AGROPRODUCTIVIDADIII2014

PRECIO AL PBLICO $75.
00 PESOS
ISSN-0188-7394
AGRO
PRODUCTIVIDAD
Ao7Volumen7Nmero3mayojunio,2014
EFECTIVIDADin vitroEin situDEFUNGICIDASQUMICOSYBIOLGICOSENEL
CONTROLDEFusarium oxysporumf.sp.gladioliyUromyces transversalisENGLADIOLA
3
CARACTERIZACINEIDENTIFICACINMOLECULARDEBACTERIASAISLADASDEKEFIR
12
CONTROLBIOLGICODEGARRAPATA(Boophilusspp.)CONDIFERENTESCEPAS
DEMetarhizium anisopliae(Metchnikoff)SorokinENBOVINOS
21
PRODUCCINDEBeuaveria bassiana(Bals.)Vuill.PARAELCONTROL
DELABROCADELCAF(Hypothenemus hampeiFerr.)
29
ELLINLOE(Bursera linanoe(LaLlave)Rzedowski,Caldern&Medina),
ESPECIEMADERABLEAMENAZADA:UNAESTRATEGIAPARASUCONSERVACIN
42
PROTOZOARIOSCILIADOSDELRUMEN,SUCULTIVOin vitro
YPLANTASCONCAPACIDADDESFAUNANTE
52
ymsartculosdeinters...
pg. 34
Influencia del fotoperiodo
sobre algunos parmetros
demogrficos y calidad de la
Cochinilla
(Dactylopius coccus)
AGRO
PRODUCTIVIDAD
Tabla comparativa.
Centmetros Pixeles Pulgadas
21.5927.94 25503300 8.511
18.511.5 21851358 7.34.5
18.55.55 2158656 7.32.2
12.211.5 14411358 4.84.5
12.25.55 1441656 4.82.2
5.855.55 691656 2.32.2
911.5 10631358 3.54.5
95.55 1063656 3.52.2
Guaparaautores
Estructura
Agroproductividad es una revista de divulgacin, auspiciada por el Colegio de
Postgraduadosparaentregarlosresultadosobtenidosporlosinvestigadoresen
cienciasagrcolasyafinesalostcnicosyproductores.Enellasepodrpublicar
informacin relevante al desarrollo agrcola en los formatos de artculo, nota
o ensayo. Las contribuciones sern arbitradas y la publicacin final se har en
idiomaespaol.
La contribucin tendr una extensin mxima de 16 cuartillas, incluyendo las
ilustraciones.DeberestarescritaenWordadobleespacioempleandoeltipo
Ariala12puntosymrgenesde2.5cm.Debeevitarseelusodesangraalinicio
delosprrafos.
Lasilustracionesserndecalidadsuficienteparasuimpresinenoffsetacolores,
yconunaresolucinde300dpienformatoJPEG,TIFFoRAWyeltamao,de-
pendiendodelaimagenysuimportanciadeacuerdoconlatablacomparativa.
Laestructuradelacontribucinserlasiguiente:
1)Artculos:unaestructuraclsicadefinidaporloscaptulos:Introduccin,Ma-
terialesyMtodos,ResultadosyDiscusin,ConclusionesyLiteraturaCitada;2)
Notas o Ensayos: deben tener una secuencia lgica de las ideas, exponiendo
claramentelastcnicasometodologasquesetransmitenenlenguajellano,con
unusomnimodetrminostcnicosespecializados.
Formato
Ttulo.Debeserbreveyreflejarclaramenteelcontenido.Cuandoseincluyan
nombrescientficosdebenescribirseenitlicas.
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mas,conunndiceprogresivoensucaso.Alpiedelaprimerapginaseindicar
elnombredelainstitucinalaqueperteneceelautoryladireccinoficial,in-
cluyendoelcorreoelectrnico.
Cuadros. Deben ser claros, simples y concisos. Se ubicarn inmediatamente
despus del primer prrafo en el que se mencionen o al inicio de la siguiente
cuartilla.Loscuadrosdebennumerarseprogresivamente,indicandodespusde
lareferencianmericaelttulodelmismo(Cuadro1.Ttulo),ysecolocarnen
lapartesuperior.Alpiedelcuadroseincluirnlasaclaracionesalasquesehace
mencinmedianteunndiceeneltextoincludoenelcuadro.
Figuras.Correspondenadibujos,grficas,diagramasyfotografas.Lasfotogra-
fasdebenserdepreferenciaacolores.Sedebeproporcionaroriginalesenta-
maopostal,anotandoalreversoconunlpizsuaveelnmeroyellugarquele
correspondaeneltexto.Losttulosdelasfotografasdebenmecanografiarseen
hojaaparte.Lacalidaddelasimgenesdigitalesdebeceirsealoindicadoenla
tablacomparativa.
Unidades. Las unidades de pesos y medidas usadas sern las aceptadas en el
SistemaInternacional.
Gua para autores
1
AGRO
PRODUCTIVIDAD
Contenido
3
EFECTIVIDADin vitroEin situDEFUNGICIDASQUMICOS
YBIOLGICOSENELCONTROLDEFusarium oxysporum
f.sp.gladioliyUromyces transversalisENGLADIOLA
12
CARACTERIZACIN E IDENTIFICACIN MOLECULAR DE
BACTERIASAISLADASDEKEFIR
21
CONTROL BIOLGICO DE GARRAPATA (Boophilus spp.)
CON DIFERENTES CEPAS DE Metarhizium anisopliae
(Metchnikoff)SorokinENBOVINOS
29
PRODUCCIN DE Beuaveria bassiana (Bals.) Vuill. PARA
EL CONTROL DE LA BROCA DEL CAF (Hypothenemus
hampeiFerr.)
34
INFLUENCIA DEL FOTOPERIODO SOBRE ALGUNOS
PARMETROS DEMOGRFICOS Y CALIDAD DE LA
COCHINILLA(Dactylopius coccus)
42
EL LINLOE (Bursera linanoe (La Llave) Rzedowski,
Caldern & Medina), ESPECIE MADERABLE AMENAZADA:
UNAESTRATEGIAPARASUCONSERVACIN
52
PROTOZOARIOS CILIADOS DEL RUMEN, SU CULTIVO in
vitroYPLANTASCONCAPACIDADDESFAUNANTE
58
ELHONGOVerticillium hemileiaeBouriquet,ALTERNATIVA
PARA EL CONTROL DE LA ROYA DEL CAFETO (Hemileia
vastatrixBerket Br.)
63
ESTABLECIMIENTODEUNSISTEMADEBIORREACTORES
PARA LA MICROPROPAGACIN DE VAINILLA (Vanilla
planifoliaJacks.exAndrews)
69
RELATORA: EL QUEHACER DE LOS LABORATORIOS
DEL SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD, INOCUIDAD Y
CALIDADAGROALIMENTARIA(SENASICA)
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58
AGRO
PRODUCTIVIDAD
Dr.JorgeCadenaIiguez
Editorial
Volumen7Nmero3mayojunio,2014.
Enestemesdejuniorecordamoselrelevoenlarevista
AGRO
PRODUCTIVIDAD,la
cualfuefundadaenel2008,porelDr.RafaelRodrguezMontessoro,
quienfuenotableacadmicodelColegiodePostgraduados,yunac-
torimportanteenlaciencia,docenciayadministracin.Fueadems
unacadmicocomprometidoconlatransferenciadelconocimiento
alosusuarios;percibiendolascomplejidadesdelacienciayelcom-
promisodesudivulgacin.Unodelosobjetivosinicialesfueatender
elreadeextensindelconocimientohacialasociedad,partiendode
laformacindetalentoseinvestigacincomomediosdegeneracin,
transmisin y aplicacin del conocimiento en forma articulada. Una
premisaimportanteparaelDr.RodrguezMontessoro,fuetraducirlos
avancesencienciasagrcolastantodelColegio,comodeotrasinsti-
tucionesrelacionadasaunplanosocialmentehorizontal,reduciendo
laverticalidaddelconocimientoparaevitarelaislamientoyprdidade
vigenciasocial.Conesaspremisassediselarevistaenunformato
accesibleensulenguajegrcoyescrito,detalformaquesuconte-
nidotuvieraelalcancedetransmisindelmensajecientcohacialos
acadmicos,tcnicosextensionistas,productoresypblicoengene-
ral,detalformaqueladivulgacindelaciencialleguehaciaaquellos
querequierendesusproductos;ypromuevaelvnculovirtuosode-
nominado: la culturizacin a travs de la tcnica, que ha permitido
a las sociedades que la ejercitan, alcanzar el aprendizaje y madurez
socialdesusmiembros.ActualmenteAgroproductividadestinscrita
enndicescomoCONACyT,Latindex,EBSCO,MasterJournalListde
ThomsonReuters,basededatosdelUSDAyCengageLearning,Inc.
JorgeCadenaIiguez
Director de
AGRO
PRODUCTIVIDAD
Directorio
SaidInfanteGil
EditorGeneraldelColegiodePostgraduados
RafaelRodrguezMontessoro
DirectorFundador
JorgeCadenaIiguez
DirectordeAgroproductividad
ComitTcnico-Cientfico
ColegiodePostgraduadosMontecillo
FernandoClementeS.
Dr.Ing.Agr.CatedrticoFaunaSilvestre
Ma.deLourdesdelaIsla
Dr.Ing.Agr.CatedrticaAereopolucin
ngelLagunesT.
Dr.Ing.Agr.CatedrticoEntomologa
EnriquePalaciosV.
Dr.Ing.Agr.CatedrticoHidrociencias
JorgeRodrguezA.
Dr.Ing.Agr.CatedrticoFruticultura
ColegiodePostgraduados-Puebla
ManuelR.VillaIssa
Dr.Ing.Agr.EconomaAgrcola
InstitutodeInvestigaciones
Forestales,AgrcolasyPecuarias
PedroCadenaI.
Dr.Ing.Agr.TransferenciadeTecnologa
RicardoMagaaFigueroa
M.C.P.DirectordePromocinyDivulgacin
ConfederacinNacionalCampesina
JessMuozV.
Dr.Ing.Agr.Agronegocios
InstitutoInteramericanode
CooperacinparalaAgricultura
VictorVillalobosA.
Dr.Ing.Agr.Biotecnologa
3
AGRO
PRODUCTIVIDAD
EFECTIVIDADin vitroEin situDE
FUNGICIDASQUMICOSYBIOLGICOSEN
ELCONTROLDEFusarium oxysporumf.sp.
gladioliyUromyces transversalis
ENGLADIOLA
In vitroANDin situEFFECTIVENESSOFCHEMICALANDBIOLOGICAL
FUNGICIDESONCONTROLOFFusarium oxysporumf.sp.gladioli
ANDUromyces transversalisINGLADIOLA
Michel-Aceves, A.C.
1
; Ariza-Flores, R.
2
,
Otero-Snchez, M.O.
1

Barrios-Ayala, A.
2
; Quiroz-Milln, A.M.
1
1
CentrodeEstudiosProfesionalesdelColegioSuperiorAgropecuariodelEstadodeGuerrero,Av.
VicenteGuerreroNo.81,ColoniaCentro,Iguala,Guerrero.CP40000,Mxico.
2
InstitutoNacional
deInvestigacionesForestales,AgrcolasyPecuarias(INIFAP-Guerrero),CampoExperimentalIguala.
CarreteraIguala-Tuxpankm2.Iguala,Gro.Mxico.
Autor responsable:amichelaceves@yahoo.com.mx
RESUMEN
Seevalulaefectividadin vitro ein situ delosfungicidassintticosProcloraz+Tiofanato-metlicoyMetalaxil+Clorotalonil
ylosbiolgicos(Trichoderma spp.,yBacillus subtilis)enelcontroldeFusarium oxysporum f.sp.gladioli (Fog)yUromyces
transversalis engladiola.In vitro serealizarontresensayos:pruebadecelofn,cultivodualypruebadefungicidas.Un
ensayo in situ con cinco tratamientos: dos fungicidas sintticos, dos biolgicos y un testigo, unidad experimental de
cuatrosurcosde0.8mdeanchopor7mdelargo.Lasvariables:alturadeplanta,incidencia,severidadyrendimiento.
LosdatosdecadabioensayosesometieronaunanlisisdevarianzaypruebadeTukey.In vitro,delosproductosbiol-
gicos,Trichoderma asperellum cepa8inhibi60.6%elmiceliodeFogconantagonismoclasedosyBacillus subtilisno
fueefectivo;delosqumicoslamezcladeProcloraz+Tiofanato-metlico,98.3%.In situ,laincidenciayseveridaddeU.
transversalis fuenuladondeseaplicaronlosproductos.EnFog,lamezclaProcloraz+Tiofanato-metlicologrreducir
la severidad 47% y 30.9% con T. asperellum. En esta zona, donde la incidencia y severidad de Fog es alta, se tiene un
productosintticoqueesbuenoyrequiereseguirbuscandocepasnativasefectivas.
Palabras clave:Trichoderma asperellum,Bacillus subtilis,controlbiolgico.
4
AGRO
PRODUCTIVIDAD
AGRO
PRODUCTIVIDAD
Efectividaddefungicidasengladiola
ABSTRACT
The in vitro and in situ effectiveness of Procloraz+Tiofanato-methylic synthetic fungicides
andMetalaxil+Clorotalonil,aswellasbiologicalones(Trichodermaspp.,andBacillus subtilis),
oncontrolofFusarium oxysporumf.sp.gladioli(Fog)andUromyces transversalisingladiola,
was evaluated. For in vitro three assays were carried out: cellophane test, dual cultivation
and fungicide test. An in situ assessment with five treatments: two synthetic fungicides, two
biological and one control, with an experimental unit of four furrows, 0.8 m wide by 7 m
long. The variables: plant height, incidence, severity and yield. The data from each bioassay
underwent variance analysis and Tukey test. In vitro, of the biological products, strain 8 of
Trichoderma asperellum inhibited the Fog mycelium with antagonism class two in 60.6%,
andBacillus subtilis wasnoteffective;ofthechemicals,themixtureofProcloraz+Tiofanato-
methylic in 98.3%. In situ, the incidence and severity of U. transversalis was null where the
productswereapplied.InFog,theProcloraz+Tiofanato-methylicmixturereducedtheseverity
in47%andT. asperellumin30.9%.Inthisarea,wheretheincidenceandseverityofFogishigh,
thereisasyntheticproductthatisgoodanditisrequiredtocontinuesearchingforeffective
nativestrains.
Key words:Trichoderma asperellum,Bacillus subtilis,biologicalcontrol.
INTRODUCCIN
La gladiola
(Gladiolus grandiflorus) es una flor econ-
micamenteimportanteenelmundo,apre-
ciada como ornamental por su diversidad de colores llamativos; se utiliza
comoplantadepaisajeenjardines,exhibicinycomoflordecorte.EnMxi-
colascondicionesagroclimticassonfavorablesparasucultivo;lasuperficie
sembradaen2011alcanzuntotalde3,714.5ha
-1
,conunaproduccinde
3,858,073.32tha
-1
.LosestadosproductoressonPuebla,Mxico,Morelos,
Veracruz,Michoacn,OaxacayGuerrero;esteltimocuentacon365ha
-1
cultivadas, equivalentes a 698.8 t ha

-1
de produccin (SIAP, 2012), y repre-
sentalafuentedeempleoysustentodehasta80%delapoblacinencomu-
nidadescomoLaConcepcin,Guerrero.
Enlaproduccindelagladiolaexistenproblemasfitosanitariosqueconlle-
van a prdidas econmicas y las de mayor importancia por su incidencia
sonFusarium oxysporum fsp.gladioli(Fog),queocasionalapudricindel
cormo; Uromyces transversalis (Ut), que provoca la roya en el follaje. De
lasvariedadescomerciales,lasdecolorrojoyblancosonmssusceptibles
y para su control se aplican diversos agroqumicos, tales como carbenda-
zim,clorotalonil(ChandelyBhardwaj,2000)ybenomilo(Ramet al.,2004),
y su uso continuo contamina el ambiente; tienen efecto residual y gene-
ranresistenciaalospatgenos(Riazet al.,2008;NaziryRiazuddin,2008).
En este sentido se requiere evaluar mtodos de control ms eficientes y
sustentables, tales como los biolgicos y de manejo cultural que faciliten
reducir o eliminar el uso de agroqumicos de origen sinttico, adems de
integrarmtodosparaunmanejoculturaldelaenfermedad(ChandelyDee-
pika,2010).Dentrodelasalternativasbiolgicassehanevaluadoespecies
comoTrichoderma harzianum,T. viride,T. koningiiyT. virens,ascomoal
hongomicorrzicoarbuscularGlomus mosseae,labacteriaBacillus subtilis,
extractosvegetalese,inclusive,seharecurridoalatransformacingenti-
capararesistenciaalaenfermedad
(ChandelyDeepika,2010).Autores
como Khan y Mustafa, (2005) han
reportadoque,aplicadaalsuelo,la
mezcla de T. harzianum (T014) y
Pseudomonas fluorescens (PS07)
reduce la infeccin por Fog e in-
crementa el rendimiento, compa-
rado con el uso de carbendazim a
200ppm;sinembargo,serequiere
un uso ms extensivo del control
biolgico y la bsqueda de agen-
tes bio-controladores eficientes y
preferentemente nativos que sean
capaces de competir con el pat-
genoenelmismonichoecolgico.
Conbaseenloanteriorseevalula
efectividad biolgica de B. subtilis,
cepa comercial y cepas nativas de
Trichodermaspp.,comoalternativa
decontrolbiolgico,yfueroncom-
parados con los fungicidas sintti-
cosdeusocomnporelproductor.
MATERIALES Y
MTODOS
Muestreo, aislamiento e
identificacin de microrganismos
Para aislar Trichoderma spp. nativo,
en el mes de octubre se colect
suelo de un terreno donde el ciclo
anterior se haba sembrado gladio-
la en la comunidad de La Concep-
cin,municipiodePilcaya,Guerrero
(1846 N y 9944 O) a 1370 m de
altitud. Para aislar a Fusarium oxys-
porum f. sp. gladioli se utilizaron
cormosrecincosechadosconsn-
tomasdelaenfermedad.Enelcaso
de U. transversalis no fue posible
cultivarlo en laboratorio por tratar-
se de un hongo parsito obligado.
El aislamiento e identificacin de
Trichoderma spp. nativo se hizo di-
rectamentedelsueloporelmtodo
dedilucinenplaca(Singletonet al.,
1992; Michel-Aceves et al., 2009) y
las colonias se identificaron por su
crecimiento tpico y caractersticas
5
AGRO
PRODUCTIVIDAD
morfolgicas (Barnett y Hunter,
1999). F. oxysporum f sp gladioli
(Fog)seaisldecormosrecinco-
sechadosconsntomasdelaenfer-
medad (Leslie y Summerell, 2006).
Las colonias se identificaron por la
forma y dimensin de micro y ma-
croconidios con claves del gnero
(Nelson et al., 1983; Seifert, 1996;
Leslie y Summerell, 2006). Para la
extraccindeADNseutilizlame-
todologa propuesta por Arhens y
Seemller(1992),dondelassecuen-
cias de nucletidos se compara-
ronconlasdelabasededatosdel
bancodegenesdelNCBI(National
Center for Biotechnology Informa-
tion).
Bioensayo in vitro I. Prueba de celofn
Se evaluaron los metabolitos de
Trichoderma spp., (Dennis y Webs-
ter, 1971), se sembr al hongo an-
tagonista en cajas Petri con medio
decultivoPDAypapelcelofn,alos
dosdasseretirelcelofnyenesa
mismacajasesembraFog.Semi-
di el dimetro del crecimiento ra-
dialhastaqueeltestigollenlacaja
Petri (12 das). Se tuvieron nueve
tratamientosquecorrespondierona
ochocepasnativasdeTrichoderma
spp., aisladas, y el testigo Fog, dis-
tribuido en un diseo experimental
completamente al azar, con ocho
repeticiones. El crecimiento mi-
celial de Fog se midi en cm y el
porcentaje de inhibicin se calcul
con la ecuacin: % de inhibicin=
[(D1-D2)/D1100] (Arzate-Vega
et al., 2006); donde: D1=dimetro
de la colonia de Fog creciendo en
cajas con PDA libre de inhibidores
y D2 =dimetro de la colonia fun-
gosadeFogcreciendoencajascon
PDA, donde anteriormente creci
Trichoderma spp., sobre el papel
celofn, impregnando al medio de
cultivo enzimas y metabolitos se-
cundariosproducidos.
Bioensayo in vitro II. Actividad antagnica de Trichoderma spp., sobre Fog.
Seutilizlatcnicadecultivoapareadoodual(CherifyBenhamou,1990).
Para cada tratamiento se sembr en un extremo de cajas Petri con PDA a
Fog y se dej crecer durante tres das; posteriormente, en el otro extremo
de la caja se sembr Trichoderma spp. Se tuvieron ocho tratamientos que
correspondieronalascepasnativasdeTrichodermaspp.,distribuidasbajoun
diseocompletamentealazarconochorepeticiones.Launidadexperimen-
talestuvoconstituidaporunacajapetri.Setomaronlecturascada24hpara
observarelnmerodedasalprimercontactoentrelashifasdeloshongos,
medirelcrecimientodeTrichodermaspp.,deFogylazonadeinterseccin.
Alos15dasdespusdelasiembraseclasificeltipodeantagonismosegn
Bellet al.(1982).
Bioensayo in vitro III. Evaluacin de fungicidas
Se utilizaron los productos sintticos Metalaxil+Clorotalonil (Blazon
), Pro-
cloraz(Sportak
)+Tiofanatometlico(Cercobin
)yelproductobiolgicoa
base de Bacillus subtilis (Serenade
) y un testigo sin productos. Los cuatro

tratamientossedistribuyeronbajoundiseoexperimentalcompletamenteal
azarconochorepeticiones;segeneraron32unidadesexperimentales(una
cajaPetri).Losfungicidassedepositaronenelfondodecadacajapetriyse
lesagreg15mLdePDAlquido;seagitsuavementehastadisolverlosyse
dejsolidificaratemperaturaambiente.Enelcentrodelacajasesembra
Fog yeldimetrodelacoloniasemididiariamentepordiezdas.Lasvaria-
blesfueronelcrecimientomicelialyelporcentajedeinhibicin.
Bioensayo in situ: Control biolgico
y qumico de Fog. Material vegetal
Se utiliz la variedad de gladiola roja borrega (Gladiolus
grandiflorus),lacualtienetallovigorosodecolorverde-
rosadoconbuenaaceptacinenelmercadoporsuvis-
tosidadyvidadeanaquel;sinembargo,esmuysuscepti-
bleaenfermedades.
Tratamientos y diseo experimental en campo
Se evaluaron cinco tratamientos. Los fungicidas sin-
tticos Metalaxil+Clorotalonil (Blason
) y (Procloraz
(Sportak
)+MetilTiofanato(Cercobin
),ascomolos
biolgicos Bacillus subtilis (Serenade
), Trichoderma
asperellum nativo (Ta8) y el testigo, distribuidos bajo
un diseo experimental de bloques completos al
azarconcuatrorepeticiones.Launidadexperimental
consistidecuatrosurcosde0.8mdeanchopor7
mdelargoylaparcelatilenlosdossurcoscentrales,
dejando 0.5 m en cada extremo por efecto de orilla.
Antes del sembrado se desinfectaron los cormos por
inmersin de 15 min en un contenedor que contena
el producto, segn su tratamiento. stos se sembraron
enhileraa5cmdedistanciacadauno.Serealizlaprimera
fertilizacinconnitrgeno,fsforoypotasio(N-P-K)almomento
delasiembracon10kgdelamezcla71
N
-52
P
-00
K
ylasegunda45
6
AGRO
PRODUCTIVIDAD
AGRO
PRODUCTIVIDAD
dasdespuscon30kgde17
N
-17
P
-17
K
,ademsdeapli-
cacionesfoliaresdemicro-nutrimentosconlosproduc-
toscomercialesViretrol20500yPKSuprem.
Preparacin y aplicacin de los productos
LacepadeTrichodermaspp.,fuemultiplicadadelacepa
nativa 8 (T. asperellum) en olote molido estril (Arzate-
Vegaet al.,2006).Secontabilizelnmerodeesporas
enunacmaradeNeubaueryseajusta110
8
esporas
mL
-1
. El fungicida biolgico con Bacillus subtilis (Sere-
nade
) (3 kg ha
-1
) y los fungicidas sintticos Procloraz
(Sportak
)+Tiofanato-metil(Cercobin
)(0.5Lha
-1
+1.0
kg ha
-1
) y Metalaxil+Clorotalonil (Blasn
) ((Blasn
)
(dosis 3 kg ha
-1
), fueron adquiridos comercialmente y
se aplicaron en las dosis indicadas. Los productos se
aplicaronalmomentodelasiembraycada10daspor
sieteocasionesenelnudovitaldelaplantayalfollaje.
Lacosechaserealizcadatercerdadurante10cortes.
Secontabilizelnmerodetallosfloralesporcorteyel
totalparasertransportadosycomercializadosenlaCen-
traldeAbastos(CEDA)delestadodeMxico.
Variables de Estudio
Alturadelaplanta,incidenciadeFog(%deincidencia=
nmerodeplantasconsntomas100/nmerototalde
plantas), severidad (% de severidad=nmero de plantas
muertas100/nmerototaldeplantas)yrendimiento.
Losdatosobtenidosdecadaensayosesometieronaun
anlisisdevarianza(ANVA)ylapruebaderangosmlti-
ples de Tukey (P0.05) con el paquete estadstico SAS
(1999).Enelcasodelosdatosenporcentajes,antesde
someterlosalANVAypruebadeTukey,selesrealizla
transformacinconlafrmula:razcuadradadelprome-
dioms0.5
RESULTADOS Y DISCUSIN
Deltejidoinfectadodelcormodegladioloseaisl,puri-
ficeidentificlaespeciedeFogenPDA.Elmicelioes
blancoconligerapigmentacinvioletaplidoalreverso
delacaja,microconidiosdeformaovaldivididosensu
mayora por un septo, macroconidos de tamao corto
dividido por tres septos, de forma apical enganchado,
la forma basal claramente con muesca, con una longi-
tudde50.5a67.5um.Noseobservaronclamidosporas
(Nelsonet al.,1983;LeslieySummerell,2006).Secon-
firmconlaidentificacinmolecularalcompararlasse-
cuenciasconelbancodegenes(F. oxysporumf.gladioli
DQ279795 F. oxysporum FJ545244). Se aislaron ocho
cepasnativasdeTrichodermaspp.conlascaractersticas
tpicasdelgnero(BarnettyHunter,1999).Seidentifica
niveldeespecielacepanativaochoquefuemejorenlos
ensayosin vitro,primeroconbaseenlascaractersticas
morfolgicasconlasclavesdeRifai(1969)yBisset(1991),
ycorrespondialaespecieT. asperellum.Seconfirm
conlaidentificacinmolecularalcompararsecuencias
conlasdelbancodegenes(gi|169117643|gb|EU280122.
1|Trichoderma asperellumstrainGJS.11100.0).
Estosresultadossonrelevantes,talcomolosobtenidos
porArzate-Vegaet al.(2006)quienesaislaron25cepas
en15huertasdepltano(Musaspp.)enTenexpa,Gue-
rrero, y similares a los obtenidos por Michel-Aceves et
al.(2009)desuelocolectadoenotoodelahuertade
mangoenTuxpan,Guerrero.Esimportantesealaryre-
saltar que la estacin del ao pudo influir en la densi-
dad de poblacin de Trichoderma spp. Harman (2002)
ha reportado altas poblaciones en primavera y verano,
comparado con otoo e invierno de zonas templadas
en suelos forestales donde la temperatura y la hume-
dadfueronparmetrosdeimportanciaenladistribucin
naturaldeTrichodermaspp.ensuelo,ademsdelain-
fluenciadelmanejodehuertasmedianteelusoexcesivo
de productos qumicos sobre la dinmica poblacional;
tal es el caso del fungicida Benomilo (Ahmad y Baker,
1987)ylaaplicacindecitrolina(aceiteagrcola),obien,
por presencia de saprofitos que compiten por espacio
y nutrientes. En el bionsayo I la cepa 8 sobresali sig-
nificativamente a los 21 das (P0.0281) con el menor
crecimiento(Cuadro1)yelmayorporcentajedeinhibi-
cin(60.6%).Lascepasdosytresmostraroncrecimiento
semejantealdeltestigoynomanifestaroninhibicin.En
Cuadro 1. Crecimiento micelial y porcentaje de inhibicin de
Fusarium oxysporumf.sp.gladioliporTrichodermaspp.alos21
dasdespusdelasiembra.
No.Tratamiento Crecimiento(cm) Inhibicin(%)
Cepa1 3.7ab
z
18.3bcd
Cepa2 4.5a 0.0d
Cepa3 4.5a 0.0d
Cepa4 3.2b 37.8b
Cepa5 3.8ab 12.2cd
Cepa6 3.6ab 23.9bc
Cepa7 3.6ab 20.6bc
Cepa8 1.6c 60.6a
Testigo 4.5a 0.0d
z
Mediasdentrodecadacolumnasseguidasconlamismaletrason
estadsticamenteiguales(Tukey0.5).
7
AGRO
PRODUCTIVIDAD
trabajos similares realizados por di-
ferentesautoressereportanvalores
superioreseinferioresalosobteni-
dosenestainvestigacin;porejem-
plo, Michel-Aceves et al. (2005a)
indicaron77.8%deinhibicinenFo
f. sp. lycopersici con cepas nativas
de Trichoderma spp. Otros, como
Aquino-Martnez et al. (2008), eva-
luando in vitro la inhibicin de ais-
lamientos de Fusarium oxysporum
f. sp. dianthi con cepas de Tricho-
derma spp., obtuvieron valores de
42.08% a 64.81%. En otra investiga-
cinMichel-Aceveset al.(2009)in-
dicaronunporcentajedeinhibicin
sobreFode62.9%.Estasdiferencias
podran deberse entre otras causas
a la especie de Trichoderma spp.,
sitio de procedencia y potencial
antagnico ante la produccin de
quitinasas y glucanasas, las cuales
sondiferentesencadaunadeellas
einclusiveencepasdelamismaes-
pecie(Harman,2002).
Al respecto, Vargas-Hoyos et al.
(2012) indica que de 27 aislamien-
tos de Trichoderma spp., las ce-
pasT46 y T109 de T. asperellum
crecieron en un amplio rango de
temperaturas y mostraron capaci-
dad de adaptacin a condiciones
ambientales cambiantes, registran-
do el mayor porcentaje de inhibi-
cinentre20Cy30C,elcualfue
superior a 75% sobre Rhizoctonia
sp.yColletotrichumsp.
En el cultivo dual el crecimiento
de ambos hongos fue significa-
tivamente diferente a los 17 das
despus de siembra (dds) (Cuadro
2);enelcasodeTrichodermaspp.
sobresali (P0.0032) la cepa seis
con4.37cm,mientrasqueenFog
(P0.0100) la cepa dos obtuvo el
mayorcrecimientocon1.22cm.Es
importante observar la zona de in-
terseccinpuesentremayorseael
readecontacto,mayoreslaagre-
sividadporpartedelhongoantag-
nico (Michel-Aceves et al., 2005a).
