TEMA 5

EJEMPLOS Y APLICACIONES
DE LA INGENIERA
ENZIMTICA MOLECULAR
Ingeniera molecular de protenas
Diseo racional de enzimas: estructura-
funcin y mutagnesis dirigida.
Posibilidades. Ejemplos de la mejora de
estabilidad y propiedades de las enzimas.
Mutagnesis al azar y evolucin molecular
dirigida.
Metagenmica
Estructura
primaria
Sobreexpresin
Mutagnesis
Anticuerpos
Clonacin
Secuencia
Recombinantes
Naturales
Mutantes
Cristales
Estructura 3-D
Ingeniera de
protenas
GENES
PROTENAS
S
Purificacin Propiedades Estructura Funcin
Concepto: re Concepto: re Concepto: re Concepto: re- -- -dise dise dise dise ar una enzima (cuya estructura 3D es ar una enzima (cuya estructura 3D es ar una enzima (cuya estructura 3D es ar una enzima (cuya estructura 3D es
conocida) mediante cambios puntuales en residuos espec conocida) mediante cambios puntuales en residuos espec conocida) mediante cambios puntuales en residuos espec conocida) mediante cambios puntuales en residuos espec ficos ficos ficos ficos
Problemas Problemas Problemas Problemas
Necesidad de estructuras 3D del biocatalizador Necesidad de estructuras 3D del biocatalizador Necesidad de estructuras 3D del biocatalizador Necesidad de estructuras 3D del biocatalizador
Debemos considerar las prote Debemos considerar las prote Debemos considerar las prote Debemos considerar las prote nas como mol nas como mol nas como mol nas como mol culas din culas din culas din culas din micas micas micas micas
DISE DISE DISE DISE O RACIONAL O RACIONAL O RACIONAL O RACIONAL
Cambio en una propiedad a costa de otra Cambio en una propiedad a costa de otra Cambio en una propiedad a costa de otra Cambio en una propiedad a costa de otra
DISE DISE DISE DISE O RACIONAL O RACIONAL O RACIONAL O RACIONAL
Mutagnesis dirigida
(Michael Smith)
(Premio Nobel de
Qumica 1993)
Ingeniera de
protenas
Posibilidades de la ingeniera enzimtica molecular
- Aumento de la estabilidad de enzimas:
Ingeniera de puentes de azufre (Lisozima de T4)
Ingeniera de los dipolos de las a-hlices (Lisozima de T4)
Ingeniera de interacciones hidrofbicas (Lisozima de T4)
Ingeniera de interacciones inicas/puentes de H (Fosfolipasas; Glucosa isomerasa)
Ingeniera del valor absoluto de la entropa
Evitar inactivacin por oxidacin de residuos crticos (antitripsina y subtilisina)
- Alteracin de propiedades cinticas:
Alteracin de la eficacia cataltica (kcat/Km) (Subtilisina)
Control de la actividad enzimtica (Lisozima de T4)
Curvas pH/actividad: (Sern y cisten proteasas)
Cambios en la reactividad: (nuevos interferones)
- Nuevos anticuerpos:
Anticuerpos catalticos o abzimas
Inmunotoxinas
(Thr)
(Thr)
(Ile)
(Ile)
(Leu)
ON/OFF
Lisozima
ESTRS OXIDATIVO
(fumadores)
*AAT no funcional
*Elastasa sin control
*Degradacin elastina pulmonar
(enfisema)
