XIII JORNADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSO JEPEX 2013 UFRPE: Recife, 09 a 13 de dezembro.

EXPRESSO DA GLICOPROTENA gE DO VIRUS DA DOENA DE

AUJESZKY EM Pichia pastoris

Luiz Cosme da Silva Jnior
1
, Karin Florncio Lins de Paiva Fontes
1
, Andr Luiz Santos de Jesus
2
, Filipe Colao Mariz
2
,
Marcelo Nazario Cordeiro
2
, Antnio Carlos Freitas
2
, Roberto Soares de Castro
1



Introduo

A Doena de Aujeszky (DA) responsvel por considerveis perdas econmicas diretas e indiretas indstria
suincola mundial, decorrentes do impacto na produo, havendo a eliminao dos animais infectados dos rebanhos e
restrio ao comrcio internacional de seus produtos. Seu agente causador o Hespesvrus Suino 1 (Suid herpesvirus 1
SHV1), um vrus de DNA, tambm conhecido por Vrus da Pseudoraiva (PRV), que acomete vrias espcies de
mamferos, e esta capacidade de infectar vrias espcies animais facilita sua manuteno na natureza (METTENLEITER,
1996; ICTV, 2011).
Algumas medidas podem ser aplicadas na tentativa de controlar e erradicar a DA. Vacinar o rebanho; realizar testes
sorolgicos nos animais do plantel; e retirar os animais positivos, repetindo o teste periodicamente uma das principais
medidas aplicadas entre os pases (MENGELING et al., 1997). O sucesso de um programa de controle da DA, que use
vacina com gene deletado, depende do uso de teste diagnstico capaz de diferenciar animais infectados de animais
vacinados, e que apresente baixo custo e confiveis sensibilidade e especificidade. A sensibilidade do teste deve ser
suficiente para identificar resposta humoral no incio da infeco e no perodo de latncia, onde o ttulo de anticorpos
diminui (MENGELING et al., 1997).
Por induzir boa resposta imunolgica e ser bem conservada nas amostras virais de campo, inclusive amostras
brasileiras, a protena gE do SHV1 pode ser usada em testes diagnsticos para diferenciao de animais naturalmente
infectados dos vacinados com vacinas deletadas para esse gene, permitindo assim a adoo conjunta da vacinao, teste e
eliminao dos portadores de anticorpos especficos para a protena gE (MENGELING et al., 1997; FONSECA
JNIOR, 2008).
A glicoprotena gE uma protena de membrana tipo 1 que est complexada com a glicoprotena gI, e sua poro C
terminal interage com a protena VP22 (UL49). Seu gene (US8) est localizado entre os nucleotdeos 123.502 e 125.235,
com tamanho de 1.733 nucleotdeos, e sua forma peptdica possui 577 aminocidos e peso molecular de 62,4 kDa. A gE
tem papel fundamental na virulncia do SHV1 por auxiliar a disseminao viral que ocorre clula-clula no hospedeiro
(METTENLEITER, 1996; KLUPP et al., 2004).
A protena gE do SHV1 glicosilada. Assim, atravs da engenharia gentica deve ser produzida usando-se sistemas
que realizem a glicosilao para que a protena recombinante se assemelhe nativa de origem viral. Por outro lado,
leveduras como Sacharomices cerevisae e Pichia pastoris, realizam a maioria das modificaes das clulas animais,
inclusive modificaes ps-traducionais como a glicosilao, e tm a melhor relao benefcio/custo para produo em
alta escala. O uso da levedura P. pastoris como sistema de expresso de protenas heterlogas tem se estabelecido nos
ltimos anos como sistema eficiente por ser de fcil manipulao gentica, metilotrfica, com alto rendimento, e com
fcil recuperao da protena recombinante, que pode ser secretada para o meio de cultivo e purificada por processos
simples atravs de centrifugao ou dilise, pelo fato dessa levedura secretar baixa taxa de protenas nativas (AO et al.,
2003).
O objetivo com este trabalho foi clonar e expressar o gene referente a poro extramembranar da glicoprotena gE do
Vrus da Doena de Aujeszky em sistema de expresso Pichia pastoris.

Material e mtodos
A. Construo da sequncia otimizada do gE (gEot)
Anlises de bioinformtica foram realizadas com base na sequncia do genoma completo do SHV1 disponvel no
NCBI, acesso NC_006151.1, para a escolha do fragmento referente ao gene da glicoprotena gE (Klupp et al., 2004). A
sequncia gnica selecionada compreende a poro extramembranar da gE (SEBASTIN, et al., 2008), e aquela que foi
sintetizada sofreu a otimizao nos cdons (codon usage) para aperfeioar sua expresso na levedura P. pastoris,
resultando em uma sequncia gnica diferente, porm, com mesma informao proteica. Stios de restrio XbaI e NotI
foram adicionados na extremidade 3 e stio XhoI na extremidade 5 do gene. Ao gene foi acrescido ainda uma sequncia
repetida de nucleotdeos (10x Histidina) para facilitar a imunodeteco da protena e um cdon de parada (stop codon).