La colonizacin del rea compi-
tiendo por espacio y nutrientes es
una manera de ejercer biocontrol,
alreducirodetenercompletamen-
teeldesarrollodelmicelio(Dennis
y Webster, 1971). Esta variable fue
visible para las diferentes cepas de
Trichodermaspp.ydelasochoais-
ladas,solotresendiferentemedida
a Fog, y en cinco de ellas no exis-
tizonadeinterseccin.Lascepas
dos y tres fueron estadsticamente
significativas (P0.0094) con 3.22
cm y 3.00 cm, respectivamente
(Cuadro2).
Sousa Rocha y Oliveira (1998) re-
portande1.93a4.5cmdelazona
de interseccin de diferentes espe-
cies de Trichoderma y Colletotri-
chum gloeosporioides. Asimismo,
Michel-Aceves et al. (2008) obtuvo
valores de 0.54 y de 2.47 cm entre
Trichoderma con Alternaria solani
y Phytophthora infestans, respec-
tivamente. Utilizando un producto
comercial a base de Trichoderma
lignorun, T. harzianum cepa Thz-
cf-12 y T. harzianum Thzn-2 nati-
va en el control in vitro de Fo y F.
subglutinans, agentes causales
de la escoba de bruja del mango
(Michel-Aceveset al.,2009)reporta
la mayor zona de interseccin con
T. lignorum (0.87 cm) contra Fo,
Thzcf-12 (0.77 cm) y la cepa nativa
Thzn-2 con 0.85 cm, todos ellos
menores a los obtenidos en la pre-
senteinvestigacin.
Las hifas de Trichoderma spp., tu-
vieron contactos con las hifas de
Fo en diferentes tiempos; a pesar
de que se dieron dos das de ven-
tajaaFog porsulentocrecimiento,
yseobservqueTrichodermaspp.,
secomportdeformaagresiva.Los
valores oscilaron significativamente
entreunoyseisdasparalamayora
delascepas,exceptolacepacinco
quenomostrocontactoalguno.Ya-
tes et al. (1999) registraron en una
cepa aislada de T. virens seis das
paraelcontactoenF. moniliforme.
Michel-Aceveset al.(2005b),repor-
t sobre contra Fo f. sp. lycopersi-
civaloresentrecincoysietedas,y
Cuadro 2. Valores de crecimiento de las cepas en cultivos duales de Trichoderma spp. y
Fusarium oxysporumf.sp.gladiolia17dasdespusdesiembra.
Cepas
Crecimiento
Trichoderma
spp.
Crecimiento
Fog
Zonade
interseccin
(cm)
Das1
er.
contacto
Clase
Antagonismo
Cepa1 3.15b
x
1.05ab 0.00b 1cd 2
y
Cepa2 3.40b 1.22a 3.22a 5ab 1
Cepa3 3.55b 1.00abc 3.00a 6a 1
Cepa4 3.50b 0.82bc 0.00b 4ab 2
Cepa5 3.52b 0.80bc 0.00b 0d 2
Cepa6 4.37a 0.77c 1.07b 4ab 2
Cepa7 3.55b 0.87bc 0.00b 3bc 2
Cepa8 3.37b 0.75c 0.00b 5ab 2
x
Mediasdentrodecadacolumnaseguidasconlamismaletrasonestadsticamenteiguales
(Tukey0.5).
y
Clase de antagonismo segn Bell et al., 1982 (1=Trichoderma sobrecrece al
patgenoycubretodalasuperficiedelmedio;2=Trichoderma creceen75%delasuperficie
delmedio,detieneelcrecimientodelfitopatgenoynolopuedesobrecrecer).
8
AGRO
PRODUCTIVIDAD
AGRO
PRODUCTIVIDAD
Arzate-Vegaet al.(2006)reportaroncontactoalas24hdespusdelaino-
culacindeochocepasdeTrichodermaspp.,apesardehaberdado16das
de ventaja a M. fijiensis. Finalmente, Michel-Aceves et al. (2009) registraron
valoresentretresycuatroparaFo,dondelascepasdeT. harzianumThzn-
2nativayThzcf-12fueronmsagresivasencomparacinconT. lignorum.
Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Snchez et al. (2007),
quienesobservaroninhibicindecrecimientodemicelioysobreposicinde
lascoloniasdeThielaviopsis paradoxaporcepasnativasdeTrichodermaspp.,
atribuyendoestemododeaccinalmicoparasitismo.
Las cepas dos y tres presentaron antagonismo clase uno y todas las cepas
restantesclasedos(Cuadro2).SousaRochayOliveira(1998)reportaronde
20 cepas de Trichoderma spp para C. gloeosporioides y Sclerotium rolfsii
slo tres de clase uno y dos; en las dems cepas el fitopatgeno fue ms
agresivo con clase cinco (Michel-Aceves et al., 2005b) y Arzate-Vega et al.
(2006)reportaronantagonismotipounoenseiscepasdeTrichoderma spp.,
sobreM. fijiensis.
Enlapruebain vitro delosfungicidas(valoresmedidosalosdos,ochoy16
dds) fueron ascendentes conforme pasaron los das (Cuadro 3). El porcen-
tajedeinhibicinalos16ddsparalamezclaProcloraz+Tiofanatometlico
provocelmenorcrecimientoparaFogcon0.07cmy,porconsiguiente,la
mayor inhibicin con 98.33%, mientras que los biolgicos como B. subtilis
registraron 58.89%. Al respecto, El-Hassan et al. (2004) indican que B. sub-
tilis present69%decontroldeF. oxysporumf.sp.Lentisbajocondiciones
de invernadero y Cao et al. (2011) reportaron control in vitro de Fo f. sp.
cucumerinumconB. subtilisSQR9alobtener65%deinhibicin.
En ensayos in vitro con Trichoderma spp., Bacillus spp. y Pseudomonas
spp. contra fitopatgenos comunes en cultivos de tomate, chile y cebo-
lla, Izzeddin y Medina (2011) demostraron que el crecimiento de Fusarium,
Rhyzoctonia spp.yPhytophthora spp.seinhibe.Trichoderma viride mostr
la mayor eficiencia significativa que B. subtilis y Pseudomonas aeruginosa.
Enestesentido,algunosautoressealanqueTrichoderma spp.debeseres-
tudiadaconunamayoratencinentemasdecontrolbiolgico,yaquesu
actividadresultadeunacombinacindemicroparasitismoyunaproduccin
demetabolitoscapacesdecontrolarungrannmerodeplagas(Stefanova
et al.,1999).
Enelensayodecampo,laalturade
plantaoscilentre69cmy95cm
a los 77 dds, sin diferencias esta-
dsticas; la mayor altura se presen-
t donde se aplic T. asperellum
(Cuadro 4). Al respecto, al aplicar
micorrizas (Glomus sp.) Zac. 19 y
G. aggregatummparaelcontrolde
F. oxysporum en el cultivo de gla-
diolavariedadFanyRoja,Khalilet al.
(2001)reportaronalturasde80cm
a 90 cm a los 120 dds, lo cual fue
coincidente con los valores regis-
trados en esta investigacin, pero
en menor tiempo. Se observaron
diferenciasevidentesdeincidencia
y severidad para los fitopatgenos
en estudio. En el caso de U. trans-
versalis fue nula en los tratamien-
tos, excepto en el testigo, donde
se present al final del ciclo del
cultivo en una incidencia de 10%
y severidad de 1%. En cambio, la
incidencia de Fog fue de 90% en
todos los tratamientos (Cuadro 4).
Respecto a la severidad, la mezcla
de Procloraz+Tiofanato metli-
co present la menor cantidad de
plantas enfermas (639) y redujo la
severidad 47% respecto al testigo
con1206plantasenfermas.
Vergara (2010) aplic en rboles
de manzano B. subtilis en dosis
de 8 kg ha
-1
y cepas nativas de
Trichodermaspp.,enfloracin,co-
secha y postcosecha. No reportan
daos en floracin; sin embargo,
Cuadro 3.Efectividaddefungicidasin vitrosobreelcrecimientoeinhibicindeFusarium oxysporumf.sp.gladioli.
Tratamiento
Crecimiento(cm) Inhibicin(%)
Da2 Da8 Da16 Da2 Da8 Da16
Metalaxil+Clorotalonil 0.1c
z
0.4c 1.05c 82.32b 87.03b 76.67b
Procloraz+TiofanatoM 0.0d 0.0d 0.07d 100.00a 100.00a 98.33a
Bacillus subtilis 0.2b 0.1b 1.85b 70.72c 66.39c 58.89c
Testigo 0.6a 2.9a 4.50a 0.00d 0.00d 0.00d
z
Mediasdentrodelascolumnasseguidasconlamismaletrasonestadsticamenteiguales(Tukey0.5).
9
AGRO
PRODUCTIVIDAD
en cosecha indicaron una baja in-
cidencia de Alternaria alternata y la
ausencia total de Botrytis cinrea.
En postcosecha (tres meses de al-
macenajemssietedasatempera-
turaambiente)indicaronbuencon-
trol, con incidencia de B. cinrea y
deA. alternatade3%y22%respec-
tivamente. Estos resultados fueron
ms relevantes en el control de la
enfermedad a los obtenidos en el
presente trabajo con incidencia de
90%deFog.
Debeexistirgrancantidaddeespo-
rasdeFog enlossuelosdelaCon-
cepcin, Guerrero, a pesar de que
realizanrotacindecultivos(gladio-
la-frijol-maz-cebolla)porquelosbe-
neficios de los fungicidas sintticos
y ms an de los biolgicos no se
ven reflejados; sin embargo, es im-
portanteseguiraplicandobiolgicos
paraqueseestablezcanenellugar.
Enestesentido,bajocondicionesde
invernadero, Cao et al. (2011) eva-
luaron el efecto del bio-fertilizante
orgnico(BIO)conB. subtilis SQR9
enelcontroldelapudricinporFo
f. sp. cucumerinum, registrando re-
duccinsignificativadelaincidencia
(49%-65%)delapudricinencom-
paracin con el testigo cuando se
aplicelBIO.Msan,detectpor
PCR la poblacin del fitopatgeno
enlarizosfera(10
6
cfug
-1
deraz)y
Cuadro 4. Efectividad de productos sobre la altura de planta, porcentaje de severidad y rendimiento ha
-1
en
condicionesdecampo.
Tratamiento
Altura
planta
Plantasenfermas
Plantas
Cosechadasha
-1
No. Severidad(%)
Procloraz+TiofanatoMetlico 83.70 639 28.53b 178,683a
Metalaxil+Clorotalonil 90.20 923 41.21ab 146,987ab
Trichoderma asperellum nativo 95.00 924 41.25ab 146,875ab
Bacillus subtilis 74.00 975 43.53a 141,183b
Testigo 90.25 1206 53.84a 115,402b
z
Mediasseguidasconlamismaletrasonestadsticamenteiguales(Tukey0.5).
fuesignificativamentemenorenlas
plantas tratadas con BIO que en el
testigo.Estosresultadosindicanque
lacepaescapazdesobrevivirenla
rizosfera y proteger a la planta del
fitopatgeno.
Se cosecharon 145,826 plantas en
promedio; el tratamiento donde
se aplic la mezcla de los fungici-
das sintticos Procloraz+Tiofanato
metlico obtuvo significativamente
la mayor cantidad de plantas por
hectrea, con 178,683 (Cuadro 4),
mientras que B. subtilis y el testigo
obtuvieron las menores cantida-
des. De acuerdo con Sierra (2009),
enelestadodeMichoacn,Mxico
se obtienen 1000 gruesas ha
-1
de
gladiolas (140,000 tallos florales),
partiendo de 140,000 plantas ha
-1
,
cantidadinferioralaobtenidaenla
presenteinvestigacin,enlaquese
cosecharon145,826plantasha
-1
en
promedio,apesardelosaltospor-
centajesdeseveridadporFog.
CONCLUSIONES
La evaluacin in vitro de los pro-
ductos biolgicos Trichoderma
asperellum cepa 8 inhibi 60.6% el
micelio de Fog con antagonismo
clase dos, mientras que Bacillus
subtilis nofueefectivo;delosagro-
qumicos sintticos, la mezcla de
Procloraz+Tiofanato-metlico fue
efectiva en 98.3%. En la evaluacin
in situ, la incidencia y severidad de
U. transversalis fue nula donde se
aplicaronlosagroqumicos.EnFog,
la mezcla Procloraz+Tiofanato-
metlico logr reducir la severidad
en 47% y con T. asperellum en
30.9%. En sta zona, donde la inci-
dencia y severidad de Fog es alta,
se tiene un producto sinttico que
es eficiente y se requiere continuar
buscandocepasnativasconmayor
efectividad.
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PRODUCTIVIDAD
12
AGRO
PRODUCTIVIDAD
CARACTERIZACINEIDENTIFICACIN
MOLECULARDEBACTERIAS
AISLADASDEKEFIR
MOLECULARCHARACTERISATIONANDIDENTIFICATION
OFBACTERIAISOLATEDFROMKEFIR
Salas-Snchez, S.I.; Valadez-Moctezuma, E.
*
LaboratoriodeBiologaMolecular.DepartamentodeFitotecnia,UniversidadAutnomaChapingo.
CarreteraMxico-Texcocokm38.5,ChapingoMxico.CP56230.
*Autor responsable:evaladez@correo.chapingo.mx
RESUMEN
Elkefiresunalimentoprobitico,compuestoprincipalmentedebacteriascido-lcticasylevaduras.Suingestaayudaal
buenfuncionamientodelintestinohumanoporelincrementodelaflorabenfica.Dependiendodellugar,esteproducto
presentacaractersticasorganolpticasdistintivasproporcionadasporeltipodemicroorganismosasociadosylacalidad
delalecheutilizada.Actualmenteexisteintersenindustrializarlo,peroesnecesarioseleccionarelinculoadecuado
paraestandarizarsusaborycalidad.Conbaseenloanterior,secaracterizaroneidentificaronmolecularmentebacterias
cido-lcticasaisladasdekefirartesanal.Todaslasbacteriascaracterizadasfuerondeformabacilar,Grampositivas,ca-
talasanegativas,sinesporulacin,yacidificaronlalecheenvaloresdepHdiferentes.Lalechefermentadapresentcon-
sistenciaviscosa,olorcaracterstico,ygeneralmenteestabagasificada.Todoslosaislamientosfuerondiferenciadoscon
RAPDs,RAPD-CAFs,separadosencuatrogrupos,ylassecuenciasdelgen16SlosidentificcomoLactobacillus kefiri.
Palabras clave:lechefermentada,marcadoresgenticos,RAPD-CAFs,rDNA,Lactobacillus kefiri.
ABSTRACT
Kefirisaprobioticfoodcomposedmainlyoflacticacidbacteriaandyeasts;intakehelpstheproperfunctionofthehuman
intestinebyincreasingthebeneficialflora.Dependingonthegeographicsite,thisproducthasdistinctiveorganoleptic
characteristicsprovidedbythetypeofassociatedmicroorganismsandthequalityofthemilkused.Kefirhasundergone
industrialization,buttostandardizethetasteandquality,itisnecessarytoselecttheappropriateinoculum.Lacticacid
bacteria isolated from artisanal kefir were identified and characterized molecularly. All the bacteria were rod shaped,
Grampositive,catalasenegativeandwithnosporulation;thebacteriaalsoacidifiedthemilkwithdifferentpHvalues.The
fermented milk showed viscous consistency, characteristic odor and most frequently it was gasified. Bacterial isolates
weredifferentiatedwithRAPDandDAF-PCR,andclassifiedintofourgroups.Thesequencesofthe16Sgeneidentified
themasLactobacillus kefiri.
Key Word:fermentedmilk,geneticmarkers,organolepticproperties,DAF-PCR,rDNA,Lactobacillus kefiri.
13
AGRO
PRODUCTIVIDAD
Bacteriasaisladasdekefir
Figura 1.Grnulosdekefir(Lactobacillus kefiri).
INTRODUCCIN
La preservacin
de los
alimen-
tos por fermentacin es uno de los mtodos ms an-
tiguos conocidos por la humanidad. La leche ha sido
unodelosprimerosproductospecuariosutilizadospor
el hombre, e incluso, de los primeros alimentos some-
tidos a procesos fermentativos (Cheesman, 1984). Las
leches fermentadas se elaboran generalmente con le-
che de vaca (Liu y Lin 2000; Je-Ruei et al., 2002), utili-
zandoselectoscultivoslcticosenmodernosprocesos.
El consumo de estos productos a nivel mundial se ha
incrementadodebidoaquefavorecenlafloraintestinal
yayudanaprevenirelincrementodeorganismospat-
genosenelintestinoporlapropiaacidificacindelpro-
ducto (Roberfroid, 2000). El kefir (de origen caucsico)
es una bebida lctea viscosa, ligeramente carbonatada,
que contiene pequeas cantidades de alcohol; se co-
noce como kephir, kiaphur, kefer, knapon, kepi y kippi
(Farnworth,2005;Karagzlet al.,2007).Seclasificaen
elgrupodelechesfermentadasyacidificadasporunami-
crofloramixtabasadaenbacteriasylevaduras(Marshall
y Cole, 1985; Ot-es y Cagindi, 2003). Los grnulos de
kefir,comnmenteconocidosenMxicocomoblga-
ros, se utilizan como inculo y se obtienen a partir de
laproliferacindegrnulospreformados(Garroteet al.,
1998),quesonestructurasdepolisacridos,gelatinosas,
blancasoamarillentas,irregularesydetamaovariable
(Figura 1) donde conviven en simbiosis bacterias cido
lcticas (BAL), levaduras y, ocasionalmente, bacterias
acticasincrustadasenunamatrizformadaporKefiran
(Frengova et al., 2002; Ninane et al., 2005). Las BAL se
localizan principalmente en la capa superficial y las le-
vaduras en el centro de los grnulos, ocasionando fer-
mentacin cido-alcohlica durante la cual se acumu-
lan metabolitos como cido lctico (producido por las
bacterias), alcohol etlico y cido carbnico (producido
porlevaduras)queleconfierenpropiedadesorganolp-
ticas distintivas a este alimento milenario (Yilmaz et al.,
2006).Ademsdeotrosbeneficiosatribuidosasucon-
sumo,lacantidaddemicroorganismosylavariedadde
componentesbioactivosquepuedenformarsedurante
lafermentacinhacendelkefirunprobiticocomplejo
(Farnworth,2005).
ElkefiresconsumidoprincipalmenteenEuropa,perose
producecomercialmenteenotraspartesdelmundo.Ac-
tualmentelaelaboracinaescalacomercialrequierede
cultivosseleccionadosyeficientesquepermitancontro-
larlamicroflorainvolucradaparaobtenerproduccinde
calidadyestandarizada;ascomoextenderlavidatildel
productoyfacilitarlosaspectosnutrimentales,conside-
randoaltosvaloresdebacteriasviables,ademsdebue-
nas propiedades qumicas y organolpticas. A la fecha
se ha intentado producir leche similar al kefir tradicio-
nal, combinando Lactobacillus helveticus, Lactococcus
lactis subsp lactis y Saccharomyces cerevisiae aislada
de kefir con las cepas para yogur, L. delbrueckii subsp
bulgaricus y Streptococcus thermophilus (Beshkova et
al., 2002). Con la misma finalidad, en Estados Unidos
(EUA)seproducekefircomercial,quecontieneS. lactis,
S. cremoris, S. diacetylactis, Leuconostoc plantarum,
L. casei, L. cremoris y S. florentinus (Hertzler y Clancy
2003).Debidoalaspropiedadesnutricionalesqueofre-
ceesteproductolcteoyalintersporindustrializarlode
formaestandarizada,ungrupodebacteriaslcticasais-
ladasdekefirproducidoartesanalmentesecaracterize
identific, utilizando marcadores gentico-moleculares
ycomparandolassecuenciasdelgen16SdelrDNA.
MATERIALES Y MTODOS
Aislamiento y caracterizacin de BAL con
pruebas bacteriolgicas
SeobtuvierondiferentesmuestrasdekefirdelaCiudad
deTexcoco,EstadodeMxico,Mxico,producidoarte-
sanalmente. Se inocul 10% (p/v) de grnulos de cada
muestra en leche de vaca, semidescremada y ultrapas-
teurizada, marca Alpura
, y se incubaron a 30 C por
48h.Delnuevokefirsehicierondilucionesensolucin
14
AGRO
PRODUCTIVIDAD
AGRO
PRODUCTIVIDAD
deRingerde10
-1
,10
-2
,10
-3
y10
-4
,sesembraronencaldoparalactobaci-
losMRS(DeManet al.,1960)porextensinenplacayseincubarona37C
durante72h.Seaislaroncoloniasdebacteriascolorblanco-cremoso,Gram
positivas y catalasa negativa. Para medir la acidificacin de los diferentes
aislamientos,cadacultivoseinoculal1%(v/v)enlechesemidescremada
ultrapasteurizadaAlpura
yseincuba37Cdurante24h.Laconcentra-
cindeclulassedeterminenunespectrofotmetroNanoDrop,ND100
ade550nm.
Extraccin de DNA y PCR
Se extrajo ADN de los aislamientos de las bacterias lcticas de acuer-
do con Sambrook et al. (1989), adems de Streptococcus thermophilus
(Gram positiva) y de Escherichia coli (Gram negativa) que se utilizaron
comogruposdecomparacinenlosanlisisdeDNA.Todaslasmuestras
se trataron con Ribonucleasa A (RNasa A) 10 mg mL
-1
(fermentas) y el
ADNsere-suspendienbufferTE(10mMTris-HClpH7.6y1mMEDTApH
8).LaintegridaddelADNseestimporelectroforesisenagarosa1%,tei-
doconbromurodeetidio0.5ugmL
-1
,yseobservconluzultravioleta.
El ADN se cuantific con espectrofotmetro (ND100) a 260 nm. Para la
caracterizacinydiferenciacindelosaislamientosseutilizaronlastc-
nicas RAPDs y una modificacin a esta tcnica, que consisti en digerir
previamente el ADN con una enzima de restriccin, con la finalidad de
hacermenoscomplejalatopologadelamolculayfacilitarelreconoci-
mientodefragmentosmoldeporpartedelprimeraleatorio,conelfinde
incrementarconsiderablementelareproducibilidadylanitidezdelosper-
filesqueseobtienenalsepararlosengelesdeacrilamida.Enelpresente
trabajoaestamodalidadseproponeelnombredeRAPD-CAFs(Random
AmplifiedPolymorphicDNA-ClavedAmplifiedFragments).Estatcnicaal-
ternativaprcticamentetienecomobaselasquereportaronKoniecznyy
Ausubel(1993),quienesrestringieronproductosdePCRenlugardelADN
molde;yCaetano-AnollsyGresshoff(1994),quetieronfragmentosDAF
consalesdeplataengelesdeacrilamidaenlugardeusarradioactividad.
Los iniciadores para PCR se seleccionaron del kit L de Carl Roth Com-
pany.LamezcladereaccinparaRAPDconsistien100ngdeADN,20
pMdecadainiciador,200pMdedNTPs,1Xdeamortiguador,2.5mMde
MgCl
2
y 1.5 unidades de Taq ADN Polimerasa. El volumen final se ajust
a25uLconaguadestiladaestril.Eltermociclajeconsistien:uncicloa
94Cdurantedosminutos;35ciclos[94C,unminuto;40C,unminuto;
72C,1.5minutosyunciclodeextensinfinalde72Cporcincominu-
tos.SeseleccionaronlosiniciadoresL-03,L-06,L-07,L-08,L-10,L-12,L-18
yL-20,dadasufuncionalidadparaeltipodemuestras.Cabehacernotar
queauncuandolosRAPDssealineancomnmenteentre32Cy35C,
enlapresenteevaluacinsehizoa40Cconlafinalidaddeincrementar
laespecificidadyreproducibilidad(Lunaet al.,2007).ParaRAPD-CAFsse
digiri 1 ug de ADN de cada cepa con la enzima EcoRI (PROMEGA) de
acuerdo con las indicaciones del fabricante. Los productos de digestin
seamplificaronconlosmismosiniciadoresempleadosparaRAPDycon
el mismo programa de termociclaje referido. Los productos de PCR se
separaronengelesdepoliacrilamida8%ysetieronconnitratodeplata
0.2%(Caetano-AnollsyGresshoff,1994).
Anlisis estadsticos de los
perfiles electrofortico
Se construy una matriz binaria (0
y1)apartirdelosdiferentesperfiles
deADN,donde1indiclapresen-
ciadeunfragmentoy0suausen-
cia entre los aislamientos compa-
rados. Se gener un dendrograma
por el mtodo de UPGMA, con
coeficiente Nei & Li/Dice y 1000
re muestreos tipo Jackknife, elimi-
nandodosbandasencadacorrida;
estoserealizconelsoftwareFree
Tree 0.9.1.50 y se grafic con Tree
View1.6.6(Hamplet al.,2001;Page,
2001).
Amplificacin del fragmento 16S rDNA
y secuenciacin
Paralaamplificacindelgen16Sdel
rDNAdelasBALseutilizaron25ng
deADNdecadaaislamiento,10pM
decadaunodelosiniciadoresuni-
versales para bacterias, el 16S (8f:
5-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3 y
U1492r:5ACCTTGTTACGACTT-3)
(Ashelford et al., 2005; Sasoh, et
al.,2006),200pMdedNTPs,1Xde
amortiguador, 2.5 mM de MgCl2 y
2UdeTaqDNAPolimerasayagua
libre de nucleasas en un volumen
final de 25 uL. El programa de ter-
mociclaje consisti en un ciclo a
95 C por dos minutos, 30 ciclos
[95C,unminuto,56C,unminu-
to; 72 C, uno punto cinco minu-
tos]yunciclodeextensinfinalde
72 C por cinco minutos. Se obtu-
vo un fragmento de alrededor de
1500 pb (pares de bases) y se lim-
piporelmtodoExo-Sap(Shrimp
Alkaline Phosphatase-Exonuclease
I de Invitrogen). Para la reaccin
de secuenciacin se utilizaron 20
ng del fragmento purificado, 10
pMdecadainiciadorU514F(5-GT-
GCCAGCMGCCGCGG-3) y 800R
(5-CTACCAGGGTATCTAAT-3) (An-
zai et al., 2000; Edgcomb et al.,
2002), 2 uL de amortiguador 5X,
15
AGRO
PRODUCTIVIDAD
4 uL de la solucin RRM (incluye
enzima AmpliTaq DNA polimera-
sa, MgCl
2
, amortiguador Tris-HCl,
dNTPs y ddNTPs) y agua. La reac-
cindePCRserealizpor25ciclos
[96C,10s;50C,5s;60C,4mi-
nutos]; posteriormente el ADN se
limpi de acuerdo con las indica-
cionesdelkitdesecuenciacinde
Applied Biosytems. Las secuencias
serealizaronconunAnalizadorGe-
ntico Applied Biosystems modelo
3130; se ensamblaron y editaron
con los programas computacio-
nales BioEdit Sequence Alignment
Editor7.0.5.3yFinchTV1.4.0Geos-
pizaInc.Estainformacinsecom-
parconlabasededatosGenBank
delNacionalCenterforBiotechno-
logy Information (http://www.ncbi.
nlm.nih.gov).
Aislamiento de bacterias y
capacidad acidificante
El medio MRS result adecuado
para crecimiento de BAL. En la Fi-
gura 2 se muestran colonias ho-
mogneas de color blanco-crema
y forma semejante que se caracte-
rizaron como Gram (+) y catalasa
(-). La cuenta de colonias se hizo
con base en las diluciones 10
-2
y 10
-3
, dando un recuento en el
orden de 3.810
5
a 1.4510
7
ufc
mL
-1
respectivamente, lo que pre-
suponequelaformadecultivoutili-
zadapermiteobtenerlacantidadde
bacterias BAL apropiadas para con-
tribuir a la calidad del kefir. En este
sentido, Siuta (2001) indica que la
diferencia en cuentas microbianas
en productos lcteos es un factor
dedeterminacindelsaboryaroma
y,adems,losprobiticosdeleches
fermentadas deben estar presentes
en cantidades apropiadas (110
6
UFCmL
-1
)parapreveniradecuada-
menteproblemasgastrointestinales.
tipificar genticamente con RAPD
los 20 aislamientos de BAL mos-
traron pocos polimorfismos; sin
embargo, fueron capaces de dife-
renciarclaramenteaS. termophillus
y E. coli (Figura 3). Con la tcnica
RAPD-CAFs solamente los inicia-
dores L-07 y L-12 fueron capaces
de reconocer y amplificar todas las
muestras que se compararon en el
estudio(Cuadro2).
Los perfiles de esta ltima tcnica
fueron diferentes a los obtenidos
conRAPDs(Figura3);lashuellasob-
tenidasfueronabundantesyntidas.
Larazndeestadiferenciasedebi
principalmenteaquelosiniciadores
encuentran ms fcilmente los si-
tiosdealineacinenlosfragmentos
de restriccin que se utilizan en la
PCRcomoADNmolde,favorecien-
do una amplificacin selectiva y
proporcionando ampliaciones me-
jor definidas y reproducibles entre
experimentos independientes. El
ADN de alto peso molecular que
normalmenteseutilizaparaobtener
RAPD dificulta el potencial recono-
cimiento por parte de los iniciado-
res, dada la compleja topologa de
la molcula; esta es seguramente
esunadelasrazonesporlaquelos
RAPDsoncuestionadosentrelabo-
ratoriosoexperimentos.Sinembar-
go, en el presente caso las huellas
tipo RAPD fueron capaces de dife-
renciarlascepasdeBALrespectoa
lasbacteriascomparadoras.
Por otro lado, los geles de acrila-
mida resultaron ser una excelente
herramienta para la visualizacin
de polimorfismos de ADN, ya que
las diferencias entre ampliaciones
conpesosmolecularescercanosse
aprecianmsfcilmente,proporcio-
nando un mayor nmero de datos.
Luna et al. (2007) reportaron resul-
tados similares utilizando la misma
Figura 2.Desarrollodebacteriaslc-
ticasaisladasdekefir.a-d:Diluciones
a 10
-1
, 10
-2
, 10
-3
, 10
-4
, respectiva-
mente.
a
b
c
d
Los valores de pH entre los 20 ais-
lamientos variaron desde 4.9 a 6.1
(Cuadro 1). La fermentacin de la
lechetambinprodujounaumento
en la viscosidad, desarrollo de olor
caractersticoyproduccindegas.
Anlisis de perfiles RAPDs y RAPD-CAFs
Losochoiniciadoresutilizadospara
16
AGRO
PRODUCTIVIDAD
AGRO
PRODUCTIVIDAD
Cuadro 1.ValoresdepHenlecheacidificadaporlosaislamientos
debacteriascido-lcticasobtenidasdekefir.
Cepa* pH Cepa* pH
10 4.9 24 5.8
17 5.1 5 5.8
21 5.5 6 5.8
19 5.5 7 5.8
28 5.6 20 5.9
14 5.7 2 5.9
16 5.7 4 5.9
9 5.7 3 6.0
13 5.7 18 6.0
26 5.7 22 6.1
*Numeracinasignadaenelestudio.
