GENTICA BACTERIANA

MUTACION GENETICA

En Gentica se denomina mutacin gentica, mutacin molecular o mutacin
puntual a los cambios que alteran la secuencia de nucletidos del ADN. No confundir
con una mutacin gnica que se refiere a una mutacin dentro de un gen.
Estas mutaciones en la secuencia de ADN pueden llevar a la sustitucin
de aminocidos en las protenas resultantes. Un cambio en un solo aminocido puede
no ser importante si es conservativo y ocurre fuera del sitio activo de la protena.
Entre las mutaciones genticas podemos distinguir:
Mutacin silenciosa o sinnima: no se produce cambio de aminocido.
Mutacin por sustitucin de bases: Se producen al cambiar en una posicin un
par de bases por otro (son las bases nitrogenadas las que distinguen los
nucletidos de una cadena). Distinguimos dos tipos que se producen por diferentes
mecanismos bioqumicos:
- Mutaciones transicionales o simplemente transiciones, cuando un par
de bases es sustituido por su alternativa del mismo tipo. Las dos bases
pricas son adenina (A) y guanina (G), y las dos pirimdicas son citosina
(C) y timina (T). La sustitucin de un par AT, por ejemplo, por un par GC,
sera una transicin.
- Mutaciones transversionales o transversiones, cuando un par de bases
es sustituida por otra del otro tipo. Por ejemplo, la sustitucin del par AT
por TA o por CG.
Si los cambios dan lugar a un nuevo aminocido, ser una mutacin no sinnima, pero
si la mutacin es neutra habr ninguna ventaja selectiva.
Mutaciones de corrimiento , cuando se aaden o se quitan pares de nucletidos
alterndose la longitud de la cadena. Si se aaden o quitan pares en un nmero
que no sea mltiplo de tres (es decir si no se trata de un nmero exacto de
codones), las consecuencias son especialmente graves, porque a partir de ese
punto, y no slo en l, toda la informacin queda alterada. Hay dos casos:
- Mutacin por prdida o delecin de nucletidos: En la secuencia de
nucletidos se pierde uno y la cadena se acorta en una unidad.
- Mutacin por insercin de nuevos nucletidos: Dentro de la secuencia
del ADN se introducen nucletidos adicionales, interpuestos entre los que
ya haba, alargndose correspondientemente la cadena.
Adems pueden dar lugar a mutaciones sin sentido si se introduce un codn de
terminacin.
Mutaciones en los sitios de corte y empalme (Splicing)
Las mutaciones de corrimiento del marco de lectura tambin pueden surgir por
mutaciones que interfieren con el splicing del ARN mensajero. El comienzo y final de
cada intrn en un gen estn definidos por secuencias conservadas de ADN. Si un
nucletido muta en una de las posiciones altamente conservada, el sitio no funcionar
ms, con las consecuencias predecibles para el ARNm maduro y la protena codificada.
Hay muchos ejemplos de estas mutaciones, por ejemplo, algunas mutaciones en el gen
de la beta globina en la beta talasemia son causadas por mutaciones de los sitios de
splicing.

REPARACION GENETICA

La reparacin del ADN es un conjunto de procesos por los cuales una clula identifica
y corrige daos hechos a las molculas de ADN que codifican el genoma. En las
clulas humanas, tanto las actividades metablicas como los factores ambientales,
como los rayos UV o la radiactividad, pueden causar daos al ADN, provocando hasta
un milln de lesiones moleculares por clula por da. Muchas de estas lesiones causan
daos estructurales a la molcula de ADN, y pueden alterar o eliminar la capacidad de
la clula de transcribir el gen que codifica el ADN afectado. Otras lesiones producen
mutaciones potencialmente nocivas en el genoma de la clula, lo que afecta la
supervivencia de sus clulas hijas a la hora de la mitosis. Por consiguiente, el
proceso de reparacin del ADN es constantemente activo, respondiendo a daos a
la estructura del ADN.
La velocidad de la reparacin del ADN depende de muchos factores, como el tipo de
clula, su edad, y el ambiente extracelular. Una clula que haya acumulado una gran
cantidad de daos en el ADN, o que no pueda reparar eficazmente los daos
producidos en su ADN, puede entrar en uno de tres estados posibles:
1. Un estado irreversible de inactividad, llamado senescencia.
2. Suicidio celular, llamado apoptosis o muerte celular programada.
3. Carcinognesis, o formacin de cncer.