1
Laboratrio de Virologia Animal, Departamento de Medicina Veterinria, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Rua Don Manoel de
Medeiros, s/n, Recife, PE, CEP 52171-900. E-mail: luizcosme.s@gmail.com
2
Laboratrio de Estudos Moleculares e Terapia Experimental, Departamento de Gentica, Universidade Federal de Pernambuco. Avenida Prof.
Moraes Rego, 1235 Cidade Universitria 50670-901 - Recife, PE - Brasil

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B. Transformao de E. coli
A transformao das clulas E. coli, linhagem DH5 (Invitrogen Carlsbad, CA, EUA), foi realizada com a insero
da construo pBSKgEot, seguindo protocolo adaptado de Sambrook et al., (1989). As clulas transformadas foram
cultivadas em placas contendo meio de cultura LB (Luria-Bertani: triptona 1%, extrato de levedura 0.5% e NaCl 1%)
com adio de 15g/L de Agar e ampicilina (100 g/ml), a 37 C em estufa de cultura microbiana (Nova tica). As
colnias que cresceram foram inoculadas em LB lquido a 37 C por 16 h, sob agitao constante de 250 RPM, e seu
DNA plasmidial foi extrado pelo mtodo de lise alcalina e purificao por precipitao proteica e centrifugao
(SAMBROOK et al, 1989). O DNA foi submetido digesto dupla com as enzimas Xho I e Not I (Promega), seguindo
recomendaes do fabricante, e o inserto gEot foi extrado do gel de agarose, purificado (GFX
TM
PCR DNA and Gel
Band Purification kit - GE Healthcare) e usado em reao de ligao com a enzima T4 ligase (Promega), no vetor
pPICZA, que possui resistncia a Zeocina
TM
.
As clulas transformadas foram crescidas e selecionadas em placas contendo meio de cultura LB low salt (NaCl 0,5%)
com adio de 15g/L de Agar e antibitico Zeocina
TM
(25 g/ml). As colnias pr-selecionadas foram inoculadas em LB
low salt lquido a 37 C por 16 h, sob agitao constante de 250 RPM, e foram submetidas extrao de DNA
plasmidial. A confirmao da construo pPICZAgBot e da clonagem da E. coli foi feita atravs de digesto com as
enzimas Xho I e Not I, e consequente liberao do inserto gEot (~1300pb) e do vetor pPICZA (~3600 pb). O DNA foi
sequenciado utilizando os primers AOX1R GCAAATGGCATTCTGACATCC e AOX1F
GACTGGTTCCAATTGACAAGC para confirmar a clonagem e a posio in frame do inserto no vetor. Foi utilizado o
Genetic Analyzer 3500 (Applied Biosystems HITACHI).
C. Transformao da levedura P. pastoris
O DNA da construo pPICZAgEot foi extrado, linearizado pela enzima SacI (Promega), purificado a partir do gel
e quantificado (Nanovue GE). O DNA foi usado na clonagem da linhagem KM71H possuindo fentipo Mut
S
e His
-
, da
levedura P. pastoris por eletroporao, com pulso de 1500 v por 5 ms no Eletroporation System 399 (BTX Harvard
Apparatus), segundo SCORER et al. (1994).
D. Imunodeteco da gEr
O sobrenadante das indues foram aliquotados em tampo Laemmli 2X (Tris-HCl 1M pH 6.8, SDS 4%, -
mercaptoetanol 4%, glicerol 20%, azul de bromofenol 0.1%) e aquecidas por 8 min a 95C antes de serem aplicadas no
gel. Foi utilizado o tampo de corrida SDS-PAGE 1X, cuba vertical para SDS-PAGE e fonte de tenso ajustada para 80
V e 30 mA por 90 minutos. O SDS-PAGE foi realizado com gel separador de 12%, composto por 6ml de
Acrilamida/Bis-acrilamida 30%/0.8%, 3,75ml de Tris-HCl 1M/SDS 0,4%, pH 8.8, 50l de APS 10% (Sigma-Aldrich),
10l de TEMED (Sigma-Aldrich), gua MilliQ q.s.p 15ml, e gel concentrador de 5%, composto por 0,65ml de
Acrilamida/Bis-acrilamida 30%/0,8%, 1,25ml de Tris-HCl 1M/SDS 0,4% pH 6.8, 25l de APS 10%, 5l de TEMED,
gua destilada q.s.p 5ml. Para o Western blot, as protenas foram transferidas para membrana de PVDF (Polyvinylidene
fluoride, Millipore), que foi submetida reao de bloqueio durante 1 h. Em seguida a membrana foi incubada com
anticorpo monoclonal anti-HIS na diluio de 1:2000 em PBS, conjugado fosfatase alcalina (Sigma) durante 1 h, e
lavada em seguida com PBS-Tween por 10 min por 3 vezes, em seguida revelada com Liquid Substrate System
BCIP/NBT (Sigma-Aldrich) em cmara escura por dez minutos.
E. Induo e expresso da gEr
O clone foi nomeado de pPICZAgEotKM71H, e a sua induo com o controle negativo pPICZA iniciou com a
etapa de crescimento celular que foi feita em 50 ml de meio YPD lquido em frascos tipo Erlenmeyer 500mL a 30C sob
agitao de 250 RPM por 48 horas ou at uma DO
600
igual a 20. Para induo, as clulas foram centrifugadas por 5min a
1500 x g e ressuspendidas em 5mL de BMMY (Buffered Methanol-Complex Medium extrato de levedura 1%, triptona
2%, 100 mM fosfato de potssio, YNB 1.34%, biotina 4x10
-5
%, metanol 1%), em mesmo tipo de frasco, a 29C sob
agitao de 250 RPM por 72 horas. Foi adicionado metanol a 24h e 48h para concentrao de 1%. Ao final da induo,
os cultivos foram centrifugados a 1500 x g por 5min e o sobrenadante precipitado com TCA (Tricloroactico) e
submetidas ao SDS-PAGE.

