AO DE LA INTEGRACIN NACIONAL DEL RECONOCIMIENTO DE NUESTRA DIVERSIDAD

EAP:

INGENIERA AMBIENTAL


ASIGNATURA:
MICROBIOLOGIA
DOCENTE:
CORDERO AZABECHE, Jorge
Integrantes:
Agustn baldeon Gaby
Huisa Altamirano Deisy
Molina vilcas Imelda
Orellana cerrn pamela
Sez lanasca Ruth
Salazar Hunuco Joel.
Camargo Colquechagua Nehemas
SEMESTRE: V



COLORACION GRAM Y COLORACIONES ESPECIALES





INTRODUCCIN



Para la observacin microscpica de microrganismos se puede realizar por
montaje hmedo o coloraciones, estos facilitan la observacin de diversas
estructuras. Los procedimientos de coloracin requieren la preparacin de un
tendido frotis de cultivo en bacterias o levaduras, se deja secar al aire y se realiza
su fijacin por medio de calor, para evitar que la muestra sea retirada al momento
de aplicar los colorantes y otros lquidos.
1
Esto nos permite el reconocimiento y
observacin ms ntida de constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas,
cpsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.
En la prctica realizada empleamos diferentes mtodos y reactivos para la fijacin
de color en las bacterias, identificando que existen diferencias tanto estructurales
como cromticas en diferentes especies microbianas observadas.














II.OBJETIVOS
GENERAL:
Identificar las principales estructuras microbianas mediante coloraciones especiales.
ESPECFICO:
Realizar montajes para observacin microscpica de bacterias.
Aplicar diferentes tcnicas de tincin.
Identificar esporas en el mtodo de Wirtz- Conklin.
Identificar capsulas en el mtodo de tincin negativa.
Hallar corpsculos meta cromticos en la saliva.
Observar la pared celular en el Mtodo de Robinow.
Observar la membrana celular en el Mtodo de Knaysi.
Observar el ncleo en las levaduras.
III. MARCO TERICO

COLORACIN GENERALIDADES
Debido a la naturaleza qumica de la clula bacteriana, su afinidad por los colorantes, su propiedad
ha sido aprovechada para estudiar los diferentes tipos morfolgicos y estructuras (capsulas, esporas,
flagelos, etc.) que ayudan a la identificacin de una especie o grupo en partculas. Los colorantes de mayor
aplicacin son: cristal violeta, violeta de genciana, fucsina bsica, safranina, azul de metileno y verde de
malaquita. Actan mejor mediante la adicin de mordientes, porque aumentan la permeabilidad de la
pared celular y membrana citoplasmtica.

Tincin de Gram o coloracin Gram:
Es un tipo de tincin diferencial empleado en microbiologa para la
visualizacin de bacterias, que desarroll la tcnica para poder referirse a la
morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera
aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram
positiva a las bacterias que se visualizan de color violeta y Bacteria Gram
negativa a las que se visualizan de color rosa.

Qu es una coloracin Gram, y para qu sirve?:
Se usa para diferencias caracterstica de la bacteria el colorante (es un color
violeta casi azul), entonces esas son GRAM +. Hay otras bacterias que no


tienen casi pared celular (es muy pobre), y en virtud de eso, no retienen el colorante (y son de color
rosadito), entonces esas son GRAM.

(1)
Libro Ecologa Microbiana Pj 58- 70
fundamentos de diferenciacin de Gram positivo y Gran negativo:
Los fundamentos de la tcnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram
positivas y Gram negativas Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y
se encuentra unida a una segunda membrana plasmtica exterior


Bacteria Gram negativa:
Las bacterias Gram negativas a aquellas bacterias que no se tien de azul oscuro o violeta por la tincin de
Gram, y lo hacen de un color rosado tenue: de ah el nombre de "Gram-negativas" o tambin
"gramnegativos.
Bacteria Gram-negativa. 1-membrana citoplasmtica (membrana interna), 2-espacio periplasmtico, 3-
membrana externa, 4-fosfolpidos, 5-peptidoglicano, 6-lipoprotena, 7-protenas, 8-lipopolisacridos, 9-
porinas.

Bacterias Gram positivas y Gram negativas

Otro sistema de clasificacin de las bacterias utiliza las diferencias en la composicin de su
pared celular. El empleo de una tcnica llamada tincin de Gram pone de relieve estas
diferencias identificando las bacterias como Gram positivas y Gram negativas. Tras la tincin,
las bacterias Gram positivas retienen el tinte y se colorean de violeta, mientras que las
bacterias Gram negativas liberan el tinte y se tien de color rosado. Las especies

Enterobacter (Enterobacterias)
Enterobacterias, nombre comn de una familia de bacterias Gram negativas que reciben este
nombre porque suelen encontrarse en el intestino de los mamferos. Las especies que poseen flagelos son
mviles; el resto, inmviles.
2.8 Estreptococo
Bacteria Gram positiva de forma esfrica. Los estreptococos aparecen en pares o cadenas, y algunas
especies son patgenas en los seres humanos. Las infecciones estreptoccicas comprenden la faringitis, la
escarlatina, erisipelas, fiebre puerperal y algunas neumonas.