RECOMBINACION GENETICA

Como ya hemos dicho, la recombinacin gentica es un proceso que lleva a la
obtencin de un nuevo genotipo a travs del intercambio de material gentico entre
secuencias homlogas de DNA de dos orgenes diferentes. Las secuencias homlogas
de DNA tienen la misma secuencia o casi la misma; por consiguiente, puede ocurrir
apareamiento de bases en una longitud extensa de las dos molculas de DNA. Los
cromosomas homlogos tienen los mismos genes ubicados en el mismo sitio.

Para que aparezcan nuevos genotipos como consecuencia de la recombinacin, es
esencial que las dos secuencias homlogas sean genticamente diferentes. Tal es el
caso en una clula eucaritica diploide, que tiene dos juegos de cromosomas, uno
procedente de cada padre. El punto donde los cromosomas se cruzan se
denomina kiasma y el proceso de intercambio se llama entrecruzamiento.

En las clulas procariotas slo existe un nico cromosoma. Por lo tanto, antes de que
pueda ocurrir la recombinacin, un cromosoma homlogo (normalmente una parte de
este) debe primero ser transferido desde una bacteria donadora a una bacteria
receptora. Debido a que el cromosoma del donador debe ser homlogo con el receptor,
las bacterias donadoras y receptoras generalmente pertenecen a la misma especie o a
especies muy relacionadas.

La recombinacin homloga ocurre despus de la transferencia es decir, cuando el
fragmento de DNA del donador est en la clula receptora. Si no se produce
recombinacin, el fragmento de DNA del donador se perder, debido a que no puede
replicarse independientemente.



RECOMBINACION GENETICA EN BACTERIAS

La recombinacin gentica en bacterias tiene lugar cuando se transfieren fragmentos
de DNA homlogo desde una clula donadora a una clula receptora por uno de estos
tres procesos:
1.- Transformacin: supone que el DNA donador se encuentra libre en el
medio.

2.- Transduccin: donde la transferencia del DNA donador est mediada
por un virus.

3.- Conjugacin: donde la transferencia implica un contacto clula-clula y
la presencia de un plsmido conjugativo en la clula donadora.

