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NORMA TCNICA NTC

COLOMBIANA 5031


2002-02-20




LECHE DESCREMADA EN POLVO.
DETERMINACIN DEL CONTENIDO DE VITAMINA A











E: DRIED SKIMMED MILK. DETERMINATION OF VITAMIN A
CONTENT


CORRESPONDENCIA:


DESCRIPTORES: leche; leche en polvo; determinacin
de vitamina A.















I.C.S.: 67.100.10

Editada por el Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin (ICONTEC)
Apartado 14237 Bogot, D.C. - Tel. 6078888 - Fax 2221435


Prohibida su reproduccin Editada 2002-03-01









PRLOGO


El Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin, ICONTEC, es el organismo
nacional de normalizacin, segn el Decreto 2269 de 1993.

ICONTEC es una entidad de carcter privado, sin nimo de lucro, cuya Misin es fundamental
para brindar soporte y desarrollo al productor y proteccin al consumidor. Colabora con el
sector gubernamental y apoya al sector privado del pas, para lograr ventajas competitivas en
los mercados interno y externo.

La representacin de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalizacin Tcnica
est garantizada por los Comits Tcnicos y el perodo de Consulta Pblica, este ltimo
caracterizado por la participacin del pblico en general.

La NTC 5031 fue ratificada por el Consejo Directivo del 2002-02-20.

Esta norma est sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en
todo momento a las necesidades y exigencias actuales.

A continuacin se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a
travs de su participacin en el Comit Tcnico 311201 Leche y productos lcteos.

ALGARRA S.A.
ALPINA PRODUCTOS ALIMENTICIOS S.A.
BIOCONTROL S.A.
CARULLA VIVEROS S.A.
CHRISTIAN HANSEN - CENTRO
AGROLECHERO
CONSEJO NACIONAL LCTEO
CONSEJO NACIONAL DE LA LECHE Y
PREVENCIN DE LA MASTITIS
COOPERATIVA DE LECHEROS DE
ANTIOQUIA, COLANTA
INSTITUTO COLOMBIANO AGROPECUARIO,
ICA
INDEPENDIENTE - HUGO PARDO
LA ALQUERA S.A.
LARKIN LTDA.
MEALS DE COLOMBIA S.A.
NESTL DE COLOMBIA S.A.
PARMALAT COLOMBIA LTDA.
PROCESADORA DE LECHES S.A.,
PROLECHE
PLASTILENE S.A.

Adems de las anteriores, en Consulta Pblica el Proyecto se puso a consideracin de las
siguientes empresas:

ASOCIACIN NACIONAL DE
INDUSTRIALES
ASOCIACIN NACIONAL DE LECHEROS,
ANALAC
COOPERATIVA DE LECHEROS DE LA
COSTA, COOLECHERA
FRESKALECHE
FRIESLAND COLOMBIA COLPURACE
INDUSTRIA COLOMBIANA DE LECHES
S.A., INDUCOLSA
INSTITUTO NACIONAL DE VIGILANCIA
DE MEDICAMENTOS Y ALIMENTOS,
INVIMA
JAIRO PASACHOA - INGENIERO DE
ALIMENTOS
LA CAMPIA S.A.
MINISTERIO DE SALUD
SECRETARIA DISTRITAL DE SALUD
TETRA PAK LTDA.
UNIVERSIDAD JORGE TADEO LOZANO


1







ICONTEC cuenta con un Centro de Informacin que pone a disposicin de los interesados
normas internacionales, regionales y nacionales.

DIRECCIN DE NORMALIZACIN





NORMA TCNICA COLOMBIANA NTC 5031

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LECHE DESCREMADA EN POLVO.
DETERMINACIN DEL CONTENIDO DE VITAMINA A.



Advertencia. El uso de esta Norma Internacional puede incluir materiales, operaciones y
equipo peligrosos. Esta norma no trata todos los problemas asociados con su uso. Es
responsabilidad del usuario de la norma establecer las prcticas de seguridad e higiene y
determinar previamente a su uso la aplicabilidad de limitaciones regulatorias.


1. OBJETO

Esta norma especifica dos mtodos para la determinacin de vitamina A en leche descremada
en polvo que contenga mnimo 10 UI de vitamina A/g, mediante el mtodo colorimtrico o por
cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC).


2. DEFINICIONES

2.1 CONTENIDO DE VITAMINA A EN LECHE DESCREMADA EN POLVO:

Es la fraccin de masa de sustancias determinada por el procedimiento especificado, en esta
norma.


Nota. Se expresa en microgramos de retinol por gramo o en Unidades Internacionales de actividad de vitamina A por
gramo de producto.


3. PARTE 1: MTODO COLORIMTRICO

3.1 PRINCIPIO

La muestra para ensayo se saponifica y se extrae la materia insaponificable, la que se hace
reaccionar con cido trifluoroactico. Se mide la absorbancia a 620 nm.

3.2 REACTIVOS

Se deben usar slo reactivos de grado analtico conocido, a menos que se especifique de otra
forma, y agua destilada o desmineralizada o de pureza equivalente.

