas. Este
compuesto, es muy soluble en el vino.
26
Principio del mtodo
Se basa en una tcnica de extraccin del vino, por cierto sencilla, con
adicin de un patrn interno e inyeccin en el cromatgrafo de gas. El
disolvente de extraccin es el exano y, como patrn interno, se emplea
el cicloexano. Esta metdica permite detectar 10 microgramos de
estireno por litro de vino.
26.S. Brun, M. Giffone y H. Matiras, Trav. Soc. Pharm. (Montpellier), 37, pginas 207-216,
(1977).
Aparatoy columna
Reactivos
Tcnica operativa
Clculos
PATRONINTERNO,
SOLUCION DE REFERENCIA,
ACIDOACETICO.
El cromatgrafo debe disponer de detector de ionizacin de llama.
La columna, en acero inoxidable de 1/8 de pulgada y 7.5 metros de
longitud. La fase estacionaria, es: Carbowax 1540 al 10% sobre
Chromosorb W-AW de 60/80 mallas. Esta columna debe acondicio-
narse a 150 C, durante 6 horas como mnimo.
preparado con 35 mg de cicloexano,
reactivo anlisis, disueltos en exano, hasta un volumen de 100
mL.
para comparacin. Se disuel-
ven 30 mg del monmero estireno y 35 mg de cicloexano, en 5
mLde exano.
1. Los parmetros de trabajo, son: Horno isotrmico a 130 C,
detector a 150 C, inyector a 180 C. Gas portador, nitrgeno a
60 mLpor minuto.
2. En un embudo de decantacin de 250 mL, se vierten 200 mL
de vino y 20 mLde exano. Se agita durante 3 a 4 minutos.
3. A continuacin se aade 1 mL de cido actico, agtese sua-
vemente y djese en reposo para separar las dos capas
lquidas.
4. De la capa superior, se toman 2 mL y se mezclan con 2 mL de
la solucin de patrn interno. Se mezcla bien y se toman 5
microlitros, para la inyeccin en el cromatgafo.
5. Para comparacion, se inyecta 1 microlitro de la solucin de
referencia.
Para la determinacin cuantitativa, se hace uso de la frmula que se
indica a continuacin:
Estireno X =
A x H x h x q
2 1
B x H x h x F
1 2
microgramos por litro
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en que las letras representan lo siguiente:
X = Concentracin de estireno en la muestra.
A = Concentracin de la solucin de referencia en g.
B = Conc. de cicloexano en solucin referencia ( g /L).
H = Altura pico de cicloexano en solucin referencia.
= Atura pico de estireno en solucin referencia.
= Altura pico de estireno en la muestra.
= Altura pico de cicloexano en la muestra.
q = Concentracion de cicloexano en la muestra.
F = Relacin de volmenes de inyeccin entre la muestra
referencia.
Abreviadamente la frmula, se reduce a la siguiente:
Por extraccin del vino con exano, puede identificarse y tambin
cuantificarse el estireno, por absorcin en el ultravioleta.
1. Se tratan, en un embudo de decantacin, 100 mL de vino con
10 mL de exano puro. Se agita, con relativa energa, durante
unos 4 minutos. Se dejan en reposo para que se separen las
dos capas lquidas.
2
1
1
H
h
h
EXANO.
2
METODO POR ABSORCION EN EL Uv
27
Principio del mtodo
Reactivos
Tcnica operativa
27. P.G. Garoglio, Enci. Vitivin. Mondiale, 7, pgina 67, (1973).
Estireno = 6 x
H x h
2 1
H x h
1 2
en microgramos/L
3.76 3.77
2. La fase orgnica superior, casi siempre permanece emulsio-
nada. Para obtener una perfecta separacin, la fase orgnica
separada, se lleva a un tubo de centrfuga y durante 5 minutos
se somete a 3000 rpm.
3. Un volumen de la capa perfectamente lmpida, se coloca en el
espectrofotmetro.
4. Se efecta una exploracin del espectro comprendido entre
320 y 200 nm. El estireno presenta un mximo de ab-
sorbancia, que se sita en los 248 nm.
5. Medir la absorbancia a aquella longitud de onda y tambin a
275 nm (longitud de onda a la cual el estireno tiene la mnima
absorcin).
Simplemente se calcula la diferencia entre la absorbancia a 248 nmy
la correspondiente a 275 nm.
Se traza una curva de tarado, empleando un vino exento de estireno,
al que se le aaden: 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 y 0.5 miligramos de estireno por
litro. Para trazar la grfica, se somete cada una de las soluciones
patrn, al anlisis como se ha indicado, llevando la diferencia de
absorbancias en funcin de la concentracin de estireno
Clculos
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3.78 3.79
Metatartrico
COMENTARIOS
28
El cido metatartrico se emplea para la estabilizacin de los vi-
nos, con objeto de evitar la precipitacin del bitartrato potsico.
El cido metatartrico en ambiente dbilmente cido, reacciona con
el acetato de cadmio dando un precipitado insoluble en agua, que
calentado con hidrxido sdico se descompone formando cido
tartrico. Este ltimo reacciona con una solucin de monovanadato
amnico, produciendo una coloracin roja.
Principio del mtodo
Reactivos
ACETATO DE CADMIO 2-hidrato al 5%,
SOLUCION ACETATO SODICO al 27%.
SOLUCION VANADATO AMONICO al 2%.
disolviendo 5 g del
producto en un matraz de 100 mL con 1 mL de cido actico
concentrado y completando a volumen con agua destilada.
Se disuelven 10 g
28. Deuts. Lebensm.-Rundschau, 6, pgina 167, (1969).
de vanadato en 150 mL de hidrxido sdico 1 M, se pasa la
solucin a un matraz aforado de 500 mL y se aaden 200 mL
de la solucin de acetato sdico, completando a volumen con
agua.
1. Centrifugar la muestra antes del anlisis, para que se halle
ompletamente lmpida.
2. En un tubo de centrfuga, se colocan 20 mL del vino centri-
fugado, al que se aaden 5 mL de la solucin de acetato de
cadmio.
3. Se mezcla y se deja en reposo durante 10 minutos. Trans-
currido el tiempo se centrifuga durante 5 minutos.
4. Se decanta con precaucin el lquido lmpido. La presencia de
un precipitado en el fondo del tubo, ya indica la presencia del
cido metatrtarico.
5. Para confirmarlo, se lava el residuo con 10 mL de agua des-
tilada, procurando dejar suelto el precipitado.
6. Se aade 0.2 mL de la solucin de acetato de cadmio, se
centrifuga nuevamente y se decanta el lquido.
7. En el tubo se introduce 1 mLde hidrxido sdico y se coloca en
un bao mara hirviente durante 5 minutos.
8. Despus de fro se aade 1 mL de cido sulfrico y 1 mide
vanadato amnico.
9. La presencia de cido metatartrico, se pone en evidencia por
el color rojo que aparece.
10. Es interesante efectuar una prueba en blanco con todos los
reactivos, cuyo color final ser amarillo.
HIDROXIDOSODICO1 M.
ACIDOSULFURICO0.25 M.
ALCOHOLETILICO96 %.
Tcnica operativa
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Acido oxlico
COMENTARIOS
METODO HENNING Y LAY
El cido oxlico no est presente en el vino, aunque algunas veces
se puede encontrar incidentalmente, como consecuencia del tra-
tamiento no legalizado, para la eliminacin del exceso de calcio en el
vino.
Consiste en la precipitacin del cido oxlico como sal de torio,
que despus de calcinacin se determina como xido de torio.
se disueven 6 g del pro-
ducto pentahidrato, colocado en un matraz de 100 mL, con
cido clorhdrico 1 M y se completa a volumen con el mismo
cido.
29
Principio del mtodo
Reactivos
SOLUCIONDENITRATODETORIO,
29. K. Henning y A. Lay, Weinberg und Keller, 12, pgina 425, (1965).
3.80 3.81
ACIDOCLORHIDRICO0.1 M,
P
saturado con oxalato de torio.
1. Se evaporan en un vaso o cpsula, 50.00 mL de vino lmpido
(centrifugado o filtrado) hasta unos 10 mL.
2. Aadir 10 mL de cido clorhdrico 2 M, para obtener una so-
lucin 1 Mde clorhdrico.
3. Se aaden 2.5 mL de la solucin de nitrato de torio, agitando,
sin frotar las paredes. Se deja en reposo 24 horas.
4. El precipitado formado de sal de torio del cido oxlico, se filtra
a travs de un filtro sin cenizas. Dejar que se seque el filtro.
5. Colocar el filtro en una cpsula de platino y se incinera a la
temperatura de 500-550 C.
6. Se enfra en un desecador y se pesa el xido de torio. Sea el
peso hallado.
Para calcular la cantidad de cido oxlico, se emplea la siguiente
frmula:
P x 0.9549 x 20 en g/L
El cido oxlico se descompone en cido frmico y C0 a pH 5.0, en
presencia de la oxalato descarboxilasa. El formiato formado es
cuantitativamente oxidado a bicarbonato por la NAD. La cantidad de
NADH formada es esteoquimtricamente igual a la cantidad de cido
oxlico.
Tcnica operativa
Clculos
Principiodel mtodo
METODOENZIMATICO
2
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Reactivos
Tcnica operativa
Clculos
755699,
x Ao
Ao
para 10 determinaciones, que contiene 8 frascos con
reactivos, que debern reconstituirse algunos con agua des-
tilada. La conservacin, as como su reconstitucin, se indica
en el folleto que acompaa a cada test.
1. Si la cantidad de cido oxlico presente en el vino es mayor
que 0.2 g/L, deber efectuarse una dilucin de 10 veces.
2. Se preparan las cubetas de plstico, como en todo anlisis
enzimtico. El espectrofotmetro estar situado en la longitud
de onda de 340 nm, con la lmpara de tungsteno.
3. Seguir paso a paso las indicaciones del folleto adjunto al test.
Para hallar la concentracin de cido oxlico, se aplica la siguiente
frmula:
c = 0.3959 en g por litro
en donde representa la diferencia de absorbancias ledas en el
anlisis.
3.82
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4. ALCOHOLES
ETANOL (grado alcohlico) 4.5
METODO USUAL DE LA CEE (Areometra) 4.5
METODO REBELEIN (qumico) 4.8
METODO EBULLIOMETRICO 4.13
METANOL 4.14
METODO COLORIMETRICO DE REBELEIN 4.14
ALCOHOLES SUPERIORES 4.18
METODO QUIMICO DE GUYMON 4.18
GLICEROL 4.23
METODO O. I. V. Ae21 4.26
2,3-BUTANODIOL 4.30
METODO QUIMICO 4.30
SORBITOL 4.33
MANITOL 4.37
METODO GAYON Y DUBOURG 4.38
4.3
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Etanol (grado alcohlico)
COMENTARIOS
METODOUSUALDELACEE(Areometra)
El alcohol es el producto principal de la fermentacin del mosto de
uva. Adems del etanol, son varios los alcoholes y polialcoholes que
estn presentes en un vino. Algunos de los alcoholes superiores, son
los que dan la caracterstica a los vinos. El etanol es el alcohol
mayoritario, y a ste producto van dirigidas las tcnicas analticas, para
determinar su concentracin.
Para efectuar el anlisis de alcohol, deben ser tomadas ciertas pre-
cauciones al preparar la muestra, para evitar la prdida por evapora-
cin, dilucin o contaminacin. Muchas son las mtodicas para de-
terminar la concentracin de este producto: mtodos basados en el
punto de ebullicin; destilacin seguida por oxidacin qumica; peso
especfico del destilado; ndice de refraccin u otras propiedades del
destilado; tcnicas enzimticas, cromatografa de gas, reflexin en el
infrarrojo y otras.
Formado por un matraz de 1000 mL, de ajuste esmeri-
lado, con una columna rectificadora de 20 cm de longitud, o en su
defecto una bola Kjeldahl. Para evitar toda pirogenacin de las ma-
Aparatos
Destilador.-
4.5 3.4
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terias extractivas, este matraz se calienta con mechero de gas, a travs
de una plancha metlica de 20 x 20 cm, con un orificio en el centro de 8
cm de dimetro. El vapor se condensa en un refrigerante de West (no
serpentn), colocado verticalmente. El destilado se recoge en un
matraz, a travs de un tubo terminado en punta. Este matraz receptor,
debe estar sumergido en agua con hielo.