Resultados e Discusso
Neste trabalho foi adotada a estratgia de clonar o gene sinttico da protena gE do SHV1 em P. pastoris usando gene
sinttico cdon otimizado. Estratgias convencionais de clonagem de genes virais utilizam PCR para isolar o gene de
interesse, a partir de amostra biolgica, e construir a sequncia de clonagem com os stios de restrio adequados. Isto
implica em risco de erros na sequncia nucleotdica mesmo com o uso de enzima Taq DNA Polimerase de alta
fidelidade, e de exposio a agentes infecciosos. Todo esse trabalho requer tempo e custo considerveis, alm de se
tornar empecilho em algumas estratgias de clonagem (AL-MUBARAK et al, 2004). Por outro lado, vrias so as
vantagens no uso do gene sinttico. Ao receber a sequncia de clonagem j com os stios de restrio inseridos e clonada
em vetor de passagem evitam-se os erros decorrentes da construo convencional de sequncias, e tambm evita-se o
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risco de contaminao no manuseio de material biolgico para obteno do material gentico, alm de facilitar o
processo de clonagem. Alm disso, o uso do gene sinttico tambm permite adequar a sequncia de clonagem para um
fragmento com maior facilidade de traduo. A substituio dos cdons originais por cdons preferenciais para o
hospedeiro de clonagem, no caso P. pastoris, permite melhor taxa de traduo e, consequentemente, maior produtividade
na produo da protena recombinante. Para a expresso de algumas protenas o uso de sequncia otimizada essencial
para que ocorra a sntese proteica (BAZAN et al., 2009).
As opes de vetores de clonagem disponveis comercialmente que tenham a habilidade de secretar a protena
recombinante so diversas. O pPICZA, escolhido neste trabalho, que possui o sinal -MF de secreo e a marca de
seleo Sh ble, demonstrou eficincia na clonagem, na expresso, na seleo de clones com mltiplas cpias e na
secreo da gEr, resultado obtido tambm por Coutinho (2011), trabalhando com a clonagem de genes dos vrus da
anemia Infeciosa Equina.
O Western blotting demonstrou a presena da gEr atravs do uso de Ac anti-His e identificao da calda de histidina,
identificando a gEr em uma altura entre 50 e 60kDa.
As anlises realizadas com a utilizao do teste de ELISA com gE recombinante, alm de serem obrigatrias so
importantes para o rastreamento epidemiolgico da doena. Somado ao baixo custo e a capacidade de diferenciar os
animais infectados dos vacinados, os resultados obtidos so importantes para o reforo da vigilncia epidemiolgica e a
criao de novas estratgias de controle da DA (SILVA et al., 2005). Espera-se que ELISA utilizando a gEr, produzida
em P. pastoris, deva apresentar alta sensibilidade e especificidade, por esta protena apresentar a conformao natural,
garantida pelo uso de sistema de expresso eucarioto que realiza as etapas ps-traducionais necessrias formao de
uma protena imunorreativa (AO et al., 2003; COUTINHO, 2011).
Agradecimentos
Agradecemos a FACEPE pelo financiamento da bolsa de Mestrado.

Referncias
AL-MUBARAK, A., ZHOU, Y., CHOWDHURY, S. I. A Glycine-Rich Bovine Herpesvirus 5 (BHV-5) gE-Specific
Epitope within the Ectodomain is Important for BHV-5 Neurovirulence. Journal of Virology. v.78, p. 4806-4816, 2004.
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and its utilization in an indirect PRV gE-ELISA. Journal of Virological Methods. v. 114, p. 145150, 2003.
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Recife: Universidade Federal Rural de Pernambuco, 2011. 91p. Dissertao de Mestrado.
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Horizonte: Dissertao Universidade Federal de Minas Gerais, 2008. 53p.
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