3.2.1 Etanol (CH
3
CH
2
0H), 95 % (en volumen), libre de aldehdo.

3.2.2 Solucin de ascorbato de sodio, 200 g/L. Si no est disponible lista para su uso, se
prepara disolviendo 3,5 g de cido ascrbico (C
6
H
8
O
6
) en 20 ml de solucin de hidrxido de
sodio (NaOH), de 1 mol/I y se mezcla. Se prepara esta solucin fresca diariamente.

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3.2.3 Solucin acuosa de hidrxido de potasio (KOH), 50 % (en peso). Se disuelven 50 g
de hidrxido de potasio en 50 ml de agua. Se mezcla y se deja enfriar la solucin. Se prepara
esta solucin fresca antes de usarla.

3.2.4 Solucin de hidrxido de potasio en agua-alcohol

Se disuelven 3 g de hidrxido de potasio (KOH) en agua y se adicionan 10 ml de etanol (vase
el numeral 3.2.1) en un matraz aforado de 100 ml. Se diluye con agua hasta los 100 ml y se
mezcla. Se prepara esta solucin fresca antes de usarla.

3.2.5 ter de petrleo, con un rango de ebullicin preferiblemente entre 40 C y 60 C, o el
de rango de ebullicin entre 60 C y 80 C.

3.2.6 Cloroformo (CHCl
3
)

3.2.7 cido trifluoroactico (CF
3
COOH)


Advertencia. El cloroformo y el cido trifluoroactico son carcingenicos. Se deben tomar
todas las precauciones necesarias.


3.2.8 Reactivo de color

Se mezcla 1 parte en volumen de cido trifluoroactico puro (vase el numeral 3.2.7) y 2 partes
en volumen de cloroformo (vase el numeral 3.2.6).

3.2.9 Solucin patrn de vitamina A

Se usa la solucin de referencia de vitamina A, de la US Pharmacopeia
1)
de todos-trans-retinil
acetato cristalino, en aceite de semilla de algodn, equivalente a 30 mg de retinol (vitamina A -
base alcohol, C
20
H
30
0) por gramo de aceite, o como se establezca al momento de la compra.


Nota. Se sugiere una solucin de referencia no inferior a 35 UI.


Se puede usar una solucin patrn secundaria, si se normaliza contra la solucin patrn
primaria o mediante la medicin de la absorbancia en la regin UV.

Se corta la punta de la cpsula de la solucin patrn de referencia de vitamina A y se vierte el
aceite en un matraz aforado de 100 ml, de color mbar. Se pesa el contenido, con una
precisin de 0,1 mg. Se diluye con cloroformo (vase el numeral 3.2.6) hasta la marca de 100 ml.
Se usa la solucin patrn de vitamina A, tan pronto como sea posible. Se desecha la solucin
patrn despus de 8 h.


1)
La solucin de referencia de vitamina A, de la United States Pharmacopeia Convention, Inc. 12601
Twinbrook Parkway, Rockville, Maryland 20852, USA, es un ejemplo de un producto apropiado, disponible
comercialmente. Esta informacin se da para la conveniencia de los usuarios de esta parte de la norma y
no constituye una garanta para este producto.

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Nota. El anterior procedimiento de preparacin de la solucin patrn de referencia es equivalente al siguiente: en un
matraz aforado de 100 ml, de color mbar se pesan 34,4 mg de retinil acetato cristalizado en el matraz con una precisin
de 0,1 mg. Se diluye con cloroformo hasta la marca de 100 ml. Esta solucin contiene una concentracin de 1 000 UI / ml y
es estable por 2 d si se mantiene a 4 C despus de lo cual debe verificarse su concentracin.


3.2.10 Hidroxitolueno butilado (BHT)


3.3 EQUIPOS

Se usan los materiales y equipos de laboratorio usuales y en particular los siguientes:

3.3.1 Colormetro fotoelctrico o espectrofotmetro

Con mecanismo ptico o filtro para longitud de onda de 620 nm (derivado de la vitamina A).

Se deben usar celdas de absorcin pareadas, de vidrio y de 1 cm. Es preferible un instrumento
que provea linealidad entre la absorbancia y la concentracin.

3.3.2 Vaso de precipitados o matraz, de 250 ml de capacidad.

3.3.3 Matraz de saponificacin, de aproximadamente 250 ml de capacidad, conectado a un
condensador de reflujo.

3.3.4 Matraz aforado, de 100 ml y de 200 ml de capacidad.

3.3.5 Pipetas aforadas, de 2 ml, 10 ml, 25 ml y 50 ml de capacidad.

3.3.6 Pipetas automticas , apropiadas para solventes orgnicos, o una pipeta que entregue
10 ml.

3.3.7 Bao de vapor, bao de agua hirviente o plancha de calentamiento elctrico

3.3.8 Bao de agua, capaz de operar a una temperatura de hasta 40 C.

3.3.9 Embudo de separacin, de 500 ml de capacidad, preferiblemente con tapn de
politetrafluoetileno (PTFE).

3.3.10 Bao ultrasnico

3.3.11 Papel filtro, de 9 cm de dimetro.

3.4 TOMA DE MUESTRAS

La toma de muestras no hace parte de este mtodo. En la NTC 666 (ISO 707) se dan los
mtodos recomendados de muestreo.

