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PRACTICA 2
TINCION DE GRAM
OBJETIVOS DE APRENDIZAJE:
Cuando haya completado este experimento, usted debe comprender:
1. La base terica y qumica de los procedimientos de tincin diferencial.
2. La base qumica de la tincin de Gram.
3. El procedimiento para diferenciar entre dos grupos principales de bacterias: Gram-
positivas y Gram-negativas.

PRINCIPIO:
La tincin diferencial requiere el uso de al menos 3 reactivos qumicos que se aplican en
secuencia a un frotis fijado por calor. El primer reactivo es llamado tincin primaria o colorante
primario. Su funcin es impartir color a todas las clulas. Con el objetivo de establecer un
contraste de color, el segundo reactivo usado es un agente decolorante, el cual puede decolorar
la clula completa o solo parte de ella. El reactivo final, el colorante de contraste, le da a las
clulas decoloradas un color que contrasta con el del colorante primario. El colorante de
contraste no puede ser absorbido por clulas que no han perdido el colorante primario. De esta
manera, tipos de clulas o sus estructuras se pueden distinguir unas de otras en funcin del
colorante que es absorbido.
El mtodo de tincin diferencial ms importante usado en bacteriologa es la tincin de Gram,
llamada as en honor al Dr. Hans Christian Gram. Este mtodo divide las bacterias en dos
grandes grupos, las Gram-negativas y las Gram-positivas. Esto es esencial para la clasificacin y
diferenciacin de microorganismos. La reaccin a la tincin de Gram est basada en la
diferencia en la composicin qumica de la pared celular bacteriana. Las bacterias Gram-
positivas tienen una gruesa capa de peptidoglicano o murena, mientras que esta capa es ms
fina en las Gram-negativas y est rodeada por una bicapa lipdica externa. El Peptidoglicano es
un polisacrido formado por dos subunidades qumicas, N-acetilglucosamina y acido N-
acetilmurmico.
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Figure 1 Microfotografa de una pared celular Gram
Positiva

Figure 2 Estructura de la Pared Celular Gram-
positiva


Figure 3 Microfotografa de pared celular de
bacteria Gram-negativa

Figure 4 Estructura de la Pared Celular Gram-
negativa

Tincin Primaria: Se utiliza Cristal Violeta, que tie todas las clulas moradas.
Mordiente: Yodo o lugol. El yodo, aparte de matar bacterias, incrementa la afinidad del
colorante primario con la clula, formando complejos insolubles con este. El complejo cristal
violeta-yodo sirve para intensificar el color del tenido.
Agente decolorante: Se utiliza alcohol etlico al 95%. El etanol tiene doble funcin:
deshidratante de protenas y solvente de lpidos. El alcohol disuelve los lpidos de la parte
externa de la pared celular Gram-negativa, haciendo la pared ms porosa. De esta manera, el
complejo Cristal violeta-yodo es removido de la capa de mureina ms fina de las bacterias Gram-
negativas, mientras que la pared ms gruesa de las Gram-positivas retiene el tinte en su interior.
Tincin de Contraste: Safranina. Este tinte se utiliza para teir de rojo las clulas previamente
decoloradas, o sea, las Gram-negativas.
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EN LA MESA DE TRABAJO
MATERIALES:
Cultivos: cultivos de 24 horas en agar nutritivo en tubo inclinado de Escherichia coli, Micrococcus
luteus, Bacillus megaterium y Rhodospirillum rubrum.
Reactivos: Cristal violeta, Yodo de Gram, Alcohol Etlico 95%, Safranina.

EQUIPOS Y MATERIALES:
Mechero de alcohol, asa de siembra, cubeta de tincin, portaobjetos, papel de absorcin, papel
de lentes, y microscopio.

PROCEDIMIENTO:
1. Obtenga 5 portaobjetos limpios.
2. Prepare un frotis de cada uno de los microorganismos y, en el quinto portaobjetos prepare
un frotis de una mezcla de Micrococcus luteus y Eschericha coli. Para preparar los frotis se
sigue el siguiente procedimiento:
a. Colocar una pequea gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es
necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra,
ya que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una mnima gota de
agua, que es suficiente.
b. Flamear el asa de siembra y dejar enfriar. Tomar, en condiciones aspticas, una
pequea cantidad del cultivo bacteriano en medio slido y transferirlo a la gota
de agua. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensin
homognea que quede bastante extendida para facilitar su secado. Nota: Si la
muestra se toma de un cultivo en medio lquido, no es necesario realizar los dos
primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensin
bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre el
portaobjetos.
c. Esperar hasta que el lquido se evapore o acelerar su evaporacin acercando el
portaobjetos a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha
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precaucin de no calentar demasiado el portaobjetos pues las clulas pueden
deformarse o romperse.
d. Para preparar el frotis de la mezcla Eschericia coli-Micrococcus luteus, coloque
una gota de agua en el portaobjetos, y luego transfiriendo cada organismo
separadamente a la gota de agua usando un asa de siembra esterilizada y
enfriada. Mezcle ambos microorganismos haciendo movimientos circulares con
el asa.
3. Permita que los frotis se sequen al aire y luego fjelos con calor.
4. Tia con cristal violeta agregando suficiente colorante y deje que acte durante 1 minuto.
5. Lave suavemente con agua.
6. Inunde suavemente con el mordiente, yodo de Gram, y deje actuar durante 1 minuto.
7. Lave suavemente con agua.
8. Decolore con alcohol etlico al 95%. Nota: no sobredecolore, agregue el alcohol gota a
gota hasta que este salga casi claro, solo ligeramente azul.
9. Lave suavemente con agua.
10. Agregue la safranina para la tincin de contraste.
11. Lave suavemente con agua.
12. Seque la preparacin.
13. Examine al microscopio con el objetivo 100X de inmersin de aceite.


Tina suavemente con cristal
violeta por 1 min

Lave suavemente con agua
Tina suavemente con
safranina por 1 min

Lave suavemente con agua

Lave suavemente con agua

Lave suavemente con agua
Aplique yodo o lugol
suavemente por 1 min
Aplique alcohol o acetona
gota a gota hasta que salga
claro
Seque al aire o con papel
absorbente
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Lave suavemente con agua
Aplique yodo o lugol
suavemente por 1 min
Seque al aire o con papel
absorbente
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PRACTICA 2
OBSERVACIONES Y RESULTADOS

De acuerdo a sus observaciones al microscopio, registre sus resultados en el cuadro.
1. Haga un dibujo de un campo microscpico representativo.
2. Describa las clulas de acuerdo a su morfologa y arreglo.
3. Describa el color de las clulas tintadas.
4. Clasifique el organismo como Gram-positivo o Gram-negativo.
E.coli M. luteus B. megaterium Mezcla
Dibujo de
campo
microscpico
representativo


Morfologa
celular:
-Forma:
-Arreglo

Color
Reaccin de
Gram