I.

INTRODUCCIN

Todos los seres vivos estn formados por clulas que son la mnima
organizacin supramolecular, que cumplen con todas las caractersticas de los
seres vivos. Estas estn compuestas por: -una membrana plasmtica o celular,
conocida como plasmalema, compuesta por una doble capa de fosfolpidos en
la que estn inmersas diferentes protenas; -una matriz citoplasmtica o
citoplasma que consiste en un gel casi liquido compuesto por agua, en el que
estn inmersas molculas y macromolculas libres, como glcidos, lpidos,
aminocidos y protenas; -material gentico o cromatina, que les permite
autoduplicarse y transmitir a su descendencia las caractersticas de la especie, y
que est formado por cido desoxirribonucleico (ADN) asociado a protenas
(histonas), situado en el ncleo de las clulas eucariotas; el ncleo esta formado
por un carioplasma (sustancia viscosa en estado de gel, con cidos nucleicos,
aminocidos, nucletidos, protenas, glucgeno, etc.) y rodeado por una doble
membrana: la carioteca o envoltura nuclear.

El ADN constituye el material hereditario de un individuo. En l estn escritas las
instrucciones que deben seguir las clulas para construir un organismo y
mantenerlo vivo. Todas las clulas que forman un individuo contienen una copia
idntica del ADN. Cada una de ellas, sin embargo, lee una parte de estas
instrucciones y por eso hay clulas con diferentes formas y funciones. Est
formado por Desoxirribonucletidos (A, G, C, T), que a su vez estn formados de
desoxirribosa y un ion fosfato. La proporcin y la secuencia de las bases
nitrogenadas diferencian a los polinucletidos. Estructuralmente la molcula
de ADN se presenta en forma de dos cadenas helicoidales enrolladas alrededor
de un mismo eje (imaginario); las cadenas estn unidas entre s por las bases
que la hacen en pares. Los apareamientos son siempre adenina-timina y


citosina-guanina. Desde el punto de vista qumico, el ADN es un polmero de
nucletidos, es decir, un polinucletido. Un polmero es un compuesto formado
por muchas unidades simples conectadas entre s. En el ADN, cada unidad es
un nucletido, y cada nucletido, a su vez, est formado por un azcar
(la desoxirribosa), una base nitrogenada (que puede
ser adenina, timina, citosina o guanina) y un grupo fosfato que acta como
enganche de cada unidad con la siguiente. Lo que distingue a un nucletido de
otro es, entonces, la base nitrogenada, y por ello la secuencia del ADN se
especifica nombrando slo la secuencia de sus bases. La disposicin secuencial
de estas cuatro bases a lo largo de la cadena es la que codifica la informacin
gentica. En los organismos vivos, el ADN se presenta como una doble cadena
de nucletidos, en la que las dos hebras estn unidas entre s por unas
conexiones denominadas puentes de hidrgeno.

II. OBJETIVOS

Extraer el ADN a partir de una muestra biolgica.
Reconocer microscpicamente el ADN, haciendo uso de un colorante.


















III. FUNDAMENTO TERICO

La extraccin de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de
que los iones salinos son atrados hacia las cargas negativas del ADN,
permitiendo su disolucin y posterior extraccin de la clula. Se empieza
por lisar (romper) las clulas mediante un detergente, vacindose su
contenido molecular en una disolucin tampn en la que se disuelve el
ADN. En ese momento, el tampn contiene ADN y todo un surtido de
restos moleculares: ARN, carbohidratos, protenas y otras sustancias en
menor proporcin. Las protenas asociadas al ADN, de gran longitud, se
habrn fraccionado en cadenas ms pequeas y separadas de l por
accin del detergente. Slo queda, por tanto, extraer el ADN de esa
mezcla de tampn y detergente, para lo cual se utiliza etanol.
El cido desoxirribonucleico (DNA) es la molcula que contiene y
transmite la informacin gentica de los organismos, excepto en algunos
tipos de virus. Est formado por dos cadenas complementarias de
nucletidos que se enrollan entre s formando una doble hlice que se
mantiene unida por enlaces de hidrgeno entre bases complementarias.
Los cuatro nucletidos que forman el DNA contienen las bases adenina
(A), guanina (G), citosina (C) y timina (T). El modo en que funciona una
clula depende de su DNA, que acta como un plano o como un
conjunto de instrucciones, y es el encargado de codificar todo lo que
nosotros somos, desde el color del pelo hasta las protenas que tenemos
en nuestra sangre. El conjunto completo del DNA de un organismo se
conoce como su genoma. La extraccin de DNA requiere una serie de
etapas bsicas. En primer lugar, se tienen que romper tanto la pared
celular (en el caso de tratarse de clulas vegetales) como la membrana
plasmtica, para poder acceder al ncleo de la clula. A continuacin,
debe romperse tambin la membrana nuclear para dejar libre el DNA.
Por ltimo, hay que proteger el DNA de enzimas que puedan degradarlo
y para aislarlo hay que hacer que precipite en alcohol.