Es importante que el laboratorio reciba una muestra que sea verdaderamente representativa y
que no haya sido deteriorada durante el transporte o almacenamiento.

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3.5 PREPARACIN DE LA MUESTRA PARA ENSAYO

Se mezcla completamente la muestra para ensayo rotando e invirtiendo repetidamente, el
recipiente. Si es necesario, se transfiere toda la muestra para ensayo a un recipiente de
suficiente capacidad, con tapa hermtica.

3.6 PROCEDIMIENTO

3.6.1 Generalidades


Nota. Si se requiere verificar el cumplimiento del lmite de repetibilidad (vase el numeral 3.11.2), se deben realizar
dos determinaciones sencillas de acuerdo con lo establecido en los numerales del 3.6.2 al 3.8.


Para todas las operaciones se debe trabajar con luz suave o usar recipientes de vidrio
antiactnico de baja transmisin de la luz.

3.6.2 Solucin para ensayo

Se pesan 20 g de la muestra para ensayo, con aproximacin de 0,001 g, en un vaso de
precipitado o matraz (vase el numeral 3.3.2) y se disuelven en 50 ml de agua a una
temperatura de al menos 80 C. Se deshace cualquier grumo presente, con una esptula, o
usando un bao ultrasnico (vase el numeral 3.3.10). Se deja enfriar hasta temperatura
ambiente. Se transfiere cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml. Se diluye con agua
hasta completar el aforo de 100 ml.

3.6.3 Saponificacin y extraccin

3.6.3.1 Se transfieren, por medio de una pipeta (vase el numeral 3.3.5), 25 ml de la solucin
para ensayo preparada (vase el numeral 3.6.2), a un matraz de saponificacin (vase el
numeral 3.3.3). Se adicionan 20 ml de solucin de hidrxido de potasio (vase el numeral 3.2.3) y
10 ml de solucin de ascorbato de sodio (vase el numeral 3.2.2). Se adicionan 50 ml de etanol
(vase el numeral 3.2.1) y se mezcla bien.

3.6.3.2 Se mantiene en reflujo por 30 min en un bao de vapor a 85 C (vase el numeral 3.3.7)
agitando de vez en cuando. Se pone a enfriar inmediatamente bajo el chorro de agua.

3.6.3.3 Se transfiere el lquido a un embudo de separacin (vase el numeral 3.3.9) usando dos
porciones de 30 ml de agua, dos porciones de 10 ml de etanol (vase el numeral 3.2.1) y dos
porciones de 40 ml de ter de petrleo (vase el numeral 3.2.5). Se agita vigorosamente
durante 30 s y se permite que permanezca en reposo hasta que las dos capas sean claras.

Se transfiere la fase acuosa (inferior) a un segundo embudo de separacin y se agita con una
mezcla de 10 ml de etanol (vase el numeral 3.2.1) y 40 ml de ter de petrleo (vase el
numeral 3.2.5). Se deja separar.

3.6.3.4 Se transfiere la fase acuosa a un tercer embudo de separacin y la fase que contiene
ter de petrleo al primer embudo de separacin. Se lava el segundo embudo de separacin
con dos porciones de 10 ml de ter de petrleo (vase el numeral 3.2.5). Se adiciona el lquido
de lavado al primer embudo de separacin.


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3.6.3.5 Se agita la fase acuosa con 40 ml de ter de petrleo (vase el numeral 3.2.5) y 10 ml
de etanol (vase el numeral 3.2.1). Se adiciona la fase que contiene ter de petrleo al primer
embudo de separacin. Se lavan los extractos combinados de ter de petrleo con tres
porciones de 40 ml de solucin alcohlica de hidrxido de potasio(vase el numeral 3.2.4),
agitando vigorosamente. Enseguida se lavan, con porciones de 40 ml de agua hasta que el
ltimo lavado sea neutro a la fenolftalena. Se dejan escurrir las ltimas gotas de agua, y se
adicionan al embudo de separacin dos hojas de papel filtro (vase el numeral 3.3.11) cortadas
en tiras y se agita.


Nota. En lugar de usar papel de filtro cortado en tiras, se sugiere hacer pasar los extractos etreos por un papel filtro
conteniendo sulfato de sodio anhidro; despus de pasar todo el extracto, este papel filtro se lava dos veces con
porciones de 10 ml de ter para recuperar algo de vitamina retenida en el filtro.


3.6.3.6 Se transfiere el extracto que contiene ter de petrleo, el cual se ha secado como se
describi en 3.6.3.5, a un matraz aforado de 200 ml (vase el numeral 3.3.4). Se enjuaga el
embudo de separacin y el papel con ter de petrleo (vase el numeral 3.2.5), se adicionan
los enjuagues al matraz, y en seguida se adicionan de 10 mg a 20 mg de BHT (vase el
numeral 3.2.10). Se diluye con ter de petrleo hasta el aforo de 200 ml y se mezcla bien.