TINCIN DE GRAM
Esta tincin desarrollada por el doctor Cristian Gram en 1884, es hoy la ms utilizada en los laboratorios de
bacteriologa y permite, de acuerdo con la estructura y grosor de la pared bacteriana, agrupar las bacterias
en gran positivas y en gran negativa. La gran positiva poseen una capa gruesa de peptidoglican y carecen de
membrana externa, mientras que la gran negativa tienen una capa ms delgada de peptidoglican y poseen
una membrana externa.
Algunas bacterias se clasifican como gran variables, pues simultneamente presentan tincin se gran
positivas y de gran negativas, aun bajo condiciones ptimas de cultivo. Sin embargo, en su estructura estas
bacterias poseen una pared de gran positivas, aunque la capa de peptidoglican es ms delgada que la
mayora de las bacterias gran positivas.
Esta tincin adems, correlaciona con otras propiedades como endotoxinas, susceptibilidad a antibiticos,
sensibilidades resistencia a sales biliares, punto isoelctrico y tencin superficial.
La tincin de gran involucra varios pasos:
1. Tincin inicial: Las clulas con cristal violeta, el cual es el colorante primario. En este paso todas las
clulas se tien de morado.
2. Mordente: Se adiciona yoduro (lugol) que reacciona con el cristal violeta y forma un complejo
cristal violeta yoduro. En este punto toda la clula continan de color morado.
3. Decoloracin: Se adiciona un solvente no polar, el cual acta lavando el complejo cristal violeta
yoduro de las clulas gran negativas. De manera las bacterias gran positivas continan moradas y
las negativas quedan incoloras. Este es el paso critico de esta tincin, pues si se exagera, decolora
las gran positivas y si se hace muy dbil no decolora a las gram negativas.
4. Contratincion: Se vuelve a teir con safarina o fucsina, de manera que las bacterias gram negativas,
que haban sido decoloradas, se tien de rosado a fucsia segn el colorante empleado; en tanto, las
bacterias gran positivas no se afectan con la contratincion y permanecen moradas debido a lo
intenso de esta coloracin.
Adems de una excesiva decoloracin, otro factor que puede influir en que las bacterias gran positivas se
observen parcial o completamente rosadas, es la edad del cultivo; las clulas viejas tienden a perder su
capacidad de retener el complejo cristal violeta yoduro y por lo tanto las bacterias se vern rosadas. Otro
factor de variabilidad podra ser condiciones de estrs durante el cultivo, que genera formas gran negativas
no viables, dentro de un cultivo de clulas gran positivas.
(2)

)
Bacteriologa General: Principios Y Prcticas de Laboratorio / Evelyn Rodrguez Cavallini






CULTIVOS DE BACTERIAS: Descripcin de cada una de las bacterias
utilizadas en el laboratorio.


ESCHERICHIA COLI: Es husped constan te del intestino del hombre y de los
animales de sangre c aliente .por su especificidad est considerado como buen
ndice de contaminacin fecal .tiene el inconveniente de vivir poco tiempo en el
ambiente extraenterico, por lo que su presencia en los alimentos indica
contaminacin reciente.
(3)

(
Microbiologa Alimentaria: Metodologa Analtica para Alimentos y Bebidas /
Mara del Rosario Pascual Anderson,Vicente Caldern y Pascual
SACCHAROMYCES : Es un gnero en el reino de los hongos
que incluye muchas especies de levadura.



BACILLUS: Es un gnero de bacterias en forma de bastn y
gram - negativas. Son aerbico estrictos o anaerbicos
facultativos.



ESTAFILOCOCOS: Es un tipo de bacteria que vive o est presente en la
mucosa especialmente alrededor de la nariz, boca en muchas
superficies de la piel de los humanos y otros sin ocasionar ningn
dao.






TINCIN DE NCLEO EN LEVADURAS
Ciertos factores citoplsmicos (que normalmente interfieren con el teido del ncleo) deben hidrolizarse
antes de aplicar la tincin nuclear (azul de toluidina). En el siguiente experimento tambin se tendr la
oportunidad de estudiar la morfologa general de la2 levadura tpica .En el procedimiento se incorpora el
3azul de toluina.
Levadura: Son hongos que carecen de gemacin, en forma de agregados sueltos de clula independientes,
que pueden ser globosas, cilndrica, alargadas.
Azul de toluina: Colorante que tie estructuras basfilas, tales como la cromatina.
(4)

(4)
http://www.e-histologia.unileon.es/1inicio/home/tecnicas.htm
TINCIN SIMPLE
Esto es, utilizando solo un colorante. El valor de esta
clase de tensin radica en su simplicidad y facilidad de
empleo. El frotis, previamente fijado, se cubre con un
colorante durante el tiempo adecuado, se lava el exceso
de colorante con agua y se seca el portaobjetos, los
colorantes bsicos como el cristal violeta, azul de
metileno y carbolfucsina se emplean con frecuencia para
determinar el tamao, la forma y la organizacin de las
bacterias
(5)

(5)
Prescott Harley Klein Microbiologa quinta
edicin Pg. 29



Las tinciones ms simples se realizan sobre
preparaciones previamente secadas. Sobre un porta con
una suspensiones de microorganismos previamente
secada y fijada, se derrama una pequea cantidad de
una solucin diluida del colorante y se mantiene el
contacto durante uno o dos minutos; a continuacin se







lava variaras veces con agua y se seca. Este tipo de preparacin suele observarse con un objetivo de 100X y
aceite de inmersin.
(6)

(6)
Brock biologa de los microorganismos dcima edicin pg. 79



TINCIONES.-E l microscopio de campo claro es ms til para la observacin de especmenes teidos. Los
colorantes son compuestos qumicos utilizados para aumentar el contraste existen algunos llamados:

COLORANTES VITALES.-Que pueden aadirse directamente a una preparacin en fresco; por tanto
colorean clulas vivas. No obstante la mayora de colorantes son efectivos despus de que los
microrganismos hayan sido fijado, es decir se encuentren murtos y adheridos al portaobjetos. Para la
fijacin del calor se realiza una fina extensin de una gota d muestra lquida en el portaobjetos y se deja
secar al aire libre o sobre la llama del mechero, el calor de la llama mata las clulas microbianas por des se
utiliza la fijacin qumica, ya que es menos lesiva que el calor. Para ello se aade una gota de fijador, como
acido osmtico, etc. naturalizacin de sus protenas; las protenas coaguladas unen sus clulas al porta. Para
las fijaciones de especmenes delicados
La fijacin posee algunos inconvenientes, a menudo distorsiona la apariencia real de las clulas y no permite
la observacin del movimiento de los microrganismos.
TIPOS DE COLORANTES
Casi todos los colorantes son sales, compuestos formados por iones cargados.

LOS COLORANTES BSICOS.-son aquellos en los cuales el agente que tie es el ion cargado positivamente
ya que estos son los ms utilizados, ya que la mayor parte de clulas microbianas poseen cargas dbilmente
negativas en la superficie lo cual facilita su unin. Entr los colorantes ms comunes se encuentran la
safranina, la fucsina bsica, el cristal violeta y el azul de metileno.

LOS COLORANTES ACIDOS.-el colorante es el ion cargado negativamente, estos colorantes se unen a las
partes de las clulas cargados positivamente. S utilizan para teir tejidos animales infectados con
microrganismos. Entr los ms frecuentes tenemos a la eosina, la fucsina acida y el rojo Congo.

TIPOS DE TINCIONES:

TINCIONES SIMPLES.-Se usa un nico colorante, de tipo bsico usado solo para incrementar el contraste,
mejorando la observacin de la clula completa.

TINCIONES DIFERENCIALES.-Se utilizan para distinguir entre tipos de microrganismos, esta tcnica primero
se hace con una tincin simple seguido de una de contraste en donde se usa otro colorante. Estas tinciones
son muy usados en microbiologa por ej. La tincin gran y la tincin de cido-alcohol, ambas aplicadas a
bacterias.

LA TECNICA DE TINCIONES GRAM.-


Desarrollado por el bacterilogo Dans Cristian Gram en 1884, clasificando las bacterias en dos grupos:

GRAM POSITIVO.-La tcnica incluye tincin primaria, decoloracin y de contraste, se tie el espcimen de
cristal violeta aadiendo el mordiente, aplicando el agente decolorante (acetona), en donde las bacterias
retienen el colorante, aadiendo safranina proporcionndolo un color violeta ms intenso. Los bacilos y
cocos gran positivos formadores de endspora consta de siete gneros entre ellos bacillus y Clostridium
ampliamente distribuidos y son de gran importancia clnica. Ambos son bacilos y algunas especies son
mviles por flagelos periticos. Todas las especies clostridium son anaerobios y de hbitat en el suelo. Todos
los basillus realizan una respiracin aerbica y algunas anaerbicas facultativos capaces tambin de
fermentar. Debido a su bajo contenido de agua, las endosporas no teidas son fcilmente visibles al
microscopio.

GRAM NEGATIVO.-Con esta misma tcnica pierden su tincin violeta durante la decoloracin y se han
teido de rosa con el colorante en contraste. En su variedad se encuentran helicoidales, vibroides, aerobias,
microaerofilas todos los miembros crecen en mejores concentraciones de oxigeno inferiores a la del aire.
Este grupo comprende varios organismos interesantes como el compylobacter (agente causante de
diarreas), azospillirium (importantes para el mantenimiento de la fertilidad de los suelos tropicales) viven en
estrecha asociacin con las races de las plantas. Este grupo incluye especies que afecta en gran medida a la
salud humana y a nuestro medio ambiente.

COLORACIN GRAM: La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin diferencial empleado
en microbiologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas. Se utiliza tanto para
poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin a la
diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color
moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella.

CORPSCULOS METACROMATICOS: Estas inclusiones se tien de rojo con algunos colorantes azules, como
el azul de metileno y se conocen tambin como grnulos de volutina. Se trata de una forma de reserva de
fosfato inorgnico (poli fosfato) que puede utilizarse en la sntesis de ATP. La volutina se forma
generalmente en clulas que crecen en ambientes ricos en fosfatos. Los corpsculos metas cromticas se
encuentran en algas, hongos y protozoos, as como en bacterias. Estos grnulos son bastante grandes y
caractersticos en Corynebacierium diphtheriae, el agente etiolgico de la difteria, por lo que tienen valor
diagnstico.
















IV. MATERIALES Y REACTIVOS
MATERIALES:


PINZA
Son un tipo de sujecin ajustable,
generalmente de madera, que
forma parte del equipamiento de
laboratorio,




MECHERO DE
BUNSEN
Es un utensilio metlico que
permite calentar sustancias,
proporciona una llama caliente de
hasta 1500 grados centgrados.




ALCOHOL
Los alcoholes pueden ser
primarios, secundarios o
terciarios, en funcin del nmero
de tomos de hidrgeno.



ALGODN


Nos sirve para hacer las torundas,
es decir, para cubrir y proteger las
muestras que hagamos en el
laboratorio.



PORTA OBJETOS

Pieza o lmina rectangular de
cristal en que se coloca el objeto o
preparacin que va a ser
observado en el microscopio.



ACEITE DE
INMERSIN

Se aplica a la muestra para poder
observar la dicha muestra,
reflecta a la luz y se logra enfocar
a una gran ampliacin.