Sustitucin Met-358 por Val
ANTITRIPSINA
SUBTILISINA
ABZIMAS (ANTICUERPOS CATALTICOS)
INMUNOTOXINAS
A B
ricina
Clula normal
Clula cancerosa
A Ab
A (toxina)
B (diana)
Ab (anticuerpo especfico receptor clula cancerosa)
EVOLUCI EVOLUCI EVOLUCI EVOLUCI N MOLECULAR DIRIGIDA: N MOLECULAR DIRIGIDA: N MOLECULAR DIRIGIDA: N MOLECULAR DIRIGIDA:
DISE DISE DISE DISE O NO RACIONAL DE BIOCATALIZADORES O NO RACIONAL DE BIOCATALIZADORES O NO RACIONAL DE BIOCATALIZADORES O NO RACIONAL DE BIOCATALIZADORES
1
a
Generacin
4
a
Generacin
3
a
Generacin
2
a
Generacin
Charles Darwin (1809-1882)
Padre de la Teora Evolutiva
Miles de millones de a Miles de millones de a Miles de millones de a Miles de millones de a os os os os
Evoluci Evoluci Evoluci Evoluci n natural n natural n natural n natural
Evoluci Evoluci Evoluci Evoluci n dirigida n dirigida n dirigida n dirigida
Semanas o meses Semanas o meses Semanas o meses Semanas o meses
ESCALA TEMPORAL ESCALA TEMPORAL ESCALA TEMPORAL ESCALA TEMPORAL
SELECCI SELECCI SELECCI SELECCI N EMP N EMP N EMP N EMP RICA RICA RICA RICA
Genes Genes Genes Genes parentales parentales parentales parentales
Mutag Mutag Mutag Mutag nesis aleatoria nesis aleatoria nesis aleatoria nesis aleatoria
Recombinaci Recombinaci Recombinaci Recombinaci n nn n
CREACION DE DIVERSIDAD CREACION DE DIVERSIDAD CREACION DE DIVERSIDAD CREACION DE DIVERSIDAD
Inserci Inserci Inserci Inserci n de la librer n de la librer n de la librer n de la librer a de genes a de genes a de genes a de genes
en un vector de expresi en un vector de expresi en un vector de expresi en un vector de expresi n nn n
Introducci Introducci Introducci Introducci n de la librer n de la librer n de la librer n de la librer a/vector a/vector a/vector a/vector
en el microorganismo en el microorganismo en el microorganismo en el microorganismo
Crecimiento de las colonias Crecimiento de las colonias Crecimiento de las colonias Crecimiento de las colonias
Transferencia de colonias Transferencia de colonias Transferencia de colonias Transferencia de colonias
a placas a placas a placas a placas multipocillo multipocillo multipocillo multipocillo
Expresi Expresi Expresi Expresi n de la enzima n de la enzima n de la enzima n de la enzima
SELECCION DE LA SELECCION DE LA SELECCION DE LA SELECCION DE LA
PROPIEDAD DESEADA PROPIEDAD DESEADA PROPIEDAD DESEADA PROPIEDAD DESEADA
Placa maestra
Gen Gen Gen Gen ganador ganador ganador ganador
NUEVA NUEVA NUEVA NUEVA
GENERACION GENERACION GENERACION GENERACION
1
2
3
4
5
6
7
mutaci mutaci mutaci mutaci n nn n
SCREENING
EVOLUCIN DIRIGIDA DE ENZIMAS
SELECCI SELECCI SELECCI SELECCI N EMP N EMP N EMP N EMP RICA RICA RICA RICA
3. ESTRATEGIAS DE ESTABILIZACI 3. ESTRATEGIAS DE ESTABILIZACI 3. ESTRATEGIAS DE ESTABILIZACI 3. ESTRATEGIAS DE ESTABILIZACI N NN N