Puede emplearse otro modelo de destilador, incluso el de arrastre de
vapor, lo que permite acelerar la operacin, a condicin de que el
aparato y la tcnica, cumplan las condiciones indicadas para el mtodo
de referencia que son las que a continuacin se detallan:
Un volumen de 200 mL de una mezcla alcohlica de 10% en volu-
men, destilado cinco veces consecutivas, debe dar como resultado
9,9% despus de la ltima destilacin, lo que quiere decir que no se
puede producir una prdida superior al 0.02% en el curso de una
destilacin.
Debe responder a las prescripciones del Consejo
76/765/CEE, de 27 de julio de 1976, relativa a los alcohmetros y
aremetros para alcohol. Estos aparatos deben estar contrastados por
el Estado.
Se emplear un termmetro graduado en grados y dcimas con
escala de 0 a 30 C, verificado adecuadamente. La probeta estar
constituida por un tubo de vidrio cilndrico de 36 mm de dimetro y 320
mmde altura, mantenida vertical sobre una placa nivelable. El dimetro
interior de la probeta, debe ser 6 mm superior, como mnimo, al
dimetro del alcohmetro.
preparada con 120 gramos de CaO por
litro.
1. Alos vinos jvenes o espumosos, se les debe eliminar, todo lo
posible, el gas carbnico que contengan, mediante agitacin
de 260 mL de la muestra en frasco de 500 mL, previamente
siliconado interiormente.
2. Al interior del matraz se vierten 250 mLde vino, medidos en un
matraz, cuyo dimetro interior del cuello sea de 12 mm, se
enjuaga cuatro veces con 5 mLde agua, cada vez.
Alcohmetro:
LECHADA DE CAL,
Destilacin
Reactivos
Tcnica operativa
4.6
3. Se aaden 10 mL de lechada de cal. La materia colorante del
vino, virar debido a la alcalinidad. En el caso de vinos
acetificados (picados), muy cidos, etc., se aade lechada de
cal, hasta que d franca reaccin a la fenolftalena, observada
por toques exteriores.
4. Se aaden trozos de piedra pmez y una gota de solucin
acuosa diluida de silicona antiespuma al 1 %, con objeto de
evitar la posible formacin de espuma.
5. Recoger el destilado en el mismo matraz que se ha medido el
vino, en el que se han vertido 10 mLde agua destilada.
6. Se deben destilar, como mnimo, 200 mL.
7. Se completa el volumen a la misma temperatura inicial, con
una aproximacin de 5 C, con agua destilada.
a) Se puede evitar la alcalinizacin del vino, colocando a la salida del
refrigerante, un tubo de prolongacin que contenga en su interior 10
gramos de resina cambiadora de iones de base fuerte, bajo forma de
hidrxido. La resina debe ser de 50/100 mallas.
b) Esta resina retiene el cido actico, dixido de azufre libre y com-
binado y el dixido de carbono, que han sido conjuntamente destilados
con el alcohol. Diez gramos de esta resina, son eficaces para 30
destilaciones de vinos normales.
c) La regeneracin se efecta con hidrxido sdico en agua al 5% y
posterior lavado con agua destilada por 6 veces consecutivas.
Observaciones
4.7
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Medida de la densidad del destilado
SOLUCIONCROMATOPOTASICO,
ACIDO NITRICO diluido,
SOLUCIONIODUROPOTASICO,
1. El destilado se coloca en la probeta, se agita, y se mantiene
perfectamente vertical.
2. Se introduce el termmetro y el alcohmetro. La lectura del
termmetro, se efecta un minuto despus de haber agitado el
conjunto, para lograr la igualdad de temperatura de la probeta,
termmetro, alcohmetro y destilado.
3. Se retira el termmetro y se lee el grado alcohlico, despus
de un minuto de reposo.
4. Debern efectuarse, como mnimo, tres lecturas. Si la tem-
peratura del destilado no es la de 20 C, se efectuar una
correccin, con el empleo de la tabla II.
5. Es necesario que la temperatura del lquido, tenga poca di-
ferencia con la temperatura ambiente, como mximo 5 C. En
caso contrario y para mayor exactitud, se recomienda utilizar
una habitacin termostatizada a 20 C.
Es un mtodo por oxidacin qumica del alcohol destilado. Es una
tcnica de microdestilacin, con equipo muy simple. El tiempo total del
anlisis es de 5 a 6 minutos, con un error medio de 0.05 %. Esta tcnica
ha sido ampliamente comprobada y verificada su validez. La firma
GAB, tiene comercializado este mtodo con destilador y placa
calefactora, diseado especialmente.
preparada con 67.445
g de cromato potsico y agua hasta completar un litro.
770 mL del cido concentrado y
agua hasta un litro.
preparada con 300 gramos
del reactivo puro, 100 mLde NaOH1 My 500 mLde agua
METODOREBELEIN(qumico)
1
Principiodel mtodo
Reactivos
1. H. Rebelein, Chem. Mikrobioi Technol. Lebensma., 2, pginas 112-121, (1973).
4.8 4.9
destilada, cuando disuelto se completa el volumen a un litro.
disolver 86.194 gramos de tio-
sulfato sdico en 100 mLde NaOH1 My 500 mLde agua
destilada, cuando disuelto se completa el volumen a un litro.
preparado con 10 gramos de al-
midn soluble, disueltos en 500 mL de agua que contenga 20
gramos de ioduro potsico y 10 mLde hidrxido sdico 1 M.
1. El aparato destilador GAB, deber estar dispuesto para el
trabajo; no es necesaria agua de refrigeracin. Previamente la
placa calefactora se tendr conectada, con objeto de que
alcance la temperatura de trabajo (unos 20 minutos).
2. Al erlenmeyer receptor, de 500 mL, se vierten 10.00 mL de la
solucin de cromato y 25 mL de cido ntrico diluido. Esta
cantidad es suficiente para oxidar 1 mL de solucin de etanol,
del 14%. Si la concentracin es mayor que la citada, deber
diluirse el vino al efectuar el anlisis.
3. En el recipiente destilador, de 100 mL, se colocan 12 mL de
agua destilada, 1 mL de la muestra de vino y piedra pmez
en polvo. Si es necesario se aade silicona antiespuma.
4. La salida del tubo del destilador, debe sumergirse en el lquido
del erlenmeyer de 500 mL.
5. Se hierve durante 3 minutos (la destilacin debe ser
completa).
6. Se retira el erlenmeyer en donde se ha recogido el destilado.
7. Se aaden unos 300 mL de agua destilada, luego 10 mL de
solucin de ioduro y 10 mLdel indicador de almidn.
8. Se valora con la solucin de tiosulfato, hasta color azul celeste
permanente.
Con el mtodo comercializado y modificado por GAB, no es nece-
sario ningn clculo, ya que el contenido de alcohol viene indicado en la
bureta directamente.
SOLUCIONDE TIOSULFATO,
INDICADOR DE ALMIDON,
.00
Tcnica operativa
Clculos
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4.10 4.11
METODOENZIMATICO
Principiodel mtodo
Reactivos
El etanol es oxidado por la nicotinamida-adenin-dinucletido (NAD),
en presencia de la enzima alcohol dehidrogenasa (ADH) a acetalde-
hdo. El equivalente de esta reaccin se halla en el lado del etanol y
NAD. A pH alcalino y bloqueando el acetaldehdo formado, puede
desplazarse el equilibrio. El acetaldehdo es oxidado en presencia de
aldehdo deshidrogenasa (Al-DH) cuantitativamente a cido actico.
La cantidad de NADH formada en las dos reacciones, equivale a la
mitad de la cantidad de etanol. NADH es un valor medible y se puede
determinar a 340 mm.
para unas 30 determinaciones. Contiene 2 frascos
con reactivos, alguno de los cuales se deben reconstituir con
agua destilada. La conservacin de estos reactivos, as como
su reconstitucin, se indican en el folleto que acompaa a
cada test analtico.
176290,
Tcnica operativa
Clculos
Principiodel mtodo
1. La muestra de vino se diluye 1000 veces. Para ello se toman
10.00 mL de vino y se colocan en un matraz aforado de 100
mL, completando el volumen con agua destilada. De sta
dilucin se toman 1.00 mL y en otro matraz de 100 mL se
diluye de nuevo. Con esta ltima solucin se efecta el
anlisis.
2. Se preparan las cubetas de plstico de 10 mmde paso de luz.
3. El espectrofotmetro, con lmpara de tungsteno, se situar en
la longitud de onda de 340 mm.
analtico.
La cantidad de alcohol, se halla segn la frmula:
Etanol =110.428
el valor hallado representa el peso de etanol, en gramos, por 100 mLde
vino. Para expresar el contenido de alcohol en volumen, la frmula se
transforma en la siguiente:
Etanol = 139.200
La dilucin que se ha indicado, permite el anlisis de vinos hasta una
graduacin del 15 % de alcohol. Si el contenido alcohlico es mayor,
convendr efectuar otra dilucin diez veces mayor, y multiplicar el
resultado por esta ltima dilucin.
La determinacin cromatogrfica del etanol en los vinos, es una
tcnica muy avanzada. Se emplea como patrn interno, la acetona, y
se han hallado resultados halagadores. Se logra una precisin del
0.05%, en el anlisis de un vino.
xAe
x Ae
METODOPORCROMATOGRAFIADEGAS
2
2. B. Stackler y E.N. Christensen, Am. J. Enol. Vitic., 25, 4, pginas, 202-207 (1974).
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4.12 4.13
La tcnica ofrece varias ventajas sobre otros mtodos, como son:
excelente precisin, metdica que puede ser automatizada y resul-
tados extraordinariamente rpidos. En grandes bodegas, en las que se
analizan muchas muestras diariamente, las ventajas anteriores son de
extrema importancia.
Cromatgrafo con detector de llama de hidrgeno. La columna en
acero inoxidable, de 2 m de longitud y 1/8 de pulgada de dimetro
exterior con un relleno de Carbowax 600 al 3%sobre Chromosorb T de
40/60 mallas.
1. Se prepara el cromatgrafo, con los siguientes parmetros:
programa isotermo a 80 C, temperatura del inyector 120 C,
temperatura del detector 125 C. Gas portador helio a 110 mL
por minuto.
2. Con el empleo de un diluidor automtico, se toman 0.1 mL de
vino y 25 mL de diluyente, que ser una mezcla de agua y
acetona como patrn interno.
3. La cantidad de muestra inyectada, ser de 0.5 microlitro. Se
har uso de un integrador para efectuar las determinaciones
cuantitativamente.
Es necesario efectuar unas inyecciones, con patrones de etanol pu-
ro, para poder comparar las reas de los picos hallados en la muestra
de vino.
La disminucin del punto de ebullicin de las mezclas de agua y
alcohol, han sido utilizadas para la determinacin de la concentracin
del alcohol en el vino. Una historia de los mtodos para deter-
Aparatoy columna
Tcnica operativa
Clculos
Principiodel mtodo
METODOEBULLIOMETRICO
minar el alcohol, utilizados en el siglo XIII, pueden hallarse en el trabajo
de Marco y Leoci . El ebullimetro Malligand data de 1875 y fue
modificado por Salleron en el ao 1881.
a) Es una metdica aproximada, ya que a pesar de que las reglas
calculadoras tengan sus correcciones, est previsto para mezclas hi-
droalcohlicas. En general, los vinos blancos, son los que ms coin-
ciden en los resultados. Vinos tintos y dulces, se apartan ms de la
realidad.
b) El ebullimetro, ha venido funcionando con mechero de alcohol,
como elemento calefactor. Estn construidos en material metlico, y
por tanto, no es visible el interior de la caldera. Es muy importante que
se mantenga sin incrustaciones el interior, con objeto de
c) La firma GABha creado un ebullimetro, construido totalmente en
vidrio, que incorpora un refrigerante para evitar las prdidas de vapor
por un exceso de ebullicin. Adems, la calefaccin elctrica ha
sustituido al clsico mechero de alcohol. Tambin incorpora un
dispositivo electrnico, que regula automticamente la potencia
calorfica, con lo que se logra una ebullicin muy regular.
3
Observaciones
lograr una
perfecta y suave ebullicin del lquido.
3. O. de Marco y B. Leoci, Riv. Vitic. Enol., 28, pgina 145-161, (1975).
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4.14 4.15
Metanol
COMENTARIOS
METODOCOLORIMETRICODEREBELEIN
El metanol es un producto que se forma directamente en la fer-
mentacin, aunque se halla presente en pequeas cantidades en los
vinos. La actividad de la pectinasa, es quien provoca la formacin de
metanol, por desmetilacin del ester metlico de la
galacturonopiranosa. La levadura raramente causa demetilacin du-
rante la fermentacin.
