Fases Datos Detalle Justificacin N explantes Observaciones

Fase 0
Origen de las
plantas madre
Nombre cientfico: M. paradisiaca. La planta
posee un tallo subterrneo del cual se origina
un seudotallo que se forma por el
envolvimiento de las bases o vainas de las
hojas, por el centro de esta estructura brota el
eje floral.El material gentico usado en esta
investigacin fue recolectado en la Comuna
Tsachila va Puerto Limn del Cantn Santo
Domingo de los Colorados

El cultivo del banano (Musa spp.) en los pases de Amrica del Sur,
tiene especial importancia, no slo porque forma parte de la dieta de
sus habitantes, sino tambin, en virtud de los beneficios econmicos
que se derivan de las actividades bananeras, medidos a travs del
establecimiento de fuentes de empleo, la generacin de divisas e
ingresos a los pases (Romn, Alonso, Gonzlez, Xiqus &Snchez,
2001).

7 plantas
7hijuelos de 6
cm. cada planta



Segn Angarita y Perea (1991) una de las caractersticas del banano es
que por su condicin gentica de ser triploide, es decir tener tres juegos
de cromosomas, no es frtil y no genera semillas, su reproduccin se
lleva a cabo por la va asexual, la misma que implica la reproduccin y
diseminacin de enfermedades junto con la del material vegetal.
Una de las estrategias desarrolladas para evitar este efecto conjunto es
el cultivo in vitro de meristemos de banano, el cual permite generan
miles de plantas libres de enfermedades.

N de plantas
madre
7 plantas madre
El tipo de explante elegido para la presente micropogacion y al uso del
SIT no es necesario un nmero mayor a 7 plantas madre.
Fase 1
Explante
inicial
Puyones, colinos o hijuelos

Los colinos se usan ms comnmente ya que fructifican con mayor
rapidez que los otros propagulos (Simmonds, 1973),
49 hijuelos
cortados en la
mitad en total 98
hijuelos

Un mes despus de la poda de las plantas de banano se obtiene de ellas
cormos de 0.5 kg cada uno.
Protocolo de
desinfeccin
ineficiente
Los hijuelos fueron desinfectados mediante
inmersin en etanol al 70% por dos minutos, y
posteriormente en leja (hipoclorito de sodio
2%) durante diez minutos. A continuacin

se secaron sobre papel absorbente

Segn (Marulanda e Isaza, 2004) el hipoclorito de sodio es uno de los
desinfectantes superficiales ms empleados en el cultivo in vitro,
generalmente en concentraciones de 1 a 3% en tiempos de diez a veinte
minutos y su efectividad puede aumentar si los explantes se lavan
primeramente con etanol al 70%

El protocolo 2 es claramente ineficiente ya que si se compara con lo
dicho por (Marulanda e Isaza, 2004) la concentracin de hipoclorito de
sodio es ms alta de lo recomendado sobrepasando lo indicado con 2%,
adems el tiempo de inmersin que se emplea para la desinfeccin es
ms bajo con al menos 10 minutos comparado con lo recomendado por
(Marulanda e Isaza, 2004)
Mientras tanto el protocolo 1 es claramente eficiente ya que se
aproxima a lo recomendado por (Marulanda e Isaza, 2004), se espera
que la eficiencia del protocolo sea de al menos 97%, dicho valor se
toma como referencia al comparar con la investigacin realizada por
(Bernal, 2007)

Protocolo de
desinfeccin
eficiente
Para la desinfeccin de hijuelos, se usaron
hipoclorito de sodio al 4 %, por 10 min. Tween
80, jabn bactericida, etanol 95 y 70,
solucin de yodo al 1% en etanol de 70 y
solucin de estreptomicina / penicilina. Como
antioxidante se usaron 100 mg/L de cido
ascrbico por 10min debido a que se realiza un
corte en el explante, para reducir la oxidacin
debida a polifenoles.
Fase 2
Tipo de
medio
Medio MS Semi-solido
Los medios semislidos se preparan a partir de los medios lquidos,
agregando a stos un agente solidificante en una proporcin menor que
para preparar medios slidos. Uno de sus usos es la investigacin de la
movilidad de las bacterias.


80% prdida= 78
hijuelos
98-78= 20
hijuelos de
2.5cm.
Problema: Prdida del 80% de explantes o ms, NO es por
contaminacin
La prdida

Entre los principales factores que contribuyen a desarrollar la
hiperhidricidad, cabe citar una elevada humedad en el recipiente y la
presencia de agua libre en los substratos, adems se puede mencionar el
hecho de la exposicin de los medios a altas temperaturas.