3.7 PREPARACIN DE LA SOLUCIN COLORIMTRICA PARA ENSAYO

Se pipetea una alcuota del extracto diluido (vase el numeral 3.6.3.6) en un matraz de fondo
redondo. Se evapora hasta sequedad, en vaco, con agitacin, en un bao de agua (vase el
numeral 3.3.8) hasta una temperatura que no exceda de 40 C. Se deja enfriar bajo un chorro
de agua y se restablece la presin atmosfrica, preferiblemente con nitrgeno. Inmediatamente
se disuelve el residuo en 10,0 ml de cloroformo (vase el numeral 3.2.6).


Nota. Una concentracin tpica de la solucin de ensayo es de 10 UI de vitamina A por mililitro de cloroformo. La
cantidad de alcuota se puede ajustar dependiendo del tamao y sensibilidad de la celda espectromtrica.


3.8 DETERMINACIN

Se marcan dos celdas colorimtricas pareadas, como 1 y 2. Se pipetean 2 ml de la solucin
colorimtrica de ensayo (vase el numeral 3.7) en la celda 1. Se pipetean 2 ml de la solucin
patrn diluida de vitamina A (vase el numeral 3.9) en la celda 2. Se adiciona, rpidamente, a
cada celda, usando preferiblemente una pipeta automtica (vase el numeral 3.3.6), 10,0 ml
del reactivo de color (vase el numeral 3.2.8) y se mezcla. Se mide la absorbancia de las
soluciones a 620 nm, con el espectrofotmetro o el colormetro fotoelctrico (vase el numeral 3.3.1)
medido contra el blanco de 2 ml de cloroformo (vase el numeral 3.2.6) y 10 ml de reactivo color
(vase el numeral 3.2.8) hasta que la absorbancia alcance su mximo. Se grafican las absorbancias
obtenidas contra el contenido de vitamina A. (Vase el numeral 3.9).

Los volmenes y proporciones usados deben ajustarse de acuerdo con la capacidad de las
celdas colorimtricas usadas.

3.9 PREPARACIN DE LA GRFICA DE CALIBRACIN

Se preparan cinco diluciones, o ms, en concentraciones diferentes de solucin patrn de
vitamina A (vase el numeral 3.2.9) con cloroformo (vase el numeral 3.3.6) de manera que las
alcuotas de 2 ml tratadas en la determinacin colorimtrica, den absorbancias en un rango de
0,07 a 0,7 a una longitud de onda de 620 nm. Se grafican las absorbancias contra el contenido

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de vitamina A en microgramos. Si la curva es una lnea recta, se debe calcular un factor para el
contenido de vitamina A en las muestras.

3.10 CLCULO Y EXPRESIN DE RESULTADOS

Se calcula el contenido de vitamina A, w, en microgramos de retinol por gramo (o la actividad
de la vitamina A, expresada en Unidades Internacionales por gramo), usando la siguiente
ecuacin:


m . V . V
V . V . V . c
w
5 2
4 3 1
=


Donde:

c = es la concentracin, en microgramos de retinol por mililitro (o actividad de
vitamina A en UI / ml) en el ensayo de la solucin colorimtrica de ensayo
(vase el numeral 3.7), calculada a partir de la curva de calibracin
(vase el numeral 3.9);

V
1
= es el volumen total en mililitros de extracto de ter de petrleo (V
1
= 200 ml);

V
2
= es el volumen en mililitros de la alcuota tomada de V
1
(vase el numeral 3.7);

V
3
= es el volumen en mililitros de cloroformo en el cual se disuelve el residuo
(V
3
= 10 ml);

V
4
= es el volumen total en mililitros de la solucin de ensayo (vase el
numeral 3.6.2) (V
4
= 100 ml);

V
5
= es el volumen en mililitros de la parte de alcuota de la solucin de
ensayo (vase el numeral 3.6.3.1) (V
5
= 25 ml);

m = es la masa de la muestra de ensayo en gramos.


3.11 PRECISIN

3.11.1 ENSAYOS INTERLABORATORIOS

Se han publicado detalles sobre la precisin del mtodo en una prueba interlaboratorios
llevada a cabo, de acuerdo con la NTC 3529-1:1999 (ISO 5725-1:1994) y NTC 3529-2:1999
(ISO 5725-2:1994). Los valores derivados de la prueba interlaboratorios pueden no ser aplicables a
los rangos de concentracin y matrices diferentes a los dados.

3.11.2 REPETIBILIDAD

La diferencia absoluta entre dos resultados de pruebas sencillas e independientes, obtenidas
usando el mismo mtodo sobre muestras idnticas en el mismo laboratorio con el mismo
operario, usando el mismo equipo dentro de un intervalo de tiempo corto, no ser mayor del 14 %
del promedio aritmtico de los dos resultados, en el 5 % de los casos.


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3.11.3 REPRODUCIBILIDAD

La diferencia absoluta entre dos resultados de pruebas sencillas e independientes, obtenidas
usando el mismo mtodo sobre muestras idnticas en diferentes laboratorios con diferentes
operarios, usando diferentes equipos no ser mayor del 42 % del promedio aritmtico de los
resultados en el 5 % de los casos.