La dosis oral letal de este producto, es de 340 mg/Kg de peso, en la
persona. Este alcohol se metaboliza por el hgado, de igual forma que
el etanol. Existen lmites de este producto en varias bebidas
alcohlicas, incluidas el vino.
-1,4-
4
Principiodel mtodo
El metanol se separa del vino o licores, por destilacin, conjunta-
4. H. Rebelein, Dtsch. Lebensm. Rundsch., 61, pginas 211-212, (1965).
mente con el etanol. El destilado se oxida a formaldehdo, que reac-
ciona colorimtrica mente, con la rosanilina o bien con el cido cro-
motrpico. El mtodo descrito utiliza la oxidacin con permanganato
potsico y la reaccin coloreada, con el cido cromotrpico.
Disolver 200 gramos de cido ortofosfrico en agua
hasta un litro. Se toman 10 mLde sta solucin y se valora con
NaOH 1 M. Se calcula la concentracin de cido fosfrico en
los 990 mLrestantes, y se ajusta a solucin 1 M, por adicin de
agua o fosfrico. Se disuelven en agua 52.67 gramos de
permanganato potsico y se completa a un litro con agua. En
un matraz de 250 mL, se vierten 60 mL de la solucin de
permanganato, 100 mL del fosfrico 1 M y se completa a
volumen con agua destilada.
preparada por
mezcla de 15.75 gramos de cido oxlico dihidratado con 100
mL de agua, se aaden 25 gramos de cido sulfrico
concentrado y se diluye hasta el volumen de 250 mLcon agua
destilada.
Se disuelven 300 mg
del cido en 20 mL de agua destilada. Si se dispone de su sal,
ser necesario obtener el cido libre, disolviendo 10 g de la sal
en 25 mL de agua, se aaden 2 mL de cido sulfrico
concentrado y 50 mLde metanol. Se calienta justo a ebullicin
y se filtra. Enfriar y aadir 100 mL, o ms, de isopropanol, para
precipitar el cido cromotrpico.
1. Se destila el vino, obteniendo un volumen de destilado igual al
volumen original. Se determina la concentracin de etanol (V=
%en volumen), para calcular el volumen del mismo que se ha
de emplear en la determinacin del metanol, segn la frmula
Reactivos
Tcnica operativa
SOLUCION PERMANGANATO POTASICO ACIDO FOSFO-
RICO.
SOLUCIONACIDOOXALICO-SULFURICO,
SOLUCIONACIDOCROMOTROPICO.
SOLUCIONNITRATODEPLATA1 M.
SOLUCIONDEHIDROXIDOSODICOal 30%.
250/V.
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4.16 4.17
2. Medir la cantidad de destilado antes calculado con una bureta,
colocando el lquido en un erlenmeyer, a continuacin se
aade agua hasta que el volumen total sea de 48 mL.
3. Se aade 1 mL de solucin de nitrato de plata y 0.5 mL de
hidrxido sdico. Se coloca un refrigerante de reflujo y se
hierve durante 30 minutos.
4. Se lava el interior del refrigerante, con varias porciones de
agua, empleando un volumen total de 10 mL.
5. Se destila a un matraz de 50 mL. Cuando se ha terminado la
destilacin se completa el volumen del matraz con agua
destilada. La concentracin de etanol en este destilado debe
ser exactamente de 5%.
6. En un tubo de 10 mLcon tapn, se colocan 2 mLde destilado y
5 mL de permanganato. Se tapa y agita. Se deja reposar 15
minutos.
7. Se aaden 2 mLde la solucin de oxlico y se deja desprender
el carbnico.
8. Alos 15 minutos la solucin debe ser incolora y lmpida. Si se
observa alguna partcula de dixido de manganeso, se tapa y
agita suavemente. Para una determinacin precisa, es
importante mantener una alta concentracin de dixido de
carbono.
9. Inmediatamente, en un tubo de 25 mL con tapn, que con-
tenga 1 mL del cido cromotrpico, se aade 1 mL de la so-
lucin anterior y 10 ml de cido sulfrico concentrado, se
mezcla y se tapa.
10. Se coloca en un bao de agua a 60 C, durante 20 minutos,
pasar luego a un bao de 20 Cy se deja enfriar.
11. Se emplea cubeta de paso de luz de 10 mm y el espectrofo-
tmetro en la longitud de onda de 570 nm, empleando aire
como referencia.
Es necesario preparar soluciones patrn de metanol. Estas solu-
ciones se tratan como ha quedado indicado anteriormente, pero slo a
partir del nmero 6). La grfica resultante sirve para determinar
cuantitativamente el metanol en el vino.
Clculos
METODOGASCROMATOGRAFICO
5
Principiodel mtodo
Aparatoy columna
Tcnica operativa
Clculos
La determinacin del metanol por esta metdica, es fcil, exacta y
rpida. El destilado obtenido cuantitativamente del vino, es el que se
inyecta en el cromatgrafo.
El cromatgrafo, equipado con detector de llama de hidrgeno. La
columna en acero inoxidable de 2 m de longitud y 1/8 de pulgada de
dimetro exterior, relleno de Porapak QS (polmero de etilvinilbenceno
sililado) de 80/100 mallas.
Se calienta la columna durante 24 horas a 210 C para
acondicionarla.
1. Las condiciones de trabajo del cromatgrafo, sern las si-
guientes: Isotermo a 115 C. Gas portador nitrgeno a 40
mL/min. Inyector a 210 Cy detector a 220 C.
2. Se inyecta 1 microlitro del destilado.
3. Se prepara una solucin patrn, pesando un gramo de me-
tanol, para disolverlo con un litro de agua.
4. De esta solucin concentrada, se preparan diluciones que
contengan 50,100, 250 y 500 miligramos de metanol por litro.
Del registro obtenido de los patrones y muestras, puede calcularse el
metanol, por comparacin de las alturas de los picos o bien por las
reas halladas en el integrador.
5. C.Y. Lee, T.E. Acree R.M. Butts, y Anal. Chem., 47, pginas 747-748, (1975).
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4.18 4.19
Alcoholes superiores
COMENTARIOS
METODOQUIMICODEGUYMON
Durante la fermentacin, adems del etanol, se forman alcoholes de
mayor nmero de tomos de carbono. De acuerdo al mecanismo
indicado por Eherlich, se forman los alcoholes superiores por oxidacin
de un ceto-cido, descarboxilacin y finalmente reduccin del aldehdo
al correspondiente alcohol. Los ms importantes alcoholes superiores
son: el n-propanol, isobutanol, isoamlico.
Si se aumenta la aireacin durante la fermentacin, puede provocar
un aumento de los alcoholes superiores.
Los alcoholes superiores reaccionan con el p-dimetilaminobenzal-
dehdo, aldehdo saliclico y vanillina, en presencia de cido sulfri-
6
Principiodel mtodo
6. J.F. Guymon, Anal. Proced. Brandy, Universidad California, Davis, (1959).
co concentrado, para formar compuestos coloreados. El cido sulfrico
deshidrata los alcoholes a hidrocarburos no saturados, que reaccionan
con los aldehdos aromticos. Es necesario eliminar interferencias,
mediante el tratamiento del destilado con nitrato de plata.
Se prepara con el al-
cohol isoamlico puro (zona destilacin entre 131 Cy 132 C)
y alcohol isobutlico (zona destilacin entre 107.5 C y 108
C). Es preferible efectuar la destilacin, recogiendo las
fracciones indicadas. Se mezclan cuatro volmenes de al-
cohol isoamlico y un volumen de isobutlico. Pesar exacta-
mente 1 gramo de la anterior mezcla disolvindolo con agua
hasta un litro. Estaes la solucin de stock.
en grnulos.
preparada por mezcla
de volmenes iguales de agua y cido sulfrico concentrado.
prepa-
rada pesando 0.5 gramos de p-dimetilaminobenzaldehdo
disueltos en un litro de cido sulfrico concentrado. Esta so-
lucin debe preparase diariamente. Mantngase la disolucin
en hielo.
1. Puede emplearse para el anlisis el destilado obtenido para la
determinacin del alcohol. En un matraz de 250 mL se vierten
25.00 mLdel destilado.
2. Se aaden 0.25 g de sulfato de plata, 0.5 mL de solucin de
sulfrico y una pequea cantidad de porcelana porosa o
piedra pmez.
3. Se coloca un refrigerante de reflujo y se hierve durante 15
minutos. Sin detener la ebullicin y transcurrido el tiempo
indicado, se vierten, por el refrigerante, 5 mL de solucin de
hidrxido sdico y unos pocos grnulos de cinc.
4. Se mantiene la ebullicin durante 30 minutos.
Reactivos
Tcnica operativa
SOLUCIONPATRONCONCENTRADA.
SULFATODEPLATA.
CINC
SOLUCION DE ACIDO SULFURICO,
SOLUCIONDEHIDROXIDOSODICO6 M.
SOLUCION DE p-DIMETILAMINOBENZALDEHIDO,
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5. Dejar enfriar, se separa el refrigerante de reflujo y se sustituye
por uno para destilacin, colocando en la punta del mismo un
matraz de 50 mL.
6. Se destila y se recogen 48 mL, completando despus hasta el
7. Cuidadosamente, se mide 1.00 mLdel destilado y se vierte en
un tubo de ensayo de 25 x 200 mm colocado en un bao de
hielo.
8. A continuacin se vierten 20 mL de la solucin fra de p-
dimetilaminobenzaldehdo. Durante esta mezcla entre reac-
tivo y destilado, es necesario agitar, con objeto de evitar cual-
quier sobrecalentamiento.
9. Preprense una serie de tubos, en los que se efectuar las
mismas adiciones, pero empleando las soluciones patrn.
Estas se preparan en matraces de 100 mL a los que se aa-
den: 0, 5, 10, 15, 20, 25 y 35 mLde la solucin de stock.
10. Despus, a cada uno de los matraces, se aaden 7 de
alcohol del 95%, previamente purificado, por reflujo sobre
sulfato de plata y posterior destilacin, recogiendo la fraccin
comprendida entre el 10 y el 75%.
11. Las soluciones patrn se completan a volumen con agua des-
tilada. Todos los tubos deben contener un lquido con trans-
parencia y color como el agua destilada.
12. Los tubos se tapan con papel de aluminio y se pasan a un bao
de agua hirviente, calentndose durante 20 minutos exactos.
13. Se enfran a continuacin en agua de hielo. Despus de trans-
curridos de 5 a 10 minutos, se dejan en gradilla para que
adquieran la temperatura ambiente.
14. Se determina la absorbancia a la longitud de onda de 525 nm
en comparacin con un ensayo en blanco en el que slo se
halle el reactivo y agua destilada.
Se prepara la grfica patrn, a partir de las lecturas de absorbancia y
los miligramos de aceite de fsel o alcoholes superiores de cada
mL
Clculos
4.20 4.21
una de las soluciones patrn. La frmula indicada a continuacin
define la cantidad:
en donde es la concentracin deducida de la grfica, expresada en
mg/Ly el volumen del destilado de vino, en mL.
Es una tcnica modificada por Ough en la que utiliza unas fases
estacionarias distintas, con objeto de lograr una mayor resolucin y
rapidez.
preparado por
dilucin de 5 g de alcohol amlico, Eastman No. 18, que con-
tiene un 76.2% de alcohol isoamlico y un 23.8% de amlico
activo, en 500 mLde alcohol etlico al 50%.
se
disuelve 1 g de alcohol isobutlico en 500 mL de alcohol etlico
al 50%.
preparado
por disolucin de 1 gramo de alcohol 1-proplico en 500 mLde
etanol al 50%.
por disolucin de 1 mL
C
V
SOLUCIONPATRONDEALCOHOLAMILICO,
SOLUCION PATRON DE ALCOHOL ISOBUTILICO,
SOLUCION PATRON DEALCOHOL PROPILICO,
SOLUCIONDEPATRONINTERNO,
7
Principiodel mtodo
Reactivos
8
7. J. H, Kahn, F. M. Trent y otros, J. Assoc. Off. Anal. Chem., 51, pginas 1330-1333, (1968).
8. M. A. Amerine y C. S. Ough, Methods forAnalysis of Musts and Wines, pgina 108,
(1980).
Aceite de fssel =
C x 50
V
en mg por litro de vino
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4.22 4.23
Glicerol
COMENTARIOS
El glicerol es, despus del agua y del alcohol, el constituyente del
vino que aparece en mayor abundancia. Debido a su sabor dulce, igual
al de la glucosa, contribuye al sabor suave de los vinos. El glicerol se
forma al comienzo de la fermentacin alcohlica, de tal manera que los
primeros 50 gramos de azcar fermentados producen la mitad de la
glicerina presente en el vino. Su formacin depende de la cantidad
inicial de azcar, de la naturaleza de las levaduras y tambin,
fundamentalmente, de las condiciones de fermentacin, tales como la
temperatura, acidez, pH, aireacin, azufrado, etc.