MICROSCOPIO

Es un instrumento que permite
observar objetos que son
demasiados pequeos para ser
vistos a simple vista.



ASA DE SIEMBRA
Es un material que nos ayuda para
poder realizar las siembras
adecuadamente, tiene una punta
de alambre que cuando lo
calentamos estamos
descontaminando.


REACTIVOS:
Solucin de
toluidina 0.1%en
etanol 10%


ETANOL DE 40% Y
DE 10%
Es un alcohol que se presenta en
condiciones normales de presin y
temperatura como un lquido
incoloro e inflamable con un punto
de ebullicin de 78 C

KOH Es higroscpico absorbiendo agua
de la atmsfera, por lo que termina
en el aire libre



YODO
Es el halgeno menos reactivo y
electronegativo.


V. PROCEDIMIENTOS Y RESULTADOS

1. COLORACION GRAM

PROCEDIMIENTO:

1. Desinfectamos el rea de trabajo ( alcohol )




2. Esterilizamos los materiales (aza de siembra) con ayuda del
mechero.


3. Sacamos una pequea porcin de muestra de los tubos con
cultivo gram - positiva y gram - negativas.



4. Obtenida la muestra en el aza de siembra la colocamos en el
portaobjetos y realizamos el frotis y la fijacin de los
diferentes cultivos de bacterias. Cada colorante que se
utilizara ser de una cantidad de 2 3 gotas.




5. Luego de ello cubrimos con colorante (cristal violeta) la preparacin,
dejndola actuar en un periodo de un minuto.



6. Lavamos cuidadosamente con agua destilada (eliminacin del exceso de
colorante).

7. Se cubre la preparacin con colorante (lugol) por un minuto, con el
objetivo de aumentar la afinidad entre el colorante y las clulas.




8. Utilizamos el agente decolorante (alcohol acetona) lavando con
sumo cuidado dicha preparacin dejando actuar por un minuto.




9. En seguida echamos colorante de contraste (safarina). las bacterias gam
- positivas se teirn de color azul y las gran negativas color rosa debido
a este colorante.





10. finalmente secamos la muestra al aire libre, le aadimos 2 gotas aceite
de inmersin y observamos en el microscopio con el objetivo de
inmersin (100X).




RESULTADO:






2. TINCION SIMPLE

PROCEDIMIENTO:
1. Desinfectar nuestra rea de trabajo.
2. Encender el mechero y esterilizar el asa de siembra.

3. Dejar enfriar el asa de siembra para tomar la muestra de microorganismos, despus
acercar el tubo hacia la muestra quitarle el tapn y flamear rpidamente la
boca del tubo, introducir el asa en el tubo y tomar cuidadosamente la
muestra.


4. Hacer el frotis y secarlo y fijarlo.
5. Cubrir con colorante /azul de metileno/ la
preparacin y dejarlo actuar durante 1 minuto.


6. Lavar suavemente con agua destilada para eliminar el exceso de colorante.
7. Secar al aire y echar 2 gotas de aceite de inmersin.


8. Observar en el microscopio con el objetivo de 100X.

RESULTADOS:


Lugo del montaje al microscopio ptimo. Observamos flagelos finos filamentos de color
rojo. Cuerpo bacteriano de color azul.






3. COLORACION DE CORPUSCULOS METACROMATICOS: METODO DE
LOEFFLER.
En esta parte de la coloracin de corpsculos metacromaticos realizamos la prctica donde se
pueden encontrar en muestras de saliva de humanos.





Para realizar la
practica de
metacromatico con
la saliva primero
pusimos la muestra
de la saliva en el
cubre objeto .

Luego de poner la
muestra en el cubre
objeto durante 1
minuto.
Seguidamente
continuando con el
procedimiento a la
muestra le pusimos
azul de metileno
durante un minuto.




Luego de eso le
enjuagamos con agua
destilada y le pasamos
a secar por 1 minuto.




Seguidamente a la
muestra le pusimos
aceite de cedro para
luego ser observado en
el microscopio.





Luego de observar en el
microscopio pues vemos
estos resultados con
puntos de color azul
claro y granulaciones.
Bacillus subtilis


RESULTADOS:
En cuanto al procedimiento de la coloracin de corpsculos metacromaticos pues despus de ver
en el microscopio encontramos bacillus diferidos y su color es azul claro con granulaciones y las
granulaciones son de color ms oscuros pues despus de haber consultado que las granulaciones
pues se debe a la alcalinidad que se presentan.

4. TINCION DE NUCLEO EN LEVADURAS

PROCEDIMIENTO:
Prepara un frotis con clulas de levadura con
agua de llave

seque al aire, fije la lama muy suavemente.


Bae el porta durante un minuto con solucin
etanol al 40%.


Bae en agua de cao





Bae la solucin con KOH y dejarlo reaccionar
por una hora. Si se empieza a deshidratar
agregue KOH

Lave bien en la llave



Aplicar azul de toluidina por dos minutos.


Lave con etanol al 10% sacuda el exceso de
alcohol y seque al aire

Prepara otra porta objeto y procede solo
ahsta el segundo paso

En vez de KOH colocar azul de toluidina por 2
minutos y continu con el frotis.





RESULTADOS:
Los resultados se observaron en el microscopio con lentes de 100x.