3.12 INFORME DEL ENSAYO

El informe del ensayo debe especificar lo siguiente:


- Toda la informacin necesaria para la identificacin de la muestra;

- El mtodo de muestreo usado, si se conoce;

- El mtodo de ensayo usado, junto con la referencia a esta norma;

- Todos los detalles operativos no especificados en esta norma, o considerados
como opcionales, junto con los detalles de cualquier incidente que pueda haber
influenciado el (los) resultado(s) del ensayo;

- El (Los) resultado(s) obtenidos del ensayo, o, si se ha verificado la repetibilidad,
el resultado final obtenido.


4. PARTE 2. MTODO USANDO CROMATOGRAFA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIN

4.1 PRINCIPIO

La muestra para ensayo se saponifica y se extrae. La vitamina A se separa de las impurezas
por HPLC. El contenido se determina usando un detector ultravioleta o con un detector
fluorescente.

4.2 REACTIVOS

Slo se deben emplear reactivos de grado analtico reconocido, a menos que se especifique de
otra manera y agua destilada o desmineralizada o agua de pureza equivalente.

4.2.1 Etanol, (CH
3
CH
2
OH), de 95 % (en volumen), libre de aldehdo.

4.2.2 Solucin de ascorbato de sodio, 200 g/l. Si no se encuentra disponible ya elaborada,
se puede preparar disolviendo 3,5 g de cido ascrbico (C
6
H
8
O
6)
en 20 ml de solucin de
hidrxido de sodio, 1 mol/l y se mezcla. Se prepara esta solucin fresca diariamente.

4.2.3 Solucin acuosa de hidrxido de potasio, 50 % (en masa). Se disuelven 50 g de
hidrxido de potasio, (KOH) en 50 ml de agua. Se mezcla y se deja enfriar, la solucin
obtenida, hasta temperatura ambiente. Se prepara la solucin fresca antes de usarse.

4.2.4 Solucin alcohlica acuosa de hidrxido de potasio, 30 g/l

Se disuelven 3 g de hidrxido de potasio (KOH), en agua, se le adicionan 10 ml de etanol
(vase el numeral vase el numeral 4.2.1) y se diluyen hasta 100 ml con agua, en un matraz
volumtrico. Se prepara una solucin fresca antes de usarse.

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4.2.5 ter de petrleo, preferiblemente con intervalo de ebullicin de 40 C a 60 C, de 60 C a
80 C de intervalo de ebullicin.

4.2.6 Metanol, (CH
3
OH), grado HPLC.

4.2.7 Fase mvil

Mezcla de metanol y agua, por ejemplo, en relacin 90:10 (por volumen). (Vase la Nota del
numeral 4.9).

4.2.8 Solucin patrn de vitamina A

Se usa una solucin de referencia de vitamina A, de la US Pharmacopeia
1)
, elaborada a partir
de todos-trans-retinil acetato cristalino en aceite de semilla de algodn, equivalente a 30 mg de
retinol (vitamina A - base alcohol, C
20
H
30
O) por gramo de aceite, o como se establezca al
momento de la compra.

Se corta la punta de la cpsula de la solucin patrn de referencia de vitamina A y se pesan
aproximadamente 20 mg de la solucin patrn en el matraz de saponificacin, con una
precisin de 0,1 mg. Se adicionan 40 ml de etanol (vase el numeral 4.2.1), 10 ml de solucin
de ascorbato de sodio (vase el numeral 4.2.2) y 10 ml de solucin de hidrxido de sodio
(vase el numeral 4.2.3)

Se saponifica y se extrae el contenido del matraz de saponificacin, como se describe en los
numerales del 4.7.2 al 4.7.5. Se prepara una solucin de referencia para ensayo como se
indica en el numeral 4.8.

4.2.10 Butil hidroxitolueno (BHT)

4.3 EQUIPOS

Equipo usual de laboratorio y, en particular, el siguiente.

4.3.1 Cromatgrafo lquido

Adaptado con un detector ultravioleta.

Las condiciones de operacin tpicas son:

- Detector UV variable que vigile la absorcin a 325 nm, o un detector de longitud
de onda fija que vigile, con sensibilidad de 0,128 AUFS (unidades de absorcin,
escala completa), a una longitud de onda entre 300 nm y 360 nm.

- Velocidad de flujo del efluente de 2 ml/min (a aproximadamente 10,13 MPa
(100 atm));

- Temperatura ambiente;

- Volumen de inyeccin de 20 l;


1)
La solucin de referencia de vitamina A, de la United States Pharmacopeia Convention, Inc. 12601
Twinbrook Parkway, Rockville, Maryland 20852, USA, es un ejemplo de un producto apropiado, disponible
comercialmente. Esta informacin se da para la conveniencia de los usuarios de esta parte de la norma y
no constituye una garanta para este producto.

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- Grfico de velocidad de 10 mm/min.


Cuando se usa un detector fluorescente, se ajusta a 325 nm para la exitacin y a 450 nm para
la emisin.

4.3.2 Columna cromatogrfica, de acero inoxidable, 250 mm x 4,6 mm (di), empacada con
C8 o C18, de 10 m de tamao de partcula, ligada qumicamente a partculas de microsilicio o
una columna de desempeo equivalente.