Los vinos tintos, generalmente, tienen mayor contenido de glicerol
que los vinos blancos. Ello es debido a que los vinos tintos fermentan a
mayor temperatura y su valor de pHes ms alto.
El glicerol puede ser determinado por distintos mtodos, pero hasta
hace poco todos presentaban un tiempo de realizacin bastante ele-
vado. Los mtodos antiguos se basan en separar, purificar y pesar el
glicerol. En la actualidad, existen mtodos rpidos, como son la
cromatografa en fase gaseosa, tcnica muy simple, y el anlisis en-
zimtico, muy exacto y rpido.
de 3-pentanol a 100 mLcon alcohol etlico de 96%, se aade 1
mL de esta solucin a cada uno de los patrones preparados
para el anlisis.
1. De las soluciones patrn se preparan diluciones de forma que
su concentracin sea prxima al contenido de la muestra,
mezclndole tambin el correspondiente patrn interno.
2. Se preparar una columna de acero inoxidable de 1/8 de pul-
gada de dimetro y 1.8 metros de longitud. La fase estacio-
naria se prepara con Gas Chrome R, 100/120 mallas mez-
clado con 2%de 1,2,6-hexanotriol y 2%de glicerol.
3. Las condiciones de trabajo del cromatgrafo, equipado con
F.I.D. son: Temperatura del horno 65 C, Detector e inyector
200 C, gas portador, nitrgeno a un flujo de 30 mL/min.
4. Destilar cuantitativamente el vino y a 10.00 mL de ste des-
tilado se aade 0.1 mLdel patrn interno.
5. Inyectar en el cromatgrafo, 2 microlitros.
6. El mismo volumen se inyectar de los patrones, para poder
comparar la altura de los picos del cromatograma.
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9
Principiodel mtodo
Aparatoy columna
Reactivos
Tcnica operativa
Con columna adecuada, el glicerol puede ser cromatografiado cua-
litativa y cuantitativamente. Esencialmente el mtodo empleado es el
de Feil y Marinelli, utilizando columna de Porapak. Se efecta inyeccin
directa del vino, mezclado con patrn interno.
Se emplea un cromatgrafo con detector de ionizacin de llama de
hidrgeno o similar. La columna en acero inoxidable de 2 metros de
longitud y 1/8 de pulgada de dimetro exterior, rellena de Porapak Qde
80/100 mallas.
Preparado con 250 mL
de etanol al 30%y 4 mLde n-exanol, redestilado.
1. Las condiciones de trabajo del cromatgrafo son: Tempe-
ratura del inyector 250 C, temperatura del detector 285 Cy la
columna isotrmica a 245 C. Gas portador nitrgeno a 30
mL/min.
2. Se mezcla 1 mL de vino o solucin patrn de glicerol con 0.2
mL del patrn interno. De esta mezcla se inyectan en el
cromatgrafo 3 microlitros para el anlisis.
3. El pico de glicerol se identifica por su tiempo de retencin y se
confirma por el aumento del rea de su pico, con la inyeccin
de un patrn conocido.
4. Como patrn interno se utiliza el n-exanol, ya que en el vino es
un producto raramente presente.
PATRON INTERNO DE n-EXANOL.
GLICEROL.
9. M.F. Feil Merinelli, y L. Am. Soc, Srew. Chem. Proc., pginas 29-34. (1969).
4.24 4.25
5. En las condiciones expuestas anteriormente, los tiempos de
retencin de distintos picos son los siguientes:
Se prepara la curva patrn, a partir de diluciones de glicerol en agua
destilada. Las concentraciones para el trazado de la grfica pueden
ser: 0.1 a 0.8 g/L.
Pueden emplearse las reas de los picos, o bien la altura de los
mismos, para el clculo cuantitativo.
El glicerol es fosforilizado por la gliceroquinasa, en presencia de
adenosina-5-trifosfato a glicerol-3-fosfato. Mediante la piruvatoqui-
nasa, se transforma en piruvato adenosina-5-difosfato. El piruvato es
hidrogenado por nicotinamida adenina dinucletido (NADH). La
cantidad de ste ltimo es equivalente al glicerol presente en la reac-
cin. Se mide en la regin del espectro ultravioleta de 340 nm.
para unas 30 determinaciones. Contiene tres frascos
con reactivos, algunos de los cuales debern reconstituirse
con agua destilada. La conservacin de estos reactivos, as
como su reconstitucin, se indican en el folleto que acompaa
a cada test analtico.
Clculos
Principio del mtodo
Reactivos
METODO ENZIMATICO
148270,
Etanol 3.65
2,3-butanediol 4.45
Lactato de etilo 5.35
n-exanol 6.95
Glycerol 9.50
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4.26 4.27
Tcnica operativa
Clculos
Observaciones
Principiodel mtodo
Aparato
1. Para vinos que no superen la cantidad de 5 gramos de glicerol
por litro, se diluyen 10 veces con agua destilada.
2. En el caso de que la cantidad de glicerol supere los 5 g/L, la
dilucin debe ser de 100 veces.
3. La longitud de onda del espectrofotmetro se situar en los
340 nm.
de anlisis.
La concentracin de glicerol en el vino se halla por la siguiente
frmula:
Glicerol= 4.41 x
si se ha efectuado la dilucin de 10 veces. En el caso de que se haya
diluido 100 veces, se deber multiplicar el resultado anterior por 10.
Los vinos tintos pueden analizarse sin decoloracin previa.
El glicerol se oxida con cido peridico y el formaldehdo formado se
hace reaccionar con la floroglucina, dando una coloracin que se mide
con el espectrofotmetro a 480 nm. A la muestra se la somete a
tratamiento, para eliminar sustancias interferentes, mediante cla-
rificacin y purificacin.
Espectrofotmetro previsto para trabajar con cubetas de paso de luz
de 10 mmy a la longitud de onda de 480 nm.
Ag
METODOO. I. V. Ae21
Reactivos
Tcnica operativa
SOLUCIONDEACIDOPERIODICO0.05 M.
SOLUCION DE HIDROXIDO SODICO 7 M. SOLUCION DE
ACIDO SULFURICO 0.5 M. HIDROXIDO DE BARIO,
ACETONA.
SOLUCION DE FLOROGLUCINA al 0.2%,
SOLUCION DE GLICEROL standard,
Separacin del glicerol y 2,3-butanodiol de las sustancias interferentes
En un matraz de
1 litro, se colocan 11.5 gramos de periodato potsico (peso
molecular 230); si se emplea el K H IO (peso molecular 304),
se pesarn 15.2 gramos, 800 mLde agua destilada y 15 mLde
cido sulfrico concentrado. En un bao de agua, se calienta
con suavidad, hasta completa disolucin, se enfra y enrasa a
volumen con agua. Esta solucin se mantiene bien durante
dos semanas.
sin
pulverizar.
debe prepararse
diariamente.
preparada por dilucin
de 20 mL de glicerol destilado, en agua hasta 100 mL. Se
determina la concentracin de glicerol mediante un refrac-
tmetro. Se diluye una parte alcuota, de forma de obtener una
solucin con una concentracin de 0.1 g/L.
1. En un erlenmeyer de 100 mLcon tapn de goma, se colocan 5
gramos de hidrxido de bario, 5 g de arena lavada y 10.00 mL
de vino. Si el vino es dulce (ms de 120 g/L), emplear 5.00 mL.
2. Se agita vigorosamente durante 30 segundos. Dejar reposar,
agitando de vez en cuando.
3. Aadir 50 mL de acetona, agitar fuertemente durante 30
segundos.
4. Se coloca el erlenmeyer en un bao de agua a 45 C, agitando
fuerte cada minuto aproximadamente, durante un total de 5
minutos.
2 3 6
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4.28 4.29
5. Filtrar sobre vidrio poroso nmero 4 la solucin todava ca-
liente, con la ayuda de succin.
6. Lavar el residuo con 40 mL de agua y finalmente con 5 mL de
solucin de hidrxido sdico. Despus, por tres veces con
acetona, agitando el residuo en cada adicin. Es interesante
que el residuo quede lo ms seco posible.
7. Los lquidos de filtrado y lavados se pasan a un matraz de
destilacin fraccionada y destilar hasta que el termmetro
marque 100 C, en este momento se destilan 20 mLms.
8. Al residuo de la destilacin, todava caliente, se le aaden 5
mL de cido sulfrico 0.5 M. Se enfra y cuantitativamente se
pasa el residuo a un matraz aforado de 50 mL, llevando a
9. Este residuo se emplea para determinar el glicerol y tambin
el 2,3-butanodiol.
10. En un matraz de 100 mL se colocan 5.00 mL del destilado
anterior y se diluye con agua hasta el enrase.
11. De esta dilucin se toman 20.00 mLy se colocan en un matraz,
con tapn esmerilado, de 60 mL al que se aaden 10 mL de
solucin de cido peridico. Se agita y se deja en reposo
durante 5 minutos.
12. Rpidamente se vierten, dejando resbalar el lquido por la
pared del matraz, 10 mL de solucin de hidrxido sdico,
agitar y aadir seguidamente 10 mL de solucin de floro-
glucina. Agitar.
13. Colocar en la cubeta del espectrofotmetro y efectuar la lec-
tura de absorbancia del color violeta a 480 nm.
14. La coloracin que se obtiene cambia con suma rapidez, por
ello la lectura debe efectuarse antes de los 50 segundos.
15. El ensayo en blanco, se efecta con 20 mLde agua destilada y
el reactivo correspondiente.
Determinacin del glicerol
Clculos
Preparar soluciones a partir de la solucin standard de glicerol, por
dilucin con agua hasta 200 mL, empleando 25, 50, 75, 100, 125, 150 y
175 mL. Se toman de cada una de estas soluciones 20.00 mL y se
efecta la determinacin, comenzando por la operacin nmero 11).
Apartir de la grfica obtenida, se determina la cantidad de glicerol en
el vino, conocida la absorbancia a 480 nm.
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4.30 4.31
2,3-butanodiol
COMENTARIOS
METODO QUIMICO
Durante la fermentacin, pueden formarse tres ismeros de este
compuesto. La fermentacin vnica genera, principalmente, las formas
meso y levo. Estos compuestos son formados por reduccin de la
acetona, procedente del cido pirvico.
Si las condiciones de fermentacin son aerbicas, slo se forma
acetona y no 2,3-butanodiol. La determinacin de este producto es
similar al anlisis del glicerol.
10
Principio del mtodo
Se basa en la oxidacin del 2,3-butanodiol a acetaldehdo y valo-
racin de este ltimo compuesto, bien directamente o por formacin de
un producto coloreado con la piperidina y nitroprusiato, y
10. H. Rebelein, Z Lebensm. Unters. Forsch., 105, pginas 296-311, (1957).
subsiguiente medida espectrofotomtrica. Para el anlisis se emplea el
filtrado obtenido para el anlisis del glicerol.
preparada con
2 gramos del producto puro para anlisis en un litro de agua.
1. Tmense 5.00 mL del filtrado preparado para el anlisis del
glicerol y 5 mL de la solucin acuosa de acetato, en un matraz
de 60 mL, se aaden 10 mL del cido peridico, se agita y se
deja en reposo durante 2 minutos.
2. Se aaden, vertiendo por las paredes del matraz, 5 mL de la
solucin de nitroprusiato y a continuacin 10 mLde piperidina.
3. Una vez mezclado, el lquido se pasa a una cubeta espec-
trofotomtrica de 10 mm de paso de luz, determinndose la
absorbancia a 570 nm.
4. La mxima intensidad coloreada tiene lugar a los 30-40 se-
gundos, disminuyendo de inmediato.
5. Se compara con un ensayo en blanco, empleando 5 mL de
agua destilada y efectuando los mismos tratamientos.
La solucin standard de 2,3-butanodiol, se diluye 1 a 10 con agua
destilada, y de esta dilucin se preparan matraces de 100 mL con 0,
10.00, 20.00, 30.00, 40.00, 50.00, 60.00 y 70.00 mL. Se toman 5.00 mL
de cada una de estas soluciones y se procede analticamente igual,
como se ha indicado anteriormente.
Se deber tener en consideracin, para los vinos dulces, la correc-
cin debida a la presencia del azcar, de acuerdo a la tabla Ill.