5. Tincin de ncleo en levaduras
Los ncleos se tien de color azul oscuro o rosa y el citoplasma rosa claro.
El ncleo (azul oscuro o rosa)

El citoplasma (rosa claro)
















6. COLORACIN DE MEMBRANA CELULAR: MTODO DE KNAYSI
La membrana citoplasmtica es de naturaleza lipoproteica y da una reaccin acida unindose
intensamente con colorantes bsicos y neutros. No obstante esta propiedad, el doble contorno de la
membrana se aprecia mejor cuando se retrae el protoplasma o cuando se trata con algn solvente
orgnico que pueda diluir las grasas y deje expuesto el contorno a la accin de los colorantes.
MATERIALES:
REACTIVOS
























PROCEDIMIENTO
Preparacin para la Coloracin de la Membrana Celular (BACTERIA DE BACILLUS Y E. COLI):

Preparamos el repectivo frotis extrayendo
las muestras de bacterias(Bacillus y E.Coli)
hecho ya la frotis pasamos las dos laminas
con las bacterias por el ETER durante 5
minutos; realizamos esto para que las
bacterias esten bien adheridas a las laminas.
pasado los 5 minutos vertimos unas cuantas
gotas de liquido de bouin sobre ambas
muestras y la dejamos reposar 10 minutos
PRIMER
PASO
SEGUNDO
PASO
TERCER
PASO
CUARTO
Y QUINTO
PASO



RESULTADOS:
Colocando ambas muestras en el microscopio con el objetivo de 100x.







No pudimos observar muy bien porque habamos enjuagado mucho ambas muestras y no
se vea bien, entonces volvimos hacer el mismo procedimiento a ambas bacterias y resulta
que observamos que la membrana celular se vio un color pardo oscuro y el citoplasma
amarillo.

RECOMENDACIN:
Pasados los minutos
escurrimos ambas
muestras con agua
destilada de manera
vertical y hechando el
agua a la parte superior
de la lamina para que
este no caiga un chorro
de agua muy fuerte y la
muestra se salga.

Hecho esto ambas
muestras seguimos el
mismo procedimieto
vertimos una gota de
lugol y colocamos el
respectivo cubreobjeto
de ambas muestras de
bacterias.


Hecho todos estos pasos
procedemos a observar
al microscopio con el
objetivo de 100x.


o No colocar mucho el fijador de bouin ni lugol en las lminas, porque no se podr
observar muy bien las bacterias.

o No echar directamente a la muestra un chorro de agua con la pizeta, porque la
muestra se podra salir, para eso se debe de inclinar las lminas donde se
encuentran las muestras y echar agua desde la parte superior, para que no caiga
directamente en la muestra.
CONCLUSION:
Esta tecnica de knaysi que utilizamos es muy escencial para este tipo de muestra ya que
nos sirvio para identificar la coloracion de membrana plasmatica de color pardo oscuro
como el citplasma de color amarillo.



VI. DISCUSIN DE RESULTADOS
COLORACION GRAM

TINCION SIMPLE
COLORACION DE CORPUSCULOS METACROMATICOS: METODO DE LOEFFLER.
Pues una vez realizado la practica en el laboratorio sobre el corpsculos metacromasticos pues
observamos que se presentaba con granulaciones de color oscuro y algunos puntos claros de color
azul claro pues eso es debido a la alcalinidad que se presenta pero si un caso no presentara las
granulaciones seria a la baja alcalinidad en la saliva pues eso es viendo desde otro punto de los
resultados.

TINCION DE NUCLEO EN LEVADURAS


VII. CONCLUSIONES
COLORACION GRAM
Concluimos que en la prctica de laboratorio pudimos identificar que la morfologa de las bacterias
(escherichia coli, saccharomyces, bacillus, estafilococos) y el tipo de tincin que presenta. Las gram
positivas poseen una gruesa capa de peptidoglucano la cual impide que escape el complejo cristal
violeta lugol. Es por ello que tien un color azul (escherichia coli, saccharomyces), mientras que
la capa peptidoglucano de las bacterias gram negativas es delgada y se encuentra a una
membrana externa lipidica susceptible a la decoloracin con alcohol acetona; estas bacterias
teirn de color rosa debido a la safarina (colorante de contraste)( bacillus, estafilococos).




TINCION SIMPLE
Con esta prctica aprendimos a realizar adecuadamente la preparacin correcta de un
frotis para poder realizar posteriormente las tensiones ms utilizadas para el laboratorio
de microbiologa que son indispensables para el correcto estudio de los
microorganismos.

As mismo mediante la realizacin de las tinciones logramos observar la forma y
agrupacin y caractersticas de las bacterias.

La tincin simple es una herramienta muy til en el laboratorio de microbiologa as como
anlisis clnicos siendo ineludible conocer su fundamento y procedimiento, para poder
tener una correcta interpretacin de los datos que nos otorga la diferenciacin de Gram
positiva y negativas concluimos que debido a la estructura de sus paredes celulares
tendrn o no propiedades patolgicas diferentes .


COLORACION DE CORPUSCULOS METACROMATICOS: METODO DE LOEFFLER.

En conclusin diramos que la practica en el laboratorio sobre el corpsculos metacromaticos nos
ayudaran a ver sobre la alcalinidad de nuestra saliva y as tendramos que saber sobre cada uno
de nosotros pienso que es muy interesante realizarnos ese tipo de prcticas en el laboratorio.