Solucin:
Este fenmeno, puede ser controlado disminuyendo la humedad
relativa del recipiente (Dillen y Buysens, 1989; Rosettto et al, 1992;
Majada et al, 1997), reduciendo los niveles de citoquininas (Williams y
Taji, 1991; Ziv, 1991), incrementando la concentracin de agar,
cambiando la composicin del medio de cultivo, reduciendo la
temperatura (Williams y Taji, 1993) o mediante la aplicacin
tcnicas de control aunque sus requerimientos
siempre van a ser especie dependiente.
Composicin
del medio
400 mg l
-1
de glicina, 100 mg l
-1
de myo-
inositol, 0,50 mg l
-1
de cido nicotnico , 0,50
mg l
-1
de piridoxina-HCl, 0,1 mg l
-1
de
tiamina, 30 g l
-1
de sacarosa y 3 mg l
-1
de
benciladenina, solificado con agar (0,6% m/v)
Hormonas
usadas
Bencilaminopurina (BAP),
Acidoindolocetico (AIA)

Fase
3 y 4
Sistema de
multiplicaci
n in-vitro
usado
Sistema de Inmersin temporal (SIT)
Las ventajas de mantener un cultivo en un SIT incluyen tres aspectos:
un mayor contacto entre la biomasa vegetal y el medio, la inexistencia
de restricciones en el intercambio gaseoso y la posibilidad de controlar
la composicin del medio, as como la de la atmsfera dentro del
biorreactor
Estas caracterstica se refleja en mayores tasas de multiplicacin y en
un mejor desarrollo de los explantes; por ejemplo, en estudios
realizados con frutilla Don y manzana Gala se observ un aumento de
85 y 131% en la tasa de multiplicacin, respectivamente .(
Magini,1984).
SIT 5
recipientes

20 explantes x 7
hijuelos c/u = 140
nuevos hijuelos
(subcultivo)
Se separa 140
explantes en 5
fracos con 28
explantes cada
uno.

140 * 7 hijuelos=
280 nuevos
explantes
(2do subcultivo)

280 plntulas en
7 das

1200 plntulas en
un mes

Debido al nmero de plantas requeridas y a la eficiencia del uso del
sistema de inmersin temporal en la fase de multiplicacin, el SIT es
sin duda alguna la mejor herramienta para la multiplicacin in-vitro de
plantas de banano

Problema: Produccin de clusters con entrenudos cortos.

Solucin: La formacin de clusters in-vitro se da debido a la continua
divisin celular y consecuente crecimiento del vegetal in-vitro
formando masas de plantas agolpadas ocupando un mismo espacio, La
elongacin de las plntulas est involucrada con el balance entre
auxinas y citoquinicas, por lo tanto si los entrenudos son cortos esto
indicara que existe una insuficiente cantidad de auxinas en el medio,
por lo tanto al aadir auxinas al medio el problema de entrenudos
cortos quedara solucionado permitiendo de esta manera poder realizar
a posteriori lo respectivos procedimientos necesarios para separar las
plntulas del cluster y asi subcultivarlas.



Hormonas
usadas
Bencilaminopurina (BAP),
Acidoindolocetico (AIA)
La adicin de BAP y AIA

que empleando 6-BAP en medio de cultivo MS semislido
se logra un coeficiente de multiplicacin de siete hijuelos por explante
inicial en solo siete das, lo que permite obtener un elevado nmero de
plantas en un tiempo reducido. (Bernal, 2007)
Condiciones
Cultivo
27 C 1, 90 % de humedad relativa, un
fotoperiodo de 16 horas luz controladas por un
T,
lumnica de 2000 lux suplidos por
fluorescentes de luz blanca marca Silvania
Gro-lux de 20 w..
Segn (Bernal, 2007) en su investigacin estas son las condiciones y
parmetros exitosos para la fase de multiplicacin. Es importante
mencionar que la reduccin de horas de luz en comparacin a las horas
de oscuridad es debido a que la elongacin se estimula en condiciones
de poca luz.
Fase 5
Hormonas
usadas
AIA / ANA


para promover el desarrollo del sistema radicular.
1200 plntulas





Tipo de
medio
Medio MS semislido
Segn (Bernal, 2007) en su investigacin estas son las condiciones y
parmetros exitosos para la fase de enraizamiento, haciendo puntual
nfasis en el hecho de que las condiciones de temperatura y fotoperiodo
son las mismas que en la fase de multiplicacin.
Composicin
del medio
400 mg l
-1
de glicina, 100 mg l
-1
de myo-
inositol, 0,50 mg l
-1
de cido nicotnico , 0,50
mg l
-1
de piridoxina-HCl, 0,1 mg l
-1
de
tiamina, 30 g l
-1
de sacarosa y 3 mg l
-1
de
benciladenina, solificado con agar (0,6% m/v)
Condiciones
27 C 1, 90 % de humedad relativa, un
fotoperiodo de 16 horas luz controladas por un
T,
lumnica de 2000 lux suplidos por
fluorescentes de luz blanca marca Silvania
Gro-lux de 20 w..
Fase 6
Sustrato
usado
Materia orgnica: arena y aserrn en relacin
1:1
La calidad del sustrato es uno de los factores que ms influyen en el
desarrollo de las plntulas. Un buen sustrato tiene las propiedades
fsicas y qumicas que promueven el crecimiento rpido y saludable de
las plantas. El uso de materia orgnica y arena garantiza los
condiciones necesarias para la planta.(Rosales, 2008).
1200 plntulas
35% plntulas =
780 plantas