Figura 3.PerfilesRAPD(3a)yDAF-PCR(3b)obtenidosconeliniciadorL-07yseparadosengelesdepoliacrilamida.Nteselanitidezde
losfragmentosdeDNAylospolimorfismosdetectadosconDAF-PCR(sealadosconflechas).Elmarcadordepesomolecular(M)esde
1kb(PROMEGA).Ec:Escherichia coli;St:Streptococcus thermophilus.Gelinferiorcontienelascepasreportadasenelpresenteestudio.
Gelsuperior,incluyeotrosaislamientosqueresultaronigualesentres.
tcnica. Para los anlisis estadsticos se utiliz un total
de 105 fragmentos obtenidos en la tcnica de RAPD-
CAFs;37%destosfueronpropiosdelosdosaislamien-
tos comparadores. El agrupamiento de las cepas de la
Figura4definiseisgrupos:dosindependientes,donde
se ubicaron los comparadores E. coli y S. termophilus,
ycuatrodondesedistribuyeronlas20cepasdeBAL.El
grupo principal estuvo integrado por 17 aislamientos, a
suvezseparadosendiferentessubgrupos:[4,17,16,2,3,
7,24,28,13y5];[21,22,20,14y26];[18y19],perolas
cepas9,6y10semantuvieronindependientesentresy
separadasdelgrupomayor.Esteniveldediferenciacin
fueevidenciadosoloutilizandolosdatosRAPD-CAFs,as
como la variabilidad gentica intrnseca del la especie,
resultadosquenoselograronconlosdatosRAPDs(no
mostrados y no considerados). Al tratar de establecer
17
AGRO
PRODUCTIVIDAD
Cuadro 2.Respuestadeamplificacindelasbacteriascido-lcticasaisladasdelkefirconochoiniciadoresaleatorios.Lashilerasindicanlos
iniciadoresutilizadosylascolumnas,losaislamientosevaluados.
2 3 4 5 6 7 9 10 13 14 16 17 18 19 20 21 22 24 26 28 Ec St
L-03
L-06
L-07
L-08
L-10
L-12
L-18
L-20
Figura 4. Dendograma agrupado con UPGMA, utilizando 105 fragmentos RAPD-CAF de 20 cepas de Lactobacillus
kefiri,conlaseparacindelosaislamientos10,6y9.
18
AGRO
PRODUCTIVIDAD
AGRO
PRODUCTIVIDAD
unacorrelacindelosgruposdelasBALdeldendrogra-
maconlosdeacidificacindelaleche(Cuadro1),sta
fue negativa, a excepcin posiblemente de la cepa 10
quetenaelpHmsbajo(4.9).
Secuenciacin.Elfragmentosecuenciadodealrededor
de1400pb,correspondientealgen16S,queidentific
con exactitud a las 20 cepas BAL, como Lactobacillus
kefiri,deacuerdoconlabasededatosNCBI(Figura5,
6). La Figura 6 muestra el rbol de relacin filogenti-
ca entre las cepas del presente estudio (LK) y algunas
bacterias relacionadas, obtenidas del banco de genes
GenBank;dondeLKseencuentramsrelacionadoge-
nticamenteconL. kefiri,L. sanfranciscensis,L. brevis,
L. casei subsp.casei yL. casei queconelrestodelas
especies comparadas. Indudablemente, la compara-
cindesecuenciasconservadasdeADN,comofueel
gen analizado en este trabajo, tiene gran importancia
porque permite comparar a los microorganismos de
manera muy fina. Torriani et al. (1999) y Blaiota et al.
(2008)hanindicadoquelasinferenciasbasadaseneste
solo gen no son del todo concluyentes al comparar
bacterias,porloquesesugiereutilizarotrassecuencias
ogenes;porejemplo,lasregionesespaciadorasinter-
gnicas (ISR) que ayudan a identificar serotipos o las
regionesenlosextremosdelasubunidad16S,llamadas
V1-V3oV6-V9e,incluso,genescodificadoresdepro-
tenasheatshock,etctera,quemuestranmayorvaria-
cinypermitenasegurarlaseparacindelasespecies
conmsprecisin.Conbaseennuestrosresultadosy
para nuestro caso, resulta muy importante considerar
otras zonas del genoma de las BAL; por ejemplo, las
sugeridasporestosautoresparaconocersilascepas6,
9y10,quemostraronperfilesdeADNdiferentestanto
con RAPDs (datos no mostrados) como con DAF, re-
presentanvariacininter-especficadelaespecieoson
otrasespeciesdebacteriascidolcticaspresentesen
elkefirdelazonadeTexcoco,Mxico.
CONCLUSIONES
AislamientosdeBALobtenidosdekefirproducidodefor-
madomsticafueroncapacesdefermentaryacidificar
lalechedevacaconvaloresdepH4.9a6.1.
LatipificacingenticarealizadaconRAPDyRA-
PD-CAF permiti apreciar claramente la variabili-
dadintra-especficadelosaislamientosdeBAL.
LosRAPD-CAFsfueronmseficientesquelosRA-
PDs para revelar polimorfismos claros entre los
aislamientosdeBALyentrelasbacteriasutilizadas
como grupos comparadores (Steptococcus ter-
mophillus y Escherichia coli); particularmente, el
iniciadorL-07fueelmsinformativo.
Los aislamientos de BAL se separaron en cuatro
grupos:elprincipalseintegrpor17delos20ais-
lamientosevaluados:[4,17,16,2,3,7,24,28,13y
ATCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGCGTTTCCGTTATTG
ATTTTAGGTGCTTGCATTTAAATGATTTAACACGAAACGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTG
GGTAACCTGCCCTTGAAGTAGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGTATAACAACCAA
AACCACATGGTTTTGGTTTAAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTAGGATGGACCCGCGGCGTATTA
GCTTGTTGGTAAGGTAATGGCCTACCAAGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGC
CACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATG
GACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTG
TTGGAGAAGAACAGGTGTCAGAGTAACTGTTGACATCTTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGG
CTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGT
AAAGCGAGCGCAGGCGGTTTCTTAGGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCAT
CGGAAACCAGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCG
TAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCG
AAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAG
TGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGA
CCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAAT
TCGATGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTCTGCCAACCTAAGAGATTAGGCGTTC
CCTTCGGGGACAGAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTA
AGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAGCAAGACT
GCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCT
ACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCGAAACCGCGAGGTCAAGCTAATCTCTTAAA
GCCGTTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGTG
GATCAGCATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACAC
Figura 5.Fragmentode1397basescorrespondientealgel16SdelrDNAdebacte-
riascido-lcticasdekefirdeTexcoco,Mxicoobtenidoconlosiniciadoresuniver-
sales8Forward5-
19
AGRO
PRODUCTIVIDAD
Figura 6. Relacin filogentica de algunas especies de
Lactobacillus spp.,obtenidasdelGenbankconcepasdelpre-
senteestudio.
5];[21,22,20,14y26];[18y19]conpocavariacin
genmica; los otros tres grupos independientes
entre s estuvieron representados por los aisla-
mientos6,9y10,respectivamente.
Las 20 cepas de BAL se identificaron como
Lactobacillus kefiri,alcompararlassecuenciasdel
gen16SdelrADN.
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PRODUCTIVIDAD
AGRO
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AGRO
PRODUCTIVIDAD
21
AGRO
PRODUCTIVIDAD
CONTROLBIOLGICODEGARRAPATA
(Boophilusspp.)CONDIFERENTESCEPAS
DEMetarhizium anisopliae(Metchnikoff)
SorokinENBOVINOS
BIOLOGICALCONTROLOFTICKS(Boophilusspp.)
WITHDIFFERENTSTRAINSOFMetarhizium anisopliae
(Metchnikoff)SorokinINCATTLE
Martnez-Tinajero, J.J.
1
; Izaguirre-Flores, F.
1*
; Aguirre-Medina, J.F.
1
;
Ley de Coss, A.
1
; Osorio-Lpez, M.W.
2
; Juregui-Jimnez, R.
2
.
1
CuerpoAcadmicodeGanaderaTropicalSustentable,FacultaddeCienciasAgrcolas,Universidad
Autnoma de Chiapas. Carretera Costera, Huehuetn, Chiapas, Mxico.
2
Centro Universitario de
OrienteCUNORIdelaUniversidaddeSanCarlosdeGuatemala,Chiquimula,Guatemala,C.A.
*Autor responsable:fizaguirreflores@gmail.com
RESUMEN
ConelobjetivodeevaluarcuatrocepasdelhongoMetarhizium anisopliae(Metschincoff)Sorokinparaelcontrolgarra-
patasdelgneroBoophilusspp.,seseleccionarondoscepasdegarrapatasparasuevaluacinensufaseadultasobre
terneros parasitados. Se utiliz un diseo completamente al azar, con seis tratamientos y diez repeticiones. En esta
faselascepasPLHyCH93-3fueronlasquemostraronlamayorefectividad,porloquefueronevaluadasengarrapatas
adultassobreternerospreviamenteparasitados;enlapruebain vivoseutilizundiseodebloquescompletamenteal
azar, cuatro tratamientos (Las dos cepas seleccionadas, un compuesto qumico y un placebo a base de agua) y ocho
repeticiones.Losresultadosmostraronquelasdoscepasevaluadaspresentaronunaefectividaddel50%conrespecto
alproductoqumico.
Palabras clave:Garrapatas,cepa,ectoparsitos,terneros,anemia.
ABSTRACT
WiththeobjectiveofanalyzingfourstrainsofthefungusMetarhizium anisopliae (Metschincoff)Sorokinusedtocontrol
ticks of the genus Boophilus spp., two tick strains were selected for their assessment during their adult phase on
parasitizedcalves.Acompletelyrandomizeddesignwithsixtreatmentsandtenrepetitionswasused.Inthisphase,the
PLHandCH93-3strainsshowedthegreatesteffectiveness,sotheywereevaluatedasadultticksoncalvesthathadbeen
previouslyparasitized;duringthein vivotest,acompletelyrandomizeddesignwasused,withfourtreatments(thetwo
strainsselected,onechemicalcompoundandawater-basedplacebo),andeightrepetitions.Theresultsshowedthatthe
twostrainsevaluatedpresentedaneffectivenessof50%withregardtothechemicalproduct.
Key words:ticks,strain,ectoparasites,calves,anemia.
22
AGRO
PRODUCTIVIDAD
AGRO
PRODUCTIVIDAD
Controlbiolgicodegarrapata
INTRODUCCIN
Las garrapatas
son par-
sitos que
sealimentandesangredeanimalesvertebrados.Delas
tresfamiliasexistentes,sehanidentificadoenelmun-
do19gnerosymsde800especies,correspondien-
do636,alafamiliaIxodidae(Soulsby,1988).ParaAm-
ricasehanidentificado170especies,delascuales48
pertenecen al gnero Ixodidae spp., y en Guatemala,
sehanidentificado13especiesdelascualesBoophilus
microplus yAmblyoma cajennense,sonlasdemayor
importanciaeconmicaparalaganadera,yaqueade-
msdeldaoqueprovocan,transmitenenfermedades
de importancia econmica, como la anaplasmosis y
piroplasmosis bovina (Prodesa, 1988). Las garrapatas
se han logrado adaptar a una gran variedad de hbi-
tatsyademsposenunadistribucincosmopolita.Los
hospederos parasitados por garrapatas presentan una
variedad considerable, desde las asociadas a un hos-
pederoenparticular,comoelcasodelBoophilus spp.
con los bovinos, hasta aquellas con un amplio rango
dehospederoscomoAmblyoma cajennenseconma-
mferos, aves, batracios, roedores y reptiles (Prodesa,
1988).
Elusodegarrapaticidasdeorigenqumico,ascomola
faltadealternativasenelmercadollevanaqueseanece-
sariodesarrollaropcionesqueseanefectivasenelcon-
troldelasgarrapatas,quenocontaminenlosproductos
delaexplotacinbovinayquealavezseaninocuasal
medioambiente.Loshongosentomopatgenostienen
gran potencial como agentes controladores, constitu-
yendoungrupoconmsde750especies,diseminados
enelmedioambienteyprovocandoinfeccionesfungo-
sasapoblacionesdeartrpodos(Puchetaet al.,2006).
LpezyHans(2001)mencionanqueentrelosgneros
ms importantes de hongos entomopagenos se en-
cuentran:Metarhiziumspp.,Beauveriaspp.,Aschersonia
spp.,Entomophthoraspp.,Zoophthoraspp.,Eryniaspp.,
Eryniopsis spp., Akanthomyces spp., Fusarium spp.,
Hirsutella spp., Hymenostilbe spp., Paecelomyces spp.,
y Verticillium spp., mientras que para la FAO (2003) los
gnerosdeimportanciasonMetarhiziumspp.,Beauveria
spp.,Paecilomyces spp.,Verticillium spp.,Rhizopus spp.
y Fusarium spp. Como respuesta a lo anterior se eva-
lu eficiencia y efectividad de cuatro cepas del hongo
Metarhizium anisopliae (Metschinkoff) como una alter-
nativadebajocostoeinocuaalambiente,comocontrol
para garrapata Boophilus spp., en condiciones in vitro,
ensufasedevidalibreein situ,ensuetapaparasitaria
enbovinos.
MATERIALES Y MTODOS
LainvestigacinsellevacaboenelCentroUniversita-
rio de Oriente (CUNORI) localizado en el municipio de
Chiquimula, Guatemala (12 47 58 N y 89 31 05 O)
a320mdealtitud.Elmunicipioseubicaenlazonade
vida de bosque seco subtropical con una temperatura
mnimade19C,unamximade42Cyprecipitacin
promediode850mmanuales(Cruz,1982).
Desarrollo experimental
Sedeterminin vitro laefectividaddecuatrocepasdel
hongoMetarhizium spp.sobrelarvas(L1)degarrapatas
delgneroBoophilus spp.obtenidasapartirdelaincuba-
cinenlaboratorioparaserinoculadasconunasolucin
estandarizadadelhongoensuspensin.Enunasegunda
faseseevaluconternerosestabuladosutilizadoscomo
hospederosparaeldesarrollodelaslarvassembradasen
camposdelimitadosporcmarasinstaladasenlosmis-
mos, donde se efectu la aplicacin del hongo de las
cepasqueresultaronmsefectivasdurante
lafasein vitro.
Manejo in vitro
Serecolect,identific,cul-
tiv y reprodujo garrapatas
del gnero Boophilus spp,
con el propsito de obtener
una poblacin homognea
para la aplicacin de las cepas
de Metarhizium spp. La recolec-
cin de las hembras repletas o te-
leginas, se llev a cabo en fincas
con ganado de doble propsito
del municipio de Chiquimula,
provenientes de bovinos pa-
rasitados; las garrapatas co-
lectadas fueron identificadas
y trasladadas posteriormente
a una cmara de incubacin
construida para ese fin, a una
temperaturaentre27Cy30C
conhumedadrelativapromedio
de85%,paraquelasgarrapatasrepletas
finalizaransuciclodevidadentrodefras-
cosdevidrioconpapelabsorbenteenelfon-
do, hasta llegar la oviposicin la cual se produjo
23
AGRO
PRODUCTIVIDAD
entreelsegundoyquintodaposterioralaintroduccin
delasteleginasenlacmaradeincubacin.
Al finalizar la oviposicin se retiraron los cadveres de
las hembras repletas y se continu con el proceso de
esperadelaeclosindelaslarvas(L
1
),periodoquedur
entre14y16das.Undadespusdeiniciadalaeclosin
delaslarvasseprocediacerrarlabocadelosfrascos
conpapelfiltroyadhesivoabasedesilicnparaevitarel
escapedelaslarvasdesusfrascos.Laslarvasestuvieron
en ambiente de 85% y 100% de humedad relativa y se
esperunperiododeentre14-18dasparaobtenerun
mejor desarrollo de las larvas antes de la inoculacin,
consolucionesdelascuatrocepasdelhongoaprueba.
Manejo del hongo Metarhizium spp.
Las cuatro cepas iniciales provinieron de laboratorios
comerciales, como el del Ingenio La Unin y el CEN-
GICAAqueproporcionaronlascepasPLHyCH93-3,
respectivamente;yeldelAgrcolaElSol,queaportlas
cepas AESCHS y AESGC. Para llevar a cabo la inocula-
cindelaslarvas(L
1
)delasgarrapatasconelhongo,las
cepas fueron estandarizadas mediante reproduccin y
multiplicacin.
La unidad experimental fue for-
mada por frascos de vidrio,
conteniendo no menos de
1,100 larvas de garrapatas
del gnero Boophilus spp.,
eclosionadas de los huevos
de dos teleginas, colocadas
en un frasco de vidrio para el
desarrollo controlado de su ci-
clo evolutivo, dispuestos dentro de
unacmaradeincubacinconam-
biente controlado. Se utiliz un
diseo completamente al azar
con seis tratamientos y 10 re-
peticiones, cuyos tratamientos
correspondieron a las cuatro
cepasdelhongoenestudio,un
grupotestigoabasedeAmitraz
y un placebo. El modelo lineal
utilizado en la prueba in vitro
fue: Y
ij
=u+0
i
+_(a)+r
j
+0r
ij
+_
ij
,
donde: Y
ij
=variable respuesta.
u=efecto de la media poblacional. 0
i
=efecto
del perodo de incubacin del hongo sobre la
L
1
de la garrapata. _(a)=error asociado a los perio-
dos de incubacin. r
j
=efecto de las cepas evaluadas.
0r
ij
=efecto de la interaccin entre el periodo de incu-
bacin y las cepas. _
ij
=error experimental asociado a
lasunidadesexperimentales.Lostratamientosevaluados
fueron T1=Amitraz, T2=Placebo, T3=PLH, T4=CH 93-
3,T5=CepaA.S.G.CyT6=CepaA.E.S.CH.S.
Enlaspruebasin vitroseefectuaronconteosalas48y
96 horas despus de la aplicacin de los tratamientos
sobrelaslarvasdegarrapatasparaevaluarelperiodode
incubacin del hongo. Posteriormente se obtuvieron
los porcentajes de larvas muertas de cada uno de los
tratamientosevaluadosenrelacinconelnmerototal
delarvas;estosporcentajesfuerontransformadosme-
dianteelarcosenodelarazcuadradadelaproporcin.
Losconteossehicieronconelestereoscopioa40Xy
para determinar el crecimiento de micelio en fase de
desarrollosobrelaslarvasdegarrapataconmicrosco-
pioa10X.Losporcentajesdelaslarvasdegarrapata(L
1
)
muertas de cada uno de los periodos de incubacin
transformadosmedianteelarcosenodelarazcuadra-
dadelaproporcinfueronsometidosaunanlisisde
varianzaylasdiferenciasestadsticasentrelosfactoresy
suinteraccinfueronanalizadasconelprocedimiento
decomparacindemediasmediantelapruebaTukey,
conunnivelde0.05designificancia.
Evaluacin in vivo
Se adquirieron ocho bovinos, jvenes encastados con
pesopromediode195kgvivo,quefueronestabulados
individualmenteyalimentadosconforrajeverdepicado
ad libitum,duranteeltiempoquedurelexperimento.
Previoalafasedeexperimentacinseaplicunperio-
dodeadaptacindelosanimalesqueincluyaplicacin
devacunas(ntrax,PiernaNegrayEdemaMaligno)va
parenteral y desparasitante oral a base de Albendazole
(12mgkg
-1
).Paramantenerlibredegarrapatasalosbo-
vinosseaplicAmitrazmedianteaspersinendosisde
2mlL
-1
deagua,tressemanasantesdelexperimento.
Cmaras de tela sobre los bovinos
Para la siembra de larvas se elaboraron 32 cmaras
de tela de 20 centmetros de dimetro cada una, ad-
heridas con pegamento de contacto en las regiones
escapularyfosaparalumbarenambosflancosdelos
animales,numeradasdelunoalcuatro,iniciandopor
el lado izquierdo anterior, y en cuyo interior se llev
a cabo la siembra de las larvas de garrapata en fase
de vida libre (L
1
) que parasitaron al bovino husped,
desarrollndose hasta la fase de telegina o hembra
24
AGRO
PRODUCTIVIDAD
AGRO
PRODUCTIVIDAD
repleta.Entotalseefectuarondossiembrasconunintervalode48horas
enlascmarasinstaladassobrelosbovinos.Unavezyacolocadasenlos
bovinos,seinicielprocesodesiembraydesarrollodelaslarvasdega-
rrapatasdentrodelascmaras.Paratalefectoserealizarondossiembras,
agregando a cada cmara las larvas nacidas de dos teleoginas adultas,
cuyaproduccinpromedioseestimenalmenos1,700larvasporgarra-
pataadulta.Seefectuarondoseventosdesiembraconintervalosdetres
dasentres(Figura1).
Manejo del Hongo Metarhizium anisopliae
Para llevar a cabo las aplicaciones en la prueba de campo, previamente
seseleccionarondoscepasdelhongoM. anisopliae,lascualesmostraron
mejoresresultadosenlapruebain vitroyfueronsometidasaunprocesode
revigorizacinatravsderepetirfasesdemultiplicacinydesarrolloparala
aplicacinenlapruebain vivo.Launidadexperimentalfueconstituidapor
unacmaradeteladeformacircularde20centmetrosdedimetroadhe-
ridaalapieldelosternerosquesirvierondehuspedesparalasiembrade
nomenosde7,000larvasdegarrapatadelgneroBoophilusspp,coloca-
dasendossiembras.Lostratamientosfueronlasdoscepasdelhongoque
resultaronmsefectivasenlafasein vitro,untratamientotestigoabasede
ungarrapaticidayunplaceboconmateriainerte(T1=Amitraz,T2=Placebo,
T3=PLH,T4=CH93-3,respectivamente).
Diseo experimental y anlisis de datos
Se utiliz el diseo de bloques completamente al azar, con cuatro trata-
mientos y ocho repeticiones, con el modelo: Y
ij
=u+0
i
+0
i
(J
j
)+r
k
+0r
ijk
+_
ijk
;
donde:Y
ijk
=variablerespuesta.u=efectodelamediapoblacional.0
i
=efecto
del perodo de incubacin del hongo sobre la garrapata en su fase parsi-
ta. 0
i
(J
j
)=efecto anidado de los pe-
riodos de incubacin dentro de las
repeticiones.r
k
=efectodelascepas
evaluadas.0r
ik
=efectodelainterac-
cinentreelperiododeincubacin
ylascepas._
ijk
=errorexperimental
asociadoalasunidadesexperimen-
tales.Seefectuunconteodegarra-
patasalmomentodelaparecimien-
todelasprimerasteleologasprevio
a la aplicacin; posteriormente se
efectuaronconteosdiariosdegarra-
patas vivas y muertas por cmara/
tratamientodurante,24,48,72,96y
120horasconelfindeevaluarelpe-
riododeincubacindelhongoysu
efectoenlosdiferentesperiodos.Fi-
nalmenteseobtuvieronporcentajes
totales de garrapatas vivas y muer-
tasdecadatratamiento,transforma-
dosmedianteelarcosenodelaraz
cuadradadelaproporcin,yfueron
sometidos a un anlisis de varianza
y comparacin de medias (prueba
Tukey)a0.05designificancia.
Variables
Porcentaje de efectividad en la prueba in vitro
Se determin efectuando el con-
teo del total de larvas dentro de
cada unidad experimental y esta-
bleciendo el nmero de larvas de
garrapatadelgneroBoophilus que
mostraron infestacin del hongo
manifestado mediante crecimiento
demicelio,desarrollodeconidiosy
penetracindelacutcula;estocon
elapoyodeestereoscopioymicros-
copio.
Porcentaje de efectividad en la prueba
in vivo y de eficiencia
Se determin efectuando un con-
teo previo a la aplicacin de los
tratamientos y luego cada 24 ho-
ras por cinco das para establecer
el nmero de garrapatas adultas
muertas y vivas que an se hospe-
daban en cada cmara. El porcen-
taje de eficiencia de los productos
Figura 1.A:Aplicacindelarva(l1)deBophillusspp.,enbovinos.B:Ternerossometidos
alapruebaderespuestaanimal.C:Frascosconteniendol1deBophillus spp.,4000por
unidad.D:Huevosdelarva(l1)invadidosporelmiceliodeMetarhizium anisopliae.
A B
C D
25
AGRO
PRODUCTIVIDAD
obtenidos se determin usando
la frmula: PE=L1-L2/L1, don-
de: PE=Porcentaje de eficiencia.
L1=Nmerodegarrapatasantesde
laaplicacin.L2=Nmerodegarra-
patasvivaspostaplicacinporcada
lectura.
Caractersticas cualitativas
stas se determinaron median-
te pruebas documentales de los
efectos del hongo, principalmen-
te durante la esporulacin sobre la
garrapata.Paraverificarlainfeccin
delhongosobrelasgarrapatasenla
pruebain vivo seefectuunmues-
treo de 10 garrapatas muertas por
tratamiento, colocadas sobre c-
maras hmedas para establecer si
serealizabadesarrollodelmicelioy
posterioresporulacindelhongo,a
partirdelocualserealizaroncortes
histolgicos que identificaron los
daos ocasionados por el hongo
sobrelacutculadelagarrapata.
Porcentaje de efectividad
en la prueba in vitro
La prueba in vitro realizada para
determinar la efectividad del M.
anisopliae, en la L
1
de garrapatas
del gnero Boophilus spp, mostr
que los tratamientos tuvieron dife-
renciasaltamentesignificativasenla
efectividadparaelcontroldelarvas
delgarrapataenestadodevidalibre
(CV=8.82%).Elcomportamientode
losseistratamientosaplicadosenla
pruebain vitro ysuefectividadcon
respectoalosdosconteosllevados
acaboevidenciaronunincremento
lineal de larvas muertas infectadas
con respecto al incremento en el
periododeconteo,conporcentajes
de17.60%paralacepaproveniente
de la Unin, 19.10 para la cepa de
CENGICAA;5.50paralacepaAES-
GCy7.30paralacepaAESCHS,alas
96 horas post-aplicacin. La Figura
2 muestra la diferencia entre trata-
mientos y entre las cuatro cepas
sometidasalaprueba,delascuales
La Unin y CENGICAA fueron re-
levantes.
En un experimento llevado a cabo
para determinar la efectividad de
12 cepas de M. anisopliae sobre
hembrasrepletasdegarrapatasdel
gnero Boophilus spp., Guedes-
Frazon (2000) encontr que seis
de las cepas ocasionaron ente 20
y 50% de infeccin a las telegi-
nas,entreelcuartoyelsptimoda
post-aplicacin de una suspensin
de conidios a 10
6
y 10
5
conidios
ml
-1
. Moreno et al. (2001) evalua-
ron a M. anisopliae, B. bassiana y
Verticillium lecanii sobre teleogi-
nasdeBoophilus microplus,donde
M. anisoplie gener inhibicin de
87% a concentracin de 10
9
coni-
diosporas ml
-1
. Posada y Lecuona
(2009) evaluaron la efectividad de
259aisladosdeB. bassianaobteni-
dosdelsuelo,degarrapatasmuer-
tas y de coleccin fngica para el
control de B. microplus, registran-
doquelaCL50para98delosais-
ladosmsvirulentosfuede110
7
y
1,1510
7
conidiosml
-1
.Fernndez-
Ruvalcabaet al.(2005)evaluaronla
efectividadin vitro deM. anisopliae
a diferentes concentraciones en
cepas de B. microplus resistente y
sensible a organofosforados, ha-
llando que una concentracin de
10
8
esporasml
-1
genera100%de
mortalidad a los 20 das postinfec-
cin.Deigualmanera,huboreduc-
cindelosparmetrosreproducti-
vos con variacin en las diferentes
concentraciones(Cuadro1).
Porcentaje de efectividad
en la prueba in vivo
En la prueba in vivo realizada para
determinar la efectividad de M.
anisopliae en garrapatas del g-
nero Boophilus spp., en su fase
parsita sobre huspedes bovinos
estabulados, se observ que los
tratamientos mostraron diferen-
cias altamente significativas en la
efectividad(Cuadro2).Esdehacer
notarqueelefectoplacebonofue
laaplicacindedichotratamiento,
sinoporelefectoanimaldelibrar-
se de las garrapatas. Sin embargo,
el comportamiento de las cepas
del hongo M. anisopliae evaluadas
con respecto a su efectividad en
los diferentes conteos efectuados
post-aplicacin demostraron que
ambas aumentan de forma lineal,
hacindosemsnotorioapartirde
las 72 horas. Adems, se muestra
Figura 2. Garrapatas del gnero Boophilus spp. infectadas de Metarhizium anisopliae
(Metschinkoff)yenplenodesarrollodelafasedecolonizacin(produccindeconidios).
EfectodelashifasdehongoMetarhizium anisopliae,(Metschinkoff)sobrelacutculade
garrapatasadultas(cortehistolgicodelacutcula),CUNORI.
26
AGRO
PRODUCTIVIDAD
AGRO
PRODUCTIVIDAD
la interaccin existente entre las dos cepas de M.
anisopliae revigorizadasconrespectoalperiodopost-
aplicacin, evidenciando una efectividad creciente en
el tiempo, principalmente en la cepa proveniente de
CENGICAA. En un experimento llevado a cabo para
evaluarlaposibilidaddeincrementarlacapacidadinfec-
tivadedoscepasdeM. anisopliaesobrehembrasreple-
tasdegarrapatasBoophilus microplus,Guedez-Frazon
(2000)observquedespusdeinfectarartificialmente
teleginasyapartirdeellaselaborarelinculoparaun
segundo pasaje (proceso de revigorizacin), dos das
despusdelaaplicacinsepresentunporcentajede
efectividadde84%,contrastandocon1.8%obtenidode
lasmismascepasenlaprimeraaplicacin.Enlostraba-
josrealizadosenanimales,lasvariacionesenlaefecti-
vidad de las cepas se pueden relacionar directamente
con los factores climticos y el lugar de procedencia
delascepas,yaqueexistenalgunasquepresentanuna
mayortoleranciaaaltastemperaturayexposicinara-
yosUV(FernndezyBittencourt,2008;Biduchkaet al.,
2001),ascomoalmicroambientedelanimal,comola
temperaturadelapiel,yaquesehademostradoqueal
Cuadro 1.Anlisisdevarianzadelapruebain vitro paradeterminarlaefectividaddeseistratamientosenelcontroldeL
1
de
garrapatasdelgneroBoophilusspp.
Fuentede
variacin
Gradosde
libertad
Sumade
cuadrados
Cuadrado
medio
F
Calculada
Probabilidad Signicancia
Total 35 33251.108
Periodo(A) 1 813.17 813.17 134.0157 0.0003 **
Errora 4 24.280 6.070
Tratamiento(B) 5 31794.813 6358.963 1397.995 0.0000 **
AB 5 527.325 105.465 23.186 0.0000 **
Error 20 90.973 4.549
Fuente:elaboracinpropia.
incrementarselatemperaturaporencimade34C,la
germinacin del hongo empieza a reducirse (Polar et
al.,2008).
Porcentaje de eficiencia
Enfuncindelosresultadosseobserva
quelascepasLaUninyCENGICA-
A fueron las que mejor eficiencia
mostraronenlaevalua-
cin in vitro y a partir
de stos se selec-
cionaron para ser
evaluadas en la
pruebain vivo ode
campo. Los resulta-
dos mostrados en los
Cuadros3y4evidencian
el nivel de eficiencia de las
cepasLaUninyCENGICA-
A, con porcentajes de 45%
y 48% de lo registrado por el
testigoabasedeAmitraz.