TINCION DE NUCLEO EN LEVADURAS
Para realizar las coloraciones especiales se puede emplear diferentes mtodos e instrumentos, lo
importante es que logremos el objetivo que se tiene en cada prctica, en este caso es ver las
diferentes estructuras microbianas a travs de las coloraciones especiales que se puede emplear
en cada mtodo.
Adems se quiere identificar si cada muestra pertenece al grupo del Gram positivos o negativos.
TINCIN DE NCLEO EN LEVADURAS

Se observ la levadura en forma de cocos, con color azul claro.
Gram positivo

VIII. RECOMENDACIONES
COLORACION GRAM



TINCION SIMPLE
COLORACION DE CORPUSCULOS METACROMATICOS: METODO DE LOEFFLER.
1. Se recomienda verter los lquidos reguladores de pH, NaOH (bsico) y el HCl (cido), gota a
gota para regular de manera exacta el agar y evitar accidentes con exceso de los mismos.
2. Utilizar los materiales de laboratorio con cuidado, por ser frgiles.
3. Leer la prctica y pedir orientacin al docente antes de ingresar al laboratorio, para el
desarrollo correcto de la actividad.

TINCION DE NUCLEO EN LEVADURAS

x. ANEXOS


CUESTIONARIO

1. Investigue cuales son las estructuras celulares o molculas responsables de la
tincin simple realizada. De ejemplos de otros colorantes que se podran
utilizarse.
Una de las herramientas principales en el estudio de las clulas es la tincin diferencial.
Una tincin diferencial es cuando dos o ms reactivos se aplican para impartir color a la
clula, mientras que una tincin simple implica la adicin de un solo reactivo.las protenas
son sustancias anfotericas que puede ionizar ya sea como cidos o como base, Como las
protenas constituyen la mayor parte de los slidos en la clula ellas participan en la
mayor parte de las reacciones de teido.
http://es.scribd.com/doc/62416626/Manual
Colorantes que podran utilizarse:
- Azul metileno Loeffer
- Azul de lactofenol
- cristal violeta
- Safranina


- Fusina diluida
2. Cules son las principales precauciones de manejo del microscopio y porque se
debe de utilizar el aceite de inmersin al hacer el estudio microscopio de
bacterias?
Precauciones:
No tocar las lentes con las manos. si ocurriera limpiar suave y cuidadosamente con
papel filtro o papel de ptica.
No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina.
No forzar los tornillos giratorios( macrometrico,micromtrico,platina,revolver y
condensador)
Nunca cambiar de objetivo agarrndolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras
se est observando la muestra a travs del ocular.
Mantener limpia y seca la platina del microscopio.
Concluido las prcticas de laboratorio revisar el microscopio.

3. El aceite de inmersin se utiliza eliminar casi completamente la desviacin de los
rayos de luz y se aumentar la eficacia de los objetivos de los microscopios.
Nos ayuda a enfocar objetos muy pequeos, como las bacterias individuales y
aplicaciones de alta resolucin.

http://www.tecnicaenlaboratorios.com/Nikon/Info_aceite_de_inmersion.htm

4. Cules son las ventajas o ilimitaciones de la tincin simple?

Ventajas:
La ventaja de esta tcnica es su sencillez, lo que permite observar en minutos las distintas
morfologas, tamaos y agrupaciones bacterianas.
Desventaja:
La desventaja consiste en que no es posible diferenciar si en la muestra existen
microorganismos de distinta composicin qumica.
Ttulo Microbiologa Estomatolgica
Autor Negroni


Edicin 2
Editor Ed. Mdica Panamericana, 2009

5. Cules son las fuentes de error ms frecuentes en la preparacin del frotis?
Fuentes de error:
Precipitacin del colorante en forma de agujas, por exceso de calos del
portaobjetos antes de su adiccin.
Contaminacin bacteriana de los reactivos.
Artificios coloreados, procedentes de la muestra o de suciedad del
portaobjetos.
Mala tcnica de coloracin que no refleja la realidad de las caractersticas tinto
riales del microorganismo.
Las bacterias gram positivas viejas, muertas o en contacto con antimicrobianos,
pueden parecer gram negativas por alteracin de sus propiedades fsicas y
qumicas.
Hay bacterias grampositivas que pierden el colorante con facilidad y pueden
aparecer gramnegativas al mismo tiempo.
Las bacterias con tincin bipolar pueden dar lugar a confusin en su
morfologa.
Las bacterias que tien dbilmente pueden pasar desapercibidas.
Hay microorganismos que no se tien con esta tincin.

Ttulo Microbiologa clnica prctica
Autores Pedro Garca Martos, Fernando Paredes Salido, Mara Teresa Fernndez del Barrio
Edicin 2
Editor Servicio Publicaciones UCA, 1994

6. Explica en forma completa la teora que explica la tincin Gram. Investigue
otros dos ejemplos de tincin diferencial?
Tincin gram:
Se utiliza para diferenciar tipos de bacterias.las muestras bacterianas se extienden
sobre un porta, se tien con un colorante violeta, se tratan con alcohol acetona (un


decolorante) y finalmente se contratien con un colorante rojo. Las bacterias
grampositivas retienen el primer colorante, y aparecen azul oscuro al microscopio,
por ejemplo las bacterias que tienen una gruesa capa de peptidoglucano en su
pared. En las bacterias gramnegativas, el alcohol acetona lava el colorante violeta y
les permite tomar la contaminacin, de forma que aparezcan rojas al microscopio.
La pared celular de estas bacterias tiene una capa externa de lipoprotena sobre
una delgada capa de peptidoglucano. La tincin se denomina asi en honor del
bacterilogo dans H. C. J. Gram (1853 1938), que fue quien primero describi la
tcnica (despus modificada) en 1884.
tulo Diccionario de Ciencias
Diccionarios Oxford-Complutense
Diccionario de ciencias, Domingo Agustn Vzquez
Traducido por Domingo Agustn Vzquez
Edicin Ilustrada
Editor Editorial Complutense, 2000
ISBN 8489784809, 9788489784802
N. de pginas 1128 pginas