En esta prctica, simplemente utilizando detergente, papana (del zumo
de pia), y etanol, el DNA puede obtenerse tanto de frutas como la fresa
u hortalizas como la cebolla.
IV. MATERIALES Y EQUIPOS
















Proporcionado por el
laboratorio
Solucin salina fisiolgica.
Solucin de cloruro de
sodio 2M.
Colorante de Acridina o
Safranina.

Mortero.
Vasos de precipitacin.
Varillas de agitacin.
Pipetas de 10ml.
Embudo de vidrio.
Laminas portaobjetos.

Pltano molido
(aprox. 10 gr)
60 ml de
detergente lquido
Vasos de precipitados Papel filtro
Alcohol etlico al
96%
Balanza
Hgado molido
(aprox. 10gr)


V. PROCEDIMIENTO



1. triturar 10 gr de hgado de pollo con 15 ml de SSF.
2. Filtrar la mezcla para eliminar restos de tejido.
3. Agregar una solucin de NaCl 2 M en igual
volumen que el filtrado.
4. Lugo aadir 1 ml de detergente y con una varilla
agitar durante 10 minutos.
5. En un vaso de preciptado aadir la muestra y por
la paredes agregar alcohol lentamente hasta que se
formen dos capas, en la interfase est el ADN.
6. Con una varilla ir moviendo en el mismo sentido,
hasta formarse una fibra blanquesina a simple vista
(ADN).
7. Realizas un preparacin en fresco sancando una
fibra de ADN y depositndolo e una lmina
portaobjetos y agregar el colorante.
8. Dejar actuar el colorante durante 2 minutos. Llevar
al microscpio y obrvar su estructura fibrilar.
Lo mismo se repite para el pltano


VI. RESULTADOS

A. Extraccin del ADN del Hgado y pltano

a. Rompimiento de membranas y paredes celulares








b. Ruptura de ncleos












c. Separacin de protenas,
carbohidratos y lpidos







Pltano triturado Hgado triturado
Muestra del hgado y pltano ya
agregado el detergente
Ruptura de la muestra del
hgado y pltano


d. Precipitacin del ADN








e. Observacin microscpica del ADN













Muestra del pltano ya
agregado alcohol. Y vista de la
fibra de ADN.
Muestra del hgado ya agregado
el alcohol. Y vista de la fibra de
ADN.
Muestra del Hgado en
el microscopio.
Muestra del pltano en
el microscopio.


VII. DISCUSIONES

El producto filamentoso obtenido de la extraccin no es ADN puro ya
que, entremezclado con l, hay fragmentos de ARN. Una extraccin
"profesional" se realiza aadiendo enzimas que fragmentan las
molculas de ARN e impiden que se unan al ADN.

Las clulas vegetales son distinguibles de las clulas animales por su
pared celular rgida y orgnulos como el cloroplasto. Tambin
contienen protenas y enzimas que juegan un papel en la fotosntesis.
Algunas clulas de las plantas son poliploides, lo que significa que
tienen ms de una copia de cada cromosoma por clula. Los
procesos celulares que ocurren en las plantas tales como la
fotosntesis producen una gama de metabolitos secundarios. Las
clulas animales no tienen una pared celular, pero todava necesitan
ser tratadas con productos qumicos como el dodecilsulfato sdico
(SDS) para romper la membrana celular para liberar el ADN
genmico.