4.3.3 Vaso de precipitado o matraz cnico, de 250 ml de capacidad.

4.3.4 Matraz de saponificacin, de aproximadamente 200 ml de capacidad, adaptado con
un condensador de reflujo.

4.3.5 Matraces volumtricos aforados, de 100 ml y 200 ml de capacidad.

4.3.6 Pipetas aforadas, de 10 ml, 25 ml y 50 ml.

4.3.7 Bao de vapor, bao de agua hirviendo o plancha de calentamiento elctrica

4.3.8 Bao de agua, capaz de operar a una temperatura hasta de 40 C 1 C.

4.3.9 Embudo de separacin, de 500 ml de capacidad, adaptado preferiblemente con un
tapn de politetrafluoetileno, (PTFE).

4.3.10 Bao ultrasnico

4.3.11 Papel de filtro, de 9 cm de dimetro.

4.4 TOMA DE MUESTRAS

La toma de muestras no hace parte del mtodo especificado en la presente norma. En la NTC 666
(ISO 707) se ofrece un mtodo de muestreo recomendado.

Es importante que el laboratorio reciba una muestra verdaderamente representativa y que no
se haya deteriorado o modificado durante el transporte o almacenamiento.

4.5 PREPARACIN DE LA MUESTRA DE ENSAYO

Se mezcla por completo la muestra para ensayo, rotndola varias veces, e invirtiendo el
recipiente con la muestra. Si para esto es necesario, se transfiere toda la muestra para ensayo
a un recipiente hermtico, de suficiente capacidad, para permitir la realizacin de esta
operacin.

4.6 PROCEDIMIENTO

4.6.1 Generalidades


Nota. Si se requiere verificar el lmite de repetibilidad encontrado (vase el numeral 4.11.2), se hacen dos corridas
de dos determinaciones simples de acuerdo con lo indicado en los numerales del 4.6.2.1 al 4.6.2.4.



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Para todas las operaciones, se trabaja con luz atenuada y se emplea material de vidrio
antiactnico de baja transmisin de la luz.

4.6.2 Solucin para ensayo

Se pesan, con aproximacin a 0,010 g, cerca de 20 g (m
1
) de leche en polvo en un vaso de
precipitado o en un matraz cnico (vase el numeral 4.3.3) y se disuelven en 50 ml de agua
caliente, por lo menos a 80 C. Se desbarata cualquier grumo con una esptula o usando un
bao ultrasnico (vase el numeral 4.3.10). Se deja enfriar hasta temperatura ambiente. Se
transfiere cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml, (vase el numeral 4.3.5) y se diluye
con agua hasta completar los 100 ml.

4.7 SAPONIFICACIN Y EXTRACCIN

4.7.1 Por medio de una pipeta, se adicionan al matraz de saponificacin (vase el numeral 4.3.4),
25 ml de muestra para ensayo preparada (vase el numeral 4.6.2). Se le adicionan 20 ml de
solucin de hidrxido de potasio (vase el numeral 4.2.3) y 10 ml de solucin de ascorbato de sodio
(vase el numeral 4.2.2), luego se le adicionan 50 ml de etanol (vase el numeral 4.2.1) y se
mezcla muy bien.

4.7.2 Se somete a reflujo durante 30 min en un bao de vapor a 85 C (vase el numeral 4.3.7), y
se agita de vez en cuando. Se deja enfriar de inmediato bajo agua corriente.

4.7.3 Se transfiere el lquido a un embudo separador (vase el numeral 4.3.9) empleando dos
porciones de 30 ml de agua, dos porciones de 10 ml de etanol (vase el numeral 4.2.1) y dos
porciones de 40 ml de ter de petrleo (vase el numeral 4.2.5). Se agita vigorosamente
durante 30 s y se permite que repose hasta que las dos capas se diferencien. Se transfiere la
fase acuosa (inferior) a un segundo embudo de separacin y se agita con una mezcla de 10 ml
de etanol (vase el numeral 4.2.1) y 40 ml de ter de petrleo (vase el numeral 4.2.5). Se
permite que se separen las fases.

4.7.4 Se transfiere la fase acuosa a un tercer embudo separador y la fase que contiene ter
de petrleo al primer embudo separador. Se lava el segundo embudo separador con dos
porciones de 10 ml de ter de petrleo (vase el numeral 4.2.5). Se adicionan los lavados al
primer embudo separador.

4.7.5 Se agita la fase acuosa con 40 ml de ter de petrleo (vase el numeral 4.2.5) y 10 ml
de etanol (vase el numeral 4.2.1). Se adiciona la fase que contiene ter de petrleo al primer
embudo separador. Se lavan los extractos de ter de petrleo combinada con tres porciones de
40 ml de solucin alcohlica de hidrxido de potasio preparada recientemente (vase el
numeral 4.2.4), se agita vigorosamente. A continuacin se lavan con porciones de 40 ml de
agua hasta que el ltimo lavado sea neutro a la fenolftalena. Se dejan escurrir las ltimas gotas
de agua, y se adicionan dos hojas de papel de filtro cortadas en tiras (vase el numeral 4.3.11) al
embudo de separacin y se agita.