Cuadro 2.Efectividaddecuatrotratamientosenelcontroldegarrapatas(Boophilusspp.),faseparsitaenbovinosestabulados.
FuentedeVariacin
Gradosde
Libertad
Sumade
cuadrados
Cuadrado
medio
FCalculada Probabilidad Signicancia
Total 159
Periodo(A) 4 7593.267 1898.317 49.979 0.0000 **
Periododebloques 35 1329.379 37.982
Tratamiento(B) 3 32771.646 10923.882 280.219 0.0000 **
AB 12 1190.086 99.174 2.544 0.0055 **
Error 105 4093.255 38.983
Fuente:deelaboracinpropia,CoeficientedeVariacin:17.37%.
27
AGRO
PRODUCTIVIDAD
Cuadro 3.Porcentajedeeficiencia(PE)deseistratamientosevaluadosin vitro,conbaseensumatoriadeconteos.
Indicador
Tratamientos
Amitraz Placebo LaUnin Cengicaa AESGS AESCHS
L1 9909.00 12299.00 13202.00 12164.00 16408.00 7763.00
L2 0.00 12175.00 11177.00 9886.00 15479.00 7163.00
PE 100 1.0082 15.3386 18.7274 5.6619 7.7290
Cuadro 4.Porcentajedeeficiencia(PE)decuatrotratamientosevaluadosin vivoconbaseensumatoria
deconteos.
Indicador
Tratamientos
Amitraz Placebo LaUnin Cengicaa
L1 107.00 192.00 145.00 155.00
L2 13.00 165.00 88.00 90.00
PE 87.8505 14.0625 39.3103 41.9355
Caractersticas cualitativas
En el efecto del M. anisopliae sobre la cutcula de la
garrapata se observ una invasin de las hifas pene-
trando las membranas, rompiendo la continuidad del
tejido;sinembargo,nosedebeolvidarelefectoenzi-
mticodelhongoqueatravsdeunahistlisisfavore-
celapenetracindelashifasyladegeneracinhialina,
queposiblementeseadetipoextracelularporlapreci-
pitacindeprotenasplasmticasdelosorganelosque
sehanescapadodelaparedcelulardelasgarrapatas,
ocurriendo la muerte por un proceso de consuncin
enlagarrapata.
CONCLUSIONES
Las cuatro
cepas del hongo M.
anisopliae evaluadas en
lapruebain vitro paraelcontroldegarrapatasenestado
de larva (L
1
) presentaron crecimiento de micelio sobre
larvas de garrapatas del gnero Boophilus spp. En
lapruebain vitroexistierondiferenciasaltamente
significativas entre las cuatro cepas del hongo
y el control qumico sobre la mortalidad
degarrapatasenestadodelarva(L
1
);las
cepas del hongo La Unin y CENGI-
CAAevaluadasin vitro fueronlasde
mayor mortalidad sobre garrapatas en
estado de larva (L
1
) y en la prueba in
vivo incrementaronsuefectividadenel
control de garrapatas del gnero Boophilus spp. en su
fase parsita, registrando hasta 50% de efectividad res-
pectoalmostradoporAmitraz.
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AGRO
PRODUCTIVIDAD
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AGRO
PRODUCTIVIDAD
29
AGRO
PRODUCTIVIDAD
PRODUCCINDEBeuaveria bassiana(Bals.)
Vuill.PARAELCONTROLDELABROCADELCAF
(Hypothenemus hampeiFerr.)
PRODUCTIONOFBeuaveria bassiana(Bals.)Vuill.FORCONTROL
OFCOFFEEBORER(Hypothenemus hampei Ferr.)
Daz-Vicente V.M.
1*
; Prez-Quintanilla J.N.
1
; Pinson-Rincn E.P.
1
; Magallanes-Cedeo R.
1
;
De Coss-Flores M.E.
1
; Cabrera-Alvarado M.E.
1
1
Facultad de Ciencias Agrcolas. Universidad Autnoma de Chiapas. Carretera costera Entronque
EstacinHuehuetn,Huehuetn,Chiapas.
*Autor responsable:vdiaz_vicente@hotmail.com.CuerpoAcadmicodeProteccinVegetal.
RESUMEN
Elhongoentomopatgeno(Beuaveria bassiana)infectaalabrocadelcaf(Hypothenemus hampei)encondicionesde
laboratorioycampo,sepuedepropagarmasivamenteusandocerealescomoarroz,trigoysalvadodetrigo,puespre-
sentanunaconcentracinmayorde110
10
conidiosporgramoyunapatogenicidadmayoral90%,porlocualcumplen
conlasnormasdecontroldecalidadparareproducirhongosentomopatgenosajustandoelpHdeaguaentre5.0y6.0.
Ladosisqueserequiereaplicarparaelcontroldelabrocaesde1.00kgha
-1
,iniciandolaaplicacinenelmesdemayo
paralascondicionesdelSoconusco,Chiapas,Mxico.
Palabras Clave:controlbiolgico,conidios,hongoentomopatgeno.
ABSTRACT
Theentomopathogenicfungus(Beuaveria bassiana)infectsthecoffeeborer(Hypothenemus hampei)underlaboratory
and field conditions; it can be massively propagated by using cereals such as rice, wheat and wheat bran, since they
presentaconcentrationhigherthan110
10
conidiapergramandpathogenicityhigherthan90%;therefore,theycomply
withthequalitycontrolregulationstoreproduceentomopathogenicfungi,adjustingthewaterpHtobetween5.0and
6.0.Thedosagerequiredtobeappliedforborercontrolis1.00kgha
-1
,andapplicationshouldbegininthemonthof
MayfortheconditionsofSoconusco,Chiapas,Mxico.
Key Words:biologicalcontrol,conidia,enthomopathogenicfungus.
30
AGRO
PRODUCTIVIDAD
AGRO
PRODUCTIVIDAD
ProduccindeBeuaveria bassiana (Bals.)Vuill.
INTRODUCCIN
En el estado
deChiapas,M-
xico, el cultivo
del cafeto (Coffea arabica) ocupa el primer lugar en
importancia, con una superficie cultivada de 230,134
hectreasyenlareginSoconusco,con70,000hect-
reas;esunaactividadsocioeconmicamuyimportan-
te por la cantidad de divisas que genera (Hernndez,
2000). Sin embargo, sta se ve amenazada por pro-
blemassanitarios,comoelataquederoyaanaranjada
delcafeto(Hemileia vastatrix Berk.et Br.)ylabrocadel
granodecaf(Hypothenemus hampei Ferr.);laprime-
ra est considerada como la enfermedad ms impor-
tantedelcultivoylasegundacomolaplagademayor
importancia. En la actualidad la broca se encuentra
distribuidaenlosestadosdeChiapas,Oaxaca,Puebla,
Veracruz,GuerreroyNayarit.Apartirdeladesaparicin
del Instituto Mexicano del Caf se crean los Conse-
josEstatalesdeCafenlosestadosproductores,pero
sedescuidelreaparasitolgicay,paraatenderesta
problemtica, en julio de 1993 se cre la Junta Local
de Sanidad Vegetal de Productores de Caf Chiapas
queatendatodoelestadodeChiapas;posteriormen-
te surgieron otras. Sin embargo, la primera, que fue
creada originalmente para atender todo el estado, se
concentrnicamenteenelSoconusco,lareginpro-
ductoradecafmsimportantedelestadoydelpas.
Dicho Organismo Auxiliar de Sanidad Vegetal opera
conrecursosdelGobiernoFederal,GobiernodelEsta-
doyconlaaportacindelosproductores.Dentrodela
Campaasurgendosalternativasdecontrol,elbiolgi-
codelabrocadelgranodecaf(H. hampei)mediante
lacraenreasruralesdelparasitoide(Cephalonomia
stephnoderis)deorigenafricano,introducidoaMxico
porelCentrodeInvestigacionesEcolgicadelSureste
(CIES),hoyColegiodelaFronteraSur(ECOSUR),ycon
el aislamiento y la propagacin masiva de una cepa
nativa del hongo (Beuaveria bassiana) (Daz, 1995; y
Barrera, 2000). En agosto de 1994 se crea el Labora-
torio de Produccin y Propagacin Masiva del hongo
B. bassiana yenelmesdeoctubrede1994seobtuvo
la primera produccin del hongo para aplicar en 155
hectreas,elcualfueaplicadoenelEjidoGuaquitepec,
municipio de Chiln, Chiapas. Posteriormente, estos
trabajos de investigacin continuaron en la Facultad
de Ciencias Agrcolas de la Universidad Autnoma de
Chiapas,dondeserealizarontrabajosencamposobre
dosis, efecto del pH del agua en la aplicacin (Daz,
1996:Dazet al.2006;yDazyRoblero,2007).
Los hongos entomopatgenos son aquellos que pue-
dencausaralteracionesfisiolgicasenlosinsectos,cau-
sndoleslamuerte.Lamayoradelasespeciesdeestos
hongosestnlimitadasprincipalmentealascondiciones
detemperaturayhumedadrelativaparasugerminacin
yesporulacin.Algunostienenungranrangodehospe-
dantesyatacanamuchasespecies;otrosestnrestrin-
gidosapocasounasolaespecie(DelaRosa,1995).La
mayoradeloshongosentomopatgenospertenecena
la clase Hyphomycetes (Deuteromycetes) (De la Rosa,
1995). La aplicacin de estos microorganismos para el
controldeplagasinsectilesllevaalabsquedadepat-
genoseficaces,desarrollodecultivoin vitro,bioensayos
yproduccinmasivaabajoscostos(DelaRosa,1995).
ParadarinicioalaproduccindeB. bassiana serealiz
unaislamientodeunacepanativadeestehongo,dado
queesmejortrabajarconestetipodecepasporqueya
estnadaptadasalmedioambientedelaregindonde
sonaisladas.Conbaseenloanteriorseevaluelefecto
del hongo entomopatgeno (Beauveria bassiana) en el
controldelabrocadelcaf(Hypothenemus hampei).
MATERIALES Y METODOS
Serealizaronmuestreosencampoenhuertascafetale-
rasdelmunicipiodeCacahoatn,Chiapasysecolecta-
ronfrutosdecaf(Coffea arabica)atacadosporbroca
delcaf(H. hampei),conlapresenciadeunhongode
aspecto algodonoso; la muestra colectada se aisl y
purific.SesiguieronlosPostuladosdeKoch,loscuales
fueron propuestos desde 1862 y tienen vigencia hasta
lafecha,paraelaislamientodelhongo,lainoculacin
de ste a organismos susceptibles y la recuperacin
del patgeno de los organismos inoculados. Posterior
a los bioensayos realizados en laboratorio (Postulados
deKoch),elhongosepropagmasivamente;paraello
se utilizaron cereales como sustratos: trigo (Triticum
aestivium), arroz (Oryza sativa), salvado de trigo, maz
(Zea mays) y sorgo (Sorghum bicolor), en la Facultad
de Ciencias Agrcolas de la Universidad Autnoma de
Chiapas. Con el producto aislado e incrementado en
forma masiva se realizaron aspersiones de cinco dife-
rentes dosis del hongo en campo: 0.20 kg
-1
, 0.40 kg
ha
-1
,0.60kgha
-1
,0.80kgha
-1
,1.00kgha
-1
yuntra-
tamientotestigosinaplicacinparadeterminarlame-
jordosisqueejercieracontroldelabroca;tambinse
evaluelpHdelagua(5.0.5.5,6.0,6.5y7.0)parahacer
lamezcladeaplicacin.Losexperimentosserealizaron
usandoundiseoexperimentalenbloquesalazar(Oli-
vares,1994).
31
AGRO
PRODUCTIVIDAD
fue ms alta en el trigo,
seguida de arroz y salva-
do de trigo (Cuadro 1),
trigo (6.06210
10
), arroz
(4.71610
10
), salvado de
trigo (3.7010
10
). En el
caso del maz y sorgo el
crecimiento fue nulo de-
bido a que estos granos
generan aflatoxinas que
evitan la germinacin de
B. bassiana (Best et al,.
1990; Johnson, 1991). In-
vestigaciones realizadas
por De La Rosa (1995)
muestran que este hongo es pa-
tgeno de la broca del caf H.
hampeiypuedecausarmortalidad
dehasta100%,dependiendodela
cantidaddeconidiosqueseutilice
(Figura2).
ElCuadro1muestraqueelporcen-
tajedepatogenicidaddeB. bassiana
fue mayor en el trigo, seguido del
arrozyelsalvadodetrigo,mientras
que en maz y sorgo crecieron los
hongos Aspergillus spp. y Penici-
llium spp. de ocurrencia tpica en
estos granos (Best et al., 1990; Jo-
hnson,1991).Laaplicacinencam-
po mostr que la mejor dosis fue
600gha
-1
aunaconcentracinde
Figura 2.Hembraadultadelabrocadelcafin-
fectada(Hypothenemus hampei)conB. bassiana
encondicionesdelaboratorio.
RESULTADOS Y
DISCUSIN
De las muestras colectadas en
campo se aisl el hongo entomo-
patgeno B. bassiana. Las caracte-
rsticas principales fueron el mice-
lio blanco, ligeramente coloreado
(blanco amarillento) y de aparien-
ciapolvosa,conidiforossimplese
irregularesagrupadosenunvertici-
liodondesesitanlosconidiosen
forma de zigzag; los conidios son
hialinos, redondeados sobre pe-
queos esterigmas (Barnet y Hun-
ter 1972). El hongo en un cultivo
puro present micelio de aspecto
algodonosodecolorblanco;elmi-
celio se ramific y form conidi-
forossimples.Lacantidaddeconi-
diosaumentconeltranscursodel
tiempo, de tal forma que despus
de 18 y 20 das la colonia mostr
una esporulacin abundante de
colorblanco-cremacontexturase-
mejantealtalco(Figura1).
Para la produccin masiva de B.
bassiana se utiliz el medio de
cultivo Sabouruad Dextrosa Agar
(SDA)y,posteriormente,ensustra-
todearroz,trigo,salvadodetrigo,
mazysorgo.Laconcentracinde
conidiosporgramodeB. bassiana
Figura 1. A: Frutos
de caf (Coffea
arabica)conlapre-
senciadelhongoB.
bassiana recolec-
tados en campo.
B: Cepa aislada de
B. bassiana de as-
pecto algodonoso.
C: Cepa de B. bas-
sianade20dasde
crecimiento con
aspecto semejante
altalco.
A
B
C
4.71610
10
, resaltando que al apli-
carB. BassianasedebeajustarelpH
delaguaanivelesdecidosaligera-
mentecidos(pH5y6)porrequeri-
mentospropiosdelhongo(Cuadro
2y3,Figura3).
De acuerdo con la biologa, ecolo-
ga de la broca y grado de madu-
rez del fruto es necesario conocer
la poca de aplicacin del hongo
(B. bassiana) para que tenga mejor
efectodecontroldeestaplaga,por
lo que es necesario realizar inves-
tigaciones por regin geogrfica.
Bajolascondicionesenqueserea-
liz la presente investigacin en la
reginSierradelestadodeChiapas,
lamejorpocadecontroldelabro-
cadelcafeselmesdejunio(Cua-
dro 4) porque present el menor
porcentaje de infestacin por (H.
hampei),pueslabrocaseencuentra
entrnsitoeinicialaperforacinde
los frutos y, como el hongo acta
porcontacto,elcontrolesmsefi-
ciente; una vez que la broca pene-
trcompletamenteelfruto,elcon-
trol es ms deficiente por la forma
deaccindelhongo.
CONCLUSIONES
El cereal ms eficiente para propa-
garelhongo(B. bassiana)enforma
masivafueeltrigo,yaquepresent
32
AGRO
PRODUCTIVIDAD
AGRO
PRODUCTIVIDAD
Cuadro 1. Comparacin de medias de la concentracin de conidios por gramo de B.
bassianayporcentajedepatogenicidad.
Tratamiento Concentracinconidios Patogenicidad(%)
Trigo 6.06210
10
a 96.00a
Arroz 4.71610
10
b 94.60b
Salvadodetrigo 3.7010
10
c 91.80c
Maz 0.00d 0.00d
Sorgo 0.00d 0.00d
PromediosconlamismaletrasonestadsticamenteigualessegnpruebadeTukeyao=0.05
deprobabilidad.
Cuadro 2.PorcentajedemortalidaddelabrocadelcafHypothenemus hampei Ferr.Con
diferentesdosisdelhongoBeauveria bassiana(Bals.)Vuill.encondicionesdecampo.
Tratamiento
Dasdespusdelaaplicacin
15 30 45 60
E1.00kgha
-1
52.32a 55.65a 38.37a 53.97a
D0.80kgha
-1
41.12a 52.07a 33.47a 40.05a
C0.60kgha
-1
34.05a 51.65a 32.17a 39.92a
B0.40kgha
-1
32.32ab 48.15a 29.80ab 34.35ab
A0.20kgha
-1
29.62ab 34.42ab 22.07ab 28.52ab
FTestigosinaplicacin 6.75b 7.55b 7.10b 6.90b
deprobabilidad.
Cuadro 3.EfectodelpHdelaguaenlamezcladeB. bassianasobrelamortalidaddelabroca
delcaf(H. hampei).
pH
Dasdespusdeaplicacin
15 30 45 60
5.0 60.00a 56.00a 53.00a 47.80a
5.5 57.50a 54.00a 54.00a 48.00a
6.0 54.00a 50.00a 56.00a 48.00a
6.5 38.00b 37.80b 38.00b 26.00b
7.0 26.80b 25.40c 28.40b 22.00b
Testigo 7.60c 6.40d 6.80c 6.60c
deprobabilidad.
Figura 3. Presencia del hongo B.
bassiana sobre H. hampei despus
de la aplicacin en condiciones de
campo.
mayorconcentracindeconidiospormililitroymayorviabilidad,patogeni-
cidad y pureza. El arroz tambin puede ser utilizado para propagar masiva-
menteelhongoB. bassiana,aligualqueelsalvadodetrigo.Elmazyelsorgo
nosonunaalternativaparapropagarestehongo.Ladosisaaplicarleesde
1.00kgha
-1
aunaconcentracinde4.7210
10
conidiosporgramo.Cuando
seaplica(B. bassiana)encampoes
necesarioutilizarunpHdelaguade
5.0a6.0.
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Daz V.V.M. 1995. Produccin masiva de
Beauveria bassiana para el control
33
AGRO
PRODUCTIVIDAD
Cuadro 4.Porcentajedeinfestacindelabrocadelcaf(H. hampei)cuandoelhongo(B.
bassiana)seaplicaendiferentespocas.
Tratamientos
15 30 45 60
Junio 9.00b 16.00b 19.70b 18.00b
Julio 16.00a 40.00a 50.50a 38.70a
Agosto 18.00a 20.00ab 20.00b 21.00b
Testigosinaplicacin 0.00c 0.00c 0.00c 0.00c
deprobabilidad.
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AGRO
PRODUCTIVIDAD
34
AGRO
PRODUCTIVIDAD
INFLUENCIADELFOTOPERIODOSOBRE
ALGUNOSPARMETROSDEMOGRFICOS
YCALIDADDELACOCHINILLA
(Dactylopius coccus)
INFLUENCEOFPHOTOPERIODONSOMEDEMOGRAPHICPARAMETERS
ANDQUALITYOFCOCHINEALINSECTS(Dactylopius coccus)
Mndez-Gallegos, S. de J.
1*
, L. A. Tarango-Armbula
1
, R. Magallanes-Quintar
2
,
A. Carnero-Hernndez
3
, F. Blanco-Macias
4
, y R. D. Valdez-Cepeda
4, 5
1
ColegiodePostgraduados,Campus SanLuisPotos.A.deIturbide#73.SalinasdeHgo.SanLuis
Potos.CP78600.MXICO.
2
UniversidadAutnomadeZacatecas,UnidadAcadmicadeIngeniera
Elctrica.Ave.RamnLpezVelarde801,Zacatecas,Zac.,CP98064.MXICO.
3
Departamentode
ProteccinVegetal.InstitutoCanariodeInvestigacionesAgrarias.38006.LaLaguna.ESPAA.
4
Uni-
versidadAutnomaChapingo,CentroRegionalUniversitarioCentro-Norte.CruzdelSurNm.100,
Col.Constelacin.ApartadoPostal196,ElOrito,Zacatecas,Zac.CP98085.MXICO.
5
Universidad
AutnomadeZacatecas,UnidadAcadmicadeMatemticas.CalzadaSolidaridads/n.Zacatecas,
Zac.C.P.98064.MXICO.
*Autor de correspondencia:jmendez@colpos.mx
RESUMEN
Paradeterminarlainfluenciadelfotoperiodoeneldesarrollo,reproduccinycontenidodecidocarmnicodelacochi-
nilla(Dactylopius coccus),seestablecieronencmarasclimticascohortesencladodiosdeOpuntia ficus-indica L.(Mill.),
lascualessesometieronacincoregmenesdefotoperiodo:0/24,8/16,10/14,12/12y24/0hdefotofase:escotofase,res-
pectivamente.Elfotoperiodoafectladuracindelciclobiolgicoocurriendomsrpidocuandolashorasdeobscu-
ridaddisminuyeron,perolosvaloresdesupervivenciaseredujeron.Elrgimencon14horasdeobscuridadproporcion
lasmejorescondicionesparaeldesarrolloyreproduccindeD. coccus.Losregmenesdefotoperiodoprobadosgene-
raronunbajoporcentajedecidocarmnico(12%),porloqueserequierenrealizarotrosestudiosparaverificarsiesla
cantidadycalidaddeluzlaqueinfluyesobrelapresenciadelcoloranteosobrelafisiologadelaplantahospedante.
Palabras clave:Supervivencia,reproduccin,colorantenatural,nopal.
ABSTRACT
To assess the influence of photoperiod on the development, reproduction and carminic acid content
ofcochinealinsects(Dactylopius coccus),cohortswereestablishedinclimaticchambersoncladodes
of Opuntia ficus-indica L. (Mill.); these were subjected to five photoperiod regimes: 0/24, 8/16, 10/14,
12/12 and 24/0 hours of photophase:scotophase, respectively. The photoperiod affected the duration of
the life cycle, which occurred faster when the hours of darkness decreased, although the survival values
were reduced. The regime with 14 hours of darkness provided the best conditions for the development
and reproduction of D. coccus. The photoperiod regimes tested generated a low percentage of
carminicacid(12%),sofurtherstudiesarerequiredtoverifyifitisthequantityandqualityoflight
thatinfluencesthepresenceofthedyeorthephysiologyofthehostplant.
Key words:Survival,reproduction,naturaldye,cactuspear
35
AGRO
PRODUCTIVIDAD
Calidaddelacochinilla
INTRODUCCIN
Por varios siglos
algunos insectos han sido
empleados para producir
ceras,lacasycolorantes;dentrodeesteltimogrupolacochinilla(Dactylo-
pius coccus)esfuentedepigmentonatural(LagowskayGolan,2009).Esta
especie contiene varias antraquinonas que incluyen como principal com-
puestoalcidocarmnico(CAS:1260-17-9;CI:75470)(Gonzlezet al.,2002),
el cual se emplea en la elaboracin de cosmticos, alimentos y productos
farmacuticos, as como en aplicaciones plsticas y textiles (Borges et al.,
2012).ElusodeestecolorantehasidoaprobadoenlaUninEuropeayen
EstadosUnidosdeAmrica,comoaditivoalimentario(Carmen,2007),dada
suinocuidad,altopodercoloranteyestabilidad.
A pesar de que Mxico fue uno de los principales productores de cochi-
nillaanivelmundial,suproduccindeclinysuexportacindesapareci.
Actualmente,suproduccinrespondealintersartesanalyconelapoyoy
esfuerzodediversasinstitucionespblicasyprivadas,sucultivoseimpulsa
nuevamente (Prez Sandi y Cuen y Becerra, 2001). Considerando que la
produccin de cochinilla a cielo abierto es limitada por factores biticos
y abiticos (Campos-Figueroa y Llanderal, 2003) se han diseado biof-
bricasparasucraintensiva,lascualessevalidanendiversasregionesdel
pas (Mndez-Gallegos, 2010). Histricamente, el comportamiento pobla-
cionaldelacochinillahaestadorelacionadoconelfotoperiodo.Entiem-
posprecolombinoslacochinillaeracriadausandodiversosmaterialespara
brindarsombraypromoveraslacolonizacinydesarrollodelinsecto.En
losperodosfrosseconservabaencuartosobscurosparaprotegeralpie
decra,esteprincipiosesigueempleando,particularmenteenelestadode
Oaxaca.AutorescomoFlores-FloresyTekelemburg(1995)yMontiel(1995)
hanestablecidoqueelfotoperiodoafectaladuracindelciclodedesarro-
llo del insecto y produccin; sin embargo, sus resultados al respecto son
contradictorios.Considerandoquelacraintensivadelacochinillatiendea
realizarseencondicionessemi-controladas,elobjetivodeesteestudiofue
conocerlasupervivenciayreproduccindeDactylopius coccusysucali-
dad,enfuncindelcontenidodecidocarmnicoendiversosregmenes
defotoperiodoencmarasclimticas.
MATERIALES Y MTODOS
Lainvestigacinsedesarrollencondicionesdecmaraclim-
tica, en el Instituto Canario de Investigaciones Agrarias, La La-
guna, Espaa (22 17 N y 16 50 O). Se emple el sistema de
craapencacortadasinsuministrodeaguaninutrimentos;las
condiciones de las cmaras fueron: temperatura 242C y hu-
medad relativa entre 60% y 70%. Para determinar la influencia
deladuracindiariadelafotofaseylaescotofasesobreelde-
sarrollodeD. coccus,secolocaroncrasdecochinillaencinco
regmenesdefotoperiodo:0/24,8/16,10/14,12/12,y24/0hde
fotofase/escotofase,respectivamente.Parasimularlascondicio-
nesnaturalesenlaszonasdecralailuminacin,ubicadaenla
parte superior de la celda, fue proporcionada por seis lmpa-
ras:tresdecoloracindiurnaytres
fluorescentes, las cuales emitieron
una radiacin de la zona espectral
del azul al rojo, asegurando as la
continuidad de los procesos bio-
lgicos. El hospedante para la cra
de la cochinilla fue Opuntia ficus-
indica (L.) Mill. cultivar amarillo. Se
utilizaroncuatrocladodiosdeentre
seisy10mesesdeedadparacada
rgimendefotoperiodo,sindaos
fisiolgicos evidentes o de plagas.
Todos los cladodios provinieron
de una sola planta, se lavaron con
aguacorrienteysecolocaronenel
contenedorparalacradelinsecto
donde complet su ciclo de desa-
rrollo(Figura1).
Elmaterialbiolgicoutilizadocomo
piedecrafueseleccionadodeen-
tre hembras adultas de D. coccus
prximas a ovipositar, provenientes
de una mezcla de varios cultivares;
stefuerevisadoparaevitarlaintro-
duccin de posibles antagonistas a
lascmarasclimticas.Parainiciarla
craconcohortesdelamismaedad
se introdujeron 2.5 g de hembras
prximas a parir en contenedores
deteladetulde412cm,ysefija-
ronaloscladodiosconunaespina
denopal,dondepermanecieronad-
heridosdurante48h.
Figura 1.Contenedoryacomododelosclado-
diosdenopal(O. ficus-indica(L.)Mill.).paralacra
deD. coccus.
36
AGRO
PRODUCTIVIDAD
AGRO
PRODUCTIVIDAD
Para determinar la influencia del
periododeluz/obscuridadsobrela
supervivencia (l
x
), cada cinco das
secontabilizaronlosindividuosso-
brevivientes en cada cladodio por
intervalodeedad.Asimismo,sede-
terminlarelacinhembra/macho
paracadargimendefotoperiodo.
Lafecundidaddelacochinilla(m
x
)
se estim con base en el nmero
deninfasyhuevosproducidospor
cada hembra adulta por da, de
una muestra de 10 hembras adul-
tas seleccionadas al azar en cada
rgimen (tratamiento) de fotope-
riodo.Enesteproceso,loshueve-
cillos y las cras recin emergidas
se cuantificaron dos veces al da
(8y20h)durantetodoelperiodo
de reproduccin. Con esta infor-
macin se calcul la fecundidad
total (huevos hembra
-1
), fecundi-
daddiaria(huevoshembra
-1
d
-1
)y
duracindelperiodoreproductivo
(d).ConbaseenMndez-Gallegos
et al. (2010) se obtuvieron la tasa
de supervivencia (l
x
) y de fecundi-
dad (m
x
), considerando los valo-
res de supervivencia y fecundidad
de cada poblacin, aplicando las
ecuaciones propuestas por Birch
(1948)yKrebs(1985).
Para determinar la diferencia esta-
dstica entre las curvas de supervi-
vencia de D. coccus se emple la
prueba de Log rank (o=0.01). Las
diferencias entre la tasa intrnse-
ca de incremento natural (r
m
) de
cadacohortesedeterminaroncon
la prueba de traslapo de intervalos
(o=0.05) (Vera y Sotres, 1991) me-
diante el programa SUFERTI pro-
puesto por Colunga y Vera (1991).
Para analizar las variables fecundi-
dad total, fecundidad diaria y du-
racin del periodo reproductivo,
el diseo experimental utilizado
fue completamente al azar, consi-
derando a los regmenes de foto-
periodo como tratamientos y las
hembras individuales como repe-
ticiones. En relacin con el conte-
nido de cido carmnico se utiliza-
ron los regmenes de fotoperiodo
comotratamientoscontresrepeti-
ciones.Enamboscasosseemple
el procedimiento ANOVA (SAS Ins-
titute, 2010) y las diferencias entre
medias fueron determinadas me-
diantelapruebadeTukey(p0.05).
Para determinar el contenido de
cido carmnico (AC) se optimiz
un protocolo para su extraccin y
determinacin(Cuadro1).Unavez
optimizado se tom una muestra
de hembras secas de cada cohor-
te, la cual se moli en un mortero
decermica;luegosetomaron125
mg de cada poblacin, se agrega-
ron30mLdecidoclorhdrico2N
ysehomogenizaronenunagitador
duranteunminuto.
ParalaextraccindelAClasmues-
tras se sometieron a bao mara a
70 C durante 35 minutos; poste-
riormente, se enfriaron y centrifu-
garon durante 15 minutos a 7000
rpm. Este proceso se repiti dos
vecesylossobrenadantessediluye-
ronen250mLdeaguadestilada.El
AC se determin a 494 nm en un
espectrofotmetro Shimadzu (Mo-
deloUV-160A)entresrepeticiones
para cada poblacin. Se construy
una curva de calibracin, midiendo
laabsorbanciadeunaseriedecon-
centracionesconocidasdeAC,yse
usunamuestradeHCL2Ncomo
blanco(Figura2).
Se determin una relacin directa
entre la colonizacin inicial de las
ninfas migrantes y el nmero de
horas de obscuridad. La densidad
Cuadro 1.ProtocoloparalacuantificacindelACdeD. coccus.