INTERCAMBIO GENTICO EN BACTERIAS
La mayora de bacterias, especialmente numerosas especies patgenas, utilizan su
ADN de forma promiscua. El intercambio de ADN entre clulas permite el intercambio
de genes y caractersticas entre ellas, lo que ocasiona la aparicin de cepas
bacterianas nuevas. Este intercambio puede resultar ventajoso para el receptor,
especialmente cuando el ADN codifica mecanismos de resistencia a los antibiticos. El
ADN transferido puede integrarse en el cromosoma del receptor o bien mantenerse de
manera estable en forma de elemento extracromosomico (plsmido) o como un virus
bacteriano (bacterifago) y se transmite a las bacterias hijas como una unidad dotada
de capacidad autnoma de replicacin.
Los plsmidos son pequeos elementos genticos cuya replicacin es independiente
del cromosoma bacteriano. La mayor parte de los plsmidos son molculas circulares
bicatenarias de ADN con un nmero variable de pares de bases (de 1.500 a 400.000).
Sin embargo, Borrelia burgdorferi, el agente etiolgico de la enfermedad de Lyme, y la
bacteria afn Borrelia hermsii presentan una caracterstica peculiar en el grupo de las
eubacterias: la presencia de plsmidos lineales. Al igual que el ADN cromosmico
bacteriano, estos plsmidos se pueden replicar de forma autnoma, por lo que reciben
el nombre de replicones. Algunos plsmidos, como el plsmido F de E. coli, son
epizonas, lo que indica que se pueden integrar en el cromosoma del anfitrin.
Los plsmidos portan informacin gentica, la cual
puede proporcionar una ventaja selectiva a las
bacterias aunque no constituya una ventaja selectiva
para la bacteria. Por ejemplo, los plsmidos pueden
conferir un nivel alto de resistencia a antibiticos,
codificar la produccin de bacteriocinas, toxinas,
determinantes de virulencia y contener otros genes
que otorguen una ventaja respecto a la
metabolizacin de ciertos sustratos en comparacin
con otros microorganismos o en el interior del
organismo anfitrin. El nmero de copias de
plsmido producidas por una clula es especfico de
cada uno de ellos. Este nmero es la relacin
existente entre las copias del plsmido y el nmero
de copias del cromosoma. Su valor puede ser bajo (hasta de 1 en el caso de los
plsmidos grandes) o alto (hasta de 50 en los plsmidos ms pequeos).
Los plsmidos de gran tamao (20-120 kb), como el factor F de fertilidad de E. coli o el
factor de transferencia de resistencia (80 kb), pueden a menudo mediar su propia
transferencia de una clula a otra mediante un proceso denominado conjugacin. Estos
plsmidos conmutativos codifican todos los factores necesarios para su propia
transferencia. En cambio, otros plsmidos pueden ser transferidos a las clulas
bacterianas por medio de mecanismos distintos de la conjugacin (p. ej., por
transformacin o por transduccin).
Los bacterifagos son virus
bacterianos. Estos elementos
genticos extracromosomicos pueden
sobrevivir fuera de la clula del
anfitrin ya que su genoma (que
puede estar formado por ARN o ADN)
est protegido por una capa de
protenas. Los bacterifagos
muestran diversidad considerable en
cuanto a la naturaleza de su cido
nucleico; dicha diversidad se refleja
en los diferentes modos de
replicacin. Los fagos lticos y
atemperados muestran estrategias de
propagacin fundamentalmente
diferentes. Los fagos lticos producen muchas copias de s mismos en un solo brote de
crecimiento. Los fagos atemperados se establecen en la forma de profagos ya sea al
volverse parte de un replicn establecido (cromosoma o plsmido) o al formar un
replicn independiente.
El dsDNA de muchos fagos lticos es lineal y la primera etapa en su replicacin es la
formacin de DNA circular. Este proceso depende de extremos de cohesin,
complementarios monocatenarios de DNA que se hibridizan. La ligadura, que consiste
en la formacin de un enlace fosfodiester entre los extremos 5 y 3 de DNA, da origen a
DNA circular unido por enlaces componentes que puede sufrir replicacin de una forma
similar a la utilizada por otros replicones. El desdoblamiento de esta estructura circular
produce DNA lineal que se empaca en cubiertas protenicas para formar la progenie de
los fagos.
El ssDNA de los fagos filamentosos se convierte a una forma de replicacin circular
bicatenaria. Una cadena de las formas de replicacin se utiliza como plantilla en un
proceso continuo que produce DNA monocatenario. La plantilla es un crculo cerrado y
el ssDNA que se produce sufre desdoblamiento y empaquetamiento con protenas para
su extrusin de la clula.
Los fagos ssRNA se encuentran entre las partculas extracelulares ms pequeas que
contienen informacin que permite su propia replicacin. Por ejemplo, el fago MS2 de
RNA contiene (en menos de 4 000 nucletidos) los tres genes que pueden actuar como
mRNA despus de una infeccin. Un gen codifica la cubierta de protenas en tanto que
otro codifica la polimerasa de RNA que forma un dsRNA para la replicacin.
El ssRNA producido por la forma replicativa es la parte principal de esta nueva partcula
infecciosa. El mecanismo de propagacin del bacterifago de RNA a travs de
intermediarios de RNA contrasta fuertemente con la propagacin de retrovirus,
RNAvirus animales que utilizan RNA como plantilla para la sntesis de DNA.
Algunos bacterifagos atemperados, que se ejemplifican por el fago P1 de E. coli
pueden establecerse en un estado de profago como un plsmido. El dsDNA de otro
bacterifago atemperado se establece como profago mediante la insercin en el
cromosoma del hospedador. El sitio de insercin puede ser bastante especifico, como
se ejemplifica por la integracin del fago de E. coli en el locus int del cromosoma
bacteriano. La especificidad de la integracin depende de la identidad de la secuencia
de DNA compartido por el locus cromosmico int y una regin correspondiente del
genoma del fago. Otro fago atemperado, como el fago Mu de E. coli, se integra en
cualquier sitio de una amplia gama de sitios cromosmicos y en este aspecto se
comporta de manera similar a los transposones.
Los profagos contienen genes necesarios para la replicacin ltica (tambin conocida
como replicacin vegetativa) y la expresin de estos genes se conserva reprimida
durante el mantenimiento del estado de profago. Una manifestacin de represin es
que un profago establecido con frecuencia confiere inmunidad celular contra
infecciones lticas por medio de un fago similar. Una cascada de interacciones
moleculares desencadena la supresin de la represin de forma que los profagos
sufren replicacin vegetativa, lo que conduce a la formacin de un brote de partculas
infecciosas. Estmulos artificiales como la luz ultravioleta pueden causar supresin de
la represin del profago. El cambio entre la lisogenia (propagacin del genoma del fago
en el hospedador) y el crecimiento de un fago vegetativo ocurre a expensas de la clula
y puede depender en parte del estado fisiolgico de la misma. Una bacteria que no
presenta replicacin no dar soporte vegetativo al crecimiento del fago, en tanto que
una clula en crecimiento intensivo contiene energa y cantidades suficientes de
bloques de construccin para soportar la replicacin rpida del bacterifago.