780 plantas/mes x
13 meses = 10140
plantas
Estos materiales permiten el fcil manejo y cosechar la plntula sin
romper sus races esto constituye la cama enraizadora
Condiciones /
Procedimiento

que contenan las plantas.
Extraer del medio de cultivo con una pinza las
plntulas, lavar cuidadosamente los restos de

en tubos de ensayo con 10ml de agua con la mezcla
de sales del medio de cultivo MS (Murashige y
Skoog, 1962)




,
,
esta fase las plantas sufrirn cambios que permitirn su adaptacin y
supervivencia en condiciones naturales. Por esta razn

debe tener precaucin a la hora de retirar el medio gelificado de las races ya que
si las races sufren dao aumenta el porcentaje de fracaso en la fase de
aclimatacin.
Previo a su siembra en campo el residuo gelificante adherido a las races se lava
con agua destilada y se procede a su siembra en el sustrato. El tamao de la cama
enraizadora es de 1 a 1.20 m. de ancho la altura debe ser de 30cm. Se pueden
colocar de 120 a 150 plntulas (es un buen suministro de agua) (Daz, 2007).

CRONOGRAMA

Meses
Fase Actividad 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Fase 0 SELECCIN DE LA PLANTA MADRE X
Fase 1 SELECCIN DEL EXPLANTE / PROTOCOLO DE DESINFECCIN X
Fase 2 FASE DE INTRODUCCIN AL MEDIO X X
Fase 3 FASE DE MULTIPLIACIN

X X X X X
Fase 4 FASE DE ELONGACIN

X X
Fase 5 FASE DE ENRAIZAMIENTO

X
Fase 6 FASE DE ADAPTACN AL SUSTRATO X X


A partir de la poda de las plantas se obtiene nuevos cormos, as tambin en los subcultivos podemos obtener nuevos cormos stos se los llevara a las camas enraizadoras las cuales tienen una
alta capacidad de producir entre 120-150 cormos por caja, obtenindose 10000 plntulas por mes.


BIBLIOGRAFIA

Angarita, A., & Perea, M. (1991). Micropropagacin de pltanos y bananos. W, Roca. L, Mroginski (Eds.). Cultivo de Tejidos en la Agricultura: Fundamentos y aplicaciones. (pp. ). Colombia:
CIAT (Centro Internacional de Agricultura Tropical).

Bernal, L. y Martnez, E. 2006. Una nueva visin de la degradacin del almidn. Rev. Centro de Inv. (Mx.) 7(25):76 - 90.

Dillen, W. and S. Byuyens. 1989. A saimple technique to overcome vitrification in Gypsophila paniculata. L. Plant Cell, Tissue Organ Cult. 19:181-188.

Marulanda, ML, Isaza L (2004) Establecimeinto in vitro de heliconias con fines de produccin masiva. Scientia et Technica10(26): 193-197

Magini E. 1984. Il ringiovanimento del materiale forestale di propagazione. In azienda regionalle delle Foreste (Ed). Propagazione in vitro: Ricerche su alune specie forestales (s/e). Italia.
(irreg.page)

Murashige, T y FS Skoog (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiologia Plantarum 15: 437-497

ROMN M; ALONSO M; GONZLEZ C; XIQUS X; SNCHEZ I. (2001). Estudios citogenticos y gentico-bioqumico en cultivares de pltano fruta (Musa spp), Cuba: Instituto de
Investigaciones en Viandas Tropicales, Facultad de Biologa, Universidad de la Habana.

Rosales L. 2008. Biorremediacin de suelos contaminados con aceite usado de automvil con el hongo de la pudricin blanca Pleurotus ostreatus (setas) en Durango. Centro Interdisciplinario
de Investigacin para el Desarrollo Integral Regional Unidad Durango (CIIDIR Durango-IPN). Durango, Mxico. Pgs. 107.Simmonds, N.W. 1973. Los pltanos. Blume, Barcelona, Espaa.

Williams, R.R., A.M. Taji, 1991. Effect of temperature, gel concentration and cytokinins onvitrification of Olearia microdisca (J.M. Black) in vitro shoot cultures. Plant Cell Tissue Organ
Cult., 26, 1-6.