Factoresenestudio Nivel
Peso
(g)
Absor-
bancia
(nm)
AC
(mgkg
-1
)
AC
(%)
TemperaturaC
30 0,1256 0,702 45,40 9,0
50 0,1253 0,823 53,21 10,6
70 0,1250 1.004 64,88 13,0
80 0,1253 0,715 46,24 9,2
65 0,1250 0,959 61,98 12,4
75 0,1250 0,536 34,69 6,9
Tiempodeextraccin(min)
15 0,1259 0,634 41,01 8,1
25 0,1255 0,754 48,75 9,7
30 0,1255 0,834 53,92 10,7
35 0,1254 0,953 61,59 12,3
45 0,1250 0,753 47,34 9,5
60 0,1258 0,791 51,14 10,2
Dosisextractiva(mLdeHCl2N)
20 0,1255 0,750 48,50 9,7
30 0,1245 0,854 55,21 11,1
40 0,1250 0,748 48,37 9,7
Nmerodeextracciones 1 0,1253 1,132 73,14 14,6
Usandomezclador 2 0,1257 1,207 77,98 15,5
37
AGRO
PRODUCTIVIDAD
inicial de ninfas se increment de 719 en promedio
porcladodio,con12horasdeobscuridad,a1,167en
obscuridad total, por lo que se atribuy un compor-
tamiento fototctico negativo de la ninfa migrante
durante su establecimiento y fijacin en el cladodio.
Es posible que este comportamiento est ligado a la
ausenciadeunacubiertaprotectora(laca,cera,seda,
etctera) en esta primera fase de desarrollo, la cual
puede estar presente en otros coccoideos. Otras es-
peciescomoD. austrinus yD. opuntiaepresentanun
fototropismo negativo, dado que las ninfas se esta-
blecen en aquellos sitios donde no se presenta la in-
cidencia de luz directa (Moran et al., 1982; Moran y
Hoffman, 1987; Aldama-Aguilera y Llanderal-Czares,
2003). Por el contrario, para la misma especie, Mon-
tiel (1995) afirma que las ninfas se establecen en si-
tios bien iluminados, presentando fototaxia positiva.
Los resultados de este estudio, sugieren que durante
la infestacin se debe reducir la cantidad de luz para
proteger a las ninfas migrantes, favorecer su estable-
cimiento y promover la oviposicin; posteriormente
se recomienda moverlas a regmenes ms favorables
de luz a fin de evitar daos a la planta hospedante y
al insecto mismo. La velocidad de desarrollo de los
individuos criados en regmenes de luz continua fue
ms rpida. Por el contrario, cuando la cochinilla se
desarrollenobscuridadtotal,lavelocidadseredujoy
elciclosealarghastaen20d.Enaquellascohortes
desarrolladasa12,14y16hdeobscuridad,losciclos
de desarrollo fueron muy homogneos, completan-
doelcicloen75dpromedio.Lamayorsupervivencia
(31%) hasta el estado adulto se registr con 14 h de
obscuridad,disminuyendoa10%alincrementarlaa16
h; la poblacin desarrollada en obscuridad total pre-
sentunasupervivenciade15%.Encontraste,Montiel
(1995)observunasupervivenciamsaltaenhembras
deD. coccusa12h(41%)y16h(40%)deobscuridad
en O. ficus-indica. En D. opuntiae, el porcentaje de
supervivenciahasidohastade66%(Flores-Hernndez
et al.,2006).
Figura 2.Calibracinparalacuantificacindelcidocarmnico.
Figura 3.CurvasdesupervivenciadeD. coccuscriadasencincoregmenesdeobscuridad.
38
AGRO
PRODUCTIVIDAD
AGRO
PRODUCTIVIDAD
Cuandolacochinillasecraamayorcantidaddehoras
luz (12 h), nicamente 6% de los individuos iniciales al-
canza el estado adulto. Este comportamiento fue ms
evidente en la cohorte mantenida con luz continua, ya
quesolamente1%desupoblacininicialalcanzelesta-
doadulto(Figura3).LapruebadeLogrankmostrquela
curvadesupervivenciadelacohortedesarrolladabajoel
rgimende12hdeobscuridadfuediferentealrestode
lascurvasdesupervivenciadelaspoblacionesevaluadas
(X
2
=6.635; g.l.=1; o=0.01). Las diferencias significativas
de supervivencia fueron registradas entre las curvas de
14hdeobscuridadyladeluzcontinua,ascomoentre
las curvas de luz y obscuridad
constantes; sin embargo, entre
las curvas de supervivencia de
las poblaciones sometidas a 14
hy16hdeobscuridadnohubo
diferencias estadsticas. Un re-
sultado similar se registr con
las curvas de 14 h de obscuri-
dadconladeobscuridadtotaly
aqullasde16hdeobscuridady
deluzcontinua.
Las cohortes criadas a luz constante y a 12 h de obs-
curidadpresentaronunefectodeletreoensusupervi-
vencia.Apesardequeenlosotrosregmenesdefoto-
periodonoseencontraronvaloresaltosdesuperviven-
cia, stos permitieron el establecimiento y desarrollo
del insecto, aunque con un retraso en el desarrollo y
unadisminucindelapoblacindecochinilla.Eneste
sentido,seresaltaque,independientementedesulon-
gitud de onda, intensidad luminosa y duracin, la luz
puedetenerunafuncinimportanteeneldesarrollode
lacochinilla.Sinembargo,nosedetectsieslacanti-
dadolacalidaddelaradiacinlaquegeneraundetri-
mentosobreelinsecto,obien,laduracindiariadela
escotofase.Enestesentidoesposiblequeladuracin
diariadelaescotofasepuedeocasionardaosdirectos
eindirectosalhospedante,talescomolareduccinde
laactividadfotosinttica,sobretodosiseconsiderael
metabolismoCAMdelascactceas,lascualesrequie-
rennecesariamentedelaobscuridadparaelintercam-
biodeCO
2
(Nobel,1998).
Eliniciodelareproduccincon12hsepresentapro-
ximadamente a los 61 d, mientras que la reproduccin
delaspoblacionesdesarrolladasentre14y16hseregis-
tralos62d.Porelcontrario,
conelrgimendeobscuridad
completa la reproduccin se
retras hasta 8 d. En condi-
ciones de campo Rodrigo et
al. (2010) observaron que el
tiempo de desarrollo fue de
78 das; mientras que Montiel
(1995) registr una duracin
del ciclo de 84 d en los foto-
periodos de 12/12 y 8/16. Se
quecuandolacochinillaesso-
metidaaunprocesodeluzconstante,ocurreunefecto
pocofavorableparasudesarrollo,yaqueningnindivi-
duo alcanz la etapa reproductiva. El nmero total de
huevecillos producidos por hembra durante el periodo
de oviposicin vari de acuerdo con la duracin diaria
de obscuridad (Cuadro 2), registrando que el nmero
promediodedescendientesporhembrasedupliccon-
forme se alarg el periodo de obscuridad de 12 a 16 h
(69.566a13071.6individuos).Seesperaraqueaque-
llas hembras desarrolladas en condiciones de obscuri-
dadcompletapresentenbajafecundidad;sinembargo,
dicha poblacin present el segundo valor medio ms
Cuadro 2.EfectodeladuracindiariadeobscuridadsobrelafecundidaddeD. coccus(n=10).
Parmetros
Duracindiariadeobscuridad(h)*
12 14 16 24
**Fecundidadmediatotal
(huevos/hembraSE)
69.56b 112.961.3ab 130.372a 115.235a
Fecundidaddiaria(huevos/
hembras/dSE)
6.94b 10.64a 11.05.1a 9.81.9ab
Perodoreproductivo(dSE) 8.15.1a 10.23.5a 113.5a 11.72a
Proporcinsexual( / ) 0.71 0.74 0.76 0.83
*Noseincluyenlosdatosde24hluz.;**Filaconlamismaletranosondiferentesestadsticamente(=0.05).
39
AGRO
PRODUCTIVIDAD
alto de descendientes, pero esta-
dsticamenteigualalvalorobtenido
en16hdeobscuridad.Unarelacin
importante fue que la duracin del
periodoreproductivosealargcon-
forme se incrementaron las horas
deobscuridad,resultadoqueapoya
la recomendacin de proteger a la
hembra reproductiva mediante un
fotoperiodo ms largo para incre-
mentarsutasadefecundidad(Cua-
dro 2). La fecundidad media total y
la duracin del periodo reproducti-
vo fueron mayores a los consigna-
dos por Montiel (1995) a 12 h (38
individuos)y16h(48individuos)de
obscuridad, pero menores a los re-
gistrados por Mndez-Gallegos et
al.(2010)enelcultivarOfferde215
individuoshembra
-1
.
La Figura 4 indica que las hembras
desarrolladas a 16 h de obscuridad
obtuvieronelvalormsaltodehue-
vecillos, y que las mantenidas a 12
h de obscuridad registraron el ms
bajo; en tanto, las hembras pro-
venientes de 14 h de obscuridad y
obscuridad total presentaron valo-
res intermedios muy semejantes.
Seobservunacorrelacinpositiva
entreladimensindelahembra,la
duracindelperiodoreproductivoy
elnmerodehuevecillosovipositados.Lashembrasconunadimensinde
65mm(largoyancho)generaronenpromedio205individuoshembra
-1
,en
contrasteaquellashembrascuyatallafuede53mmprodujeronsolamente
73individuoshembra
-1
;estatendenciatambinlaregistraronMathengeet
al.(2009)enD. tomentosus.
Los valores de fecundidad fueron bajos, heterogneos y variaron segn la
duracindiariadelashorasdeobscuridad.Estastendenciaspodranatribuir-
se a la alta proporcin de hembras comparada con los machos presentes
entodoslosregmenesdefotoperiodoevaluados;laproporcinsexual( /
)oscilentre3.5:1a12hdeobscuridadhasta6:1enlosregmenesdeluz
yobscuridadcontinua.Larelacinhembra/machopudoevitarbajafertiliza-
cin,fecundacinparcial,fertilizacintardadelashembras,obien,quela
bajacantidaddeluzhabrainfluenciadounbajoniveldemovimientodelma-
cho.Losresultadossugierenquelavariacindeldacortoadalargoinfluye
enlareproduccindelacochinilla,enlafisiologadelaplantahospedante
y, por tanto, en la nutricin misma del insecto. La poblacin desarrollada
en14hdeobscuridadregistrelvalormsaltodelatasanetareproductiva
R
o
(hembra hembra
-1
generacin
-1
) y de la tasa intrnseca de incremento
naturalr
m
(hembrasd
-1
)(Cuadro2).Asimismo,seobservaquelapoblacin
mantenidaa14hdeobscuridadseincrement3.6vecesenunperiodode
66d,loqueindicaque,tericamente,dichapoblacinpodramultiplicarse
diariamenteun2%yduplicarsutamaoen35d.Latasaintrnsecadeincre-
mento natural (r
m
) de D. coccus entre poblaciones difiri estadsticamente
(Cuadro3).Elvalormsaltodelatasaintrnsecadeincrementonatural(r
m
)
de D. coccus (0.0193) se obtuvo cuando la cohorte se cri a 14 horas de
obscuridad(Cuadro3).Mndez-Gallegoset al.(2010)determinaronunvalor
superiorde0.0025hembrasdia
-1
encoloniasdeD. coccuscriadasenelcul-
tivarOffer.Esteparmetro,queconjuntatantolosvaloresdesupervivenciay
defecundidad,permitenprecisarsilapoblacinpuedeaumentaroreducirse
y, bajo esta condicin de obscuridad, la poblacin podra duplicarse en un
periodode36das,mientrasqueenelrgimende12deobscuridad,dupli-
carseletomara204das.
Figura 4.CurvasacumulativasdeoviposicindeD. coccus criadasencuatroregmenesdeobscuridad.
40
AGRO
PRODUCTIVIDAD
AGRO
PRODUCTIVIDAD
Noseregistrarondiferenciasestads-
ticas (F=0.49; g.l.=3,11; Pr>0.7011)
entre los porcentajes de cido car-
mnico(AC)delaspoblacioneseva-
luadas en las diferentes regmenes
de fotoperiodo. Asimismo, no se
observ una tendencia clara de la
duracindelashorasdeobscuridad
y el contenido de AC en las pobla-
ciones evaluadas; sin embargo, la
presencia del AC se ve favorecida
por la disminucin de las horas de
obscuridad, aunque no fue este el
caso para la poblacin mantenida
enobscuridadtotal,lacualpresen-
t un aumento muy ligero. El por-
centaje de AC en este estudio fue
enpromedio11.5%promedio,valor
inferior al registrado por Aldama-
Aguilera et al. (2005), Rodrguez et
al. (2005), Briseo-Garzn y Llan-
deral (2008), y no rene las carac-
tersticas de calidad que requiere
el mercado. El valor promedio ms
altoseobtuvoconlapoblacinde-
sarrollada con mayor cantidad de
luz (11.9%), lo que podra indicar su
importancia en la produccin de
AC. El bajo contenido de AC regis-
trado en este estudio pudo estar
relacionado a que la cochinilla fue
criada en ambiente confinado, con
cladodiosdesprendidosdelaplanta
madre (sin suministro adicional de
nutrimentosniagua)yprovenientes
de plantas sin manejo agronmico
previo(sinriegoysinfertilizacin).
CONCLUSIONES
Conelincrementodelashorasluz,
la duracin del ciclo de desarrollo
de D. coccus se reduce, pero su
mortalidadseincrementa.Losreg-
menes de 14 horas de obscuridad
y 10 horas de luz favorecen la su-
pervivencia y la fecundidad de D.
coccus.Elporcentajedecidocar-
mnico en todos los tratamientos
fuebajo,porloqueserecomienda
verificar si la cantidad y calidad de
Cuadro 3.ParmetrosdemogrficosdeD. coccuscriadaencuatroregmenesdefotoperiodo.
Obscuridad(h) Ro G r
m
l TD
12 1.251 64.99 0.0034
c
1.0034 203.9
14 3.612 66.47 0.0193
a
1.0195 35.91
16 3.25 66.39 0.0170
b
1.0179 40.77
24 1.843 72.08 0.0084
d
1.008 82.51
PruebadetraslapedeIntervalos(o=0.05).
luz desempean un rol determi-
nantesobreelinsecto,obien,enla
plantahospedante.
LITERATURA CITADA
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PRODUCTIVIDAD
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42
AGRO
PRODUCTIVIDAD
ELLINLOE(Bursera linanoe(LaLlave)
Rzedowski,Caldern&Medina),
ESPECIEMADERABLEAMENAZADA:
UNAESTRATEGIAPARASUCONSERVACIN
LINALOE(Bursera linanoe(LaLlave)RzedowskiCalderon&Medina),
THREATENEDSPECIESWITHTIMBERANDINDUSTRIALPOTENTIAL:
ASTRATEGYFORITSCONSERVATION
Arellano-Ostoa, G.
1
, Gonzlez-Bernal, S
2
. Arellano-Hernndez, G.
1*
1
PosgradoenRecursosGenticosyProductividadFruticultura,ColegiodePosgraduados,Campus
Montecillo,Km36.5carreteraMxico-Texcoco,TexcocoMxicoCP56230.
2
P.S.Ing.Agrcolaegr.
FESC-UNAM,Km.2.5delaCarreteraCuautitlnTeoloyucan,SanSebastinXhala,CuautitlnIzcalli,
Mxico.CP.54714.
*Autor responsable:arellano@colpos.mx
RESUMEN
Elrboldelinloe(Bursera linanoe (LaLlave)Rzedowski,Caldern&Medina),esunaespecieamenazada,debidoalaso-
breexplotacinquehasufridoenlosestadosmexicanosdePuebla,Guerrero,MorelosyOaxaca.Elusoprincipaleslafabri-
cacindelasartesanasdeOlinal,Guerrero,queutilizanseccionesdemaderanecrosadaojaspe,locualincrementasu
valorcomercialylasidentificacomoartesanasoriginalesdebidoasuaparienciayaroma.Tambinseobtieneaceiteesen-
cialporladestilacindelamaderayfrutosqueseutilizaenlasindustriasdeperfumerayfarmacutica.Estasactividades
implicanlaexplotacindelaspoblacionesnaturales quesehanrealizadosinconsiderarprogramasdemanejosustentable.
Enestetrabajosepresentaunaalternativaparalapropagacindellinloe,atravsdelenraizamientodeestacasderboles
adultosnativosseleccionadosdelacuencadelroBalsas,Mxico.Estatcnicapermitiracortoplazoestablecerviveros
enlaszonasruralesyenformamediataelestablecimientodeplantacionesparalaexplotacinsustentabledelaespecie.
Palabras clave:Estacas,enraizamiento,linalol,propagacin,Burceraceae.
ABSTRACT
The LINALOE tree (Bursera linanoe (La Llave) Rzedowski Calderon & Medina), is a species endangered because of over-
exploitation in the Mexican states of Puebla, Guerrero, Morelos and Oaxaca. Its main application is in the manufacture
of handicrafts in Olinal, Guerrero, where necrotic or jaspe wood sections are used, increasing their market value and
identifying them as original crafts due to their appearance and aroma. Essential oil is also obtained from distillation of
woodandfruits,anditisusedintheperfumeandpharmaceuticalindustries.Theseactivities
involvetheexploitationofnaturalpopulationsthathasbeenconductedwithoutregardto
sustainablemanagementprograms.Thisstudypresentsanalternativeforthepropagation
of linaloe tree, through rooting of cuttings of mature native trees selected in the river
Balsas basin, Mxico. This technique will allow establishing nurseries in rural areas in the
short-term,andinthemediatewayestablishingplantationsforthesustainableexploitation
ofthespecies.
Key words:cuttings,rooting,linaloe,propagation,Burceraceae.
43
AGRO
PRODUCTIVIDAD
Ellinaloe,especiemaderableamenazada
INTRODUCCIN
El gnero
Bursera agrupa a un centenar
de especies leosas distri-
buidas solo en el Continente
Americano. Su centro de di-
versidadselocalizaenMxico,
donde hasta la fecha se co-
nocen al menos 80 especies
que habitan en los bosques
tropicalesaaltitudesentre650
y 1800 m, situados principal-
menteenlacuencadelroBal-
sas(Rzedowskiet al.,2005).El
linloe(Bursera linanoe (LaLlave)Rzedowski,Caldern&
Medina)esunmiembroimportantedeestegrupoyge-
neralmentesetrataderbolesdetamaobajoamedio
(5a15m);seconsideracaractersticodecomunidades
maduras, ya que su presencia en los sitios perturbados
espocofrecuente.Esunaespeciedioica,muyresinosa,
con aroma agradable y penetrante. Presenta un tronco
dehasta60cmdedimetro,concortezagris-rojiza,no
exfoliante y con ramillas lignificadas rojizas oscuras. Su
floracinsepresentademayoaprincipiosdejulioyse
encuentra desprovisto de follaje durante los meses de
noviembreamayo(Figura1)(RzedowskiyKruse,1979).
El linloe se conoce mundialmente por el fino aroma
desuaceiteesencial;enMxicosehaexplotadodefor-
maintensivadesdeelsigloXIX,siendoFranciaeInglate-
rra los principales mercados para la madera y el aceite
esencial. Desde fines del siglo XIX y durante la primera
mitad del XX, en Mxico se destil el aceite que se ex-
portabaaEstadosUnidosdeAmricayEuropaparaser
utilizadaporlaindustriadelaperfumera.Sinembargo,
losinglesessellevaronpropgulosdeplantasmexicanas
deB. delpechianumalaIndiaparasucultivocomercial,
produciendoalafechacercade50toneladasdeaceite
alao,loqueleshapermitidoabastecerdelinalolalas
industrias especializadas en todo el mundo y desplazar
alaceiteprovenientedeMxico(Hussain,1993;Hersch-
Martnez,2005).Ademsdeloanterior,laespecieseusa
paraartesanasenlosestadosdePuebla,Guerrero,Mo-
relosyOaxaca,causandosobreexplotacin,sinunpro-
grama de sustentabilidad, por lo que la especie se ha
vistoamenazada(Figura2).
MATERIALES Y MTODOS
Estrategias de propagacin
Lapropagacinvegetativadeestaespecie,ascomode
otrasdelmismognero,seraimportanteyaquesuesta-
blecimientoensitiosperturbadosaceleraralasucesiny
ayudaraarestablecerlacomposicinyestructuradelas
comunidadesnaturales(Bradshaw,1987;Bonfil-Sonders
et al.,2007).Ellinloeesunaespecierecalcitrantepara
supropagacinporsemilla,dadoquenicamente10%
destasgerminan(Andrs-HernndezyEspinosa-Orga-
nista,2002)debidoaladurezadelascubiertasseminales
ysuimpermeabildadalaguayaloxgeno.Porotrolado,
en trabajos publicados sobre la propagacin vegetativa
de esta especie se ha mencionado un enraizamiento
Figura 1.Cortezagris-rojizadelinloe(Bursera linanoe)yfrutosdeunejemplardeChiautla,
Puebla,Mxico.
Figura 2.ArtesanasdeOlinal,GuerrerohechasdeBursera linanoe.
44
AGRO
PRODUCTIVIDAD
AGRO
PRODUCTIVIDAD
de entre 17% y 40%, utilizando material juvenil (Bonfil-
Sanderset al.,2007;Castellanos-CastroyBonfil-Sanders,
2010).Esimportanteconsiderarqueelprocesodefor-
macinderacesadventiciasenvariasespeciesleosas
esafectadoporlavariacingentica,elestadoontoge-
ntico del tejido, caractersticas fisiolgicas del brote y
los tratamientos que se aplican a las estacas despus
dequesoncortadas(Bonga,1982),ademsdequelas
diferencias en la respuesta entre materiales del mismo
genotiposepuedeatribuira:cambiosfisiolgicosaes-
cala hormonal, edad ontognica del propgulo y fac-
tores ambientales como temperatura, humedad, luz y
nutricin mineral (Marks et al., 1998; Howard, 1996). Al
parecer,losnivelesdeauxinalimitanelenraizamientoen
muchasespeciesconsideradasdifciles,demodoquese
requiere una aplicacin exgena para contrarrestar los
bajos niveles y favorecer el enraizamiento (De Klerk et
al.,1999).
Seleccin de individuos nativos
Seseleccionencampoyrecolectelmaterialvegeta-
tivoderbolesnativosdelinloe(Bursera linanoe)enlas
localidadesdeChiautla,Puebla,Olinal,enelestadode
Guerrero,ylaTigra,Morelos(Figura3).Larecolectafue
llevadaacabodurantelascuatropocasdelao(invier-
no,otoo,primaverayverano)paraevaluarelpotencial
deenraizamientoin vivo.Seuselhbitodecrecimien-
to como parmetro para seleccionar a los rboles que
podranserutilizadosparalaproduccindemadera(h-
bito erecto) y de aceite (hbito ramificado). Adems se
considerelsexodelosindividuosparaelmismofin,es
decir,individuosmachosparausopotencialmaderablee
individuoshembraparausoindustrial(Cuadro1).
Seobtuvieronestacasprocedentesdelapartebasal(Rb)
ydelacopa(C)delmismorbol(Ballesteret al.,1999;
Vidal et al., 2003) (Figura 4). Las estacas se recolecta-
ron durante los meses de octubre-noviembre (otoo),
diciembre-febrero (invierno), marzo-mayo (primavera)
y julio-agosto (verano) para determinar la mejor poca
deenraizamiento.Enlamayoradeloscasoslalongitud
final de las estacas fue de entre 15 cm a 20 cm, con
presenciaonodehojas,segnlapocadeevaluacin.
Cuadro 1.Caractersticasdelosrbolesdelinloe(Bursera linanoe)
seleccionadosenlaCuencadelRoBalsas,Mxicoparapropaga-
cinasexual.
Clon Procedencia Hbito/sexo Uso
CP1 Puebla
Ramicado/
macho
Maderable
JCP Puebla
Ramicado/
hembra
Industrial
2CP Puebla Erecto/macho Maderable
OEAL1 Guerrero
Ramicado/
hembra
Industrial
OEAL2 Guerrero
Ramicado/
hembra
Industrial
OEJ Morelos Ramicado Industrial
Figura 3.Individuosseleccionadosdelinloe(Bursera linanoe)recolectadosenlocalidadesde:A:Guerrero,B:Morelos,C:OaxacayD:Puebla.
B A
C
D
45
AGRO
PRODUCTIVIDAD
Encadapocadelaoserealizarondosexperimentos
independientes. Se evalu la aplicacin del producto
comercialRadix
10,000(i.a.cidoindol-3-butrico(AIB)
10,000ppm)yparaconformarlostratamientos(T0-T4)
elp.c.sediluycontalcoal0%,10%,20%,40%y80%.Se
evalulaaplicacinanivelreactivodeAIByelcidonaf-
taln actico (ANA) en concentraciones de 10,000 mg
kg
-1
;elRAIZONE*PLUS(i.a.3%AIBy0.06%Alfanaftila-
cetamida)enpolvo;lamezclalquidade5,000mgkg
-1
ANA+5,000mgkg
-1
AIByeltestigosinhormonas.Para
cadaclonorbolseleccionadoseusaronentre20y35
estacas por tratamiento, segn la cantidad de material
disponibleporindividuo.
Enlapreparacindelasestacasseretirarondosterceras
partes de las hojas, (verano); posteriormente se realiz
un corte transversal en la base de la estaca en la parte
inferiordondeseubicaraunayema,yuncorteinclinado
porarribadeotrayemaenlapartesuperior.Lasestacas
setrataronconunasolucinde2gL
-1
delfungicidaa
basedebenomilopor30minutos.Posteriormenteseles
aplic el tratamiento con el enraizador a la concentra-
cinindicada,enformadepolvoolquido(Figura5,6).
Lasestacasseestablecieronenunacmaradeenraiza-
miento bajo condiciones de invernadero, manteniendo
lahumedadrelativacercanaa100%conlaayudadeun
sistema de nebulizacin intermitente y la temperatura
del sustrato a 28 C, por medio de resistencias elctri-
cas.Latemperaturamediadelaireenlacmarafuede
25Cylamnimade18C.Seutilizunamezclabase
desustratode2:1v/vpeatmossyagrolita,lacualnore-
quiereesterilizacin.Despusde60dasseevaluaronlas
siguientesvariablesportratamientoyporpocadelao:
Porcentaje de enraizamiento (% ER), nmero de races
porestaca(NR),longitudradical(LR),porcentajedeesta-
casvivassinenraizar(EV),porcentajedeestacasmuertas
(EM),porcentajedeestacasconcallo(%Callo)ynmero
de estacas brotadas con y sin raz (PB). Cada siete das
serealizaronaplicacionesdefungicidasybactericidasa
lasestacas,exceptoenlaspocasdondenohabaho-
jas.Conrelacinalossustratos,seusaronmaterialesdel
lugar de origen de la especie y otros comerciales para
produccindeplantasenvivero.
RESULTADOS
Efecto de la concentracin de Radix
(verano)
Elporcentajemximodeenraizamientoobtenido(27%)
fue muy bajo, comparado con los valores registrados
en otras especies del gnero Bursera spp., lo que de-
muestraqueellinloeesunaespeciededifcilenraiza-
miento.Bonfil-Sanderset al.(2007)encontraronqueel
rangoenlaformacindecallofuedeentre40%y100%
ensieteespeciesdeBursera,mientrasqueelderaces
oscilentre18%y70%.Estadificultadseagravacuando
Diseo utilizado para la
propagacin de linaloe
rbolesdediferentes
edadesdelinaloe
Renuevosbasales Ramasdelacopa
Cultivos in vitro con ALTA
capacidadmorfogentica
CultivosinvitroconBAJA
capacidadmorfogentica
Ciclodemultiplicacin
Induccindelenraizamiento
Anlisisbioqumico Anlisismolecular
Anlisismorfolgico
---
+++
G
r
a
d
i
e
n
t
e
d
e
j
u
v
e
n
i
l
i
d
a
d
Copa
Renuevos
basales
Figura 4.Modeloexperimentalutilizadoparalaclonacinderbolesdelinloe(Bursera linanoe)seleccionadosparapropagacinasexual.
ModificadodeBallesteret al.(1999).
46
AGRO
PRODUCTIVIDAD
AGRO
PRODUCTIVIDAD
separtedematerialadultoquepro-
cededereasrurales,porloquees
necesario el diseo de estrategias
adecuadas de propagacin para
obtenerindividuosconcalidadque
recibanunmantenimientocorrecto
dentrodeunprogramademanejo
deviveros.LaFigura7muestraque
las estacas con hojas colectadas
enelverano,delosrbolesnativos
seleccionados en Puebla, tuvieron
unenraizamientodiferente.Elclon
CP1ensumodalidad(Rb),esdecir,
con caractersticas juveniles, fue el
queobtuvoelmayorporcentajede
enrizamiento(27%)conelproducto
Radix
10,000 diluido al 80%. Con

esta concentracin, el mismo ma-
terialCP1ensumodalidad(C),que
present caractersticas adultas,
tuvo un enraizamiento ligeramen-
te mayor (14%) al resto de los clo-
nes evaluados (JCP y 2CP). Estos
resultados sugieren que el linloe
presenta variabilidad gentica para
la capacidad de enraizamiento, re-
sultados que fueron constatados
cuando se evaluaron individuos
Figura 5.Secuenciadelapreparacindeestacasdelinloe(Bursera linanoe)conenraizadorenpolvo:A,B,C:Enraizamiento
eninvernadero,Montecillo,Texcoco,EstadodeMxico.D,E,F:EnraizamientoenViveroenOlinal,Guerrero.
A B C
D E F
Figura 6.Preparacindelasestacasconhojasdelinloe(Bursera linanoe).A:Enraizadorlquido,B:Enraizadorenpolvo,C:
Condicionesdenebulizacin.
A B C
procedentes de los estados de
GuerreroyMorelos.
Cabeindicarquelasestacasdeto-
dos los clones evaluados que sir-
vieron como testigo no formaron
races adventicias, lo que puso de
manifiesto que el uso de las auxi-
nas es imprescindible para inducir
la formacin de races. Se observ
tambinquesinlaaplicacindeau-
xinaoenraizadorseprodujomayor
porcentaje de callo en la base de
lasestacasdelosclonesevaluados.
47
AGRO
PRODUCTIVIDAD
Algunos autores mencionan que la formacin de callo
podrasuponerqueexisteunmayorpotencialparaobte-
nerxitoeneldesarrollodelasraces(Bonfil-Sanderset
al.,2007);sinembargo,enesteestudioseobservque
entodoslosclonesevaluadossepresentaltoporcen-
tajedecalloelcual,aundespusde60das,noculmin
coneldesarrolloderaces(Figura8,9).Estosresultados
estn en lnea con lo mencionado por Hartmann et al.
(1990)yVidalet al.(2003)enelsentidodequelaforma-
cindecalloenmuchoscasosnoconllevaalaforma-
cinderaces,obien,soneventosantagnicos.
Sepudoobservarqueenlaspocasdeotooeinvierno
nohuboenraizamiento;portalmotivo,setomladeci-
sindeevaluarnuevamentelapocadeverano,lacual
s haba presentado un efecto positivo en la formacin
deracesenlosrbolescolectadosenChiautla,Puebla.