Los transposones (genes que
saltan) son unos elementos
genticos mviles que pueden
transferir ADN de una posicin a
otra del genoma o entre distintas
molculas de ADN dentro de una
misma clula (p. ej., de un
plsmido a otro o de un plsmido a
un cromosoma). Los transposones
se detectan tanto en los
procariotas como en los
eucariotas. Los transposones ms
simples se conocen como
secuencias de insercin y su
longitud comprende de 150 a 1.500
pares de bases con repeticiones
invertidas de 15 a 40 pares de
bases y la informacin gentica mnima necesaria para su propia transferencia (es
decir, el gen que codifica la transposasa). Los transposones complejos contienen otros
genes, como genes que proporcionan resistencia frente a antibiticos. En ocasiones,
los transposones se introducen en el interior de los genes y los inactivan.
Si la insercin e inactivacin tiene lugar en un gen encargado de codificar una protena
esencial, la clula muere.
Por tanto podemos decir los transposones no portan la informacin gentica necesaria
para acoplar su propia replicacin a la divisin celular y por tanto su propagacin
depende de su integracin fsica con el replicn bacteriano. Esta asociacin se
favorece por medio de enzimas que confieren la capacidad de los transposones para
formar copias de s mismos; estas enzimas pueden permitir que los transposones se
integren con el mismo replicn o con un replicn independiente. La especificidad de la
secuencia en el sitio de insercin por lo general es baja, de forma que los transposones
a menudo parecen insertarse en un patrn aleatorio, pero tienden a favorecer regiones
codificadas por tRNA. Muchos plsmidos se transfieren entre clulas bacterianas y la
insercion de un transposon en dicho plsmido es un vehculo que conduce a la
diseminacin de transposones en toda la poblacin bacteriana.
Algunas bacterias patgenas utilizan un mecanismo semejante para coordinar la
expresin de un sistema de factores de virulencia. Los genes de actividad pueden
agruparse en un islote de virulencia o patogenicidad rodeado por unos elementos
mviles semejantes a los transposones que les permiten moverse tanto en el interior
del cromosoma como hacia otras bacterias.
Cualquier unidad gentica puede reaccionar ante la presencia de un estmulo ambiental
(p. ej., pH, calor o contacto con la superficie de la clula del anfitrin) como mecanismo
de coordinacin de la expresin de un proceso complejo. Por ejemplo, el islote SPI-1
de Salmonella codifica 25 genes que permiten la entrada de esta bacteria en clulas no
fagocitadas.
MECANISMOS DE TRANSFERENCIA GENTICA ENTRE CLULAS
El intercambio de material gentico entre las clulas bacterianas puede tener lugar a
travs de uno de los tres mecanismos siguientes 1) conjugacin, que consiste en un
apareamiento o intercambio cuasisexual de informacin gentica entre una bacteria
(donante) y otra bacteria (receptora); 2) transformacin, la cual provoca la adquisicin
de nuevos marcadores genticos mediante la incorporacin de ADN exgeno, o 3)
transduccin, la cual se caracteriza por la transferencia de informacin gentica de
una bacteria a otra por medio de un bacterifago. En el interior de la clula, el
transposn puede saltar entre distintas molculas de ADN (p. ej., plasmido a
plasmido o plasmido a cromosoma).
TRANSFORMACIN
La transformacin es el proceso mediante el cual las bacterias captan fragmentos de
ADN desnudo y los incorporan a sus genomas. La transformacin fue el primer
mecanismo de transferencia gentica que se descubri en las bacterias. En 1928,
Grifflth observ que la virulencia del neumococo se relacionaba con la presencia de
una cpsula de polisacrido que le rodeaba y que los extractos de bacterias
encapsuladas productoras de colonias lisas podan transmitir este rasgo a las bacterias
no encapsuladas, las cuales presentan generalmente una morfologa rugosa. Alrededor
de quinceaos despus, los estudios de Grifflth permitieron que Avery, McLeod y
McCarty identificaran el ADN como el principio clave del mecanismo de transformacin.
Las bacterias grampositivas y gramnegativas son capaces de captar y conservar de
forma estable ADN exgeno. Ciertas especies presentan una capacidad natural de
captacin de ADN exgena (por lo que se definen como competentes), como
Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae y bacterias pertenecientes a los
gneros Bacillus y Neissera. La competencia aparece al final de la fase logartmica de
crecimiento, un cierto tiempo antes de que la poblacin bacteriana entre en la fase
estacionaria. La mayor parte de las bacterias no muestra una capacidad natural de
captacin del ADN. Asimismo, para introducir plsmidos y otras molculas de ADN en
el interior de E. coli y otras bacterias se utilizan mtodos qumicos o de electroporacn
(empleo de pulsos de alto voltaje).
CONJUGACIN
La conjugacin se produce en la mayora, si no en todas, las eubacterias. Suele darse