Ejemplos:
Tincin de cido alcohol resistencia. (fija de modo firme solo a las
bacterias que poseen ceras en las paredes de sus clulas).
Ttulo Introduccin a la microbiologa
Autores Gerard J. Torture, Berdell R. Funke, Christine L. Case
Edicin 9
Editor Ed. Mdica Panamericana, 2007

Tincin de ziehl Neelsen (la tcnica es capaz de diferenciar dos grandes
grupos de eubacteria: BAAR positivas y BAAR negativas).BAAR: bacilos
acido alcohol resistentes.
http://www.slideshare.net/josemagarinos/tinciones-diferenciales-aspectos-
tecnicos





7. Cules son las fuentes de error ms frecuentes en la tincin Gram?

Los peores obstculos de la Tincin, que impiden conseguir el resultado perseguido, son los
errores del tcnico. Para evitarlos hay que elegir bien los reactivos y ser muy cuidadosos al
ejecutar la tcnica. A continuacin describimos algunas de las fuentes de error: Impurezas en los
reactivos de Tincin.
Concentracin inadecuada de los reactivos de tincin.
pH inadecuado.
El colorante se fija a la clula por mecanismos fsico-qumicos, que se alteran si el Ph no es el
apropiado.
Los colorantes pueden ser cidos, bsicos o neutros.
Tiempo de Tincin incorrecto.
Temperatura suficiente.

8. Cul es la base bioqumica de la coloracion Gram?
El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el
microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que la
rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste es la utilizacin de colorantes. Estos
pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de clulas o para revelar la presencia de
determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares,
centros de actividad respiratoria,

9. Si cambiara el orden de empleo de los colorantes primarios y de contraste cree
que la tincin seguira permitiendo distinguir entre bacterias grampositivas y
gram negativas.
Si por que primero se tien que fijar la muestra
10. Existe alguna relacin entre el tipo de morfologa y la tincin de gram.
La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin diferencial empleado en
microbiologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas.



11. Qu tipo de morfologa y de agrupacin ha podido observar en las muestras de los
cultivos de Eschericha, Saccharomyces, Bacillus y Stafilococus.
ESCHERICHA COLI: pertenece a la familia Enterobacteriaceae y dentro de ella al grupo
coliformes, que se caracteriza por fermentar la lactosa con produccin de cido y gas a
37C. Adems, esta bacteria es capaz de llevar a cabo dicha fermentacin a 44C. Es de
inters su investigacin en alimentos por ser indicador de contaminacin fecal, que
implica una mala manipulacin del producto. Caractersticas estructurales y fisiolgicas:
. Bacilos Gram Negativos
. Citocromo C oxidasa negativos
. Fermentadores de la glucosa
. Fermentadores de la lactosa
. Productores de indo a 44C
. Reductores de nitratos a nitritos.
SACCHAROMYCES: El gnero Saccharomyces incluye muchos tipos diferentes de levaduras
y forma parte del reino de los hongos. La incapacidad para utilizar nitratos y la capacidad
de fermentar varios carbohidratos son las caractersticas tpicas de los Saccharomyces. Sus
colonias pueden crecer y madurar en 3 das y muestran un color amarillo oscuro. Muchos
miembros de este gnero se consideran muy importantes en la produccin de alimentos.
Un ejemplo es el Saccharomyces cerevisiae, que se usa en la produccin de vino, pan y
cerveza. Otros miembros de este gnero son: S. bayanus, utilizado para la produccin de
vino y S. boulardii, usado en medicina. Ms recientemente, se ha demostrado que el S.
boulardii es una subespecie del S. cerevisiae.

BACILLUS: Algunas de estas bacterias son productoras de esporas (Bacillus, Clostridium)
resisten algunos procesos de conservacin utilizados en la industria alimentaria en los que
las formas vegetativas se destruyen y son causa de alteraciones. Tambin especies de
estos gneros provocan enfermedades alimentarias.

STAFILOCOCUS: Especie perteneciente a la familia de micrococcaceae, microrganismo
ubicuo que se encuentra en el hombre y muchos animales como parte de la flora normal.
algunas cepas son capaces de elaborar entero toxinas aunque tambin es responsable de
algunas supuraciones y septicemias.


12. Indique que etapas debe de seguir para preparar una extensin de las siguientes
muestras: yogurt, saliva, una colonia bacteriana, re suspendida en agua, sedimento de un
rio.
YOGURT: Bacterias del yogurt. (A) Extensin de yogurt donde se pone de manifiesto la
presencia de bacillus lacticus con su tpica morfologa bacilar. (B) Aspecto de lactobacilus
observados con el microscopio electrnico de barrido. (C) Extensin de yogurt donde se
pone de manifiesto la presencia de Streptococcus lacti formando parejas (diplococos) o
cadenas (estreptococos). Las extensiones (A y C) estn teidas con azul de metileno.




SALIVA: Para preparar una extensin de saliva en el laboratorio se puede tener una
pequea muestra o poca muestra de saliva y luego fijarlo con azul de metileno y luego con
agua destilada y una vez concluido con la practica se debe de realizar el observado en el
microscopio para luego poder identificar los microrganismos o bacterias que se encuentran
presentes.