4.7.6 Se transfiere el extracto de ter de petrleo, secado como se describi anteriormente, a
un a matraz volumrico de 200 ml (vase el numeral 4.3.5). se enjuaga el embudo de
separacin y el papel con ter de petrleo (vase el numeral 4.2.5), se adicionan los enjuagues
al matraz volumtrico y se adicionan de 10 mg a 20 mg de BHT (vase el numeral 4.9). Se
diluye con ter de petrleo hasta completar los 200 ml aforados.


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11
4.8 PREPARACIN DE LA SOLUCIN DE REFERENCIA Y DE LA SOLUCIN PARA
ENSAYO

Se adicionan a matraces de fondo redondo separados, alcuotas de los extractos diluidos
(vase el numeral 4.7.5) obtenidas a partir de ambas, la solucin para ensayo (vase el
numeral 4.6.2) y la solucin patrn de vitamina A (vase el numeral 4.2.8). Se evaporan hasta
sequedad, bajo vaco, mediante agitacin con movimientos giratorios en un bao de agua
(vase el numeral 4.3.8) a una temperatura que no exceda de 40 C. Se dejan enfriar bajo
agua corriente y se restaura la presin atmosfrica, preferiblemente con nitrgeno. Se disuelve
el residuo inmediatamente en 10 ml de metanol (vase el numeral 4.2.7)

4.9 DETERMINACIN

Se inyectan 20 l de la solucin de muestra para ensayo y de la solucin de referencia (vase
el numeral 4.8) a una columna, y se ajustan las condiciones de operacin del detector para dar
el pico de vitamina A sobre la escala ms grande posible. Se miden las reas de los picos de
vitamina A.


PRECAUCIN. Los detalles del procedimiento cromatogrfico dependen, entre otros, del
equipo, el tipo, edad, y el proveedor de la columna, los medios de introduccin del ensayo y de
la solucin de referencia, el tamao de la muestra y del detector. La relacin de metanol a agua
variar de acuerdo con estos factores; el incremento del contenido de agua de la fase mvil
causa un incremento en el tiempo de retencin.


4.10 CLCULO Y EXPRESIN DE RESULTADOS

Se calcula el contenido de vitamina A, w, en microgramos de retinol por gramo (o la activiadad
de la vitamina A, expresada en Unidades Internacionales por gramo), usando la siguiente
ecuacin:


m . V . V . A
V . V . V . A . c
w
r
s
5
2
4 3 1
=


Donde:

c = es la concentracin, en microgramos de retinol por mililitro (o actividad de
la vitamina A en UI por mililitro) en la solucin de referencia (vase el
numeral 4.8);

A
s
=

es el valor numrico del rea del pico de vitamina A en la solucin de
ensayo (vase el numeral 4.9);

A
r
=

es el valor numrico del rea del pico de vitamina A en la solucin de
referencia (vase el numeral 4.9);

V
1
=

es el volumen total, en mililitros, del extracto de ter de petrleo (V
1
= 200 ml);

V
2
=

es el volumen, en mililitros, de la alcuota tomada en V
1
;


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12
V
3


=

es el volumen, en mililitros, de metanol en el cual el residuo se disuelve
(V
3
= 10 ml);

V
4
=

es el volumen total, en mililitros, de la solucin de ensayo (vase el
numeral 4.6.2) (V
4
= 100 ml);

V
5
=

es el volumen, en mililitros, de la parte de alcuota de la solucin de
ensayo (vase el numeral 4.7.1) (V
5
= 25 ml)

m = es la masa de la muestra para ensayo, en gramos.


4.11. PRECISIN

4.11.1 ENSAYO INTERLABORATORIO

Se han publicado los detalles de un ensayo interlaboratorio realizado de acuerdo con la
NTC 3529-1:1999 (ISO 5725-1:1994) y NTC 3529-2:1999 (ISO 5725-2:1994). Los valores
derivados de este ensayo interlaboratorio pueden no ser aplicables a otros rangos de
concentracin y matrices diferentes a aquellos dados.

4.11.2 REPETIBILIDAD

La diferencia absoluta entre dos resultados de ensayo, nicos, independientes, obtenida
empleando el mismo mtodo, sobre material de ensayo idntico, en el mismo laboratorio, por el
mismo operador, utilizando el mismo equipo, dentro de un intervalo corto de tiempo, no ser en
ms del 5 % de los casos superior al 14 % de la media aritmtica de los dos resultados.

4.11.3 REPRODUCIBILIDAD

La diferencia absoluta entre dos resultados de ensayo nicos, independientes, obtenida
empleando el mismo mtodo, sobre material de ensayo idntico, en diferentes laboratorios, con
diferentes operadores, usando diferentes equipos, no ser en ms del 5 % de los casos
superior al 17 % de la media aritmtica de los dos resultados.

4.12 INFORME DE ENSAYO

El informe del ensayo debe especificar:


- toda la informacin requerida para la completa identificacin de la muestra;

- el mtodo de muestreo empleado, si se conoce;

- el mtodo de ensayo empleado, con referencia a la presente norma;

- todos los detalles operativos no especificados en esta norma, o considerados
opcionales, junto con detalles de los incidentes que puedan haber influido en el
(los) resultado(s) del ensayo;

- el (los) resultado(s) de ensayo obtenidos; y

- si se ha verificado la repetibilidad, el resultado final obtenido.