entre bacterias pertenecientes a una misma especie o de especies relacionadas,
aunque tambin tiene lugar entre procariotas y clulas vegetales, animales y micticas.
La conjugacin se ha descrito en E. coli, bacteroides, enterococos, estreptococos,
estreptomicetos y clostridios. Un gran nmero de plsmidos conjugativos de mayor
tamao codifica colicinas o resistencia a antibiticos.
La transferencia gentica en E. coli fue descrita por vez primera en 1946 por Lederberg
y Tatum al observar un intercambio semejante al sexual entre dos cepas mutantes de
E. coli K12. La conjugacin es el proceso por el que el ADN pasa directamente por
contacto intercelular durante el acoplamiento de las bacterias. La conjugacin
produce una transferencia unidireccional de ADN desde un clula donante (o macho)
hasta una clula receptora (o hembra) a travs del llamado pilus sexual. Las bacterias
grampositivas que llevan a cabo una conjugacins R (resistencia antibitica), como ios
estreptococos, los estreptomicetos y los clostridios, se acercan por medio de una
molcula de adhesina presente en la superficie de la clula donante en lugar de a
travs de un pilus.
El tipo de acoplamiento (sexo) de la clula depende de la presencia (clula macho) o
ausencia (clula hembra) de un plsmido conjugativo, como el plsmido F de E. coli.
El plsmido F se define como conjugativo porque contiene todos los genes necesarios
para su propia transferencia, como la capacidad de fabricar pli sexuales e iniciar la
sntesis de ADN en el llamado origen de transferencia (OrT). El plsmido F se
transfiere a s mismo, convirtiendo a las clulas receptoras en clulas macho F+.
Cuando un fragmento de ADN cromosmico se ha incorporado a la secuencia del
plsmido, se designa como plsmido F prima (F'). Cuando este plsmido se
transfiere al interior de la clula receptora, transporta el fragmento y lo convierte en un
F' macho. Cuando la secuencia del plsmido se integra en el interior del cromosoma
bacteriano, la clula se designa como clula Fffr (alta frecuencia de recombinacin).
El ADN transferido por conjugacin no es una molcula bicatenaria helicoidal, sino una
molcula monocatenaria. La movilizacin comienza cuando una protena codificada por
un plsmido introduce una rotura monocatenaria en un punto especfico del OriT. La
muesca as formada inicia un replicacin por crculo rodante y la cadena lineal
desplazada se dirige hacia la clula receptora. A continuacin, el ADN monocatenario
adopta nuevamente una conformacin circular y sintetiza su cadena complementaria.
La integracin de un plsmido F en el cromosoma bacteriano crea una clula Hfr. La
conjugacin comporta la transferencia parcial de la secuencia plasmdica y de un
fragmento del ADN cromosmico bacteriano. Como consecuencia de la fragilidad de la
conexin formada entre las dos clulas acopladas, la transferencia se suele interrumpir
antes de finalizar el proceso, de modo que nicamente se transfieren las secuencias
cromosmicas cercanas al plsmido F integrado.
La interrupcin artificial de un acoplamiento entre un Hfr y una pareja F~ ha resultado
til para cartografiar el ADN cromosmico de E. coli. Este tipo de mapas muestra la
posicin de cada gen en minutos (en relacin con los 100 minutos que requiere la
transferencia completa a 3 7 C) segn su momento de entrada a una clula receptora
respecto a un origen fijo.
TRANSDUCCIN
La transferencia gentica por transduccin est mediada por virus bacterianos
(bacterifagos) que captan fragmentos de ADN y los almacenan en el interior de
partculas de bacterifago. El ADN suministrado a las clulas infectadas es luego
incorporado al genoma bacteriano. La transduccin puede clasificarse como
especializada si los fagos en cuestin transfieren genes especficos (habitualmente los
adyacentes a sus lugares de integracin en el genoma) o generalizada si la seleccin
de las secuencias es aleatoria debido al almacenamiento accidental del ADN de la
clula anfitriona en el interior de la cpside del fago.
Las partculas de la transduccin generalizada deben contener sobre todo ADN
bacteriano y una cantidad pequea o nula de ADN del fago. Por ejemplo, el fago Pl de
E. coli codifica una nucleasa que degrada el ADN cromosmico de las clulas
anfitrionas de E. coli. Un pequeo porcentaje de las partculas resultantes de fago
almacenan los fragmentos de ADN en el interior de sus cpsides. En lugar del ADN del
fago, se inyecta ADN encapsulado en el interior de una nueva clula anfitriona, en la
que puede recombinarse con el ADN homlogo de aquella. Las partculas implicadas
en la transduccin generalizada son muy valiosas para realizar el cartografiado
gentico de los cromosomas bacterianos. Cuanto ms prximos se dispongan dos
genes en el cromosoma bacteriano, mayor ser la probabilidad de un proceso de
cotransduccin en el mismo fragmento de ADN.