El ADN genmico de las plantas es ms difcil de extraer a causa de la
pared celular de la planta, que se elimina por homogeneizacin o
mediante la adicin de celulasa para degradar la celulosa que forma
la pared celular. Adems, los metabolitos presentes en la clula
vegetal pueden interferir con la extraccin de ADN genmico por la
contaminacin de la muestra de ADN durante el proceso de
precipitacin.

Los leucocitos de sangre perifricos son una fuente principal de ADN
genmico en animales, pero la recogida de muestras es difcil ya que
la sangre debe ser retirada del animal. La sangre contiene una serie


de compuestos como protenas, lpidos, glbulos blancos, glbulos
rojos, plaquetas y plasma, que pueden contaminar la muestra de
ADN. El contaminante principal del ADN de animal extrado por
muestras de sangre es hemo, el componente no proteco de la
hemoglobina.


Las diferencias entre el ADN de las plantas y los animales se
encuentra en la secuencia de bases en la hlice. Los compuestos que
se encuentran en las clulas vegetales estn ausentes en las clulas
animales y las secuencias de bases de ADN reflejan esto, puesto que
el ADN genmico de la planta es a menudo mayor que el ADN de los
animales. Estas diferencias afectan los mtodos de extraccin, ya que
impacta en el rendimiento y la pureza del ADN.

La observacin de ADN como filamentos blanquecinos no ha sido
posible debido al vencimiento de la proteasa peptina. La funcin de
la encima proteoltica es proteger al ADN de enzimas que puedan
degradarlo y elimina las protenas que puedan contaminar al ADN y
aquellas que se encuentran en el ncleo celular. A partir de esto el
ADN no se pudo ver porque qued atrapado en el ncleo celular
donde, al no funcionar la peptina, no se pudieron degradar las
membranas proteicas que recubren al ADN, haciendo que no se
desenrolle y salga al exterior.


Si la peptina hubiese separado al ADN de las protenas hubiera
sucedido la precipitacin del mismo ante la presencia del alcohol
para luego extraerlo de la solucin. De esta manera habramos
obtenido como resultado final la aparicin de fibras blanquecinas de
ADN.


VIII. CONCLUCIONES

1. En esta prctica se logr el objetivo principal y planteado que es la
extraccin del ADN en este caso fue de tejido animal, todo esto siguiendo
una serie de pasos para poder lograrlo, as se pudo separar de otros
componentes como protenas, lpidos, carbohidratos y se pudo distinguir
cual era cual y el resultado final fue la extraccin y separacin del ADN.

2. Para la obtencin del ADN en las de tejidos vegetales suele ser ms
compleja que en la de tejidos animales debido a su pared celular.

3. Existen otros colorantes aparte del colorante de safranina o acridina como;
El bromuro de etidio, SYBR Green y Poliacrilamida.

4. Se considera a la pectina proteoltica como el nico factor que llev a la
falla de la experimentacin ya que los pasos del procedimiento fueron
llevados a cabo.

5. En otro caso para poder cuantificar la cantidad de ADN Primero separando
bien el ADN de la muestra y despus usando la tcnica de PCR (reaccin en
cadena de la polimerasa).







IX. CUESTIONARIO

1. Qu muestras biolgicas se puede utilizar para extraer ADN?
Para la obtencin de ADN se puede utilizar cualquier muestra biolgica
que cuente con enzimas ya que estas son las que contienen el ADN.

2. Cul es el mtodo estructural del ADN?
El ADN dentro del ncleo celular se encuentra enrollado y comprimido,
haciendo que su dimetro sea de 2nm. Pero es posible verlo a simple
vista luego de la experimentacin ya que el ADN al encontrarse fuera del
ncleo, se desenrolla aumentando su volumen al ocupar ms espacio.

3. Qu otros colorantes podran ser utilizados para visualizar ADN?
Entre otros tenemos al El bromuro de etidio, SYBR Green Poliacrilamida,
Agarosa y Almidn

4. Cul es la importancia de la prctica?
La importancia es que ya se conoce como encontrar el ADN y en que partes
especficas se puede encontrar, tambin para conocer cules son los mtodos
ms utilizados para el reconocimiento de este.

X. BIBLIOGRAFA

1. Mary K. Campbell,Shawn O. Farrell, Bioqumica. Editorial Cengage learning.
30/11/2006 - 844 pginas.

2. Helena Curtis, Sue James, Adriana Schnek. Biologa, editorial mdica
panamericana, sptima edicin.