COMPUESTO
ENZIMA INDUSTRIAL
LIPOLASA
SUBTILISINA
PEROXIDASA
ANTICUERPO VITAXIN
PROTEINA DE SANGRE
SUPRESOR DE TUMORES P53
ALFA INTERFERON
RECEPTOR DE CELULAS T
APLICACION
Pilas de combustible
Detergente para lavadoras
Detergente para lavadoras
Detergente para lavadoras
Medicamento contra el cancer
Substituto sanguneo
Medicamento contra el cancer
Frmaco antiviral
Medicamento para la artritis
COMPAIA
Oficina de Investigacin Naval, USA
Novo Nordisk
Maxygen/Novo Nordisk
Novo Nordisk (Novozymes, A/S)
Ixsys
Diversa
Universidad de Texas, Austin
Maxygen
Universidad de Illinois
APLICACIONES DE LA EVOLUCI APLICACIONES DE LA EVOLUCI APLICACIONES DE LA EVOLUCI APLICACIONES DE LA EVOLUCI N MOLECULAR DIRIGIDA N MOLECULAR DIRIGIDA N MOLECULAR DIRIGIDA N MOLECULAR DIRIGIDA
Aminoacil transferasa
p-nitrobencil-esterasa
Citocromo P
450
monooxigenasa
Lacasa
Subtilisina
p-nitrobenzil-esterasa
Subtilisina
p-nitrobenzil-esterasa
Cloroperoxidasa
Galactoxidasa
Atrazina hidrolasa
Timidina quinasa
Alquil-transferasa
Lipasa
Aspartato aminotransferasa
Dioxigenasa
Citocromo P
450
monooxigenasa
Lipasa
Esterasa
Transaminasa
Protena verde fluorescente
Subtilisina E
Lacasa
Peroxidasa de rbano
Galactoxidasa
AUMENTO DE LA ACTIVIDAD
AUMENTO DE LA EXPRESION GENICA
AUMENTO DE LA ENANTIOSELECTIVIDAD
ALTERACION DE LA ESPECIFIDAD DE SUSTRATO
AUMENTO DE LA ACTIVIDAD EN PRESENCIA DE DISOLVENTES
AUMENTO DE LA TERMOESTABILIDAD
PROPIEDAD EVOLUCIONADA PROPIEDAD EVOLUCIONADA PROPIEDAD EVOLUCIONADA PROPIEDAD EVOLUCIONADA ENZIMA ENZIMA ENZIMA ENZIMA
EL POTENCIAL DE LOS MICROORGANISMOS
SELECCI SELECCI SELECCI SELECCI N EMP N EMP N EMP N EMP RICA RICA RICA RICA
En 1 gramo de materia existen >10
9
bacterias (1000-1500
especies)
1) Aislar microorganismos
2) Aislar ADN Clonar
SELECCI SELECCI SELECCI SELECCI N EMP N EMP N EMP N EMP RICA RICA RICA RICA
Dos posibilidades:
> 3500 m
NUEVOS TERRITORIOS: NUEVOS TERRITORIOS: NUEVOS TERRITORIOS: NUEVOS TERRITORIOS: nuevas nuevas nuevas nuevas enzimas enzimas enzimas enzimas
SELECCI SELECCI SELECCI SELECCI N EMP N EMP N EMP N EMP RICA RICA RICA RICA
Metagenoma Metagenoma Metagenoma Metagenoma
Ruptura ADN
Clonacin
SELECCI SELECCI SELECCI SELECCI N EMP N EMP N EMP N EMP RICA RICA RICA RICA
Libreria
Clon
positivo
Secuenciacin
Expresin
Funcin
DNA
Enzima
T TT T CNICAS METAGEN CNICAS METAGEN CNICAS METAGEN CNICAS METAGEN MICAS PARA LA MICAS PARA LA MICAS PARA LA MICAS PARA LA
B BB B SQUEDA DE NUEVAS ENZIMAS SQUEDA DE NUEVAS ENZIMAS SQUEDA DE NUEVAS ENZIMAS SQUEDA DE NUEVAS ENZIMAS
Tcnicas Metagenmicas
No se necesita crecer microorganismos
Biodiversidad
Catalizadores ms especficos para
reacciones de inters
Nuevas enzimas? Nuevas reacciones?
SELECCI SELECCI SELECCI SELECCI N EMP N EMP N EMP N EMP RICA RICA RICA RICA