Paraesteestudiosecolectaronmuestrasderbolesse-
leccionadosenlaregindeIxcamilpa,PueblayOlinal,
Guerrero y fueron sometidos a tratamientos con enrai-
zador,aplicadostantoenformadepolvocomolquida.
Efecto del tipo de enraizador en forma lquida (verano)
La Figura 10 muestra que existi un comportamiento
diferencial entre clones en la respuesta al enraizamien-
to. Los clones tuvieron su mejor respuesta con Radix
10,000(OEJ1con33%)yANA10,000ppmparaOEAL1
(25%)yOEAL2(21%).Sinembargo,elclonOEAL1enrai-
z con todos los tratamientos probados, excepto con
eltestigo.Lostratamientosquemejorrespondieronala
formacin de races fueron el Radix
10,000 en polvo
sindiluirylaaplicacinlquidadeANA10,000mgkg
-1
.
Figura 7.EstacasenraizadasdeBursera linanoe durantelapocadeveranocondiferentesdilucionesdelenraizadorRadix
10,000.T0=
Testigo;T1=10%;T2=20%;T3=40%yT4=80%.A:Porcentajedeenraizamiento(PE)y(B)nmeropromedioderacesporestaca,delos
clonesevaluadosdelinloecolectadosenChiautla,Puebla.
A B
Figura 8. Estacas
enraizadas de linloe
(Bursera linanoe) en
pocadeveranocon
Radix
10000al80%.
A: Estaca juvenil con
tres races, despus
de 10 semanas de
iniciado el proceso.
B, C, D: Estacas en-
raizadas derivadas de
lacopadelclonCP1.
E: Estaca que form
una raz muy dbil y
F: Estaca que gener
solocallo.
A B C
D E F
48
AGRO
PRODUCTIVIDAD
AGRO
PRODUCTIVIDAD
Figura 9. EvaluacindeenraizamientoenelclonCP1cdelin-
loe(Bursera linanoe),mostrandolarelacininversaentre(%ER)
yproduccindecallo(%Callo).Seusarondiferentesdiluciones
deRadix10000.T0=Testigo;T1=10%;T2=20%;T3=40%y
T4=80%.
Eltratamientotestigosinaplicacindeauxinanologr
generar races. Estos datos coinciden con aquellas es-
peciesqueenrazancondificultad,lascualesrequieren
deuntratamientoconalgnproductoquecontribuyaa
mejorarelporcentajedeestacasenraizadasylacalidad
del sistema radical formado. Hatmann y Kester (1988)
mencionanquealtratarlasestacasconsustanciasregu-
ladorasdecrecimiento(fitohormonas)deltipoauxnico
aumentaelnmerodelasqueformanracesyseacelera
suiniciacin,ascomoelnmero,lacalidadylaunifor-
midaddelenraizamiento.
La aplicacin lquida de ANA a una concentracin de
10,000 ppm (T3) se us en los clones OEJ1, OEAL1 y
OEAL2, practicando un anillado en la base de las es-
tacas antes de la aplicacin de la auxina. Los resulta-
dosindicaronquelaformadeaplicacindelaauxina
puedeserunfactorimportanteenlarespuestaalen-
raizamiento ya que las estacas que fueron anilladas y
tratadas posteriormente con el regulador lquido pre-
sentaron un incremento significativo en la respuesta,
logrando46%deenraizamientoconcincoyseisraces
porestacadebuenacalidad(TratamientoOEAL1y2)
(Figura11).
A B
C
Figura 10.RespuestadelasestacasenraizadasdetresclonesdeBursera linanoe colectadosdurantelapocadeveranoenOlinal,Guerrero.
(T1)=Radix
polvo10000al100%;(T2)=cidoindol-3-butrico(AIB)10,000mgkg
-1
formalquida;(T3)=cidonaftalnactico(ANA)10,000
mgkg
-1
formalquida;(T4)=RaizonePlusenpolvo;(T5)=Combinacinlquidade5,000ppmANA+5,000mgkg
-1
AIBy(T0)=Testigo.
49
AGRO
PRODUCTIVIDAD
Ellargotiemporequeridoparaalenraizamientoesotracaractersticadeesta
especie,yaqueentodoslosensayosseobservqueserequieredeunpe-
riodo de ocho a diez semanas para la formacin de races adventicias. Un
datorelevantefueelefectomarcadodelatemporadadelaoenlaquese
colectaronlasmuestras.Apesardetratarsedeunaespeciecaducifolia,en
elcasodellinloelapocadereposonofueadecuadaparainducirelenrai-
zamientoenningunodelosrbolesevaluados.Elcomportamientodeesta
especieesmsparecidoalqueguardanlasperennifoliasdehojaancha,las
cualestienenunoomsperiodosdecrecimientoduranteelao;sepueden
obtenerestacasenlaspocasrelacionadascondichosperiodos(finalesde
primavera y verano). Se podra incrementar el xito de enraizamiento si las
estacassetomandespusdequesehacompletadounciclodecrecimiento
ylamaderaestparcialmentemadura,loquepuedeocurrirdeprimaveraa
finesdeverano.Seregistrquelabrotacindelasestacasnoesunavariable
confiableparaevaluarelenraizamientodelaespecie,yaquehuboalgunas
brotadasdespusdedosmesesdeaplicadoslostratamientosconauxinas;
sin embargo, 80% de las estacas no presentaron races adventicias, pero s
calloabundante.Estopodraatribuirsealaacumulacindereservasquetie-
ne la estaca al momento de la recolecta y al alto contenido de aceite en
tallosyhojas.Probablementeestasustanciaseuseparaobtenerlaenerga
necesariaquepermitalasupervivenciadelasestacasporlargotiempoenel
sustrato,sinlaemisinderaces(Figura12).
Castellanos-Castro y Bonfil-Sanders
(2010) mencionan que estacas de
unclonjuvenildeCuicatln,Oaxaca
recolectadasamediadosdeprima-
vera,cuandoelrbolanpermane-
casinhojas,sedejaronorearduran-
te15dasalambienteencondicio-
nesdesombray,posteriormente,se
colocaronenunatinaconenraiza-
dor en solucin durante 48 horas.
Despus de ese tiempo las estacas
semantuvieronenaguamsfungi-
cida durante dos meses. El resulta-
dofueelenraizamientode60%de
lasestacascon3-5racesporestaca
apartirdelasextasemana,atribuido
al estado juvenil del rbol donante.
Lacondicinsanitariaesotrofactor
importante que debe considerarse,
sobre todo cuando el material pro-
vienedesitiosnaturalesnoperturba-
dos,yaquelapresenciadepatge-
nosnosloreduceelporcentajede
enraizamiento, sino tambin el n-
mero de races que podran formar
lasestacas.Elmantenimientodelas
condicionesambientalesduranteel
proceso de enraizamiento es muy
importante, sobre todo en las po-
cas donde las estacas tienen hojas.
Esesencialquestasmantengansu
turgenciayquetenganunpotencial
de agua elevado, ya que represen-
tan un fuerte estmulo para la for-
macinderacesporlaproduccin
de carbohidratos y auxinas. Por el
contrario,laprdidadeaguapuede
reducirlaturgenciadelasestacasa
un nivel tan bajo que provoque la
muerte antes de formar races. Es
recomendable mantener saturada
laatmosfera(100%H.R.)durantelas
primerascuatrosemanasdelproce-
so, disminuyendo gradualmente la
humedadenlassiguientesdoshas-
ta75%.Lastemperaturasregistradas
enlacmaraduranteelprocesode
enraizamientooscilaronentre21C
y25Ceneldayde15Ca18C
porlanoche.Elcalordefondotuvo
Figura 11.A:PorcentajedeenraizamientodeestacasdelosclonesdeBursera linanoetra-
tadasconANA10,000ppmenformalquidacolectadosenveranoenOlinal,Guerrero.B:
Elanilladodelaestacaincrementelporcentajedeenraizamientoyelnmeroderaces.
C:Estacasenraizadasyestablecidasenmaceta.
A
B C
50
AGRO
PRODUCTIVIDAD
AGRO
PRODUCTIVIDAD
comoobjetivoquelastemperaturaselevadasenelam-
biente tendieran a estimular el desarrollo de las yemas
vegetativasconanticipacinalinicioydesarrollodelas
racesadventicias,porloquesemantuvoen27Cdu-
rantelasprimerascuatrosemanasdelproceso.
Efecto del dimetro de las estacas
En relacin con la mezcla de sustrato, la realizada a
partirdetierradellugarmstierradevegaderoyare-
na, en proporcin de 1:1:1 v/v, provoc un ambiente
negativoparalaestacayaque,dependiendodelahu-
medad,stapuedetenerciertadurezaydificultarlaai-
reacinyeldrenaje,mientrasquelacomercialdepeat
moss,tezontleyagrolitaenproporcin1:1:1v/vfuela
que mejores resultados ofreci para el enraizamiento
yelmantenimientodehumedadyaireacinduranteel
proceso.Independientementedeltipoydelaconcen-
tracin del enraizador y sustrato, las estacas con di-
metrosmenoresa2cmpresentaronmenorporcentaje
de races, mientras que aqullas con dimetros entre
3-4cmfueronlasquemejorrespondieronalenraiza-
miento.
CONCLUSIONES
Elrboldelinloepresentavariabilidadenlacapacidad
deenraizamientoyrequiereuntratamientoconauxinas
paralograrlo.Laspocasdeprimaverayveranosonlas
ms propicias para inducir el enraizamiento y cuando
setratederbolesadultossedebeutilizarmaterialcon
caractersticasjuveniles.Laconcentracinptimadeau-
xinaparaenraizamientooscilaentre8,000y10,000mg
kg
-1
.Sepuedenestablecerviverosenlascomunidades
ruralesdelaselvabajacaducifoliaparaestablecerplanta-
cionescomercialesenlosestadosdePuebla,Guerrero,
OaxacayMorelos,Mxico.
Figura 12. Estacas de Bursera
linanoe con emisin de hojas
despus de 10-12 semanas del
tratamientoconauxinas,sinfor-
macinderacesadventicias.
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PRODUCTIVIDAD
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AGRO
PRODUCTIVIDAD
52
AGRO
PRODUCTIVIDAD
PROTOZOARIOSCILIADOSDELRUMEN,
SUCULTIVOin vitroYPLANTASCON
CAPACIDADDESFAUNANTE
CILIATEDRUMENPROTOZOA,THEIRin vitro CULTURE,
ANDPLANTSWITHDEFAUNINGCAPACITY
Ley de Coss, A.
1*
, Aguirre-Medina, J.F.
1
, Marroqun-Agreda, F.J.
1
,
Toledo-Toledo, E.
1
, Aguilar-Fuentes, J.
2
, Guerra-Medina, E.
3
1
CuerpoAcadmicoenProductividaddeAgroecosistemasTropicales,FacultaddeCienciasAgrco-
las,CampusIVy
2
CentroMesoamericanodeEstudiosenSaludPblicayDesastres,UniversidadAu-
tnomadeChiapas,Chiapas,Mxico.
3
DepartamentodeProduccinAgrcola,CentroUniversitario
delSur,UniversidaddeGuadalajara,Jalisco,Mxico.
*Autor responsable:aleycoss@gmail.com
RESUMEN
Conelfindetenerunmtodoparaevaluarlacapacidaddesfaunante(CD)deloscompuestosqumicospresentesenlas
plantasmultipropsito,sehaevaluadolafactibilidadylaefectividaddeusarmediosdecultivoin vitro enriquecidoscon
minerales,vitamnicasyfuentesdeprotena,dosismnimasdeantibiticosycomonicafuentedeenergaelextractode
diferentesplantas(Avena sativa,Manihot esculenta,Musa spp.,Oryza sativa,Triticum aestivum yDactylis glomerata).Enla
mayoradelostrabajos,elextractodelasplantasevaluadassloredujeronlacantidaddeprotozoarios(amenosde10
2
mL
-1
demedio),mientrasqueotrasplantastuvieronunefectodesfaunantetotal,perountercergrupodeplantas,incluso
conmayorcontenidoyvariedaddecompuestosqumicospresentes,nopresentaronefectoalgunosobrelosprotozoarios
del rumen; por tanto las plantas evaluadas tienen diferencias en la CD durante los periodos de
evaluacin.EstaCDenmuchoscasosfueohasidoatribuidaalapresenciadecompuestos
secundariosconposibleefectotxicosobrelosprotozoariosciliadosdelrumen;sinhasta
elmomentoestohayasidoratificado.
Palabras clave:silvopastoril,plantastxicas,taninos,saponinas,microorganismos.
ABSTRACT
With the goal of having a method to evaluate the defauning capacity (DC) of the
chemicalcompoundspresentinmultipurposeplants,thefeasibilityandeffectiveness
ofusingin vitro mediumsenrichedwithminerals,vitaminsandproteinsourceshas
been evaluated, as well as minimum doses of antibiotics and extracts from different
plants (Avena sativa, Manihot esculenta, Musa spp., Oryza sativa, Triticum aestivum
y Dactylis glomerata) as the single source of energy. In most studies, the plant extracts
assessedonlyreducedtheamountofprotozoa(tolessthan10
2
mL
-1
medium),whileother
plants had a total defauning effect, yet a third group of plants did not present any effect on the
rumenprotozoa,evenwithhighercontentandvarietyofchemicalcompoundspresent;therefore,theplantsevaluatedhave
differencesintheDCduringtheperiodsofevaluation.ThisDCinmanycaseswasorhasbeenattributedtothepresenceof
secondarycompoundswithpossibletoxiceffectontheciliatedrumenprotozoa,althoughthishasnotbeenratifieduntilnow.
Keywords:forestgrazing,toxicplants,tannins,saponins,microorganisms.
53
AGRO
PRODUCTIVIDAD
Protozoariosciliados
INTRODUCCIN
La alimentacin de los rumiantes en las regiones tropi-
calessebasaprincipalmenteenelconsumodeespecies
forrajerascomosuprincipalfuentedeenergayprotena;
sinembargo,dadoelbajocontenidoenergticoyprotei-
co,ademsdelabajatasayextensindeladegradacin
deestasespeciesvegetales(Leng,1990),generalmente
ocasionabajoconsumovoluntario,desequilibrioenlos
nutrientes aportados y, por consiguiente, reduccin en
losindicadoresproductivosdelhato.Bajoestosesque-
mas de produccin se ha reportado que existe un ma-
yoraporteymejoraenelcocientedeprotena-energa
cuando se reduce la poblacin o se elimina a los pro-
tozoariosciliados(Dazet al.,1994).Apesardequelos
protozoarioscontribuyenenladegradacindelafibray
elaportedemayorcontenidoenergticoparaelanimal,
existe un proceso conocido como secuestro de pro-
tozoariosqueimpidesusalidaderumeny,conello,se
reducesuaportenutrimentalhaciaelanimal(Hsuet al.,
1991).
Caractersticas generales del rumiante
Losrumiantespertenecenaungrupodeanimalesque
tienen un tubo digestivo con cuatro compartimentos
(rumen,retculo,omasoyabomaso)quepermiteapro-
vecharalimentosconaltocontenidodefibra(FDN,ce-
lulosa,hemi-celulosaylignina).Estaadaptacinhaper-
mitidoalrumianteutilizardistintasfuentesdealimentos
(forrajes) no aprovechable para otros animales no ru-
miantescomoloscerdosylasavesy,adems,generar
bienesparaelhombre,comocarneyleche.Elrumenes
un compartimento donde el alimento es degradado y
fermentadohasta80%porlaaccindeenzimasmicro-
bianas. El contenido ruminal contiene, adems de par-
tculas de alimento, un gran nmero de bacterias (10
10
a 10
12
mL
-1
), protozoarios ciliados (10
6
mL
-1
), proto-
zoariosflagelados(10
2
mL
-1
)yhongosanaerobios(10
3
mL
-1
);algunasdesuspropiedadesson:altopotencialde
oxido-reduccin(-250a-450vM),unpHde5.3a7.2,
adems de una concentracin, segn el tipo y la can-
tidad de alimento consumido de gases disueltos, tales
comobixidodecarbono,metano,nitrgeno,oxgeno,
hidrgeno, de amoniaco, de bicarbonato, y de cidos
grasos voltiles (AGV; actico, propinico y butrico),
ademsdecidosorgnicos(lctico,succnico)(Cobos,
2007).
Protozoarios ciliados del rumen
A estos microorganismos se les atribuyen diversas fun-
ciones, como regular la poblacin bacteriana, la con-
centracin de amonio, el pH, volumen y tasa de dilu-
cinruminal(Jouanyet al.,1988);sinembargo,pueden
causarefectosnegativosporaltaingestindebacterias
ruminalesyporserretenidosdentrodelrumen(secues-
tro); lo que disminuye la disponibilidad de nutrimentos
paraelanimal.SegnBirdet al.(1979),slo30%delos
ciliadosquehabitanelrumenllegananiveldelduodeno
yconsueliminacin(desfaunacin)sepodraincremen-
tar el aporte de nutrientes, principalmente protena de
mayorvalorbiolgicoporpartedeestosmicroorganis-
mos (Eugene et al., 2004). Lo anterior ha permitido la
bsquedadeestrategiasparadesfaunaralosrumiantes
y con ello contribuir a esclarecer la importancia o no,
de la fauna, en el ecosistema ruminal (Ley de Coss et
al.,2011a,2011b).Sehanevaluadomuchastcnicas(in
vitroein vivo);sinembargo,noexisteunaqueseaeficaz
yclaraparadesfaunarrumiantesyquepermitaadems,
evaluareldesempeodestosenlaproductividadani-
mal(ChaudharyySrivastava,1995).Msbien,losresulta-
dosobtenidoshancontribuidoaaumentarlacontrover-
siaqueexisterespectoalasmejorasenladegradacin
delamateriaseca(MS)ylaorgnica(MO;VanNevelet
al.,1993),enladigestibilidadaparentedelafibra(Birdet
al.,1994)yenladegradacindelalmidn(Mendozaet
al.,1993).Paraesclarecerlafuncindelosprotozoarios
enelrumen,sepresentaunarevisindetrabajosdein-
vestigacinrelacionadosconelcultivoylasobrevivencia
fueradelambienteruminalparaconoceralgunosreque-
rimientosnutricionalesyfactoresdecrecimientoesen-
cialesparasucultivo.
MATERIALES Y MTODOS
Cultivo in vitro de protozoarios y efecto desfaunante
Sehanusadocomofuentedenutrimentoslasharinas
deyuca(Manihot esculenta),pltano(Musaspp.),arroz
(Oryza sativa)(Coleman,1981;Dehority,2003)pajade
avena(Avena sativa)(Chandramoniet al.,2002)ypaja
y gluten de trigo (Triticum aestivum) (especfico para
Epidinium ecaudatum;MichaOwskiet al.,2001),heno
deOrchard(Dactylis glomerata)(Leeet al.,2000)yal-
midn de A. sativa (Ley de Coss et al., 2011a, 2011b),
mslaadicinde20000UIdepenicilinay25mgdees-
treptomicina para mantener contralada una poblacin
de10
8
bacteriasmL
-1
demedio(FondevilayDehority,
2001); esto ha permitido mantener un pH estable de
6.80.2ylasobrevivenciadeprotozoariosciliados.Se
realizaronpruebasenmediosdecultivo,usandolatc-
nicaanaerbicadescritaporHungate(1950),yelmedio
evaluado(Cuadro1)permitimantenerentre7.510
3
y
54
AGRO
PRODUCTIVIDAD
AGRO
PRODUCTIVIDAD
1.2210
4
protozoarios por mililitro con una viabilidad
de 88 a 90% durante ms de 72 h; adems, el medio
de cultivo no fue especfico, ya que se identificaron
protozoarios de las rdenes Entodiniomorfida (Ento-
dinium spp.) (Figura 1 A) y Tricostomatida (Holotricos
spp.) (Figura 1B), lo que contrasta con los reportes de
Fondevila y Dehority (2001), quienes indicaron mayor
presencia en los medios de cultivo de ciliados del g-
neroEntodiniumspp.AutorescomoDeLen(2012)re-
gistraronunapoblacinde2.2410
4
protozoariospor
mililitrodemediodecultivo,similaralosvaloresregis-
tradosenelCuadro1,usandocomofuentedeenerga
alaplantatropicalParmentiera edulis.
Elcultivoin vitrohanpermitidoevaluarlacapacidaddes-
faunante(CD)delextractosolubledeplantasforrajeras
y no forrajeras que existen en las regiones del trpico
secoyhmedodeMxicoyotrospases.Dediferentes
resultados publicados se infiere que existen diferencias
estadsticasenlasconcentracionesdeprotozoariosen-
trelasplantasyportiemposdeincubacin(Figura2).Por
ejemplo,elextractodeDatura inoxiatuvounanulaCD,
manteniendounacantidadpor72hde1.6110
4
proto-
zoariospormL
-1
demedio,valorsimilaraltestigo,segui-
dadelextractodeBuddleia cordata,lacualsloredujola
poblacindeprotozoariosalfinalizareltratamiento(72
h),mientrasqueVerbesina perymenioides tuvoelmismo
efectoalas48hdeincubacin;sinembargo,losextrac-
tosdeChenopodium ambrosioides,Marrubium vulgare
yMentha piperita redujeronlacantidaddeprotozoarios
desdelas24h,pero24hmstardeeliminarontotalmen-
teaestosmicroorganismosencomparacinconelres-
todelostratamientos.Alrespecto,sereportqueelex-
tractosolubledeV. perymenioides,Montanoa leucanta
Cuadro 1.Composicindelmediocultivoanaerobioconextracto
deA. sativa.
Compuesto
Cantidadpara
100mL
-1
demedio
Aguadestilada,mL 47.42
Lquidoruminalclaricado
(1)
,mL 30.0
SolucinmineralI
(2)
,mL 5.0
SolucinmineralII
(3)
,mL 5.0
Carbonatodesodio,solucin8%
(4)
,mL 5.0
Acetatodesodio,1.5%
(5)
,mL 5.0
Solucinsuldo-cistena
(6)
,mL 2.0
Solucinrezarsurinaal0.1%
(7)
,mL 0.1
Tripticasa-peptona,g 0.20
Extractodelevadura,g 0.10
Fuentedeenerga(plantatropical),mL 0.20
(1)Lquidoruminalclarificado,previamentefiltradoenunagasatri-
pleycentrifugadoa17664gdurante15mina4C,esterilizado20
minutosa15psi,121C;(2)Conteniendo(por1000mL)6gdeK
2
H-
PO
4
;(3)Conteniendo(por1000mL)6gdeKH
2
PO
4
;6g(NH
4
)
2
SO
4
;
12gNaCl;2,45gMgSO
4
y1,6gdeCaCl
2
*
H
2
O;(4)8gdecarbonato
desodioen100mLdeaguadestilada;(5)1,5gdeacetatodesodio
en100mLdeaguadestilada;(6)2,5gdeLcistena(disueltaen15
mLde2NNaOH)+2,5gdeNa
2
S-9H
2
O(en100mLdeH
2
O);(7)0,1
mLderesazurinaenunvolumenfinalde100mL.
y B. cordata tuvieron un efecto sobre la concentracin
deprotozoariosporlapresenciadetaninos,saponinas,
entreotroscompuestosenlasplantasevaluadas.
Plantas forrajeras desfaunantes
Se han reportado compuestos qumicos secundarios
en plantas arbustivas multipropsito (lea, forraje y
Figura 1.ProtozoariosciliadosdelrumendelaordenEntodiniomorfida.A:ProtozoariosdelasrdenesEntodiniomorfida(Entodinium
spp.).B:Tricostomatida(Holotricos spp.).
A B
55
AGRO
PRODUCTIVIDAD
medicinal), con propiedades toxi-
cas contra los protozoarios, aun-
que en la mayora de los casos
con poca eficacia y sin datos que
afirmen dicho efecto (Navas-Ca-
machoet al.,1994;Newboldet al.,
1997).Portanto,laCDdelosagen-
tes qumicos reportados en la lite-
raturahasidopuestosenduda(Ley
de Coss et al., 2011a; 2011b). Me-
tabolitos secundarios tales como,
alcaloides, saponinas, taninos,
aminocidos no protenicos, mi-
cotoxinas, terpenoides, esteroides,
lecitinas, inhibidores de proteasas
y fenoles son producidos por las
plantas como un mecanismo de
defensa contra otras plantas, ani-
males, insectos depredadores e
infecciones microbianas (DMello,
1992; Newbold et al., 1997; Daz
et al., 1994) y compuestos an-
logos de la tirosina (mimosina) y
los productos de su degradacin
(3,4 dihidroxipiridina) que estn en
Leucaena leucocephala, Mimosa
pdica yPittosporum ondulatum,y
la 3,4 dihidroxifenilalanina (DOPA),
presenteenVicia faba,Mucunaspp
yStizolobium deeringianum(ahora
Mucuna aterrima), se ha identifica-
doquetienenunefectotxicopara
el animal, pero no para los proto-
zoariosciliados.Mientrastanto,los
efectos de estos compuestos pro-
ducencambiosenelmetabolismo
ruminal con aumentos en la con-
centracindecidosgrasosvolti-
les(AGV)yreduccinenamoniaco
(Domnguez, 1993; Navas-Cama-
cho et al., 2001). El efecto desfau-
nantehasidoatribuidoalapresen-
cia de: saponinas para Sapindus
saponaria y Medicago sativa, tani-
noscondensadosparaB. cordatay
V. perymenioide, y glucsidos cia-
nognicosenB. cordata,aunquela
CD del extracto de ciertas plantas
han mostrado efecto variable; en
otras se ha reportado eliminacin
o disminucin en la poblacin de
protozoariosdelrumen(Thi,1998;
McSweeneyet al.,1999;Dazet al.,
1994).Loscompuestosantihelmn-
ticos, como la antitripanosoma y
la amebicida, identificados como
monoterpentenos (ascaridole) y
aceites esenciales con efecto des-
faunante,hanidentificadoenalgu-
nasplantascomoC. ambrosioides.
Enlamenta(M. piperita),plantasin
efectodesfaunante(LeydeCosset
al.,2011a),identificaronmsde100
compuestos qumicos con efec-
to bactericida, fungicida, antiviral
y vermfugo, adems de mentol,
mentona, metil-esteres y mono-
terpentenos (puleguna, piperitona,
mentofurano y jasmona) (Schmel-
zeryGurib-Fakin,2008).Porloan-
terior, es poco confiable asegurar
quelaCDestrelacionadaconlos
compuestos qumicos presentes,
ya que se ha reportado la presen-
ciadestosenlasplantasquehan
eliminado protozoarios, como B.
cordata y V. perymenioides, y en
aquellas donde no hay tal efecto,
comoD. inoxia.Enestastresltimas
plantas se han reportado diversos
compuestos qumicos; por ejem-
plo, en B. cordata los que tienen
capacidad analgsica, diurtica y
antisptica(Ortiz,1996;Schmelzer
y Gurib-Fakin, 2008), bactericida y
amebicida (Ordaz, 1996), mientras
queenD. anoxia sehanidentifica-
do compuestos con efectos alu-
cingenos, adems de sustancias
con efecto desparasitante, princi-
palmente contra amibas (Bonde,
2001), compuestos como atropi-
na, daturina, hiosciamina, hiosci-
na, escopolamina (Janthangvith et
al., 2000), alta concentracin de
alcaloides (cido cafenico, cloro-
gnico, para-cumrico y ferlico),
adems de esteroles (campesterol,
daturalactonayestigmasterolilla)y
triterpenosencantidadesde0.5%a
1.1%(ChaudharyySrivastava,1995).
En Argemone mexicana, que es
unaplantatxicaparaelganado,se
encuentran alcaloides que atacan
el sistema nervioso central, tales
comoberbecina,protopina,proto-
pinahidroclorina, sanguinarina y
dihydro-sanguinarina (Schmelzer y
Gurib-Fakin, 2010). Tambin se ha
observado que la fraccin soluble
en agua de Yucca schidigera con-
tiene una alto contenido de sapo-
ninas,resveratrol(3,4,5trihidroxistil-
beno),fenoles,3,3,5,5,tetrahidroxi-
4-metoxitilbeno y yucaols A y C
(Sen et al., 1998). En un estudio in
vitro, con el extracto de saponina
provenientedeestaplanta,usando
dosis de 0.5 mg mL
-1
, la cantidad
de protozoarios fue reducida drs-
ticamente,aunquenoselogruna
eliminacintotaldelafaunadelru-
men(Wanget al.,1988).
Otro grupo de plantas evaluadas
como A. mexicana, B. vaccinioides
Figura 2. Proto-
zoarios en fase re-
productiva (fisin
binaria)enunmedio
decultivoin vitro.
56
AGRO
PRODUCTIVIDAD
AGRO
PRODUCTIVIDAD
e Y. schidigera presentaron CD, mientras que Hibiscus
rosa-sinesis y M. alba mantuvieron una cantidad similar
a la observada en el tratamiento testigo (1.2210
4
pro-
tozoarios mL
-1
). Se ha reportado que los extractos de
B. vaccinioidesyM. leucantatienenCDdesdelas24h
de incubacin en medios de cultivo in vitro (Dehority,
2003).Porloanterior,msquelapresenciademltiples
compuestossecundariostxicos,sepodrasugerirque
es la concentracin lo que estara afectando la pobla-
cin de protozoarios, aunque tambin se ha reportado
queenlaspoblacionesenrumenseadaptanymetabo-
lizan compuestos secundarios presentes en las plantas
forrajeras(Thi,1998;McSweeneyet al.,1999).
Otras tcnicas de desfaunacin
Enlabsquedadetcnicasparadesfaunarrumiantesse
hanevaluadodistintosmtodos,comoelretirodelcon-
tenido ruminal y posterior lavado con cido actico o
lctico(Klitaet al.,1996),olaadicindediocilsulfatode
sodio(jabones)(Chandramoniet al.,2002);enlamayo-
ra de los casos han ocasionado problemas en la salud
omuertedelosanimales(Lovelocket al.,1982),sinlle-
garaeliminaroreducirsignificativamentelacantidadde
protozoarios (Osdemir et al., 2006), otro agente qumi-
coantiprotozoarioconunaaltaCDfueelSecnidazol
,
conunaefectividadde100%enmenosde24h(Leyde
Coss,2003).Laefectividadparadesfaunarhasidovaria-
ble; otras tcnicas han sido el aislamiento desde el na-
cimientodelbecerro(Abou-Akkadaet al.,1968),adicin
deperxidodecalcioalrumen(Demeyer,1982),obien,
aceitesminerales(NewboldyChamberlain,1988),pero
sinefectoalgunosobrelapoblacindeprotozoarios.