Reactivos
Tcnica operativa
Clculos
SOLUCIONACETATOSODICO, al 27%.
SOLUCIONACIDOPERIODICO0.05 M.
SOLUCIONNITROPRUSIATOSODICO, al 2%.
SOLUCION ACUOSA DE 2,3-BUTANODIOL,
SOLUCIONACUOSADEPIPERIDINA, al 10%.
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4.32 4.33
11
Principiodel mtodo
Aparatoy columna
Tcnica operativa
Clculos
Con el empleo de la cromatografa de gas, es posible la determi-
nacin de los dos ismeros del 2,3-butanodiol, con inyeccin directa del
vino. El mtodo se debe a Guymon y Crowell.
El cromatgrafo debe estar equipado con detector de ionizacin de
llama. Se emplea columna de 2 m de longitud y 1/4 de pulgada de
dimetro exterior, en acero inoxidable. La fase estacionaria es: 10%de
aceite HUCON75-H-90Msobre Chromosorb Wde 60/80 mallas.
1. Las condiciones de trabajo del cromatgrafo son: Tempe-
raturas del inyector y detector 200 C, columna a 125 C,
isotrmico y gas portador, helio a un flujo de 60 mL/min.
2. Se inyecta en el cromatgrafo 2 Lde muestra.
3. De los dos ismeros, el primero en salir es el levo.
4. En el caso del anlisis de vinos dulces, pueden aparecer picos
fantasmas y deriva de la lnea de base. Para subsanar estos
defectos, se recomienda aumentar la temperatura del horno a
180 C, durante unos pocos minutos y volver a enfriar, antes
de un nuevo anlisis.
Deber inyectarse una solucin patrn de 2,3-butanodiol, en igual-
dad de condiciones de trabajo, para efectuar comparaciones de las
reas o alturas de los picos correspondientes.
11. J.F. Guyman y E. A. Crowell, Am. J. Enol. Vitic., 23, pginas 200-209, (1967).
Sorbitol
COMENTARIOS
En los vinos normales, existen pequeas cantidades de sorbitol que
no llegan a sobrepasar los 50 mg/L. La fermentacin por levaduras no
altera la presencia del sorbitol original en el mosto.
Puede servir el anlisis para comprobar algn fraude, por mezcla de
vino con sidra u otro lquido fermentado, procedente de frutas.
Previa separacin de azcares y alcohol, los polialcoholes son ace-
tilados. Estos compuestos acetilados se cromatografan en una co-
lumna de fluorosilicona y detectados en ionizacin de llama.
METODOPORCROMATOGRAFIADEGAS
12
Principiodel mtodo
12. A. Bertrand y R. Pissard, Am. falsif Expert. Chim., 69, pginas 571-579, (1976).
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El mtodo descrito sirve para la determinacin simultnea de varios
polialcoholes, como: sorbitol, glicerol, eritritol, arabitol, xilitol, manitol y
mesoinositol.
(polialcohol de 7 tomos de
carbono, 4 gramos por litro).
Cromatgrafo de gas, provisto de detector de ionizacin de llama. Se
prepara una columna de 3 m de longitud en acero inoxidable de 1/8 de
pulgada de dimetro exterior. Se rellena con una mezcla de 7%de QF-
1, sobre GaschromQde 80/100 mallas.
1. Los parmetros de trabajo del cromatgrafo son: Tempera-
turas del inyector y detector 270 C, el horno isotrmico a 210
C. Gas portador, nitrgeno, a 30 mL/min.
2. En primer lugar, se prepara la resina IRA400, por lavado con
hidrxido sdico, luego con cido clorhdrico 1 M y posterior
lavado con agua, hasta ausencia de iones cloruro, com-
probado con nitrato de plata.
3. Finalmente se eluye con hidrxido sdico y se lava con agua,
hasta reaccin negativa a la fenolftalena.
4. Se toman 10 mL de la resina y se colocan en una columna de
vidrio de 10 x 200 mm.
5. Se mezclan 2.00 mL del patrn interno, con 20.00 mL de la
muestra de vino.
Reactivos
Aparatoy columna
Tcnica operativa
RESINA DE CAMBIO IONICO AMBERLITE IRA 400 (80/100
mallas).
SOLUCIONHIDROXIDOSODICO1 M.
PATRONINTERNO, PERSEITOL
TETRACLORURODECARBONO. ANHIDRIDOACETICO.
PIRIDINA.
4.34
6. De la mezcla se toman 5.00 mL y se pasan a la columna de
vidrio donde se halla la resina.
7. Acontinuacin se lava con 100 mL de agua. Se recoge todo el
eluado, que contiene todos los polialcoholes. Los cidos y
azcares son retenidos por la resina.
8. Puede regenerarse la resina, con 100 mL de hidrxido sdico,
comprobndose la neutralidad tal como se ha indicado
anteriormente. La resina, despus de cuatro ciclos, debe re-
generarse con cido y base, como se ha descrito en el nmero
2).
9. El eluado se concentra al vaco, a la temperatura de 60 C.
Cuando est casi seco, se aaden de 5 a 10 mLde tetracloruro
de carbono, para destilar azeotrpicamente el agua residual.
10. Al residuo se aaden 2 mL de anhdrido actico y 0.4 mide
piridina. Se calienta a reflujo a 100 C, durante una hora.
11. Despus de fra, se inyectan en el cromatgrafo 5 microlitros.
El sorbitol sale despus de 18-20 minutos y el patrn interno a
los 35 minutos.
Se prepara una curva patrn con las alturas de los picos del cro-
matograma. La solucin stock se prepara por disolucin de 1 gramo de
sorbitol puro, en un litro de agua destilada.
Amatraces de 100 mL, se aaden: 0, 5.00, 10.00, 15.00 y 20.00 mL
del stock y, una vez completados a volumen, se tendrn con-
centraciones de 0, 50, 100, 150 y 200 mg/L. Se toman 20.00 mL de
estas soluciones y se procede como en el vino.
El d-sorbitol se oxida en presencia de la enzima sorbitol-
dehidrogenasa (SDH) a travs de la nicotinamida-adenina-dinucletido
Clculos
Principiodel mtodo
METODOENZIMATICO
4.35
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(NAD) a d-fructosa formndose NADH. Se mide la absorbancia a 492
nm.
para 3 x 10 determinaciones, que contiene cuatro
frascos con reactivos, que debern reconstituirse algunos con
agua destilada. La conservacin, as como su reconstitucin,
se indica en el folleto que acompaa a cada test analtico.
1. Si la concentracin de d-sorbitol en el vino no sobrepasa la
cantidad de 0.1 g/L, no es necesaria la dilucin. En el caso de
que la cantidad no alcance a 1 g/L, la dilucin ser de 10
veces; si el nivel va de 1 a 10 g/L, se diluir 100 veces.
2. El vino a analizar debe estar perfectamente lmpido, obtenido
por una buena filtracin.
3. Preparar las cubetas de plstico de 10 mmde paso de luz y el
espectrofotmetro con lmpara de tungsteno a la longitud de
onda de 492 nm.
4. Seguir con detalle las instrucciones de anlisis que se indican
en el folleto adjunto al test.
La concentracin de sorbitol en la muestra de vino se halla por la
siguiente frmula:
d-sorbitol = 0.2792 en g/L
en donde representa la absorbancia de la muestra de vino.
Reactivos
Tcnica operativa
Clculos
670057,
xAs
As
Manitol
COMENTARIOS
METODOS POR CROMATOGRAFIA DE GAS
En los vinos, la presencia de manitol en niveles superiores a los 40
mg/L es signo de alteracin. Se forma por accin bacteriana sobre la
fructosa. Casi siempre tiene lugar en fermentaciones que han superado
los 35 Cde temperatura.
Las fermentaciones llamadas manticas provienen del
Las vendimias atacadas de aumentan
el contenido de polialcoholes, aparte del glicerol.
Se emplean las mismas metdicas especificadas para el anlisis
del sorbitol.
Bacterium
mannitopoeum. Botrytis cinerea
Principio del mtodo
4.36 4.37
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METODOGAYONYDUBOURG
13
Cualitativo
Cuantitativo
SOLUCIONHIDROALCOHOLICAal 85%.
Para un anlisis cualitativo, es suficiente hacer evaporar en fro unos
2 3 mL de vino, preferiblemente decolorado, con la cantidad mnima
posible de carbn activo, en un vidrio de reloj. Si hay manitol, al cabo de
24 horas se habrn formado unas agujas cristalinas muy finas, en
disposicin radial. Se distinguen perfectamente de los cristales de
tartrato de cal y del bitartrato potsico. Este sistema es sensible para
una concentracin de manitol superior a 1 gramo por litro.
Si el vino es dulce, es necesario hacer fermentar los azcares con
anterioridad al anlisis.
1. Se toman 50 mL del vino y se concentran a bao mara, hasta
consistencia siruposa.
2. Se deja cristalizar durante 2 3 das en un lugar fresco.
3. El residuo se mezcla con 2 gramos de arena silcea, lavada y
calcinada.
4. Despus se pasa a un mortero y se mezcla ntimamente con
100 mL de la solucin de alcohol. Se filtra y se deja en reposo
unas 3 horas.
5. Se coloca en un matraz el filtro y su contenido, y en caliente se
tratacon 100 mLdel alcohol diluido al 85%, durante una hora.
6. Una vez fro, se procede a su destilacin hasta obtener las 4/5
partes, se aade un poco de carbn decolorante al lquido y se
filtra.
Reactivos
Tcnica operativa
13. J. Ribreau-Gayon y otros, Trait d'Oenologie, vol 1, Analyse et Contrle des Vins, Dunod,
Pars (1972).
7. El carbn contenido en el filtro se lava con 50 mL de alcohol
diluido y caliente.
8. Los lquidos recogidos son evaporados a sequedad a la tem-
peratura de 60 C.
9. Despus de la evaporacin total, el residuo est formado por
manitol puro, y por lo tanto se procede a pesarlo y de este
resultado se deduce la concentracin de manitol en la
muestra.
4.38 4.39
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5. AZUCARES
REDUCTORES 5.5
METODOUSUALDELACEE 5.6
METODOREBELEIN 5.10
MTODOGAB 5.12
GLUCOSAYFRUCTOSA 5.13
METODOENZIMATICO 5.13
SACAROSA 5.15
METODODEREFERENCIADELACEE 5.15
METODOCUALITATIVOUSUALDELACEE 5.18
METODOGAB 5.20
METODOENZIMATICO 5.21
5.3
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Reductores
COMENTARIOS
Los azcares predominantes en el zumo de la uva son la glucosa y la
fructosa; el primero de ellos con funcin qumica aldehdica y el
segundo cetnica. Los dos tienen accin qumica reductora sobre la
solucin cuproalcalina.
En los granos de uva se almacenan los azcares durante la madu-
racin. Si la fermentacin ha sido total, los vinos resultantes prcti-
camente no contienen materias azucaradas.
Para efectuar un anlisis,. en casi todas las metdicas qumicas
debe realizarse una defecacin previa a la tcnica analtica
propiamente dicha. Para mayor exactitud, se recomienda el anlisis
que no necesite de la defecacin, por la prdida apreciable de materias
reductoras que comporta el tratamiento, an perfectamente realizado,
cosa bastante difcil de llevar a cabo.
5.5 5.4
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MTODOUSUALDELACEE
Principiodel mtodo
Reactivos
Tcnica operativa
El vino se somete en primer lugar a la defecacin, que puede efec-
tuarse con acetato neutro de plomo o bien con exacianoferrato (II) de
cinc.
Despus de la defecacin se hace reaccionar el mosto o el vino
defecados, sobre una cantidad determinada de reactivo cuproalcalino,
y los iones de cobre sobrantes son valorados por iodometra.
El lquido en el cual se va a efectuar el dosado de azcares debe
tener una concentracin de estos compuestos comprendida entre 0.5 y
5 g/L. Si el vino es seco, evitar la dilucin durante la defecacin. Si los
vinos son dulces, se diluyen de manera que la concentracin de
azcares est en los lmites indicados anteriormente.
Se prepara con 250 gramos de acetato de plomo y
agua destilada muy caliente, para un volumen total de 500 mL.
Agitar hasta total disolucin.
1. En un matraz de 100 mL, se vierten 50.00 mL de vino, se
aaden mL de solucin molar de hidrxido sdico, sien-
do volumen de solucin 0.1 Mgastado en la acidez total de
50 mLde vino.
2. Con agitacin se aaden 2.5 mL de solucin saturada de ace-
tato de plomo y 0.5 gramos de carbonato clcico; se agita
varias veces y luego se deja 15 minutos en reposo.
