INTRODUCCIN A LA METROLOGA QUMICA

CURVAS DE CALIBRACIN EN LOS MTODOS ANALTICOS

Mara Antonia Dosal Marcos Villanueva Marzo 2008

Un procedimiento analtico muy utilizado en anlisis cuantitativo es el llamado de calibracin
que implica la construccin de una curva de calibracin. Una curva de calibracin es la
representacin grfica de una seal que se mide en funcin de la concentracin de
un analito. La calibracin incluye la seleccin de un modelo para estimar los parmetros que
permitan determinar la linealidad de esa curva. y, en consecuencia, la capacidad de
un mtodo analtico para obtener resultados que sean directamente proporcionales a la
concentracin de un compuesto en una muestra, dentro de un determinado intervalo
de trabajo. En el procedimiento se compara una propiedad del analito con la de estndares
de concentracin conocida del mismo analito (o de algn otro con propiedades muy similares
a ste). Para realizar la comparacin se requiere utilizar mtodos y equipos apropiados para
la resolucin del problema de acuerdo al analito que se desee determinar.

La etapa de calibracin analtica se realiza mediante un modelo de lnea recta que consiste
en encontrar la recta de calibrado que mejor ajuste a una serie de n puntos experimentales,
donde cada punto se encuentra definido por una variable x (variable independiente,
generalmente concentracin del analito de inters) y una variable y (variable dependiente,
generalmente respuesta instrumental). La recta de calibrado se encuentra definida por una
ordenada al origen (b) y una pendiente (m), mediante la ecuacin y = mx + b .

A partir de la curva de calibracin (conjunto de concentraciones que describen el intervalo
en el cual se deber cuantificar el compuesto por analizar) y a fin de asegurar que la recta
encontrada con los puntos experimentales se ajuste correctamente al modelo matemtico de
la ecuacin se calculan los valores de la ordenada al origen, la pendiente y el coeficiente de
determinacin (r
2
).

Por tener una buena exactitud y confiabilidad estadstica, el mtodo ms empleado
para encontrar los parmetros de la curva de calibrado es el mtodo de los mnimos
cuadrados Este mtodo busca la recta del calibrado que haga que la suma de los
cuadrados de las distancias verticales entre cada punto experimental y la recta de
calibrado sea mnima o tienda a cero. A la distancia vertical entre cada punto experimental
y la recta de calibrado se le conoce como residual. En forma grfica se representa como:




Fig. 1 Curva de calibracin con n = 5
19
Antologa de Qumica Analtica Experimental



De acuerdo a este mtodo, las expresiones matemticas para calcular la pendiente (m) y la
ordenada al origen (b), as como el coeficiente de determinacin (r
2
) son:




PENDIENTE


m =
n

xy

x

y
n

x
2
(

x)
2



ORDENADA AL ORIGEN

b =
=
y
m

x n



COEFICIENTE DE
DETERMINACIN


2

r
2
=
(n( xy)( x)( y))

(n( x
2
)( x)
2
)(n( y
2
)( y)
2
)

En la prctica para construir la curva de calibracin se utilizan disoluciones que contienen
concentraciones conocidas de analito, llamadas disoluciones patrn o estndar.
Los estndares o disoluciones patrn para construir la recta de calibrado deben ser
preparadas en forma independiente, a partir de una o varias soluciones madre; el nmero de
puntos a escoger depender del uso que se d a la recta de calibrado.
Si bien con dos puntos se puede construir una curva, estadsticamente se requieren por los
menos tres para que la curva sea confiable; este nmero se suele aplicar a mtodos de
rutina perfectamente establecidos y validados (proceso por el cual se demuestra, por
estudios de laboratorio, que la capacidad del mtodo satisface los requisitos para la
aplicacin analtica deseada).

Sin embargo, si el mtodo est en una etapa de desarrollo, el nmero de puntos mnimo
ser de cinco o seis para que la variabilidad sea mnima y el intervalo lineal sea suficiente.
Hay que considerar que un aumento en el nmero de puntos experimentales implicara mayor
fiabilidad en la recta de calibrado. La verificacin del comportamiento de un analito
mediante una curva de calibracin requiere un mnimo de cinco puntos para un intervalo
de confianza del 95 % y de ocho puntos para uno del 99 %.

Cabe mencionar que en la prctica es muy importante efectuar la medida del blanco
4
Se
llaman disoluciones blanco o simplemente blancos a las disoluciones que contienen todos
los reactivos y disolventes usados en el anlisis, pero sin el analito. Los blancos miden la
respuesta del procedimiento analtico a las impurezas o especies interferentes que existan en
los reactivos o, simplemente, a las especiales caractersticas del instrumento de medida.