CONCLUSIONES
Esposiblemantenerunapoblacindeprotozoariosvia-
blessuperiora10
3
durante72henunmediodecultivo
anaerobio. Los resultados obtenidos bajo condiciones
experimentalespermitensugerirquelasplantasevalua-
das tienen diferente capacidad desfaunante y que sta
podranoestardirectamenterelacionadaconeltipode
metabolito, sino con la concentracin de estos com-
puestos. La CD de las plantas podra estar tambin re-
lacionada con factores nutritivos ya que, por ejemplo,
la degradacin de la materia seca (DMS) result afec-
tada principalmente por la cantidad de fibra en la dieta
yelporcentajedeprotenacruda(PC).Enestecasose
encontr que a mayor cantidad de PC se aument la
DMS(r
2
=0.53;p<0.01);porelcontrario,amayorcanti-
dad de fibra se tuvo una disminucin en la DMS (r
2
=-
0.54; p<0.01); en este sentido, un bajo contenido de
nutrientes y/o baja degradacin puede afectar la su-
pervivencia de los protozoarios, sin que esto indique la
presenciadeuncompuestotxico.Deacuerdoconlos
resultadosrevisados,sepuedeconsiderarquelasplantas
multipropsitoconactividaddesfaunantepuedentener
unoovariosmetabolitostxicosqueafectenalospro-
tozoarios; por ello, se sugiere que la tcnica de cultivo
in vitro de protozoarios debera mantener poblaciones
porarribade10
4
microorganismospormL
-1
demedio
yhacerpruebascualitativasodeidentificacindelode
loscompuestostxicosinvolucrados.Esrecomendable
continuarestudiandoelefectosobrelaspoblacionesmi-
crobianas(protozoarios,hongosybacterias)delrumeny
loscompuestossecundariospresentesenlasfracciones
solubleeinsolubledeplantasforrajeras.
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58
AGRO
PRODUCTIVIDAD
ELHONGOVerticillium hemileiaeBouriquet,
ALTERNATIVAPARAELCONTROLDELAROYA
DELCAFETO(Hemileia vastatrixBerket Br.)
THEFUNGUS(Verticillium hemileiaeBouriquet),ALTERNATIVEFOR
THECONTROLOFCOFFEERUST(Hemileia vastatrix Berket Br.)
Daz-Vicente V.M.
1*
; Pinzn-Rincn E.P.
1
; Prez-Quintanilla J.N.
1
;
Cabrera-Alvarado M.E.
1
; Magallanes-Cedeo R.
1
; De Coss-Flores M.E.
1
1
Facultad de Ciencias Agrcolas. Universidad Autnoma de Chiapas. Carretera Costera Entronque
EstacinHuehuetn,Huehuetn,Chiapas.
*Autor responsable:vdiaz_vicente@hotmail.com.CuerpoAcadmicodeProteccinVegetal.
RESUMEN
SeaislelhongoVerticillium hemileiaeBouriquetasociadoapstulasdelaroyadelcafeto(Hemileia vastatrix)enmuestras
colectadasenelmunicipiodeCacaohatan,Chiapas,Mxico.EnelaislamientocrecinicamenteV. hemileiae,yaqueen
elcasodeH. vastatrixcomoparsitoobligadonosedesarrollaenmediodecultivo.Serealizarontrabajosenlaboratorio
yvivero,usandoundiseoexperimentalcompletamentealazar,yencampoconunadistribucinenbloquesalazar.El
mejormediodecultivoparapropagar(V. hemileiae)fueSabouruadDextrosaAgarmsextractodemalta;seobservuna
germinacinde90%conunaconcentracinde2.5710
5
conidiosmL
-1
.ElpHdelmediofuede5.5,conelcualpresent
germinacinde91.8%,patogenicidadde92.2%yconcentracinde2.5610
5
conidiosmL
-1
.Elmejorsustratoparapro-
pagarenformamasivaaV. hemileiaefueelsalvadodetrigo,enelcualseregistrconcentracinde2.3110
5
conidios
mL
-1
,viabilidadde90.96%,crecimientode66.2%ypatogenicidadde91.1%.Alaplicarenplantasencondicionesdevivero
ycampo,lamayorinfeccinynmerodepstulassepresenteneltestigosinaplicacin.
Palabras clave:Uredosporas,parsitoobligado,virulencia,patogenicidad.
ABSTRACT
The fungus (Verticillium hemileiae Bouriquet) associated with pustules of coffee rust (Hemileia vastatrix) was isolated of
samplescollectedinthemunicipalityofCacahoatn,Chiapas,Mxico.Intheisolationgrewonly(V. hemileiae),sincein
thecaseof(H. vastatrix)asobligateparasitedoesnotdevelopinculturemedium.Workwascarriedoutinlaboratoryand
nursery,usingacompletelyrandomizedexperimentaldesign,andinfieldwitharandomizedblockdistribution.Thebest
culture medium to propagate (V. hemileiae) was Sabouruad Dextrose Agar plus malt extract, spore germination of 90%
wasobservedataconcentrationof2.5710
5
conidiapermilliliter.ThemediumpHwas5.5withwhichpresented91.8%
germination,pathogenicity92.2%andaconcentrationof2.5610
5
conidiapermilliliter.Thebestsubstratetopropagate
massively(V. hemileiae)waswheatbran,whichrecordedconcentrationof2.3110
5
conidiapermilliliter,viabilityof90.96%,
growthof66.2%,pathogenicity91.1%;andapplyingplantsinnurseryandfieldconditionsthelargestnumberofpustulesand
infectionoccurredinthecontrolwithoutapplication.
Key words:Uredospores,obligateparasite,virulence,pathogenicity.
59
AGRO
PRODUCTIVIDAD
ElhongoVerticillium hemileiae
INTRODUCCIN
El cafeto
(Coffea arabica)esuncultivo
de importancia econmica
mundial, debido a que genera gran cantidad de divisas
paralospasesproductores.Brasileselprimerproductor
delmundo.Mxicoocupaelquintolugarenlaproduc-
cinmundialy,juntoconlacaadeazcar(Saccharum
officinarum), representa el cultivo de mayor relevancia
socioeconmica. Su cultivo involucra regiones de 12
estados de Mxico en una superficie aproximada de
665,837ha
-1
;elestadodeChiapaseselprimerproduc-
tor con una superficie de 230,134 ha
-1
, sobresaliendo
laregindelSoconusco(costadeChiapas)con70,000
ha
-1
.Delasuperficiecultivadaconcaf,84%correspon-
deapequeosproductoresquecuentanconunprome-
diodetreshectreasqueaportan29%delaproduccin.
Elcultivoesunafuentedetrabajoparacercade282,593
productoresquegeneranmsde300,000empleosru-
ralesyasalariadosenactividadesdelcultivo,talescomo
podas,controldemaleza,fertilizacin,controldeplagas,
cosechaybeneficiado(Nolasco,1998;Annimo,2001;
Aranda,2004;yAnnimo2008).Elcafetosecaracteriza
porcultivarseenterrenosdetopografamuyheterog-
nea, desde terrenos planos, con pendientes modera-
dasydehasta50%,conintensasprecipitaciones(hasta
5,200 mm anuales) distribuidas de mayo a noviembre
y una altitud de 300 a 1500 m. Dentro de las limitan-
tes que afectan al cultivo estn las de mercadeo y las
fitosanitarias,yentrelossegundosseencuentralaroya
anaranjadadelcafeto(Hemileia vastatrix Berk.et.Br.),re-
portadacomolaenfermedadmsimportantedelcultivo
por causar la muerte de la planta por defoliacin. Para
reducirlafuentedeinculodelaroyaesnecesarioreali-
zarelcontroldemaleza,ampliarladistanciadesiembra,
y realizar podas, fertilizacin y regulacin de la sombra
arbrea,sinembargo,lascondicionesambientalesdela
regindelSoconuscohanfavorecidolapropagacinde
laroya(Daz,2012).Investigacionessobreepidemiologa
hanindicadoquelaroyatieneuncrecimientosigmoidal,
dondeelmximocrecimientodelaenfermedadseob-
servaentrelosmesesdeeneroyfebrero;despusentra
en decadencia, debido a que se establece una poca
secaycalurosaynoexistencondicionesfavorablespara
su desarrollo (Durn y Medel, 1985). Para el control de
estaenfermedadsehanevaluadodiferentesfungicidas,
sistmicosypreventivosdondeelTriadimefon25%P.H.y
elOxiclorurodecobreal50%quehandadolosmejores
resultados(RegaladoyPonce,1983);sinembargo,tam-
bin se ha observado presencia del hongo Verticillium
hemileiae Bouriquet en campo sobre las uredosporas
deHemileia vastatrix enformanatural(Daz,2012).Con
basealoanterior,elobjetivodelapresenteinvestigacin
fueaislarelhongo(Verticillium hemileiae),evaluardife-
rentesmediosdecultivos,propagarlosdeformamasiva
yaplicarloenviverosdecafyencafetalesparaelcon-
troldelaroyadelcafeto(H. vastatrix).
MATERIALES Y METODOS
LainvestigacinsedesarrollenlosmunicipiosdeCa-
caohatan y Huehuetn, Chiapas, Mxico. Con base en
laobservacinencampodelhongodetonalidadblan-
quecina asociado a pstulas de la roya del cafeto (H.
vastatrix)serealizunarecolectaparasuaislamientoen
el Laboratorio de Microbiologa, Fitopatologa y Nema-
tologa de la Facultad de Ciencias Agrcolas de la Uni-
versidadAutnomadeChiapas,conelfindeevaluarsu
efectosobreelpatgeno.Seevaluaronseismediosde
cultivo para el crecimiento del hongo Verticillium he-
mileiae, concentracin de conidios, pH del medio de
cultivoyproduccinmasivaenundiseoexperimental
completamentealazar(Olivares,1994).
Evaluacin en plantas de vivero
Elhongo(Verticillium hemileiae)aisladoypropagadoen
laboratorioseaplicencincodiferentesdosis(2.0gl
-1
,
4.0 g l
-1
, .6.0 g l
-1
, 8 g l
-1
, 10 g l
-1
) y un tratamiento
testigoenplantasdecafetodeviveroalascualesseles
habaninoculadouredosporasdeH. vastatrix;seutiliz
undiseoexperimentalcompletamentealazar(Olivares,
1994).
Evaluacin en condiciones de campo
ElhongoV. hemileiaeseaplicenhuertascomerciales
de caf infectadas con H. vastatrix en cinco dosis dife-
rentes:0.6kgha
-1
,1.2kgha
-1
,1.8kgha
-1
,2.4ha
-1
,3.0
kgha
-1
yuntestigosinaplicacin.stasedirigihaciael
envsdelahojasinfectadasporlaroyadelcafeto,conla
finalidaddequeV. hemileiaeestuvieraencontactocon
lasuredosporasdeH. vastatrix,aplicandoundiseoex-
perimentalenbloquesalazar(Olivares,1994).
El hongo recolectado y aislado fue identificado como
Verticillium spp. con la clave propuesta por Romero
(1998). Presenta conidios producidos en conidiforos
(libresoagrupados);elordenMonilialeshasidosubdivi-
didoenfamilias,principalmenteporelcolordelosco-
nidiforos, y la familia Moniliaceae presenta conidios y
conidiforoshialinosodecoloresbrillantes.Locciet al.
(1971)reportaelhiper-parasitismodeV. hemileiaesobre
60
AGRO
PRODUCTIVIDAD
AGRO
PRODUCTIVIDAD
H. vastatrix;Sobero(2006)mencio-
na que la prdida del color amari-
llento-anaranjado tpico en esporas
de roya se acelera con un hongo
blancuzco parastico identificado
como(V. hemileiae)(Figura1y2).
El gnero Verticillium tiene las si-
guientes caractersticas morfolgi-
cas: conidiforos delgados ramifi-
cados, por lo menos algunas ramas
verticiladas,conidiosovalesaelipsoi-
dales,hialinos,unicelulares,produci-
dos apicalmente, solitarios o en pe-
queascabezuelas;paraelpresente
estudio la especie correspondi a
Verticillium hemileiae Bouriquet.
ElCuadro1muestralamayorgermi-
nacin de conidios de V. hemileiae
(90%) a la mayor concentracin de
2.5710
5
conidios por mL
-1
en el
medio de cultivo Sabouraud Dex-
trosaAgarmsExtractodeMalta.Lo
anterior coincide con lo reportado
por Carballo (1999), quien seala
queelhongo(Verticilliumspp.)cre-
cebienenmediosdecultivocomo
ExtractodeMaltaSabouraudyPapa
DextrosaAgar.Deformasemejante,
Hall (1981) menciona que las colo-
niasdeVerticillium spp.crecenbien
en un medio de cultivo a base de
agar malta, harina de avena o papa
dextrosaagar,enloscualessedesa-
rrolla un micelio delgado blanco o
crema que forma colonias blancas
conaparienciaalgodonosa.
Un dato relevante en el proceso
de aislamiento y multiplicacin del
hongo parastico fue determinar el
pH del medio de cultivo en el cual
(V. hemileiae) generara mayor con-
centracin de conidios, resultando
que es necesario ajustar el pH de
la solucin del medio de cultivo
a 5.5 porque es donde present
mayor formacin de conidios con
2.5610
5
, germinacin de 91.80%
y patogenicidad de 92.20%; para
la propagacin masiva, el hongo
(V. hemileiae) debe ser propaga-
do en salvado de trigo porque fue
donde este hongo present mayor
concentracin de conidios por mi-
lilitro (2.3110
5
), mayor viabilidad
(90.96%), crecimiento (66.20%) y
patogenicidad sobre (H. vastatrix)
(91.10%)(Figura3)(Cuadro2y3).
La aplicacin de V. hemileiae en
plantas cafeto en vivero infectadas
previamenteconH. vastatrixmostr
Cuadro 1.Porcentajedegerminacinyconcentracindeconidiosdelhongo(V. hemileiae)
endiferentesmediosdecultivo.
Mediodecultivo Germinacin(%) Mediodecultivo Concentracin
SDA+E.deMalta 90.0a SDA+E.deMalta 2.5710
5
a
SDA+E.deLevadura 78.0b SDA+E.deLevadura 1.7410
5
b
SDA 71.0c SDA 1.5910
5
c
PDA 50.0d PDA 1.4710
5
d
PDA+E.deMalta 49.0d PDA+E.deMalta 1.3210
5
e
PDA+E.deLevadura 39.0e PDA+E.deLevadura 1.2010
5
f
*Promedioconlamismaletrasonestadsticamenteiguales,segnlaPruebadeTukeyauna
ode0.01deprobabilidad.
Figura 1. Hoja de cafeto
(Coffea arabica) afectada
porroya(Hemileia vastatrix
Berk et Br.) con pstulas
color amarillo. El micelio
color blanco correspon-
de a Verticillium hemileiae
Bouriquet.
Figura 2.Micelioseptadoyverticiliosdelhongo(V. hemileiae)tomadasalmicroscopio
deluz40X.
61
AGRO
PRODUCTIVIDAD
que el mayor nivel de infestacin,
cantidad de pstulas de roya por
hoja y defoliacin se observ en el
tratamientotestigo,elcualseinocu-
l con H. vastatrix sin V. hemileiae
(Figura4).
V. hemileiae propagado en labora-
torio se aplic en diferentes dosis
(Cuadro 4) y la mayor infeccin se
observeneltratamientotestigosin
aplicacin.
CONCLUSIONES
ElhongoVerticillium hemileiaeBou-
riquet es un parsito de la roya del
cafeto (Hemileia vastatrix Berk. et
Br.); el medio de cultivo ms efec-
tivo para producirlo es Sabouraud
Dextrosa Agar ms extracto de Le-
vadura y, para propagarlo masiva-
mente,elsalvadodetrigo.ElpHdel
mediodecultivosetienequeajustar
a5.5.Suaplicacinaplantasdeca-
feto(Coffea arabica),viveroycampo
(V. hemileiae) ejerce control de H.
vastatrix.
LITERATURA CITADA
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Figura 3.A:Matrices(BotellasRoux)consalvadodetrigoinoculadasconelhongo(V. hemileiae).B:Bolsasdeplsticodealtadensi-
dadlinealinoculadasconsalvadodetrigoconelhongo(V. hemileiae).
Cuadro 2.Comparacindemediasdelaconcentracin,porcentajedegerminacinypato-
genicidaddeconidiosdelhongo(V. hemileiae)endiferentesmediosdecultivo.
pH Concentracin pH Germinacin(%) pH Patogenicidad(%)
5.5 2.5610
5
a 5.5 91.80a 5.5 92.20a
6.0 2.2210
5
b 5.0 89.80ab 6.0 89.80ab
5.0 1.4210
5
c 6.0 89.20b 5.0 80.40b
6.5 1.0410
5
d 6.5 58.80c 6.5 79.80c
7.0 1.7610
4
e 7.0 52.80d 7.0 70.00d
ade0.01deprobabilidad.
Cuadro 3.Propagacindelhongo(V. hemileiae)endiferentessustratos.
Tratamiento
Concentracin
(%)
Viabilidad
(%)
Crecimiento
(%)
Patogenicidad
(%)
Salvadodetrigo 2.3110
5
90.96a 66.20a 91.10a
Trigoengrano 2.3110
5
63.63b 59.20b 53.40b
Arrozengrano 2.3110
5
45.53c 41.70c 40.80c
ade0.01deprobabilidad.
Cuadro 4.Porcentajedeinfeccinde(H. vastatrix)conaplicacindelhongo(V. hemileiae).
Tratamientos
0 15 30 45 60
A0.6kgha
-1
5.00 6.15 8.12 15.15 5.68
B1.2kgha
-1
13.55 12.02 15.62 20.49 9.40
C1.8kgha
-1
8.78 9.17 10.65 16.57 7.65
D2.4kgha
-1
9.03 14.48 16.92 21.72 12.10
E3.0kgha
-1
18.82 13.45 19.55 24.92 12.62
FTestigosinaplicacin 18.52 20.55 20.10 21.27 16.40
62
AGRO
PRODUCTIVIDAD
AGRO
PRODUCTIVIDAD
Aranda J. 2004. El sistema campesino
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vastatrix Berk. et. Br.) en el Istmo
Figura 4.A:Hojasdecafetoconmenorcantidaddepstulasderoya(H. vastatrix).B:Hojasdecafetocon
tratamientotestigo,mostrandomayorconmayorcantidaddepstulasderoya.C:Presenciadelhongo(V.
hemileiae)despusdesuinoculacin.D:Pstulasde(H. vastatrix)eneltratamientotestigosinaplicacinen
condicionesdecampo.
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63
AGRO
PRODUCTIVIDAD
ESTABLECIMIENTODE
UNSISTEMADEBIORREACTORESPARA
LAMICROPROPAGACINDEVAINILLA
(Vanilla planifoliaJacks.exAndrews)
ESTABLISHMENTOFABIOREACTORSYSTEMFORVANILLA
(Vanilla planifolia Jacks.exAndrews)MICROPROPAGACIN
Jeric J. J.
1
, Bello-Bello, J. J.
1
, Spinoso-Castillo, J.
1
, Iglesias-Andreu, L. G.
2
*
1
ColegiodePostgraduados-CampusCrdoba.CarreteraFederalCrdoba-Veracruzkm348,Con-
gregacinManuelLen,MunicipiodeAmatlndelosReyes,C.P.94946,Veracruz,Mxico.
2
Insti-
tutodeBiotecnologayEcologaAplicada(INBIOTECA),UniversidadVeracruzana.Campusparala
Cultura,lasArtesyelDeporte,Xalapa,VeracruzMxico.
*Autor responsable:xliglesias@gmail.com
RESUMEN
Se dise e instal un sistema de biorreactores para la micropropagacin a gran escala de Vanilla planifolia Jacks. ex
Andrews,unaorqudeadeimportanciaeconmica.Secomparlaeficienciadelprotocolodecultivoin vitroempleando
elmtodoconvencionalenmedioslidoconelsistemadeinmersintemporalenmediolquido.Losresultadosmos-
traronqueelcultivoenbiorreactorespermitialcanzaren30dasdecultivounatasamselevadademultiplicacin(12
brotes/explante)mientrasqueenmediosemislidolatasademultiplicacinfuemenor(7brotes/explante),indicando
queelsistemadecultivoenbiorreactoresesunaexcelentealternativaparalapropagacinin vitrodeesta
valiosaespecie.
Palabras clave:propagacin,inmersintemporal,SIT,vainillina.
ABSTRACT
A bioreactor system was designed and installed for the large-scale
micropropagation of Vanilla planifolia Jacks. an orchid of economic
importance. The efficiency of the in vitro culture protocol using the
conventional method in solid medium was compared with the
temporaryimmersionsysteminliquidmedium.Theresults
showedthatcultivationinbioreactorsallowedtoreach
ahigherrateofmultiplication(12shoots/explant)in30
daysofcultivation,whileinthesemisolidmediumthe
rate of multiplication was lower (7 shoots/explant);
this indicates that the cultivation system in
bioreactors is an excellent alternative for in
vitropropagationofthisvaluablespecies.
Key words:propagation,temporary
immersion,SIT,vanilla.
64
AGRO
PRODUCTIVIDAD
AGRO
PRODUCTIVIDAD
Micropropagacindevainilla
INTRODUCCIN
La vainilla
(Vanilla planifoliaJacks.exAndrews)esunaor-
qudeaquesecultivacomercialmenteporsus
silicuasaromticasdelascualesseextraelavainillina,unasustanciasabori-
zanteampliamentedemandadaparasuusoenlaindustriaalimenticiaycomo
cosmtico(Bory,2008).Apesardesuimportanciaestaespecieseencuentra
amenazada(NOM-ECOL-059-2001)debidoaquelaspoblacionessilvestres
hansidodiezmadasconlarecolectaexcesivaparaestablecerplantaciones
comerciales.EnMxicoesunaespeciesubutilizada,yaqueactualmenteslo
seproducecercade1%delaproduccinmundialynosehaaprovechala
denominacindeorigenVainilladePapantlaqueelInstitutoMexicanode
la Propiedad Industrial (IMPI) le otorg en 2009 para su proteccin (Soto,
2006). Una de las limitantes actuales de esta especie es que no se cuenta
conprotocoloseficientesparasupropagacinmasiva.Enlaactualidadesta
especie se propaga comercialmente por la va asexual mediante el uso de
esquejes(segmentosdetallo)queseobtienendeplantacionescomerciales,
sinembargo,dadalaimportanciaeconmica,socialyculturaldelcultivo,as
comoeldesabastodepropgulosresultaimportantecontarconunprotoco-
loeficienteparapropagarcomercialmentelaespecie(Figura1).
La micropropagacin de plantas
Lamicropropagacinoclonacinin vitro deplantasesunadelasaplicacio-
nes biotecnolgicas ms desarrollada en los ltimos aos. En la actualidad
constituye una de las herramientas ms utilizadas. Por esta va, es posible
obtenerungrannmerodeindividuoslibresdeplagasyenfermedadesen
menor tiempo y empleando espacios reducidos. Actualmente la industria
biotecnolgicaagrcolaenMxicocuentaconpotencialproductivoparala
propagacinmasivadeplantas.Sinembargo,elempleodelamicropropaga-
cinaescalacomercialsehalimitadocadavezms,debidoprincipalmente
alosaltoscostospormanodeobra,bajaeficienciabiolgicayfaltadeau-
tomatizacindurantelosprocesosdelamicropropagacin.Existenreportes
paramicropropagacindeV. planifolia (PhilipyNainar,1986;Tencio,1992;
Lee-Espinosaet al.,2008;Minoo2009;Palamaet al.,2010;ChinTanet al.,
2011).Sinembargo,losprotocolosdemicropropagacinquesehandesa-
rrolladoenestecultivotienenbajatasademultiplicacin;adems,elusode
sistemasdeinmersintemporalnohasidoreportadoenestaespecie.
Sistemas de inmersin temporal (SIT)
ElSistemadeInmersinTemporal(SIT)eselcultivodeclulas,tejidosur-
ganosexpuestostemporalmenteamediodecultivolquidoenbiorreactores
semiautomatizados bajo condiciones axnicas y controladas. Actualmente
existenunaampliagamademodelosysistemasautomatizadosqueseem-
pleanenlamicropropagacindeplantas,dentrodeloscualesdestacaelBio-
rreactordeInmersinTemporal(BIT
)(Escalonaet al.,1999),elRecipientede
InmersinTemporalAutomatizado(RITA
)(Alvardet al.,1993),elBiorreactor
Modular de Inmersin Temporal (BioMINT
) (Robert et al., 2006), el Plan-

tima
(A-Tech Bioscientific, 2010) y, ms recientemente, el SETIS
(SETIS,
2012).Latecnologadebiorreactoresytcnicasdemicropropagacindealta
frecuenciaabrenlaspuertasparalograrunmayorescaladoenelprocesode
micropropagacin. El sistema de micropropagacin que se propone en el
Figura 1.Huertacomercialdevainilla
(Vanilla planifolia) originada asexual-
mente.Esquejeyyema.
65
AGRO
PRODUCTIVIDAD
presentetrabajopermitelasemiau-
tomatizacin del proceso y evita el
usodeagentesgelificantesqueen-
careceelprocesoconvencional,re-
duceloscostosocasionadosporla
manodeobrayaumentalaeficien-
ciabiolgicadelcultivoin vitrodeV.
planifolia.Conbaseenloanterior,el
objetivodelpresentefuedesarrollar
unprotocoloparalamicropropaga-
cin eficiente del germoplasma de
V. planifolia.
MATERIALES Y MTODOS
El presente trabajo se realiz en el
Laboratorio de Cultivo Vegetal del
Instituto de Biotecnologa y Eco-
loga aplicada (INBIOTECA) de la
Universidad Veracruzana. Para su
ejecucin primeramente se dise
e instal el SIT a nivel de laborato-
rio y posteriormente se estableci
el protocolo de micropropagacin.
ParalainstalacindelSITseadecu
unespaciofsicoconcontroldelas
condiciones de temperatura y hu-
medadadecuadasparaeldesarrollo
eincubacindeloscultivosin vitro.
Sedispusodeunanaquelcuyapar-
tesuperiorseadaptparaubicarun
recipiente con los explantes y, en
su parte inferior, otro conteniendo
elmediodecultivo.Ambosfrascos
estuvieroncomunicadosatravsde
mangueras de silicona. Las condi-
cionesdeesterilidadselograronmedianteelempleodefiltroshidrofbicos
de0.2um.Segneltiempoprogramado,lavlvulayelaireprovenientedel
compresorseabrenparaimpulsarelmediodecultivohacialapartesuperior
conteniendolosexplantes.Duranteelperododeinmersinseproduceun
flujo de aire que genera el burbujeo del medio que a su vez remueve los
explantes. Pasado el tiempo de inmersin, el lquido regresa por gravedad
al reservorio de medio de cultivo. La frecuencia y el tiempo de inmersin
se regulan mediante el empleo de un temporizador o controlador lgico
programable(PCL).Deestaformaselogralaautomatizacindelsistemade
inmersintemporal(Figura2).
Propagacin in vitro
Seemplearoncomoexplantes,yemasypicesdeplantasdevainilla(V. plani-
folia)recolectadasenPapantla,VeracruzMxico;selavaronbajounflujode
aguacorrientepor45minutos.Posteriormentesemantuvieronenagitacin
por30minutosenunasolucindeBenomilo1gL
-1
(Promyl
).Unavezen
lacmaradeflujolaminarseprocediadesinfectarlosexplantesensolucio-
nesdeetanolal70%v/vdurante30syclorocomercialal10%v/vdurante20
minutos. Finalmente se aplicaron tres enjuagues con agua destilada estril.
Despusdeestetratamientolosexplantessesumergieronnuevamentepor
10minutosenunasolucinal3%declorocomercial(hipocloritodesodio)y
seenjuagaronentresocasionesconaguadestiladaestril.Losexplantesse
cultivaronenmediodemultiplicacinMS(MurashigeySkoog,1962)suple-
mentadocon2gL
-1
debenciladenina(BA)deacuerdoconlametodologa
propuestaporLee-Espinozaet al.(2008).Paralaetapadeenraizamientose
utilizmedioMSal50%sinreguladoresdelcrecimiento.Paraelmediosemi-
slidoseusGelrite(SIGMA
)al0.22%(w/v)comoagentegelificante.El
pHdelosmediosfueajustadoa5.8.Laesterilizacinserealizenautoclave
a1.5Kgcm
-2
depresiny121Cdurante20minutos.Losrecipientesdecul-
tivo,conteniendotresexplantesparaelmediosemislidoycincoparaelSIT,
fueronincubadosa242Cysemantuvieronbajoluzfluorescente(40-50
umolm
-2
s
-1
)confotoperiodode16:8hluz/oscuridad.Seutilizundiseo
Figura 2.Diagramadelsistemadeinmersintemporal(SIT).A:Sininmersin.B:Coninmersin.1:Compre-
sordeaire,2:Mangueradesilicn,3:Temporizador,4:Bombadesolenoide,5:Conexinatubodeventeo,
6:Filtroventeo,7-8:Recipienteconexplantes.
66
AGRO
PRODUCTIVIDAD
AGRO
PRODUCTIVIDAD
experimentalcompletamentealazaryseemplearon30
explantes por tratamiento. Los datos fueron analizados
mediante el paquete estadstico SPSS v. 11.5 para Win-
dowsy,paradetectardiferenciasentrelostratamientos,
serealizunapruebat-Student(p0.05).
Los resultados obtenidos mostraron que fue posible
lograrlainduccindebrotesenlosdossistemaseva-
luados.Sinembargo,elcultivoenbiorreactoresresult
serelmseficienteyaquepermitiobtener12brotes
porexplanteenpromedio.Elcultivoenmediosemis-
lido solo permiti obtener una tasa de multiplicacin
de siete brotes por explante (Cuadro 1). El sistema de
inmersintemporalenbiorreactoresaumenten42%
latasademultiplicacin,comparadoconelsistemaen
medioslido.
La longitud de los brotes fue mayor en medio slido
(1.8 cm), mientras que en inmersin temporal fueron
de1.4cmenpromedio.Estosedebiprobablementea
quelosformadoseninmersintemporaltienenmayor
superficiedecontactoconelmediodecultivolquido.
Adems,losformadosenmediolquidofueronhomo-
gneos. Una de las ventajas del sistema de inmersin
temporal, comparado con otros realizados in vitro, es
quepermitecombinarlaaireacinconlainmersindel
explante,sometindoloaltiempoyperiododeinmer-
sinrequeridoparaquelasplntulastomendelmedio
de cultivo los nutrientes y reguladores del crecimien-
to para su desarrollo. Esta es una de las razones que
lo hacen ms eficiente. De acuerdo con Alvard et al.
(1993),eltiempodeinmersindelexplantees,proba-
blemente, la caracterstica que ms atencin requiere
cuando se desea propagar una especie. Los SIT han
sido empleados para la micropropagacin de plantas
dectricos(Citrusspp.)(Cabassonet al.,1997),caade
azcar(Saccharum officinarum)(Lorenzoet al.,1998),
cafeto(Coffea arabica)(Etienne-Barryet al.,1999),ba-
nano(Musa paradisica)(ColmenaresyGimnez,2003),
manzano(Malus domestica)(Zhuet al.,2005),eucalip-
to(Eucaliptusspp.)(McAlisteret al.,2005),chilehaba-
nero(Capsicum chinense)(Bello-Belloet al.,2010),en-
treotros.EnelcasoparticulardeV. planifolia,losbrotes
obtenidos bajo el SIT mostraron ser ms vigorosos en
comparacin con aquellos que fueron cultivados en
mediossemislido(Figura3).
Cuandolosbrotesalcanzaronentre2-4cmdelongitud
despusde30dasdecultivoin vitro,fuerontrasferidos
aetapadeenraizamientoenbiorreactores,donde100%
delosbrotesprodujeronraces(Figura4A),con95%de
supervivenciadurantelaetapadeaclimatizacin,obser-
vndoseplntulasvigorosas(Figura4B).