RECOMBINACION GENETICA
La recombinacin gentica es un proceso que lleva a la obtencin de un nuevo
genotipo a travs del intercambio de material gentico entre secuencias omlogas de
DNA de dos orgenes diferentes. La informacin gentica de dos genotipos puede ser
agrupada en un nuevo genotipo mediante recombinacin gentica. Por lo tanto la
recombinacin gentica es otra forma efectiva de aumentar la variabilidad gentica de
una poblacin.

Las ventajas de la recombinacin gentica son:
1. Diferentes cepas superproductoras pueden ser reunidas en una sola cepa, de forma
que el efecto acumulativo de estas mutaciones puede ser mayor que el efecto de
una sola mutacin. Sin embargo, la esperanza inicial de obtener un aumento
significativo en el rendimiento por simple recombinacin de dos mutantes de alta
produccin slo ha sido conseguida en unos pocos casos. En la mayora de los
casos, la productividad de los recombinantes generalmente es intermedia entre los
valores de las cepas parentales.

2. En el curso del desarrollo de cepas existe frecuentemente un descenso en el
aumento del rendimiento despus de cada etapa de mutacin. Adems de los
mutantes que son enriquecidos selectivamente debido a su aumento en la
productividad, existe un desarrollo de mutaciones que no se detectan que impiden
un aumento adicional en la produccin de metabolitos a travs de influencias
pleiotrpicas. Con cruces genticos, estos alelos mutantes desfavorables pueden
ser reemplazados por alelos de uno de los padres del cruce.

3. Las cepas de alta produccin pueden realmente aumentar el coste de la
fermentacin debido al cambio de las propiedades fisiolgicas (mayor produccin de
espuma, cambio en los requerimientos del medio de cultivo, etc.). Cruzando de
nuevo la cepa con la cepa silvestre pueden obtenerse cepas de alta produccin con
propiedades mejoradas de fermentacin.

Como ya se menciono, la recombinacin gentica es un proceso que lleva a la
obtencin de un nuevo genotipo a travs del intercambio de material gentico entre
secuencias homlogas de DNA de dos orgenes diferentes. Las secuencias homlogas
de DNA tienen la misma secuencia o casi la misma; por consiguiente, puede ocurrir
apareamiento de bases en una longitud extensa de las dos molculas de DNA. Los
cromosomas homlogos tienen los mismos genes ubicados en el mismo sitio. Sin
embargo, los genes, aunque similares, pueden no ser necesariamente idnticos como
ocurre cuando existe una mutacin en un gen.
Para que aparezcan nuevos genotipos como consecuencia de la recombinacin, es
esencial que las dos secuencias homlogas sean genticamente diferentes. Tal es el
caso en una clula eucaritica diploide, que tiene dos juegos de cromosomas, uno
procedente de cada padre. El punto donde los cromosomas se cruzan se
denomina kiasma y el proceso de intercambio se llama entrecruzamiento.
En las clulas procariotas slo existe un nico cromosoma. Por lo tanto, antes de que
pueda ocurrir la recombinacin, un cromosoma homlogo (normalmente una parte de
este) debe primero ser transferido desde una bacteria donadora a una bacteria
receptora. Debido a que el cromosoma del donador debe ser homlogo con el receptor,
las bacterias donadoras y receptoras generalmente pertenecen a la misma especie o a
especies muy relacionadas.

La recombinacin homloga ocurre despus de la transferencia es decir, cuando el
fragmento de DNA del donador est en la clula receptora. Si no se produce
recombinacin, el fragmento de DNA del donador se perder, debido a que no puede
replicarse independientemente.
Mecanismo de transferencia gentica
El intercambio gentico se realiza a travs de la transferencia de una porcin del
genoma de una clula donadora a otra receptora. No es un paso obligado para
completar el ciclo biolgico del organismo, sino ms bien un proceso ocasional que
ocurre por tres mecanismos diferentes: transformacin, transduccin y conjugacin.
1. En el caso de la transformacin. se libera ADN de las clulas al medio circundante y
las clulas receptoras lo incorporan tomndolo de esta disolucin.