La medida de la seal del blanco puede realizarse: a) registrando directamente la seal del
blanco e incluir este punto experimental en la recta de calibrado con x=0 como seal del

4
BLANCO. Definido por IUPAC como la lectura resultante originada por la matriz, los reactivos o cualquier otra
medida residual debida al instrumento a al proceso de medicin, que contribuye al valor obtenido en el proceso
analtico para el mensurando.
20
Antologa de Qumica Analtica Experimental


blanco; o b) restar a la seal medida con el analito, la seal media de varias lecturas del
blanco (seal observada blanco).

Es importante sealar que los mtodos analticos son establecido por
instituciones nacionales o internacionales que proporcionan procedimientos y caractersticas
del mtodo y que concluyen con indicadores de calidad (denominados caractersticas del
desempeo analtico) que suelen incluir: exactitud, precisin, especificidad,
5
, adems de los
parmetros que se determinan a partir de los curvas de calibracin

Independientemente de la tcnica instrumental responsable de la seal analtica (cuyas
caractersticas se estudian en forma particular) los parmetros que se determinan a partir de
las curvas de calibracin obtenidas con cualquiera de ellas son:

- la linealidad
- la sensibilidad
- el lmite de deteccin
- el lmite de cuantificacin
- el intervalo analtico

Linealidad del sistema de medicin

La linealidad de la curva de calibracin (habilidad para asegurar que los resultados obtenidos
directamente o por medio de una transformacin matemtica definida) es un requerimiento
fundamental en la prctica del anlisis qumico cuando se realizan curvas de calibracin. En
general la linealidad no se cuantifica pero se observa por simple inspeccin o
mediante pruebas significativas de no linealidad. La no linealidad se elimina mediante la
seleccin de un intervalo de operacin ms restringido. Cabe mencionar que el intervalo
lineal puede ser distinto para matrices diferentes de acuerdo al efecto de las interferencias
procedentes de la matriz.

Como ya se mencion con anterioridad, para demostrar la linealidad se requieren cumplir
ciertos criterios de aceptacin en la que estadsticamente se puede justificar esa linealidad;
para ello es necesario calcular:

- la pendiente (m)
- la ordenada al origen (b)
- el coeficiente de determinacin (r
2
)

Este clculo se realiza fcilmente con una calculadora cientfica sencilla por lo que
normalmente no se recurre a las conocidas ecuaciones .Como criterio de aceptacin de la
linealidad a partir de la curva de calibracin (conjunto de concentraciones que describen el
intervalo en el cual se deber cuantificar el compuesto por analizar) se considera r
2
>0.98




5
La exactitud indica la cercana de la medida entre el valor aceptado y el verdadero y se expresa mediante el
error
La precisin expresa la concordancia entre varios valores obtenidos de la misma manera.; con frecuencia es ms
fcil conocer la precisin que la exactitud porque no siempre se conoce el valor verdadero
La especificidad requiere que la respuesta del instrumento utilizado sea especfica para el analito que se
determine y que las condiciones de medida de los estndares y el analito sean iguales.
21
Antologa de Qumica Analtica Experimental


Sensibilidad. La sensibilidad de mtodo mide su capacidad para discriminar entre
pequeas diferencias en la concentracin del analito. Dos factores limitan la sensibilidad. la
pendiente de la curva de calibracin y la precisin del sistema de medida.

Para dos mtodos que tengan igual precisin, el que tenga la mayor pendiente ser el ms
sensible; es importante sealar que para determinar la pendiente de la curva se considera
nicamente el intervalo lineal de la misma puesto que cuando la curva pierde su linealidad la
pendiente tambin es diferente.

Por otra parte, es importante mencionar que, al igual que la linealidad, tambin la pendiente
de la curva puede ser distinta para matrices diferentes; esto significa que la pendiente de la
curva depende de todas las condiciones de medida y que stas deben ser iguales (o
al menos similares) para los estndares y la muestra problema

Lmite de deteccin (LD). En general este trmino se define como la mnima concentracin
del analito detectable por el mtodo. Su determinacin es importante (particularmente
en anlisis de trazas) pero los problemas asociados con ella son diversos; estos problemas
han sido estadsticamente estudiados y varios criterios de decisin han sido propuestos.
Aunque ninguno es universal uno de los ms aceptables es el
de la concentracin que correspondera a la medida del promedio del
blanco+ 3s.

El blanco es la seal emitida por el instrumento con una disolucin que contiene las
mismas especies que la muestra problema (pero sin el analito). Para fines de validacin se
considera que deben hacerse 10 mediciones de blancos independientes El valor de 3s se
refiere a tres veces la desviacin estndar al realizar la medicin de estos blancos;
cabe mencionar que la eleccin de estos blancos no siempre es fcil.