3. Se completa el volumen con agua destilada y se filtra.
4. Un mLdel filtrado equivale a 0.50 mLde vino.
Defecacin con acetato de plomo
SOLUCIONDEACETATODEPLOMO(aproximadamente sa-
turada).
CARBONATOCALCICO, en polvo.
Vinos secos
n-0.5
n el
5.6
Mostos, mistelas y vinos dulces
Defecacin con hexacianoferrato (II) de cinc
SOLUCIONI de hexacianoferrato (II) potsico,
SOLUCIONIl de sulfato de cinc,
1. En un matraz de 100 mL se coloca un volumen de mosto o
vino, definido por lo siguiente:
Mostos y mistelas. Diluir al 10% el lquido a analizar, emplear
10.00 mLde esta dilucin.
Vinos dulces, alcohlicos o no, cuya densidad se halle com-
prendida entre 1.005 y 1.038. Diluir al 20% y tomar 20.00 mL
del lquido diluido.
Vinos semisecos, con densidades comprendidas entre 0.997
y 1.006, emplear 20.00 mLdel vino no diluido.
2. Aadir 0.5 gramos de carbonato clcico, unos 60 mL de agua
destilada y 0.5, 1 2 mL de solucin saturada de acetato de
plomo. Se agita y se deja en reposo 15 minutos, agitando de
cuando en cuando y finalmente se completa a volumen con
agua, y filtrar.
3. En el primer caso, 1 mL del filtrado equivale a 0.01 mL del
mosto o mistela. En el segundo caso, 1 mL de filtrado co-
rresponde a 0,04 mLde vino dulce y, por ltimo, 1 mLequivale
a 0.20 mLde vino semiseco.
Este procedimiento de defecacin slo se aplica a los vinos blancos,
vinos dulces claros y mostos.
preparada con
150 gramos de hexacianoferrato (II) potsico y agua hasta un
litro.
obtenida por disolucin de
300 gramos de sulfato de cinc y completando a volumen de un
litro con agua destilada,
1. En un matraz de 100 mL, se coloca un volumen de vino, de
acuerdo a lo siguiente:
Mostos y mistelas. Diluir al 10% y emplear 10.00 mL de sta
dilucin.
Reactivos
Tcnica operativa
5.7
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Vinos dulces, alcohlicos o no, cuya densidad est compren-
dida entre 1.005 y 1.038. Se diluye al 20%y se emplean 20.00
mL.
Vinos semisecos, con densidad entre 0.997 y 1.006. Emplear
20.00 mLdel vino no diluido.
Vinos secos, se toman 50.00 mLdel vino sin diluir.
2. Se le aaden 5 mL de solucin I y 5 mL de solucin II. Agitar y
llevar a volumen con agua destilada. Esperar 10 minutos y
filtrar.
3. Las equivalencias con la muestra original son las siguientes:
Primer caso, 1 mL de filtrado corresponde a 0,01 mL de mosto
o mistela. Segundo caso, 1 mL de filtrado equivale a 0.04 mL
del vino dulce. Tercer caso, 1 mL de filtrado igual a 0.20 mL de
vino semiseco. Por ltimo, 1 mLigual a 0.50 mLde vino seco.
preparada con 25 gramos de
sulfato cprico pentahidratado, 50 g de cido ctrico y 368 g de
carbonato sdico cristalizado. Se disuelve el sulfato de cobre
en 100 mL de agua, el cido ctrico en 300 mL de agua y el
carbonato sdico en unos 350 mL de agua destilada caliente.
Se mezclan las soluciones de ctrico y carbonato. De
inmediato se aade la solucin de sulfato de cobre y se com-
pleta hasta el litro.
preparada con
30 gramos de ioduro potsico, reactivo anlisis, y agua sufi-
ciente para 100 mL.
vertiendo 25 g del cido con-
centrado sobre unos 80 mL de agua destilada. Dejar enfriar y
completar a volumen de 100 mL.
preparada con 5
g/L de almidn y conservada por la adicin de 200 gramos de
cloruro sdico.
Anlisis propiamente dicho
SOLUCIONCUPROALCALINA,
SOLUCION DE IODURO POTASICO al 30%,
ACIDO SULFURICO al 25%,
SOLUCION DE ENGRUDO DE ALMIDON,
TIOSULFATOSODICO0.05 M
Reactivos
5.8 5.9
Tcnica operativa
Clculos
1. En un erlenmeyer de 250 mL, se colocan 25.00 mLde solucin
cuproalcalina, 15 mL de agua y 10.00 mL del lquido defecado
objecto del anlisis. Este volumen de lquido no debe contener
ms de 60 miligramos de azcares reductores.
2. Aadir algunos granos de piedra pmez y llevar a ebullicin en
2 minutos.
3. Colocar un refrigerante de reflujo al erlenmeyer y mantener la
ebullicin durante 10 minutos exactamente.
4. Enfriar de inmediato con un chorro de agua fra.
5. Cuando fro, se aaden 10 mLde solucin de ioduro, 25 mLde
cido sulfrico diluido y 2 mLde engrudo de almidn.
6. Se valora con la solucin de tiosulfato sdico 0.05 M. Sea n el
nmero de mililitros gastados.
7. Comprobar un ensayo en blanco, sustituyendo los 25 mL del
lquido azucarado por agua destilada y valorar. Sea el
volumen de tiosulfato empleado.
La cantidad de azcares, expresado en azcar invertido, contenido
en la toma del ensayo, se halla por la diferencia de volumen hallados
entre el ensayo en blanco y la muestra. Se expresar la concentracin
en gramos de azcar por litro, teniendo en cuenta las diluciones
efectuadas durante la defecacin y el volumen de muestra. En la tabla
IV, se hallan las equivalencias entre volumen gastado y azcares.
n'
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5.10 5.11
METODOREBELEIN
1
Principiodel mtodo
Reactivos
Se fundamenta tambin en la reduccin del reactivo cuproalcalino.
No es necesaria defecacin alguna, lo que representa una mayor
exactitud en la determinacin, por cuanto no hay prdidas de materias
reductoras, que siempre tienen lugar en el proceso de defecacin. Se
puede comparar, en exactitud, con los mtodos mucho ms largos de
ejecucin, ya que en sta metdica slo se tarda unos 5 minutos en
efectuar una determinacin. Un adicional calentamiento puede causar
variaciones en los resultados, por ello es necesario respetar los
tiempos indicados de ebullicin.
pentahidrato, prepa-
rada con 41.92 gramos de sulfato cprico, reactivo anlisis, 10
mLde cido sulfrico 0.5 My agua destilada hasta un litro.
Se pesan 250 g de tartrato sdico
potsico y se disuelven en 400 mL de agua, 80 g de hidrxido
sdico en 400 mL de agua. Se mezclan las dos soluciones en
un matraz de un litro y se completa a volumen cuando est
fro.
En un matraz de un litro se
colocan 300 g de ioduro potsico y unos 500 mL de agua. Se
disuelve y se aaden 100 mL de solucin de hidrxido sdico
1 M. Se mezcla bien y se completa a volumen con agua.
preparada con 175
mL del cido concentrado sobre agua y completar a volumen
de un litro.
Se deslen 8 g de almidn en agua y
se vierten a 500 mLde agua en ebullicin y se mantendr sta
durante 2 minutos. Se enfra. En 400 mLde agua se disuelven
20 g de ioduro potsico y 10 mL de hidrxido sdico 1 M. Se
mezclan las dos soluciones y se completa al volumen de un
litro.
SOLUCION DE SULFATO DE COBRE
SOLUCION ALCALINA.
SOLUCION IODUROPOTASICO.
SOLUCION ACIDO SULFRICO al 16%,
SOLUCION ALMIDON.
1. H. Rebelein, Chem. Mikrobiol. Technol. Lebensm., 2 pginas 112-121, (1973).
SOLUCIONDE TIOSULFATO, preparada con 13.777 g de tio-
sulfato sdico puro, en un matraz de un litro, al que se aaden
50 mL de solucin de hidrxido sdico 1 M y completando a
1. En un erlenmeyer de 250 mL, se vierten 10.00 mL de solucin
cprica, 5 mL de solucin alcalina y 2.00 mL de la muestra de
vino (no debe contener ms de 28 g de azcar por litro).
2. Se hace hervir durante un minuto y medio exactamente, en-
friando rpidamente al chorro de agua fra.
3. Cuando est fra, se aaden 10 mL de solucin de ioduro, 10
mLde cido sulfrico y 10 mLde solucin de almidn.
4. Se valora con solucin de tiosulfato sdico, hasta un color
ligeramente amarillo.
5. En este momento se aaden 10 mL de almidn y se completa
la valoracin hasta una coloracin crema claro.
6. La concentracin de azcar, en g/L, se lee directamente de la
bureta de valoracin.
7. Si el vino ha sido diluido, se deber multiplicar por el factor de
dilucin.
No son necesarios, ya que la concentracin viene indicada en la
misma bureta.
La bureta es de 30 mLde volumen total, graduada de tal manera que
en la parte superior se halla la cifra 30 g/Ly en el extremo inferior el 0.
Tcnica Operativa
Clculos
Observaciones
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5.12 5.13
METODOGAB
2
Principiodel mtodo
Reactivos
Tcnica operativa
Clculos
Es una modificacin del mtodo Rebelein, que permite determinar,
tanto las materias reductoras, como los azcares que necesitan de una
inversin previa para ser analizados. El tiempo de anlisis es tambin el
mismo y los reactives vienen ligeramente modificados.
Mtodo muy satisfactorio para el anlisis de los vinos de tiraje, para
la elaboracin de cava y vinos espumosos en general, por su exactitud
y rapidez.
para unos
50 anlisis. Contiene 6 frascos con los reactivos preparados
para el uso, as como una pequea cantidad de piedra pmez.
Cada pack contiene el folleto explicativo de los pasos a realizar
para el anlisis.
1. Preparar la placa calefactora proyectada para ste anlisis (se
recomienda siempre utilizar la suministrada por GAB).
2. Utilizar la bureta destinada a este anlisis, graduada direc-
tamente en g/L(Ref. GABnmero 3019033).
3. Seguir, paso a paso, las indicaciones del folleto adjunto al
pack analtico.
No son necesarios, ya que la cantidad de azcares viene indicada en
la misma bureta. Slo deber tenerse en consideracin la dilucin que
se haya realizado en la muestra de vino.
PACK ANALISIS AZUCARES GAB, Ref. 1002000,
2. P.E. GAB, 08734 MOJA(Barcelona).
Glucosa y fructosa
COMENTARIOS
METODOENZIMATICO
Estos son los azcares fundamentales en la maduracin de la uva, y
por tanto presentes en el mosto antes de fermentar. Puede ser in-
teresante conocer la concentracin de estos azcares e incluso la re-
lacin existente entre ellos. La metdica que se ha credo ms idnea
para el anlisis es la que se resume seguidamente.
La d-glucosa y la d-fructosa son fosforiladas por la enzima hexoki-
nasa (HK) y adenosin-5'-trifosfato (ATP) a glucosa-6-fosfato (G-6-P) y
fructosa-6-fosfato (F-6-P) con la formacin simultnea de adenosin-5'-
difosfato (ADP). La cantidad de NADPH obtenido en la reaccin con la
glucosa y la fructosa es proporcional a dichos azcares y las
absorbancias sirven para cuantificarlos.
Principiodel mtodo
system
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5.14 5.15
Reactivos
Tcnica operativa
Clculos
de catlogo 139106, para unas 50 determinaciones. Contiene
10 frascos con reactivos, algunos de los cuales debern ser
reconstituidos con agua destilada. La conservacin y duracin
de estos reactivas, as como su reconstitucin, se indican en el
folleto que acompaa a cada test analtico.
1. Se preparan las cubetas de 10 mm de paso de luz. El espec-
trofotmetro, con lmpara de tungsteno, se sita en 340 nmde
longitud de onda.
2. Si la concentracin en la muestra no supera un gramo por litro,
no se efectuar dilucin. Hasta 10 g/L diluir 10 veces. De 10 a
100 g/L la dilucin ser de 100 veces y si la cantidad es mayor
la dilucin debe ser de 1000 veces.
3. La muestra debe estar perfectamente filtrada.
4. Los vinos o mostos tintos no necesitan decoloracin alguna.
5. Para la realizacin del anlisis, se deben seguir las instruc-
ciones que se adjuntan a cada test analtico.