13. Cul es la finalidad tiene fijar las muestras cuando se realiza un frotis bacteriano.
La fijacin es muy importante ya que tiene por objeto provocar modificaciones en la
composicin fsico-qumico de la bacteria de forma que esta conserve definitivamente una
estructura similar a la que tenia en vivo, sin deformarse como consecuencia de los
tratamientos a que se vera sometida durante la tincin. Pero tambin sabemos que la
fijacin impide el arrastre de los microrganismos al quedar estos adheridos al portaobjeto y
hace que la pared celular sea ms permeable a los colorantes.


14. Seale las ventajas y desventajas de la tincin simple respecto del examen en fresco.
VENTAJAS: La ventaja principal es que nos permite observar estructuras que en su forma
natural carecen de coloracin suficiente para ser distinguidas por microscopio. Otra
ventaja es que nos permite distinguir entre diferentes tipos celulares, ya que distintas
clulas responden de manera diferente a las tinciones, adems de que, mediante el uso de
las llamadas tcnicas histoqumicas, podemos teir un determinado tipo celular y hacer
que slo estas clulas se tian, mientras que las otras no, as podemos seguir clulas que
tengan una enzima determinada o donde tenga una reaccin particular que no ocurra en
otras, siempre que se usen colorantes adecuados.

DESVENTAJAS: La principal desventaja es que, debido al tratamiento al que debe
someterse un tejido vivo para su tincin, las clulas acaban muriendo, con lo cual, no es
posible observar esas clulas activas en su estado natural, sino muertas.
15. Con los resultados de una tincin simple se puede saber si la muestra teida es un
cultivo puro.
La tincin simple es en que se utiliza un solo colorante se utiliza azul de metileno o
safranina de naturaleza bsica y pienso que la muestra si pueda que salga un cultivo puro
ya que solo se utiliza un solo tipo de colorante.











http://docencia.izt.uam.mx/gra/bioquimica1pdfs/1-1_celulas_procariontes.pdf



15. Qu es una vacuola de gas? Explique su estructura y funcin.

Es un cuerpo de inclusin orgnico realmente extraordinario. La vacuola de gas, est
presente en muchas cianobacterias, as como en bacterias fotosintticas purpuras y
verdes, y en algunas bacterias acuticas como Halobacterium y Thiothrix. Estas bacterias
flotan en o cerca de la superficie, gracias a las vacuolas de gas que les confieren
flotabilidad.

Estructura:
Las vacuolas de gas son agregados de un gran nmero de estructuras pequeas, huecos,
cilndricas, denominadas. La pared de las vesculas de gas no contiene lpidos y est
compuesta nicamente por pequeas protenas. Concretamente, se trata de la repeticin
de un nico tipo proteico conformando un cilindro rgido que es hueco e impermeable al
agua, pero totalmente permeable a los gases atmosfricos. Las bacterias con vacuolas de
gas pueden regular su flotabilidad para permanecer en la profundidad necesaria para
obtener una intensidad de la luz.
PRESCOTT MICROBIOLOGA QUINTA EDICIN PG. 54

16. Defina quimiotaxis, carrera y giros.

La quimiotaxis se define como la capacidad que tienen ciertos microorganismos para
percibir gradientes de concentracin de sustancias y a su vez dirigir su movimiento a favor
o en contra de ese gradiente. Esto les permitira encontrar condiciones ptimas para su
crecimiento y supervivencia.


Giro carrera








17. Explique de forma general la manera en que las bacterias son atradas por
sustancias como nutrientes, y repelidas por materiales txicos.

La mayora de las bacterias se desplazan mediante flagelos, apndices locomotores en
forma de hilos que se extienden hacia fuera de la membrana plasmtica ya que un
incremento en la concentracin de nutrientes facilitar una mayor interaccin de PQM.


FOTOS
Fotos del laboratorio










PINSAS COCINA
BURETAS
ALGODON AGUA DESTILADA
VASOS PRESIPITADOS
BURETAS MUESTRAS DE YOGURT
ENSENDIDO DE MECHERO











REACTIVOS BACTERIAS
COLORACION G + -
BACTERIA BASILUOS ESTERILIZACION DEL MATERIAL
MUESTRAS DESINFECTADAS
PRIMERA COLORACION LIMPIEZA DE LA MUESTRA
LIMPIEZA CON AGUA DESTILADA












1 MUESTRA 2 MUESTRA
3 MUESTRA
OBSERVACION DE LA MUESTRA 4. MUESTRA
5. MUESTRA
USO DE REACTIVOS USO DE REACTIVOS
FIJACION DE LA MUESTRA


bacillus




saccharomyces


metacromaticos




saccharomyces




E . coli


Nucleo de la levadura


E . coli




BACTERIA LEVADURA
VERDE
MALAQUITA
BACTERIA
3. MUESTRA BACTERIA
BACTERIA BASILUOS
FIJACION DE REACTIVOS
1 MUESTRA BACTERIA
SECADO DE LAS BACTERIAS
2 MUESTRA BACTERIA
BACTERIA LEADURA
MUESTRA 6
MUESTRA 7




BIBLIOGRAFA:

PRESCOTT MICROBIOLOGA QUINTA EDICIN PG. 70
http://docencia.izt.uam.mx/gra/bioquimica1pdfs/1-1_celulas_procariontes.pdf
Beishir, L. Microbiology in practice. A self-instructional laboratory course.5 Ed. Harper
Collins Pub. Inc., 1991.
Case, C.L. y T.R. Johnson. Laboratory experiments in Microbiology. The
Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1984.
Claus, GW. Understanding microbes: A laboratory textbook for microbiology. 1 Ed.
W.H. Freeman and Co. New York, 1989.
Collins, C.H. y P.M. Lyne. Microbiological methods. Butterworth & Co. (Pub) Ltd., 1985.