Lmite de cuantificacin (LC) Llamado tambin lmite de determinacin, se define como la
ms pequea concentracin del analito que puede ser determinada con un nivel de exactitud
y precisin aceptables. Dependiendo del convenio utilizado se considera como la
concentracin de analito que corresponde al valor del promedio del blanco mas 5, 6 o 10
veces la desviacin estndar del mismo (esta ltima es la ms comn).

Es importante hacer notar que ni LD ni el LC representan niveles a los cuales sea imposible
la cuantificacin del analito; el significado es que el LC representa la mnima concentracin
del analito que puede ser determinada con un aceptable nivel de incertidumbre

Intervalo analtico. Est definido como el intervalo de concentracin en que el analito
puede ser determinado mediante la utilizacin de la curva de calibracin; se considera que
es el comprendido entre el lmite de cuantificacin hasta la concentracin en la cual
se pierde la linealidad de la curva

A ttulo de ejemplo, a continuacin se muestra la curva de calibracin obtenida al
representar la absorcin de radiacin (absorbancia ,A) de disoluciones estndar de
albmina srica. A partir de esta curva se explicarn los parmetros antes mencionados. Se
conoce que el promedio de 10 mediciones del blanco fue 0.015 con una desviacin estndar
de 0.002
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Antologa de Qumica Analtica Experimental
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a




Albmica srica bovina


0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0












0 0.05 0.1
Concentracin ( moles/L)



En esta curva se observa linealidad hasta valores de absorbancia iguales a 0.4; este valor
corresponde a una concentracin igual a 0,0207 mol//L El coeficiente de correlacin de la
curva considerando nicamente estos cuatro puntos es igual a 0,9987 mientras que si se
consideraran todos ellos el coeficiente de correlacin sera igual a 0,9382.

La ecuacin de la curva en este intervalo lineal es:
A= 0,0036 + 17,584 C
Por lo que el lmite de deteccin ser:






y el de cuantificacin
(0, 015 + 3 * 0, 002) 0, 0036
(
17, 584

= 0, 000989mol / L


(0, 015 + 10 * 0, 002) 0, 0036
(
17, 584

= 0, 00176mol / L

La sensibilidad del mtodo es igual a 17.584 mol
-1
L (la absorbancia no tiene unidades)


Incertidumbre en la determinacin de la concentracin de una disolucin de
concentracin desconocida del analito en una muestra mediante el mtodo de la
curva de calibracin

A partir de la ecuacin de la recta obtenida con la curva de calibracin de los diferentes
estndares es posible calcular la concentracin del analito en una muestra
de concentracin desconocida. Para ello se requiere efectuar la medida de la
seal correspondiente y despejar el valor de la concentracin en la ecuacin de la recta.
23
Antologa de Qumica Analtica Experimental


Por ejemplo, supongamos que en el ejemplo de la albmica srica anteriormente descrito se
obtuvo una absorbancia A=0.38 con una muestra de concentracin desconocida. En
este caso :

0.38 = 0,0036 + 17.584 C

al despejar la concentracin (C), se obtiene:
0,38 - 0,0036
C =
17,584


= 2,14x10
-2


De esta ecuacin se observa que hay tres parmetros que son causa de incertidumbre en la
determinacin de la concentracin : 1) la medida (y) efectuada ( en el ejemplo, la
absorbancia A), 2) la de la ordenada al origen (b) de la recta de regresin y 3) la
de la pendiente (m) de la recta . De esta manera el clculo de la concentracin en la
ecuacin anterior se ver afectado por la incertidumbre en estos tres parmetros .
Asumiendo esta incertidumbre como la desviacin estndar en cada uno de ellos se tiene:
0,38 s
y

C =
- 0,0036 s
b

17,584 s
m


De donde el clculo de la incertidumbre
6
para la concentracin de C deber considerar estos
tres componentes. Al calcular las respectivas desviaciones estndar se obtienen los
siguientes valores :

S
y
= 0.00707


S
b
= 0.00900 y


S
m
= 0.62714

se calcula la incertidumbre combinada de los 2 trminos del numerador:

(0.00707)
2
+ (0.00900)
2


=0.01144

Finalmente un clculo simplificado
7
permite calcular la incertidumbre relativa en la
concentracin de la muestra:
|
| |
2
|
|
2
U
c
0.6274 0.01144

C
=

|

|
+

|
= 0.038

\
\
17584
.
.


0.38
.