2. En la transduccin se transfiere ADN de una clula a otra como consecuencia de la
formacin de un virin defectuoso de un bacterifago, en el cual parte o todo su
complemento normal de ADN se sustituye por ADN bacteriano (ADN de la clula
donadora). Cuando este fago defectuoso se fija a otra clula bacteriana (clula
receptora) y le introduce este ADN, se produce el intercambio gentico.
3. La conjugacin implica un intercambio gentico entre dos clulas que se hallan en
contacto directo, mediante un proceso que, en todos los casos conocidos, est
codificado por genes situados en plsmidos. Habitualmente por este proceso slo
es transferido el propio plsmido desde la clula donadora a la receptora, pero a
veces se transfieren tambin genes del cromosoma bacteriano.






INGENIERIA GENETICA
La ingeniera es la aplicacin de las ciencias a las necesidades sociales. En aos
recientes la ingeniera basada en gentica bacteriana ha transformado a la biologa. Es
posible aislar fragmentos especficos de ADN y amplificarse y sus genes pueden
expresarse en concentraciones elevadas. La especificidad de los nucletidos
necesarios para el desdoblamiento de las enzimas de restriccin permite que los
fragmentos que contienen genes o partes de los mismos se unan (incorporen) a los
plsmidos (vectores) que pueden usarse a su vez para transformar a las clulas
bacterianas. Las colonias bacterianas o clonas portan genes especficos que pueden
identificarse por hibridacin de ADN o ARN con sondas marcadas. Los productos
protenicos codificados por los genes pueden identificarse ya sea por actividad
enzimtica o por tcnicas inmunolgicas. Este ltimo procedimiento ha incrementado
en gran medida la selectividad notable con la cual se unen anticuerpos
monoclonales a determinados antignicos especficos en las protenas. As , pueden
utilizarse tcnicas de ingeniera para aislar prcticamente cualquier gen y dichos genes
pueden expresarse de forma tal que es posible estudiar o explotar las propiedades
bioqumicas identificadas.
Los genes aislados pueden utilizarse para diversos propsitos. La mutagenesis de
sitio dirigido puede identificarse y alterar la secuencia de ADN de un gen. Es posible
determinar y, si se desea, alterar los residuos de nucletidos esenciales para las
funciones de los genes. Con las tcnicas de hibridacin el ADN puede utilizarse como
una sonda que reconozca los cidos nucleicos correspondientes a las secuencias
complementarias de su propio ADN. Por ejemplo, un virus latente en un tejido animal
se detect con una sonda de ADN incluso en ausencia de infeccin viral evidente. Los
productos protenicos de los genes virales aislados ofrecen una gran promesa como
vacunas porque se preparan sin genes que codifican la replicacin de cido nucleico
viral. Adems, protenas como la insulina que tienen funciones tiles pueden
prepararse en grandes cantidades a partir de bacterias que expresan los genes
clonados.
Preparacin de fragmentos de ADN con enzimas de restriccin
La diversidad gentica de las bacterias se refleja por su amplia gama de enzimas de
restriccin, las cuales poseen una selectividad notable que les permite identificar
regiones especficas de ADN para su desdoblamiento. Las secuencias de ADN
reconocidas por enzimas de restriccin son de manera predominante palndromos
(secuencias de repeticiones invertidas). Una secuencia tpica en palndromo,
reconocida por EcoR1 , una enzima de restriccin utilizada con frecuencia, es
GAATTC; la repeticin invertida, inherente en su complementariedad en los pares de
bases G-C y A-T, da origen a la secuencia 5TTC que se refleja como AAG en la
cadena 3.
La longitud de los fragmentos de ADN producidos por enzimas de restriccin vara en
gran medida por la individualidad de secuencias de ADN. La longitud promedio de los
fragmentos de ADN depende en gran parte del nmero de bases especficas
reconocidas por una enzima. La mayora de las enzimas de restriccin reconoce
cuatro, seis u ocho secuencias de bases; sin embargo, otras enzimas de restriccin
reconocen 10, 11,12 o15 secuencias de bases. El reconocimiento de cuatro bases de
origen a fragmentos con una longitud promedio de 250 pares de bases y por tanto
suele ser til para el anlisis o manipulacin de fragmentos gnicos. Con frecuencia
genes completos son abarcados por enzimas de restriccin que se reconocen seis
bases y producen fragmentos con un tamao promedio de 4 Kbp. Las enzimas de
restriccin que reconocen ocho bases producen fragmentos con un tamao tpico de 54
Kbp y son tiles para el anlisis de regiones genticas grandes. Las enzimas de
restriccin que reconocen ms de 10 bases son tiles para la construccin de un mapa
fsico y de la tipificacin molecular mediante electroforesis en gel en un campo de
pulsos.
Separacin fsica de fragmentos de ADN de tamao diferente
Gran parte de la simplicidad de las tcnicas de ingeniera gentica yace en el hecho de
que la electroforesis en gel permite la separacin de fragmentos de ADN con base en
el tamao; mientras ms pequeos los fragmentos, ms rpida ser la tasa de
migracin. La tasa general de migracin y el intervalo ptimo de tamao para la
separacin puede determinarse con base en la naturaleza qumica del gel y el grado de
formacin de enlaces cruzados. Los geles con alto grado de enlaces cruzados
optimizan la separacin de fragmentos pequeos de ADN. El colorante bromuro de
etidio forma un aducto de color fluorescente brillante que se une al ADN pueden
visualizarse sobre los geles. Fragmentos especficos de ADN pueden identificarse por
sondas que contienen secuencias complementarias.
La electroforesis en gel en campo de pulsos permite la separacin de fragmentos de
ADN que contienen hasta 100 Kbp que se separan en geles de poliacrilamida de alta
resolucin. La identificacin de fragmentos tan grandes ha permitido la construccin de
un mapa fsico para los cromosomas de varias especies bacterianas y han sido de gran
utilidad para la identificacin de huellas genticas de aislados bacterianos relacionados
con brotes epidmicos de enfermedades infecciosas.
