Las concentraciones de glucosa y fructosa, se calculan por las si-
guientes frmulas, a partir de las absorbancias ledas:
glucosa = 0.8636 x Ag en g/L
fructosa = 0.8694 x Af en g/L
ser necesario tener en cuenta la dilucin efectuada en la muestra,
para anotar su concentracin.
Sacarosa
COMENTARIOS
METODODEREFERENCIADELACEE
Este azcar aparece en la uva, en cantidad muy reducida, ya que slo
existe en un nivel que vara, segn J. Ribreau-Gayon , entre 1 y 3 g/Ly
an se hidroliza a azcares reductores.
3
Para la investigacin cualitativa
Principio del mtodo
Se emplea la cromatografa en capa fina. La sacarosa se identifica
en los mostos y vinos, empleando la capa fina de gel de slice G, que
contiene acetato sdico. El revelador (cido tiobarbitrico y triclora-
ctico) se incorpora al disolvente (acetato de etilo, isopropanol y agua).
3. J. Ribreau-Gayon, Trait d'Oenologia, Dunod, 2.2., Pars (1973).
system
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5.16 5.17
La sacarosa, por calentamiento en medio cido forma hidroximetil-
furfural, que reacciona con el cido tiobarbitrico, con formacin de una
coloracin amarillo-anaranjado.
Se dispondr del material necesario para efectuar una cromatografa
en capa fina, principalmente cubeta y pulverizador.
de gel de slice o similares.
Se prepara con 65 mL de acetato de etilo, 30
de isopropanol y 5 mLde agua destilada.
En el momento del empleo, se aaden a 100
mL del disolvente: 0.3 g de cido tiobarbitrico y 5 g de cido
tricloractico, en cristales.
en 100 mL.
preparada al 0.5% en agua
destilada.
de cada
azcar.
Se preparan empleando 1 mL de la
solucin 'A' y 1, 2, 3, 4 y 5 mLde solucin B en sendos tubos
con enrase a 10 mL. Se completa el volumen con agua. De
esta forma se obtienen una serie de soluciones patrn de
sacarosa, con diferentes concentraciones de azcares
reductores.
1. Si el vino es tinto o fuertemente coloreado, deber tratarse con
carbn decolorante, antes de depositarlo en la placa
cromatogrfica.
2. En una lnea de partida, que se halla a 2.5 cm del borde de la
placa, se colocan los lquidos a analizar, separados unos de
otros 3 cmy tambin a 3 cmdel borde lateral.
3. Segn la concentracin de azcares, se colocan de 1 a 5 mi-
crolitros de muestra. Cada mancha no debe contener ms de
0.25 mg de azcares.
Aparatos material
Reactivos
Tcnica operativa
y
CROMATOPLACASMERCK
DISOLVENTE
mL
REVELADOR.
SOLUCIONPATRONDESACAROSA, al 0.05 g
SOLUCION 'A' DE SACAROSA,
SOLUCION 'B' DE GLUCOSA Y FRUCTOSA, al 5%
SOLUCIONES PATRON.
4. Se colocan igualmente 5 microlitros de la solucin patrn de
sacarosa.
5. Para que las manchas queden del menor tamao posible, se
depositan por etapas, previo el secado entre ellas.
6. Se coloca la cromatoplaca en la cubeta cromatogrfica y se
deja ascender el disolvente unos 16 cm, a partir de la lnea de
origen.
7. Se retira la placa y se seca, con la ayuda de una corriente de
aire.
8. Luego se coloca en una estufa a 105 C, durante 15 minutos.
9. En presencia de sacarosa, aparece una mancha de color
amarillo, en el idntico al de la solucin patrn de
sacarosa. Los de la glucosa y fructosa son superiores al de
la sacarosa.
Sobre el lquido obtenido por la defecacin del vino, es donde puede
determinarse la sacarosa. Se efecta por comparacin de los poderes
reductores de antes y despus de la hidrlisis con cido clorhdrico.
Este lquido se prepara como se ha indicado en el anlisis de los
azcares reductores. El mtodo de anlisis del poder reductor es el
mismo que el empleado en la determinacin de reductores.
1. Colocar en dos matraces de igual volumen, designados como
y , la misma cantidad, en cada uno de ellos, del lquido
obtenido en la defecacin.
2. Acada uno de los recipientes y se aaden 0.3 mLde cido
clorhdrico concentrado por cada 10 mLde la muestra.
3. En el recipiente se aade de de NaOH 12
M, por cada 10 mL del lquido azucarado defecado, y se
procede al anlisis de los azcares reductores tal como se ha
indicado anteriormente.
Rf
Rf
Para la determinacin cuantitativa despus de la inversin
A B
A B
A inmediato 0.3 mL
Principiodel mtodo
Tcnca operativa
system
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5.18 5.19
4. El recipiente , que contiene el lquido azucarado acidificado,
se coloca en un bao mara hirviente, durante 2 minutos. Se
deja enfriar el recipiente durante 15 minutos.
5. A continuacin se aade el mismo volumen de NaOH 12 M,
como en el matraz y se procede a su anlisis.
6. La diferencia entre las cantidades de los azcares reductores
hallados multiplicada por el factor 0.95 da la concentracin de
sacarosa.
7. Se expresar en gramos de sacarosa por litro de vino, des-
pus de haber tenido en cuenta las diluciones efectuadas en la
defecacin y en el volumen de la muestra sometida a anlisis.
Es un mtodo colorimtrico. El vino se somete a la defecacin con
acetato de plomo, xido de magnesio y permanganato potsico a pH8-
9. Sobre el defecado caliente a 100 C, se aade la difenilamina en
medio clorhdrico y actico. El producto de condensacin, en presencia
de la sacarosa, se extrae con cloroformo, el cual adquiere una
coloracin azul.
cristalizado.
en polvo.
B
A
ACETATODEPLOMONEUTRO,
OXIDODEMAGNESIOpesado,
SOLUCION DE PERMANGANATO POTASICO al 0.2 %.
SOLUCI ON SATURADA DE SULFATO SODI CO.
CLOROFORMO.
METODOCUALITATIVOUSUALDELACEE
Principiodel mtodo
Reactivos
REACTIVO DE DIFENILAMINA. A 10 mL de difenilamina al
10% en etanol absoluto, se aaden 20 mL de cido actico
glacial y 70 mLde cido clorhdrico concentrado. Es necesario
comprobar la pureza del reactivo. Para ello se toman 2 mL de
difenilamina y 2 mLde agua destilada, se colocan en un tubo y
se lleva a bao mara, durante 5 minutos. Se enfra la solucin
bruscamente por inmersin en agua fra y se extrae con 1 mL
de cloroformo. La fase orgnica, no debe presentar coloracin
azul.
1. Disolver unos 200 mg de xido de magnesio y 200 mg de
acetato de plomo, en 10 mLde agua destilada.
2 Se lleva al bao mara a unos 95 C, durante 3 a 5 minutos.
3 Se aaden 2 mL de vino o mosto, que debe estar perfecta-
mente lmpido y una concentracin en azcares totales in-
ferior al 1 %, se diluye la muestra, si es necesario, para man-
tener la concentracin indicada.
4 Debe procurarse que la cantidad de acetato de plomo sea la
suficiente, pero sin exceso, ya que disminuira la sensibilidad
de la reaccin.
5 Al lquido claro, que sobrenada, se aaden unas gotas de
solucin concentrada de acetato de plomo, hasta que no se
observe precipitacin alguna. Se agita y se mantiene en el
bao mara, hasta que el lquido superior est limpio.
6 Se aade solucin de sulfato sdico para eliminar el exceso de
plomo.
7. Se aaden 0.5 mLde solucin de permanganato potsico y se
mantiene en el bao mara durante 10 minutos. Enfriar
bruscamente y filtrar. Puede suceder que aparezca una co-
loracin amarilla, ello no perjudica la reaccin.
8. En un tubo de ensayo, colocar 2 mL del filtrado y 2 mL del
reactivo de difenilamina. Se mantiene en el bao mara hir-
viente durante 5 minutos exactamente.
9. Enfriar por inmersin en agua fra, aadir 1 mLde cloroformo y
extraer la coloracin por agitacin.
Tcnica operativa
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Observaciones
Principiodel mtodo
Tcnica operativa
Observaciones
Los vinos blancos secos, no adicionados de sacarosa, pueden dar
una coloracin azul-gris muy ligera. En presencia de sacarosa, la co-
loracin es netamente azul. Los vinos con azcar residual, mostos y
mostos concentrados, dan una coloracin amarilla, que en el caso de
presencia de sacarosa, la coloracin es netamente verde.
Con el empleo del pack de azcares se puede hallar la
sacarosa por diferencia, entre los azcares previa inversin y los
reductores directos. Es mtodo muy sencillo y fcil de realizar.
1. Se determinan los azcares previa inversin, siguiendo las
instrucciones que acompaan al pack de anlisis, Se anota
estevalor.
2. Los reductores se hallan directamente sin pasar por la ebu-
llicin previa de los 2 minutos. El valor obtenido en este an-
lisis se anota.
3. La sacarosa se halla por diferencia entre el primer anlisis y el
segundo, multiplicando el resultado por el factor 0.95, para
obtener los gramos de sacarosa por litro de la muestra.
Debe tenerse en cuenta que la sacarosa presente en el vino dis-
minuye con el tiempo, por la hidrlisis que tiene lugar en el medio cido
del vino. Es muy posible que efectuando anlisis en espacios de tiempo
un poco largos, se observe una disminucin apreciable de la sacarosa.
METODOGAB
4
Ref. 1002000
4. P.E. GAB, 08734 MOJA(Barcelona).
5.20 5.21
METODOENZIMATICO
Principiodel mtodo
Reactivos
Tcnica operativa
Se determina la glucosa antes y despus de la hidrlisis enzimtica
de la sacarosa. Antes de la inversin la glucosa se determina por
fosforilizacin con ATP, empleando como catalizador la enzima exo-
cinasa. La glucosa-fosfato (G6P) que se forma, es oxidada especfi-
camente por la NADPa NADPH. La cantidad de este ltimo compuesto
es equivalente a la cantidad de glucosa.
La sacarosa se hidroliza por medio de la enzima fructosidasa (in-
vertasas) a glucosa y fructosa. La determinacin de la glucosa despus
de la inversin (glucosa total), se efecta como se ha indicado
anteriormente.
Por la diferencia de las concentraciones de glucosa antes y despus
de la inversin enzimtica, se calcula el contenido de sacarosa.
para unas 40 determinaciones de sa-
carosa o glucosa. Contiene 3 frascos con reactivos algunos de
los cuales se deben reconstituir con agua destilada. La
conservacin de estos reactivos, as como su reconstitucin,
se indican en el folleto que acompaa a cada test de anlisis.
recomiendan sean de plstico para un solo uso, con objeto de
evitar contaminaciones. El espectrofotmetro con lmpara de
tungsteno se sita a 340 nmde longitud de onda.
2. En los vinos cuya suma de glucosa y sacarosa est compren-
dida entre 0.8 y 8.0 g/L, se diluirn 10 veces. Si la concen-
tracin es superior a la indicada e inferior a 80 g/L, la dilucin
debe ser de 100 y si es mayor se diluirn 1000 veces.
de anlisis.

de catlogo 139041,
system
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5.22
Clculos
Observaciones
La diferencia de la glucosa total (muestra de sacarosa) y la glucosa,
dar la absorbancia correspondiente a la sacarosa.
La concentracin de sacarosa se calcula por la siguiente frmula, si el
vino ha sido diluido 10 veces:
Sacarosa = 16.41
Los vinos tintos tambin pueden analizarse por esta metdica, sin
necesidad de tratamiento previo alguno.
(As)
x As
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6. CARACTERISTICAS
CROMATICAS
CARACTERISTICASCROMATICAS 6.5
METODOA.O.A.C. nm. 976.11 6.6
METODOO.I.V. referencia 6.6
METODORAPIDOO.I.V 6.7
METODOOUGH, BERGYCHICHESTER 6.9
COLORDELOSVINOStintos y rosados 6.10
6.3
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Caractersticas cromticas
COMENTARIOS
La caracterstica cromtica de un vino, se basa en dos factores im-
es el factor cuantitativo que define la intensidad del
color, puede definirse tambin como transmitancia, ya que sta vara
inversamente proporcional a la intensidad. Un vino puede ser plido o
subido.
el factor de cualidad del color y corres-
ponde a la longitud de onda dominante (rojo, amarillo, verde, etc.) que
caracteriza la tonalidad.