Si, por ejemplo, la determinacin de la muestra hubiera sido realizada por triplicado, habr
que introducir este dato en la incertidumbre final:



6
Este clculo puede hacerse rpidamente con EXCEL utilizando la herramienta anlisis de datos de la regresin
( se obtienen los valores como error tpico)
7
Se considera que puesto que la ordenada al origen es muy y pequea y tiende a cero, el valor del numerador es
prcticamente igual a 0.38. No se han considerado en el clculo las incertidumbres por el material volumtrico
utilizado por asumirse que es el mismo utilizado para la preparacin de los estndares
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Antologa de Qumica Analtica Experimental




U = C


|
0.6274
|

2
|
0.01144
|
2

+
2

|
S
rep
|

+
| |
|

c
\ 17584 . \
0.38 .
3
|
\ .


Suponiendo que la desviacin estndar en las tres determinaciones efectuadas fuera igual a
0.027 y la concentracin obtenida con la media de las tres fuera igual a 0.0220 , el resultado
final se expresara como:

R= 0.02202*9.03x10
-4
con k=2 y un 95% de probabilidad

El uso de la curva de calibracin para la determinacin de la concentracin de un analito
implica que los estndares contengan, adems del analito, los mismos constituyentes que
contiene la muestra ( misma matriz).


Curva de calibracin con adicin estndar

En ocasiones la matriz de la muestra es compleja y/o desconocida. Por ejemplo una muestra
de sangre contiene muchos constituyentes que no pueden ser incorporados a los estndares
en las disoluciones de los utilizados para la curva de calibracin ; en este caso lo que se
recomienda es aadir a la muestra pequeos volmenes de una disolucin de un estndar
concentrado; de esta manera la matriz que contiene el estndar no difiere mucho de
la propia muestra.

Consideremos, por ejemplo, que una muestra de un analito X en concentracin inicial
desconocida C
x
da una seal M
x
proporcional a dicha concentracin; cuando a esta muestra
se le aade un pequeo volumen de un estndar C
es
del mismo analito, se obtendr una
seal M
x+es
. Como la seal es proporcional a la concentracin del analito y como la matriz
es la misma , es posible escribir:

M
x
= kC
x
y


M
x+es

= k(C
x


+ C
x+es
)


y, por tanto: en una curva de calibracin

C
x


C
x+es


M
x

=
M
x+es

Es evidente que, cuando el estndar se aade en disolucin, tanto la concentracin C
x
del
analito como la concentracin C
x+es
del estndar se vern afectadas por el efecto de
la dilucin y que este efecto deber ser corregido.

Cuando se preparan estndares que contienen la muestra y se representa la concentracin
de los estndares (corregida por el efecto de la dilucin) vs la seal obtenida al medirlos, se
obtiene una curva de calibracin en la cual el intercepto de x corresponde a la concentracin
desconocida
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Antologa de Qumica Analtica Experimental


S
e

a
l

m
e
d
i
d
a

(
A
)




Curva de calibracin con adicin
estndard


0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0

R = 0,995
-10 0 10 20 30
Concentracin de estndares

.

Por ejemplo, en la grfica anterior se representa la curva de calibracin para una muestra de
un analito X al que se han aadido estndares del mismo analito de concentraciones
conocidas (en ppM) y se ha determinado el valor de la absorbancia (A) producida por cada
uno de ellos. Se observa que la concentracin del analito en la muestra, debe ser calculada
para un valor de A=0


b 0.1049
x = = = 6.55 ppM
m 0.016

Para calcular la incertidumbre se procede en forma anloga al caso de la curva de
calibracin sin adicin estndar. Para ello se debern considerar las incertidumbres
asociadas a cada uno de los parmetros requeridos para calcular el valor de x ; en este
caso:
s
b
= 0, 007

s
m
= 0, 0005

Y, finalmente, el clculo simplificado permitir calcular la incertidumbre relativa en la
concentracin de la muestra:

U
c
|


0.007

2 2

| |
0.0005
|

C
=
|

+
|

= 0.0702

\
0.1049
. \ 0.016
.

y U
c

= 6.55 * 0.0702 = 0.0459

Si la determinacin de la muestra hubiera sido realizada n veces , habra tambin que
introducir este dato en el clculo de la incertidumbre final.
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Antologa de Qumica Analtica Experimental



Bibliografa

- Harris Daniel C. Anlisis Qumico Cuantitativo, 2 edicin. Editorial Reverte,
Espaa
2001.
- Miller James N., Miller Jane C. Estadstica y Quimiometria para Qumica
Analtica, 4
edicin, Editorial Prentice Hall, Espaa 2002.
- Danzer Klaus, Currie Lloyd A. Guidelines for calibration in analytical chemistry
Part I.
Fundamentals and single component calibration, IUPAC Pure & Appl. Chem,
Vol.70, No.4, pp.993-1014, 1998.
- Alcntara Pineda A. Rodrguez R. Gua de validacin de Mtodos Analticos, Editada
por
el Colegio Nacional de Qumicos Farmacuticos Bilogos Mxico, A. C., M