Clonacin de fragmentos de restriccin de ADN
Muchas enzimas de restriccin producen desdoblamiento asimtrico y fragmentos de
ADN con extremos cohesivos (adhesivos) que pueden hibridarse con otros
fragmentos. Este ADN puede utilizarse como donador con un plsmido receptor para
formar un plsmido recombinante por medio de ingeniera gentica. Por ejemplo, el
desdoblamiento de ADN con EcoR1 produce ADN que contiene una secuencia AATT
en el extremo 5 y la secuencia complementaria TTAA en el extremo 3. El
desdoblamiento de un plsmido (una pieza circular de ADN) con la misma enzima de
restriccin produce un fragmento lineal con extremos adhesivos que son idnticos uno
con otro. La eliminacin enzimtica de los tres grupos fosfatos de estos extremos
asegura que no se unirn para formar el plsmido circular original. La ligadura en
presencia de otro fragmentos de ADN que contienen grupos fosfatos produce
plsmidos recombinantes, que contienen fragmentos de ADN que se introducen con
enlaces covalentes en el ADN circular cerrado. Los plsmidos deben ser de forma
circular a fin de replicarse en la bacteria que acta como hospedador.
Los plsmidos recombinantes pueden introducirse en el hospedador bacteriano, con
frecuencia E. coli, por medio transformacin. La electroporacion es un procedimiento
desarrollado en fechas recientes que introducen ADN en la bacteria utilizando un
gradiente elctrico. Las clulas transformadas pueden seleccionarse con base en uno o
ms factores de resistencia a frmacos codificados por los genes de los plsmidos. La
poblacin bacteriana resultante contiene una biblioteca de plsmidos recombinantes
que portan varias clonas de fragmentos de restriccin insertados, derivados del ADN
del donador. Pueden utilizarse tcnicas de hibridacin para identificar colonias
bacterianas que portan fragmentos especficos de ADN o, si el plsmido expresa en
gen insertado, pueden estudiarse las colonias en busca de los productos gnicos.






Formacin de un plsmido recombinante o quimrico a partir de ADN donador y un vector del
receptor. El vector es un plsmido que porta el sitio de restriccin EcoR1, que sufre
desdoblamiento por enzimas y se prepara para la ligadura mdiate la eliminacin de los grupos
fosfato terminales. Este paso evita que los extremos adhesivos del plsmido se unan en
ausencia de material insertado. El ADN donador se trata con las mismas enzimas de restriccin
y un enlace covalente cierra la molcula mediante una ligadura. Un marcador de resistencia
farmacolgica mostrado como amp
R
en el plsmido puede utilizarse para seleccionar los
plsmidos recombinantes despus de su transformacin en la Escherichia coli. Enzimas de la
bacteria hospedera completan el enlace covalente del ADN circular y median su replicacin.





Uso de sondas para identificar clonas que contienen fragmentos especficos de ADN. Las
colonias pueden transferirse a un filtro y calentarse de forma tal que las clulas se destruyan y
el ADN se adhiera al filtro. Ms tarde, el filtro puede ser tratado con una solucin que contenga
una sonda de ADN marcada en forma apropiada lo que produce hibridacin especifica con las
clonas deseadas. La autorradiografia subsiguiente del filtro identifica estas clonas (crculos
oscuros). Las clonas tambin pueden ser expuestas a sondas con anticuerpos para saber si
sintetizan un producto protenico especifico.