CONCLUSIONES
El sistema de micropropagacin de vainilla emplean-
do los biorreactores propuestos aumentan la tasa de
multiplicacin y permiten disminuir el costo de ope-
racin y el uso de agentes gelificantes, facilitando la
Cuadro 1.Nmeroylongituddebrotesdevainilla(Vanilla planifolia
Jacks.exAndrews)desarrolladosendiferentessistemasdecultivo
in vitro.
Sistemadecultivo
Nmerodebrotes/
explante(mediaES)
Longitud
(cm)
Medioslido 7.110.31b 1.880.09a
Inmersintemporal 12.040.48a 1.450.07b
*LosvaloresrepresentanlamediaES(errorestndar).Mediascon
diferenteletraentrecolumnassonsignificativamentediferentes(t-
Student,p0.05).
Figura 3. Desarrollo de brotes obtenidos
en diferentes sistemas de micropropaga-
cin. A: Medio semislido. B: Inmersin
temporal.
A
B
67
AGRO
PRODUCTIVIDAD
regeneracin de plantas a gran
escala,loquehaceposibleliberar
accesiones conservadas in vitro y
facilitarsureinsercinalosecosis-
temasalterados.
LITERATURA CITADA
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Figura 4.Enraizamientoyaclimatizacindevitroplntulasdevainilla.A:Enraizamiento.
B:Aclimatizacinencondicionesdeinvernadero.
A
B
68
AGRO
PRODUCTIVIDAD
AGRO
PRODUCTIVIDAD
planifolia (Orchidaceae): proteomic and metabolic responses at early stage. BMC
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AGRO
PRODUCTIVIDAD
69
AGRO
PRODUCTIVIDAD
RELATORA:ELQUEHACERDE
LOSLABORATORIOSDELSERVICIONACIONAL
DESANIDAD,INOCUIDADYCALIDAD
AGROALIMENTARIA(SENASICA)
THEWORKOFTHELABORATORIESOFTHENATIONALHEALTHSERVICE,
SAFETYANDQUALITYOFFOOD(SENASICA)
Zamora-Nava, M.C.
1
; Arias-Ruiz, A.
1
; Barrera-Andrade, M.G.
1
; Acatzi-Silva, A.I.
1
;
Garca-Lpez, L.C.
1
; Gonzlez-vila, D.
1
ServicioNacionaldeSanidad,InocuidadyCalidadAgroalimentaria.Av.MunicipioLibreNo.377,Piso
7-B,ColSantaCruzAtoyac,Del.BenitoJurez,Mxico,D.F.,C.P.03370.Tel:+52(55)59051000,
Ext.51005.
Direccin de contacto:difusion@senasica.gob.mx
RESUMEN
Debido a grandes brotes de enfermedades en animales o plagas que han afectado a Mxico, desde principios del siglo
veintesurgelanecesidaddecrearsistemasdeanlisissofisticadosenloslaboratoriosconlafinalidaddecrearprotocolos
dediagnstico,fichastcnicas,manualesycatlogos,ascomodetectarpatgenos,plagasymalezas.ElServicioNacional
deSanidad,InocuidadyCalidadAgroalimentaria(SENASICA)dependientedelaSAGARPA,tienelamisinderegular,ad-
ministraryfomentarlasactividadesdesanidad,inocuidadycalidadagroalimentaria,reduciendolosriesgosinherentesen
materiaagrcola,pecuaria,acucolaypesqueraenbeneficiodelosproductores,consumidoreseindustria;cuentaconuna
reddelaboratoriosqueatiendeladeteccindeplagasyenfermedadesqueponenenriesgolaviabilidadeconmicadel
sectoragropecuarioacucola,pesqueroydesaludpblica.
Palabras clave:sanidad,inocuidad,agroalimentario.
70
AGRO
PRODUCTIVIDAD
AGRO
PRODUCTIVIDAD
Biofertilizantes y produccin de caa de azcar Relatora:(SENASICA)
INTRODUCCIN
El Servicio
Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad
Agroalimentaria (SENASICA) dependiente de
la SAGARPA, tiene la misin de regular, administrar y fomentar las activida-
desdesanidad,inocuidadycalidadagroalimentaria,reduciendolosriesgos
inherentes en materia agrcola, pecuaria, acucola y pesquera en beneficio
delosproductores,consumidoreseindustria;cuentaconunareddelabo-
ratoriosqueatiendeladeteccindeplagasyenfermedadesqueponenen
riesgolaviabilidadeconmicadelsectoragropecuarioacucola,pesqueroy
desaludpblica.Larednacionalde50laboratoriosdealtaespecializacin
respaldaalSistemadeVigilanciaEpidemiolgicadeMxicoenbeneficiodel
comercionacionaleinternacional,ascomoaldesarrolloyevolucinsanita-
riadelinventariopecuarionacionalydesaludpblica.Loslaboratorioscuen-
tanconinfraestructuraparabrindarserviciosdediagnsticoyconstatacin
oportunos, confiables y de calidad, ejecutados por personal especializado
queempleatcnicasmodernasyequiposdevanguardiaparalaatencinde
emergencias,locualpermitetomardecisionesparacontrolaryerradicarpla-
gasyenfermedadesdealtoriesgoparalaagricultura,ganadera,acuacultura
ypesca,alaplicaroperativosymedidassanitarias.ElSENASICAllevaacabo
diferentes actividades de monitoreo, inspeccin y vigilancia de productos
agrcolas,pecuarios,acucolasypesquerosalolargodelterritorionacional,
conelfinderegularyvigilarlainocuidaddeestosalimentos.Paracumplir
conestatarea,secuentaconelapoyoylaparticipacindelaboratoriosofi-
cialesquefungencomoCentrosNacionalesdeReferenciaenelanlisisde
alimentos,identificandolapresenciaoausenciadecontaminantesqumicos
ymicrobiolgicosolasmodificacionesgenticasquepuedancausardaoa
lasalud,obien,questosseencuentrendentrodeloslmitespermitidospor
la regulaciones nacionales e internacionales, asegurando as la entrega de
productosinocuosalconsumidor.
Centro nacional de referencia en
deteccin de organismos genticamente
modificados (CNRDOGM)
Labiotecnologamoderna,aplicada
enespeciesvegetales,esunaherra-
mienta que desde mediados de los
aos noventa gener los primeros
desarrollos de Organismos Genti-
camenteModificados(OGMs),tam-
binconocidoscomotransgnicos.
Actualmenteanivelmundialseuti-
lizan plantas genticamente modi-
ficadas como soya, algodn, maz,
trigo, canola y arroz, entre otras,
quelespermitenresistirelataquede
plagas, enfermedades, condiciones
climticas extremas, como heladas
o sequas; tolerar herbicidas, au-
mentarsuspropiedadesnutrimenta-
les,obien,combinarvariasdeestas
caractersticasenunamismaplanta.
ElCentroNacionaldeReferenciaen
Deteccin de Organismos Genti-
camente Modificados (CNRDOGM)
esellaboratoriooficialdelaSAGAR-
PA para el anlisis de OGMs desde
diciembre de 2011. Cuenta con el
reconocimientoporlaconfiabilidad
desusresultadosatravsdelaacre-
ditacin SA-0338-005/11 otorgada
por la Entidad Mexicana de Acredi-
tacin(EMA).Estelaboratoriollevaa
caboelanlisisdediversoscultivos
para detectar, identificar y cuanti-
ficar las modificaciones genticas
que pudieran estar presentes en la
muestra. Actualmente se analizan
principalmente muestras de maz,
algodn,soya,alfalfaytrigo.Acon-
tinuacin se describen los pasos
ms representativos para el anlisis
delosOGMs(Figura1).
Recepcin, registro y acondicionamiento
de muestras
Durante su registro, a las muestras
se les asigna un nmero nico e
irrepetible,loquegarantizasuiden-
tificacin a lo largo del proceso de
anlisishastalaemisindelinforme
Figura 1.TipodemuestrasquesonanalizadasenelCNRDOGM.
71
AGRO
PRODUCTIVIDAD
Relatora:(SENASICA)
de resultados. En esta etapa a las
muestras de tejido vegetal (hojas
o tallos) se le realizan varios cortes
y son cristalizadas con nitrgeno
lquido (N
2
); posteriormente son
trituradas. Cuando la muestra con-
siste en granos o semillas, se mue-
len hasta obtener harinas; tanto la
trituracin como la molienda se
realizan mecnicamente. La mues-
tra acondicionada es dividida en
tressub-muestras,delascualesdos
son enviadas al rea de resguardo
en donde permanecern en con-
gelacinporunperiodomnimode
cincoaos;conlaotrasub-muestra
seiniciaelprocesodeextraccinde
ADN(Figura2,3).
Extraccin de ADN
Una vez reducido el tamao de la
muestra,elsiguientepasoeshacerla
interactuarconalgunoscomponen-
tesqumicos(salesydetergentes)y
biolgicos (enzimas que degradan
protenas)querompenlaclulave-
getal con el objetivo de liberar el
ADNdelinteriordelamisma.
Anlisis de secuencias
genticamente modificadas
Esteanlisissellevaacabomedian-
telatcnicadereaccinencadena
delapolimerasaentiemporeal(RT-
PCR,porsussiglaseningls),lacual
permiteamplificaromultiplicarbi-
llones de veces los fragmentos de
ADN caractersticos de la modifica-
cingenticaenlamuestraanaliza-
da.Estaesunatcnicaconunaalta
especificidad, de manera que aun-
quesetengamuypocacantidadde
ADN es posible detectar pequeas
concentraciones de OGMs. El an-
lisis de secuencias de la muestra
constadelosnivelesdedeteccin,
identificacinycuantificacindedi-
chassecuencias.
Deteccin, identificacin y
cuantificacin de OGM
La deteccin permite determinar si
existelapresenciaoausenciadema-
terialgenticamentemodificadoen
una muestra, mientras que la iden-
tificacin indica las caractersticas
introducidas al cultivo (resistencia
a insectos, tolerancia a herbicidas,
resistenciaasequa,etctera),inclu-
sive en eventos apilados o stacks.
De esta forma se puede identificar
variedades genticas no permitidas
para su liberacin al ambiente. La
cuantificacindeterminaelporcen-
tajedematerialgenticamentemo-
dificado (GM) de una muestra y se
pueden detectar niveles muy bajos
de material GM en cualquier caso
(herramienta para el etiquetado y
monitoreo).Unavariacindelatc-
nica de PCR para la cuantificacin
deOGMeslaPCRdigital(dPCR),la
cual cuenta con mayor exactitud y
precisin.Estatcnicatrabajaabase
dedilucionesserialesyescapazde
cuantificar las secuencias gentica-
mente modificadas en unidades de
nmero de copias, que equivale al
nmerodemolculasdeADN,yse
caracteriza por una sensibilidad ex-
traordinaria, pues mide desde 0.6
molculas de ADN, siendo as la
tcnica de cuantificacin de OGM
conmayorjerarquaanivelmundial
(Figura4).
Secuenciacin
Las actividades en el rea de se-
cuenciacin incluyen la caracteri-
zacin de OGMs a partir de hojas
de tejido vegetal, granos, semillas
y plsmidos (molculas circulares
deADNquesereplicandemanera
independientealcromosomadela
clula hospedera), con la finalidad
Figura 2. Recepcin y acondiciona-
mientodemuestras.
Figura 3.ExtraccinyanlisisdeADNdelasmuestrasrecepcionadas.
72
AGRO
PRODUCTIVIDAD
AGRO
PRODUCTIVIDAD
Figura 4.A:CurvadecuantificacindeOGM.B:CurvadeamplificacinporRT-PCR.
A
de monitorear los eventos liberados al campo (Figura
5). A partir de 2013 se inici el proceso de secuencia-
cin masiva para organismos patgenos, con el obje-
tivodecrearunabasededatosnacionaldecepaspa-
tgenas que se encuentran en productos alimenticios
deinters.
Lasmuestrasvegetalespasanporunprocesodeacon-
dicionamiento y extraccin de ADN, mientras que los
organismos patgenos quedan exentos de esta etapa
yaquesepartedirectamentedelADN.Ambasmuestras
pueden llevarse a cabo utilizando el principio de piro-
secuenciacin, o bien, por secuenciador Ion Torrent, a
travsdeunchipsemiconductor,comosemuestraen
laImagen2.
El proceso de pirosecuenciacin
comienza con la adaptacin del
ADN para obtener una librera de
pequeos fragmentos de 600 a
700paresdebases,locualselogra
fragmentandoelADNasecuenciar
mediante un proceso fsico cono-
cido como nebulizacin, donde
el ADN se rompe utilizando un
gas inerte a una presin y tiempo
constante. Posteriormente se tra-
baja con una mezcla de enzimas
quecortanlasdoshebrasdeADN
porelmismolugar,generandodos
extremos de doble cadena que
permitirn la unin del adaptador
(pequeas secuencias A y B), el
cual est diseado para poder se-
leccionar, amplificar y secuenciar.
Elsiguientepasoconsisteencar-
garlasesferasenunaplaca(Figu-
ra6),lacualconstademsdeun
millndepocillosde44micrasde
dimetro.LasesferasconADNse
introducenaotrotipodeesferas
quecontienenlasenzimasnece-
sarias para detectar la incorpora-
cin de nucletidos (compuesto
orgnico que est formado por
una base nitrogenada, un az-
car y un cido fosfrico) durante
la sntesis de la cadena comple-
mentaria;ydeestaformaselleva
a cabo una cascada enzimtica
liberandounpirofosfatoyterminaconlaemisindeluz,
comosemuestraenlaFigura7.
Elsecuenciadorrecogeelpatrndedestellosluminosos
que se emiten en la placa y los resultados se analizan
medianteprogramasbioinformticosyseconviertenen
secuencias.LaplataformaIonTorrentconlaquecuenta
elCNRDOGMessimilaralapirosecuenciacin;ladife-
renciaesquelamuestrapasaporunadigestinenzim-
ticay,medianteunfactordedilucin,iniciaelproceso
delamuestraenlacualelADNseligaalosadaptadores,
generandolalibreraqueposteriormenteseamplificay
se secuencia. El principio de Ion Torrent se basa en la
incorporacindepequeassecuenciasqueadicionael
secuenciadoralamuestradeintersymedianteeluso
Figura 5.Recoleccindemuestraencampo.Fuente:SAGARPA.
73
AGRO
PRODUCTIVIDAD
Relatora:(SENASICA)
de un chip semiconductor (Figura
8)sedetectancambiosenelpHde
la muestra, generando las seales
correspondientes que finalmente
soncaptadasporelsecuenciadory
analizadas mediante una programa
bio-informtico.
Estetipodesecuenciacinesconsi-
deradacomodenuevageneracin,
ya que proporciona la informacin
necesaria para poder verificar cual-
Figura 6.MontajedelllenadodelaPPTparalaplataforma454GSFLX.Fuente:www.roche-applied.science.com.
Figura 7. Resultados de la emisin
deluzgeneradaenelsecuenciador,
uncolorverdequeindicaincorpora-
cin de secuencia y los pocillos ro-
jos,ausenciadeADN.
Figura 8.EquipoIonTorrentquetra-
bajaconunchipsemiconductorque
es utilizado para validar resultados
del454GSFLX
quiertipodeeventoomodificacin
genticaquesepresenteendiferen-
tesvariedadesdemuestras,adems
deobtenerinformacinmasivapara
poderidentificarlasecuenciadein-
ters.Adems,elCNRDOGMcuenta
con reconocimiento internacional,
puescadaaoparticipaenpruebas
internacionales, conocidas como
ensayos de aptitud, donde compa-
rasusresultadosdeanlisisconlos
delaboratorioshomlogosdeotros
pasescoordinadospororganismos
de Francia y Estados Unidos, com-
probandoqueeltrabajoqueserea-
lizaenMxicoenmateriadeanlisis
deOGMseencuentraalniveldelos
mejoreslaboratoriosdelmundo.De
esta manera, el SENASICA imple-
mentaymejoralasaccionesregula-
torias y operativas que contribuyan
a lograr una proteccin adecuada
de la sanidad animal, vegetal, acu-
cola y pesquera en beneficio de la
sociedad,fortaleciendo
el compromiso del
Gobierno Federal de
salvaguardarlabiose-
guridadenMxico.
Laboratorio de diagnstico
para la deteccin de
organismos patgenos
(LDDOP)
UnodelosobjetivosdelSENA-
SICAeslavigilanciadelaaplicacin
de los Sistemas de Reduccin de
Riesgos de Contaminacin, como
sonlasBuenasPrcticasdeProduc-
cin(BPP)ylasBuenasPrcticasde
ManejooManufactura(BPM)duran-
telaproduccinyelprocesamiento
primario de los alimentos agrcolas
que permiten asegurar que cada
eslabn de la cadena agroalimen-
taria establezca controles
y actividades que eviten
riesgosdecontami-
nacinyobtener
74
AGRO
PRODUCTIVIDAD
AGRO
PRODUCTIVIDAD
en consecuencia alimentos
inocuos, definindose esto
comola caracterstica que
tiene un alimento de no
causar dao a la salud del
consumidor por efectos de
algn contaminante.
ElSENASICAcoordinayope-
ra el Programa Nacional de
Monitoreo de Contaminan-
tes y Residuos Txicos, el
cualcontemplaelmonitoreo
de alimentos agropecuarios
no procesados, producidos
en el pas, y aquellos que
se importan y pudieran pre-
sentar existencia de conta-
minantes fsicos, qumicos y
microbiolgicos (Figura 9).
Este programa se basa en el
anlisis de muestras obteni-
dasdelasdiferentesregiones
agropecuariasdelpasquereciben
losLaboratoriosOficialesdelains-
titucin. Estas muestras permiten
determinar la condicin sanitaria
que guardan los alimentos y cum-
plirconlosmselevadosyestrictos
estndares de sanidad e inocuidad
exigidos en el mercado nacional e
internacional.
Derivadodelosprogramas,lacola-
boracinentreLaboratoriosde
laAdministracindeAlimentos
y Medicamentos de los Esta-
dos Unidos de Amrica (FDA
por sus siglas en Ingls) y el
SENASICA, se gener mayor
comunicacinyentendimiento
tcnico entre ambas agencias,
lograndolaalineacindetcni-
cas y metodologas de anlisis
microbiolgico con FDA, que
beneficianalsectoragropecua-
rio al realizar exportacin de
alimentos frescos con un res-
paldodesucondicinsanitaria
emitidaporLaboratoriosOficia-
Figura 9.Productoshortofrutcolas
lesencargadosdeVigilarlaCalidad
eInocuidaddelosalimentos.
Como resultado de esta colabora-
cinseconformaelLaboratoriode
Diagnstico para la Deteccin de
Organismos Patgenos (LDDOP) y
cuatroLaboratoriosMvilesdeIno-
cuidad, cuya finalidad es generar
diagnsticosconfiablesyoportunos
de productos hortofrutcolas, as
comofuentesdeaguaquepermitan
identificarpuntosdecontaminacin
durante todo proceso de produc-
cin y empaque, que sus resulta-
dosproporcioneninformacinpara
determinarlasaccionespreventivas
y/o correctivas a implementar para
reducir los riesgos por contamina-
cinenlasunidadesdeproduccin
primaria, con la finalidad de
brindar productos de calidad
e inocuos en los mercados
nacional e internacional (Fi-
gura10).
El Laboratorio para la De-
teccin de Organismos Pa-
tgenos tiene como misin
realizar la deteccin e identi-
ficacin oportuna de conta-
minantes microbiolgicos en
productos agrcolas de pro-
duccin primaria, as como
contaminantes qumicos en
fluidos de ganado bovino
Figura 10. Laboratorio de Diagnstico para
la Deteccin de Organismos Patgenos
(LDDOP).
75
AGRO
PRODUCTIVIDAD
Relatora:(SENASICA)
parasatisfacerlasnecesidadesdenuestrosclientesbajoelesquemadecali-
daddelanormaNMX-EC-17025-IMNC-2006.
Los procedimientos operativos para la deteccin e identificacin de los
organismos patgenos en muestras de productos agrcolas, en agua y en
superficies de contacto empleados por el LDDOP, se realizan a travs de
equipos y metodologas de PCR-RT, los cuales cuentan con un certificado
de la Association of Official Analytical Chemists (AOAC International) y la
Association Franaise de Normalisation (AFNOR). Dichos organismos reco-
nocenquelosMtodosOficialesdeAnlisissonaceptables,brindancredibi-
lidadyconfianza,ysonvlidosentodoelmundo(Figura11).
En caso de obtener resultados positivos presuntivos se aplican mtodos
convencionales que, mediante pruebas bioqumicas y la utilizacin de los
mediosdecultivoapropiados,permitenladiferenciacin,seleccinyaisla-
mientodelpatgenoblanco.
Determinacin de clembuterol
Adicionalalanlisisparalaidentificacindeorganismospatgenosenpro-
ductosvegetalesserealizalaidentificacinycuantificacinderesiduosde
clembuterolenmuestrasdefluidosdebovinos.Lasmuestrasaanalizarson
obtenidasporpersonaloficialyprovienendeunidadesdeproduccinins-
critasalProgramaProveedorConfiable;stefueestablecidoporelSENA-
Figura 11. Registro e identificacin de la muestra, preparacin y homogenizacin de
la muestra, enriquecimiento de la muestra, extraccin de cidos Nucledos del pat-
geno blanco, ejecucin de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa o el Ensayo de
Fluorescencia Ligado a Enzimas, interpretacin de resultados y emisin de resultados
presuntivos.
SICA para vigilar y evitar el uso de
dicha sustancia. Las muestras son
obtenidasenlosoperativosrealiza-
dos en conjunto con la Secretara
de Salud, a travs de la Comisin
Federal para la Proteccin contra
Riesgos Sanitarios (COFEPRIS), la
ProcuraduraGeneraldelaRepbli-
ca (PGR) y los Gobiernos Estatales
(Figura12).
El procedimiento operativo para la
determinacin de Clembuterol en
muestrasdefluidosdebovinos(sue-
royorina)empleadosporelLDDOP
se realiza a travs de la tcnica de
ELISA(EnsayodeInmunoabsorcin
LigadoaEnzimas),basadaenlare-
accin antgeno-anticuerpo, con el
Kit Ridascreen-Biopharm, metodo-
loga aceptada por la Secretara de
SaludySAGARPAatravsdesusr-
ganos desconcentrados COFEPRIS
ySENASICA.Consisteengeneralen
la separacin del suero sanguneo
de la muestra, centrifugacin del
suero u orina, sensibilizacin de la
placa,colocacindelosestndares,
controles, blancos y muestras, apli-
cacindelcromgenoysolucinde
paroylecturadeabsorbanciaa450
nm.ElLaboratorioparalaDeteccin
deOrganismosPatgenos(LDDOP)
cuentaconunainfraestructurafsica
yhumanadeprimernivelenmateria
dediagnsticomicrobiolgico.Est
provistoconreasdiseadasacorde
al proceso analtico y con equipos
devanguardiaquepermitenbrindar
un servicio de calidad en el anlisis
microbiolgicodelasmuestras.Las
metodologas implementadas por
elLaboratoriopermitenobtenerre-
sultados presuntivos en 36 horas,
unamediantelatcnicadePCR-RT
(ReaccinenCadenadelaPolime-
rasa en Tiempo Real) y otra ELFA
(Ensayo de Fluorescencia Ligado a
enzimas), ambas altamente sensi-
blesyespecficas(Figura13).
76
AGRO
PRODUCTIVIDAD
AGRO
PRODUCTIVIDAD
Figura 12.Tomademuestrasdefluidosenanimalesyprocesamientoenlaboratorio.
Figura 13.InfraestructurayequipodelaboratoriosdelSENASICA.
Por otra parte, los mtodos con-
vencionales consisten en utilizar
medios selectivos y diferenciales
paraelaislamientodelabacteriade
inters. Una vez aislada, se proce-
de a la serotipificacin mediante la
aplicacindesuerossomticos,fla-
gelaresycapsulareslacualpermite,
por aglutinamiento, discriminar la
pertenencia de un patgeno a un
determinado grupo serolgico. Fi-
nalmente,enelanlisismicrobiol-
gico,laimplementacindelaTcni-
cadePFGE(ElectroforesisdeCam-
pos Pulsados), tcnica altamente
discriminatoria, estable y reprodu-
cible,consideradacomoelmtodo
de eleccin para la epidemiologa
molecular de bacterias patgenas,
determina la subtipificacin mole-
cular(huellagenticadelpatgeno)
a travs del anlisis completo del
cidonucleicodelabacteriaconla
utilizacindeenzimasderestriccin
que digieren el ADN en segmentos
y tamaos especficos, generando
un patrn nico y exclusivo de la
bacteria, el cual se compara con la
basededatosdePulseNetdelCDC
(Control Disease Center) para de-
terminar el origen y la distribucin
mundialdelpatgeno(Figura14).
Centro nacional de referencia
de plaguicidas y contaminantes
(CNPYC)
Este centro realiza los servicios de
anlisisparaidentificacinycuantifi-
cacinderesiduosdeplaguicidasy
contaminantesenalimentosdeori-
genvegetal,conmuestrasdetodos
losestadosdelaRepblicaMexica-
naconlaintencinde:
Coadyuvar en las acciones
de vigilancia de la aplicacin
de sistemas de reduccin de
riesgos, participando en el
anlisis de muestras de pro-
ductosdeorigenvegetalpro-
venientes de los programas
nacionalesdemonitoreo.
Satisfacer las necesidades de
losusuarios,cumpliendocon
las atribuciones y las disposi-
cionesoficialesenlamateria.
Cumplirlosrequisitosdedes-
empeotcnicoenelanlisis
deresiduosdeplaguicidasen
vegetales establecidos por
las autoridades sanitarias de
losgobiernosconlosquese
tienen acuerdos comerciales
para la exportacin de pro-
ductosdeorigenvegetal.
Coadyuvar a la atencin de
alertas sanitarias y otras noti-
ficaciones sobre embarques
originariosdeMxico.
Proceso analtico
Los anlisis se llevan a cabo me-
diante la ejecucin de mtodos
internosbasadosenelmtodopu-
blicado por la FDA de los Estados
Unidos para anlisis de plaguicidas
PAM (Manual de Anlisis de Pla-
guicidas por sus siglas en ingls)
77
AGRO
PRODUCTIVIDAD
Relatora:(SENASICA)
Figura 14.Mtodosconvencionalesparaladeteccindepatgenosmicrobiolgicos.
que permiten procesar productos
con alto contenido de humedad,
productos secos y con alto con-
tenidograsopararealizarladetec-
cin,identificacin,confirmaciny
cuantificacin de residuos de pla-
guicidasdelosgruposqumicosde
organofosforados,organoclorados,
organonitrogenados, piretroides y
carbamatos. El proceso que sigue
de rutina el CNRPyC consta de las
siguientesetapas:
Recepcin y molienda: En esta
etapaserevisanlascondicionesde
llegada de las muestras y se regis-
tralainformacinquelaacompaa,
para asegurar la trazabilidad de la
misma. En caso de que la muestra
nocumplaconlascondicionespara
el anlisis se rechaza y se informa
al cliente para considerar la reposi-
cin.Conlamoliendasereduceel
tamaoyseseleccionalaporcina
analizar. La molienda de la porcin
analticanossirveparahomogenei-
zar la muestra y facilitar la extrac-
cin.
Extraccin y particin: Se realiza
una extraccin slido lquido en la
quesevaarecuperarlamayorparte
posibledeplaguicidasdelamuestra
por solubilidad de stos en los di-
solventes orgnicos utilizados. Para
estepasoseocupan50gdemues-
trahomogneayencondicionesde
se para reducir el volumen y maxi-
mizarlaposibilidaddedeteccinde
losplaguicidasrecuperados.
Purificacin: En caso de observar
interferencias en los extractos de
las muestras se aplica un proceso
de purificacin con sales de flori-
sil.Unavezquesetieneelextracto
concentrado y, cuando es el caso,
purificado, se analiza por mtodos
cromatogrficos para detectar la
presenciadealgnplaguicida.Elpri-
merpasoeslabsquedaexhaustiva,
ya que el CNRPyC no tiene limita-
cionesencuantoalnmerodepla-
guicidasquebusca;esdecir,queva
arastrearcualquierposibleplaguici-
daqueseencuentreenelextracto
delamuestrahastatenerlacerteza
dequeestonopresente.ElCNR-
PyC puede utilizar el mtodo Que-
chersparalaextraccinydeteccin
de posibles plaguicidas, el cual se
fundamenta en un principio similar
al del PAM, de extraccin slido-
lquido, pero con tan solo 15 g de
muestray15ml.desolventes.Lase-
paracindelasfasesslidaylquida
esporcentrifugacinylainyeccin
es directa en cromatgrafos con
detectoresdemasas.Esimportante
sealarquenoexistenlosmtodos
universales para extraer y detectar
plaguicidas; en muchas ocasiones
se requiere combinar los mtodos
paraasegurarlamejorrecuperacin
ydeteccinposible.Cuandosede-
tecta un candidato a plaguicida se
debe confirmar por medio del uso
dediferentestiposdecolumnascro-
matogrficas en las que cambia la
polaridaddelasmismas,loquemo-
dificaeltiempoqueuncompuesto
tardaenpasaratravsdeella;siel
posible plaguicida se compara con
un estndar puro y coincide en los
tiempos de permanencia dentro
de las diferentes columnas croma-
togrficas, entonces se confirma;
anlisis.Unavezrealizadoelextrac-
to se aplican lavados para eliminar
loscomponentesdelamuestraque
no son plaguicidas y se eliminan
junto con la fase acuosa; esta acti-
vidad se realiza mediante agitacin
manual.Enestaetapaseobtieneel
extractofinal,quedebeconcentrar-
78
AGRO
PRODUCTIVIDAD
AGRO
PRODUCTIVIDAD
en caso de que no se pueda hacer por este medio, se
utilizanespectrmetrosdemasasconlosquelaconfir-
macinsedaporpesosatmicosespecficosparacada
compuesto.Lacapacidaddedeteccinycuantificacin
de plaguicidas con los equipos que cuenta el CNRPyC
esdelordendelosnanogramosdeplaguicidaenunki-
logramodemuestra,esdecir,0.000000001gramopor
kilogramo.
Confiabilidad de los resultados
LaAsociacindeNormalizacinyCertificacin(ANCE)
otorg el certificado en la norma NMX-CC-9001-IM-
NC-2008 (ISO-9001 y su equivalente internacional) al
CentroNacionaldeReferenciadePlaguicidasyConta-
minantes.Deigualforma,laEntidadMexicanadeAcre-
ditacin (EMA) otorg al Centro otra certificacin en la
normaNMX-17025.ConestareddelaboratoriosSENA-
SICAdemuestraquelosproductosproducidosenelpas
cumplen con todos los estndares de calidad, sanidad
e inocuidad, coadyuvando a la seguridad alimentaria y
manifestandosuresponsabilidadconlosconsumidores.
AGRO
PRODUCTIVIDAD

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) y un testigo sin productos. Los cuatro

10,000 diluido al 80%. Con

) (Robert et al., 2006), el Plan-

(A-Tech Bioscientific, 2010) y, ms recientemente, el SETIS

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