El color de los vinos es muy variable, debido a su origen, forma de
elaboracin y envejecimiento. La medicin de las caractersticas
cromticas, debe realizarse con la ayuda de aparatos que puedan eva-
luar cualquier zona del espectro visible. El ojo humano no puede dis-
tinguir, por separado, los colores que configuran la tonalidad de un vino,
pero s su mezcla.
portantes, como son: luminosidad y tonalidad.
Luminosidad,
Tonalidad o cromancia, es
6.5 6.4
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METODOA.O.A.C. nm. 976.11
METODOO.I.V. referencia
1
Principiodel mtodo
Reactivos
Tcnica operativa
Principiodel mtodo
Para anlisis de control rutinarios en vinos blancos, puede emplear-
se un colormetro sencillo, que incorpore filtros entre 420 y 530 nm de
longitud de onda.
Medicin de la absorbancia en la longitud de onda de 430 nm. Como
patrn comparativo se emplea una solucin de cromato potsico.
Pre-
parada por disolucin de 0.040 gramos de cromato potsico,
reactivo puro para anlisis, en hidrxido potsico 0.05 M y
completar a un litro con la misma solucin de KOH.
1. Preparar el espectrofotmetro para trabajar con cubetas de 25
mmde paso de luz. Situar a 430 nmla longitud de onda.
2.Ajustar el aparato a 100% de transmitancia, con agua
destilada.
3.Situar luego una cubeta con la solucin de cromato y tomar
lectura.
4. La muestra de vino se mide a continuacin.
5. Las diferencias de transmitancia, nos darn la intensidad de
color de la muestra.
Mtodo espectrofotomtrico que permite el clculo de los valores
triestimulares y los coeficientes tricromticos necesarios para es
SOLUCION DE CROMATO POTASICO, 0.0002059 M.
1. Official Methods of Analysis, 15 edicin, nmero 976.11, (1990).
6.6
pecificacin del color, de acuerdo a los trminos de la Commission
Internationale de l'Eclairage.
Espectrofotmetro que permita las medidas entre 300 y 700 nm.
Cubetas de vidrio, aparejadas, de paso ptico , igual a 1, 2, 5 y 10 mm.
1. Si el vino es turbio, centrifugarlo o bien filtrar con filtro de
membrana.
2. Los vinos jvenes o espumosos, deben ser eliminados de la
mayor parte posible del dixido de carbono, por agitacin bajo
vaco.
3. El paso de luz de las cubetas, debe ser escogido de forma tal,
que la absorbancia medida est comprendida entre 0.3 y 0.7.
4. Efectuar las medidas espectrofotomtricas, utilizando como
lquido de referencia el agua destilada colocada en una cu-
beta del mismo paso ptico, para regular el cero en la escala
de absorbancias a las longitudes de onda: 445, 495, 550 y
625.
5. Anotar las absorbancias obtenidas por el vino en las cuatro
longitudes de onda indicadas, expresadas con tres decimales.
Es necesario transformar las absorbancias ledas, en transmitan-
cias. Todos los datos necesarios para el clculo, se pueden hallar en
halla
al final de este captulo.
Se fundamenta en la lectura de las absorbancias, a las longitudes de
onda de 420, 520 y 620 nm. Aplicable a vinos tintos y rosados.
Aparatos
Tcnica operativa
Clculos
Principiodel mtodo
b
el
apartado de clculos del mtodo COLOR DE LOS VINOS que se
METODORAPIDOO.I.V.
6.7
system
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Tcnica operativa
Clculos
Expresindelosresultados
1. El vino se somete a centrifugacin o filtracin por membrana,
para lograr una perfecta limpidez. No se diluye nunca el vino,
ya que la dilucin modifica el equilibrio de la materia colorante
del vino.
2. Se emplear una cubeta de paso de luz adecuada, para poder
efectuar la lectura. Este paso de luz puede ser de 1, 2, 5 y
10mm.
3. Ajustar a cero de absorbancia con agua destilada, en cubeta
con paso de luz igual a la que se va a utilizar con el vino,
empleando la longitud de onda de 420 nm.
4. Leer la absorbancia del vino a 420 nm.
5. Proceder como en 3), pero a 520 nm. .
6. Tomar lectura de la absorbancia del vino a 520 nm.
7. Proceder como en 3), pero con la longitud de onda de 620 nm.
8. Leer la absorbancia de la muestra del vino a los 620 nm.
Deben referirse las lecturas a 10 mm de paso de luz, por lo tanto
debern multiplicarse los resultados obtenidos de las absorbancias por
10, 5 y 2, si se han empleado cubetas de 1, 2 5 mm, respectivamente.
La por definicin, es la suma de las tres absorbancias a
420, 520 y 620 nm, referidas a 10 mmde paso de luz:
luminosidad
expresada con tres decimales.
se la considera como el cociente entre las absorbancias
a 420 y 520 nm, tambin expresada con tres decimales.
luminosidad,
= A + A520 + A
La tonalidad,
420 620
6.8 6.9
METODOOUGH, BERGYCHICHESTER
2
Principiodel mtodo
Tcnica operativa
Clculos
Observacindel autor
Como en todas las metdicas, se basa en la lectura de las absor-
bancias a 420 y 520 nm.
1.Filtrar el vino tinto a travs de una membrana de 0.45 micras.
2.Determinar el pHdel vino con exactitud.
3. Tomar 10.00 mLdel vino y colocarlo en un matraz de 100 mL.
4. Aadir al matraz, agua destilada, cuyo pHha sido ajustado por
adicin de una mezcla de cido ctrico y tampn de fosfato, al
mismo pHdel vino.
5. Se ajusta el espectrofotmetro con agua destilada situada en
una cubeta de 10 mmde paso de luz.
6. Acontinuacin se coloca el vino y se mide absorbancia a 420
nm.
7. Se procede, a continuacin, como en 5) y 6) pero en 520 nm.
Se calcula la luminosidad por la suma de las absorbancias y la to-
nalidad por el cociente de las absorbancias a 420 y 520 nm.
Si el espectrofotmetro permite la colocacin de cubetas de 1 mmde
paso de luz, no es necesaria la dilucin.
El empleo de cubetas de 1 mm de paso de luz, comporta facilidad
para el trabajo, por cuanto no es necesaria la dilucin. El problema
aparece en la limpieza de la cubeta despus del anlisis, aparte del
coste elevado de dicha cubeta. Se hace imprescindible el empleo de un
bao ultrasnico y buen detergente, para su perfecta limpieza.
la
2. C.S. Ough, H.W. Berg y C.O. Chichester, Am. J. Enol. Vitic., 13, pginas 32-39, (1962)
y J. Food Sci., 29, pginas 661-667, (1964).
system
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6.10 6.11
COLORDELOSVINOS
3
Principiodel mtodo
Aparatos
Tcnica operativa
Es un mtodo espectrofotomtrico que permite el clculo de los
valores triestimulares y de los coeficientes tricromticos necesarios
para la especificacin de color, con los trminos de la Commissin
Internationale de l'Eclairage (C.I.E.).
Se necesitar un espectrofotmetro que permita medidas de trans-
mitancia o absorbancia en la gama de las longitudes de onda del es-
pectro visible. Los valores de una misma transmitancia, medida varias
veces, no debe presentar diferencias superiores a 0.005. Cuando la
escala del aparato est graduada en valores de transmitancia
multiplicada por 100, es decir, expresados en porcentaje (T%), esta
diferencia no debe sobrepasar 0.5.
Cubetas de cuarzo o de vidrio de ndice de refraccin 1.5 como
mximo, que tengan las paredes paralelas que den a los lquidos un
espesor uniforme expresado en centmetros. El espesor debe ser
conocido con una precisin de 0.002 . Conviene disponer de cuatro
pares de cubetas cuyos espesores sean iguales a 0.1, 0.2, 0.5 y 1 cm.
El espesor del par de cubetas que hay que utilizar, est en razn
inversa a la intensidad del color del vino. Se elige de manera que la
absorbancia est comprendida preferentemente entre 0.3 y 0.7
(transmitancia comprendida entre 0.5 y 0.2).
1. Si el vino no est limpio, se centrifuga o filtra a travs de
membrana. Si es espumoso o de aguja, se elimina el gas por
agitacin a vaco.
2. Se miden directamente en el espectrofotmetro las trans-
mitancias del vino a las siguientes longitudes de onda: 625,
550, 495 y 445.
3. Segn la intensidad colorante del vino, se elegir la cubeta de
espesor ms conveniente.
b b
b
b
A
3. B.O.E., 11 de octubre de 1981.
4. Se utiliza el agua destilada como lquido de referencia, en una
cubeta del mismo espesor.
Calcular las coordenadas (x, y) del punto representativo del color del
vino en el diagrama tricromtico de la C.I.E.
Los valores triestimulares X, Y y Z expresan las proporciones de
colores rojos, verdes y azules que dan por mezcla el color del vino.
Cuando el espesor de la cubeta sea inferior a 1 cm, referir la trans-
mitancia a 1 cm en la siguiente forma: si la transmitancia viene
expresada en porcentaje:
T=transmitancia referida a 1 cm de espesor de cubeta.
T'=transmitancia obtenida para cm de espesor de cubeta.
=espesor en cmde la cubeta utilizada.
Como los espectrofotmetros estn generalmente graduados tanto
en transmitancia como en absorbancia , se puede tambin calcular
la transmitancia en 1 cm de espesor del vino a partir de la absorbancia
observada en el espesor , si la medida se ha hecho en cubeta de
espesor inferior a 1 cm, teniendo en cuenta que:
A = log 1/T
Con este fin se calculan las absorbancias en un cm de espesor
multiplicando respectivamente por 2, 5 y 10 las absorbancias ledas en
un espesor de 0.5, 0.2 y 0.1 cm. Se obtienen despus los valores
correspondientes de transmitancia bien por aplicacin de la relacin
anterior, bien refirindose a la tabla calculada a partir de esa misma
relacin. Ver tabla V.
Clculos
b
T=T'" y
b
b
T A
b
A
b
s
x =
X
X + Y + Z
y =
Y
X + Y + Z
X = 0.42T + 0.35T + 0.21T
Y = 0.20T + 0.63T + 0.17T
Z = 0.24T + 0.94T
625 550 445
625 550 445
495 445
T =
T
1/b
100
(1/b)-1
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6.12 6.13
Expresinderesultados
Luminosidad relativa. Es el Y,
y=0 y y=100).
Cromaticidad.
Q
valor de expresado en porcentaje
(siendo el negro el incoloro
Para expresar la cromaticidad (longitud de onda do-
minante y pureza) se recurre al diagrama de cromaticidad, que re-
presenta el locus de todos los colores del espectro, considerando
que a 400 nm, corresponde el azul, a 520 nm corresponde el verde y a
700 nm el rojo. El punto O corresponde a la fuente luminosa utilizada,
que, en este caso, es el iluminante standard , que representa la luz de
un da medianamente claro y cuyas coordenades son:
X =0.3101 yY =0.3163.
0 0
Longitud Conocidas las coordenadas x de[
color, se une el punto de esas coordenadas Cal punto O. En el punto en
que esta recta corta el Spectrum Locus, se encuentra la longitud de
onda dominante, que corresponde al matiz de este color. As en el caso
de vinos de tono teja, la longitud de onda dominante se sita entre 585 y
598 nm aproximadamente. Para los vinos de un color tinto franco, se
sita entre 599 y 650 nm, mientras que para los vinos de tono rojo
prpura, est caracterizada por la longitud de onda dominante del color
complementario. Se obtiene el valor de esta longitud de onda,
prolongando la recta en la direccin de C hacia Opara que ella corte el
SpectrumLocus como hemos visto antes.
Este color complementario en el caso de vinos de tono rojo prpura
se sita en el verde. Se anota el valor de esta longitud de onda seguida
de (complementario), por ejemplo 495 .
. La pureza se calcula, determinando la distancia relativa del
punto C que representa el color del vino examinado y del punto S que
corresponde al Spectrum Locus al punto O, que representa al
iluminante.
Se expresa la pureza en porcentaje por la relacin:
a) El color de un vino, queda completamente definido por la lumi-
nosidad relativa en porcentaje y las coordenadas tricromticas x e
b) Se pueden preveer las caractersticas cromticas de una mezcla
de varios vinos cuando se conocen las caractersticas cromticas de
los mismos. Los valores triestimulares de la mezcla se obtienen
por la suma de esos valores, multiplicando por su proporcin para cada
constituyente.
de onda dominante. e y
c c
Pureza
Y y.
X, Y, Z
Observaciones
100 x
Distancia del punto C al punto O
Distancia del punto O al punto S
system
tel. +34 938 171 842 fax. +34 938 171 436

Tecnicas Analiticas para Vinos

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