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13
5. NORMAS QUE DEBEN CONSULTARSE

Las siguientes normas contienen disposiciones que, a travs de la referencia en este texto,
constituyen disposiciones de la presente norma. Dichas publicaciones no se aplican para
referencias fechadas, subsecuentes enmiendas o actualizaciones. No obstante, se invita a las
partes que lleguen a acuerdos con base en la presente norma a indagar sobre la posibilidad de
aplicar las ediciones ms recientes de las normas indicadas a continuacin. Para referencias
no fechadas, se aplica la ltima edicin de la norma referenciada.


NTC 666:1996, Leche y productos lcteos. Gua para muestreo. (ISO 707:1997, Milk and Milk
products Guidance on sampling)

NTC 2175:1986, (Reaprobada 1999) Material de vidrio para laboratorio. Buretas. Requisitos
generales. (ISO 385-1:1984, Laboratory Glassware Burettes Part 1. General Requirements)

NTC 3529-1:1999, Precisin de los mtodos de medicin y de los resultados. Principios
generales y definiciones. (ISO 5725-1:1994, Accuracy (trueness and precision) of
measurement methods and results. Part 1. General Principles and Definitions).

NTC 3529-2: Exactitud (veracidad y precisin) de mtodos de medicin y resultados. Parte 2.
Mtodo bsico para la determinacin de repetibilidad y reproducibilidad en un mtodo
normalizado de medicin. (ISO 5725-2:1994, Accuracy (trueness and precision) of
measurement methods and results. Part 2. A basic Method for the Determination of
Repeatability and Reproductibility of a Standard Measurement Method).


6. DOCUMENTOS DE REFERENCIA

INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Dried Skimmed Milk.
Determination of Vitamin A Content. Part 1. Colorimetric Method. Switzerland, ISO, 2000. 7 p.
(ISO 12080-1).

INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Dried Skimmed Milk.
Determination of Vitamin A Content- Part 2. Method using High-Performance Liquid
Chromatography. Switzerland, ISO, 2000. 7 p. (ISO 12080-2).



















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Anexo A (Informativo)


Actividad expresada en Unidades Internacionales (UI)



A1. ACTIVIDAD DE LA VITAMINA A

La actividad de la vitamina A se expresa en Unidades Internacionales. Se ha definido en la
Farmacopea Europea (European Pharmacopoeia, Monograh vitamin A), que 1 UI de vitamina A
corresponde a la actividad de 0,344 g todo de trans-retinil acetato.

La actividad de otros compuestos de vitamina A se calcula estequiomtricamente tal que 1 Ul
corresponde a la actividad de 0,300 g todo de trans-retino, 0,359 g todos de trans-retinil
propionato o 0,500 g todos de trans-retinil palmitado, respectivamente.

Esto significa que la actividad de 1 g, todo de trans-vitamina A alcohol y ester, expresado en
Unidades internacionales, es igual a:


- vitamina A alcohol (reitnol) 3 333 000 Ul;

- vitamina A acetato 2 907 000 Ul;

- vitamina A propionato 2 785 000 Ul;

- vitamina A palmitato 1 818 000 Ul;


A2. ENSAYO DE VITAMINA A ESTNDAR

Con una aproximacin de 0,1 %, se pesan 25 mg de vitamina A ester en un matraz. Se
disuelve esta en 5 ml de pentano y se diluye, dependiendo de la cantidad pesada, con 2-
propanol a una presunta concentracin de 10 Ul/ml hasta 15 Ul/ml. Se verifica que la absorcin
mxima, A
m
, de la solucin est situada entre 325 nm y 327 nm usando 2-propanol como
lquido de compensacin (blanco). Se mide la absorbancia, A
n
, a 300 nm, 326 nm y 730 nm.

Se calcula la relacin A
n
/A
m
para cada longitud de onda mencionada. Si las relaciones no
exceden de 0,593 a 300 nm, 0,537 a 350 nm, 0 0,142 a 370 nm respectivamente, entonces se
calcula el contenido, w, de vitamina A en Unidades Internacionales por gramo usando la
ecuacin:


m
d . V . A
w
m
100
=

Donde:

A
m
= es el valor numrico de la absorbancia mxima obtenida a 326 nm;

V = es el volumen total al cual la vitamina A ester ha sido diluida para dar 10
Ul/ml hasta 15 Ul/ml;


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15
d = es el factor para convertir la absorbancia especfica de steres de
vitamina A a unidades Internacionales por gramo (d = 1 900);

m = es la masa de steres de vitamina A pesados en gramos.


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Anexo B (Informativo)

Otras normas internacionales sobre el mismo tema

Organismo
internacional
Nmero norma Tema Principio Norma ISO
relacionada
INTERNATIONAL DIARY
FEDERATION, IDF
IDF Standard
142: 1990
Leche en polvo
descremada.
Determinacin del
contenido de vitamina A
Mtodo
colorimtrico
ISO 12080-1
Official Methods of
Analysis of AOAC, 17 th
Edition 2000
AOAC 992.04
Vitamina A
(Retinol Isomers)
in Milk and Milk-
Based
Infant Formula
Leche y frmula infantil
a base de leche
Mtodo de
cromatografa
lquida