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LABORATORIO DE
SALUD AMBIENTAL



PROCEDIMIENTO DE ANLISIS PARA LA
DETECCIN DE Salmonella spp.

LSA-P5.4-ML12

INDICE

1. OBJETIVO ............................................................................................................... 2

2. ALCANCE ............................................................................................................. 2

3. DOCUMENTOS RELACIONADOS ... .. 2

4. DEFINICIONES...... 2

5. RESUMEN .. 2

6. DESARROLLO..... 2

7. FORMULARIOS Y REGISTROS... 8

8. REFERENCIAS .. 9

9. ANEXOS .... 9









FECHA DE APROBACION: 25 de agosto de 2008
FECHA DE REVISION: 25 de agosto de 2008

REVISION: 02





NOMBRE CARGO FIRMA
APROBO

Blga. Soledad Osorio Alva.
Directora del Laboratorio de Salud
Ambiental DIGESA.

REVISO

Blga. Edith Villanueva
Huamn
Aseguramiento de calidad Laboratorio de
Salud Ambiental DIGESA.

Blga. Aydee Valenzuela
Warthon.
Jefa del rea de Microbiologa de
Alimentos. Laboratorio de Salud
Ambiental DIGESA.

ELABORO Blga. Patricia Nez Ramos
Analista del rea de Microbiologa de
Alimentos. Laboratorio de Salud
Ambiental DIGESA.


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PROCEDIMIENTO DE ANLISIS PARA LA
DETECCIN DE Salmonella spp.
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I OBJETIVO

Describir la metodologa para realizar el ensayo de deteccin de Salmonella spp. de acuerdo al
mtodo horizontal para la deteccin de Salmonella spp ISO 6579: 2002 (E).

II ALCANCE

Este procedimiento se aplica para realizar el ensayo de deteccin de Salmonella en muestras de
de alimentos destinados para el consumo humano.

III DOCUMENTOS RELACIONADOS

Instructivo de preparacin y esterilizacin de medios de cultivo.

IV DEFINICIONES

4.1 Salmonella: microorganismo que forma colonias tpicas en un medio slido selectivo y que
muestran caractersticas bioqumicas y serolgicas descritas cuando se llevan a cabo las
pruebas de acuerdo con este procedimiento.

4.2 Deteccin de Salmonella: es determinar la presencia o ausencia de la Salmonella, en una
masa o volumen de muestra, cuando se efectan pruebas de acuerdo con este procedimiento.

V RESUMEN

La deteccin de Salmonella, requiere de 5 etapas sucesivas:
a) Enriquecimiento no selectivo
b) Enriquecimiento selectivo
c) Siembra en placa de medios slidos selectivos y diferenciales.
d) Estudio de las caractersticas bioqumicas de las colonias sospechosas, en los medios
adecuados
e) Anlisis antignico. En dos fases: a) empleo del antisuero polivalente O y del antisuero
Polivalente H, b) utilizacin de los antisueros especficos del grupo 0 y H.

Los pasos a) hasta c) se refieren al aislamiento y los d) y e) a la identificacin. El paso a) tiene
como fin la revitalizacin de las Salmonellas daadas por las diferentes condiciones de
tratamientos industriales o de almacenamiento. El paso b) es de enriquecimiento selectivo y sirve
para favorecer el crecimiento de las salmonellas en un ambiente que puede contener gran nmero
de bacterias diferentes de ellas mismas. El paso c) permite la visualizacin de las colonias
sospechosas, por su aspecto caracterstico. El paso d) se refiere a la identificacin bioqumica. El
paso e) conduce por medio de pruebas serolgicas a la identificacin definitiva de las cepas
sospechosas como miembro del gnero Salmonella.

VI DESARROLLO

6.1 Medios de cultivo, reactivos y sueros.

6.1.1 Medio de pre-enriquecimiento no-selectivo: agua peptonada tamponada.
6.1.2 Primer medio de enriquecimiento selectivo: Rappaport-Vassiliadis con soya (Caldo RVS).
6.1.3 Segundo medio de enriquecimiento selectivo: Caldo Muller-Kauffmann tetrationato con
novobiocina (Caldo MKTTn).
6.1.4 Medio slido selectivo:
6.1.4.1 Primer medio: Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (Agar XLD).
6.1.4.2 Segundo medio: Agar Verde Brillante Rojo de Fenol Lactosa segn Kauffmann
6.1.5 Agar nutritivo.
6.1.8 Agar hierro tres azcares (Agar TSI).
6.1.9 Agar urea (Christensen).

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6.1.10 Medio L-lysina descarboxilasa.
6.1.11 Reactivo para la deteccin de la -galactosidasa (o discos de papel preparado, usado de
acuerdo con las instrucciones del fabricante).
6.1.12 Reactivo para Voges Proskauer (Reactivo VP).
6.1.13 Reactivos para la reaccin de indol (Reactivo de Kovack).
6.1.14 Agar Nutritivo semi-slido.
6.1.15 Solucin salina fisiolgica.
6.1.16 Antisueros O (monovalente o polivalente), antisuero Vi, antisuero H (monovalente o polivalente).

6.2 Equipos y materiales.

6.2.1 Balanzas, 2000 g de capacidad y sensibilidad de 0,01g.
6.2.2 Incubadora, a 37C 1C.
6.2.3 Incubadora bao Mara a 41.5 C 1C
6.2.4 Incubadora bao Maria a 44 a 47 C.
6.2.5 Asas de siembra, de platino/iridio o nquel/cromo, aproximadamente 3 mm de dimetro.
6.2.6 Cucharas estriles u otro instrumento para transferir las muestras.
6.2.7 Botella o frascos de cultivo de boca ancha, pueden usarse botellas o frascos de tapa hermtica
metlicos no txicos o de plstico de 500 mL de capacidad. Frascos, erlenmeyer, beakers
estriles de 250 mL u otros recipientes de capacidad apropiada para colocar la muestra.
6.2.8 Tubos de ensayo, de 16 x 160 mm, 13 x 100 mm.
6.2.9 Pipetas graduadas, estriles capacidad nominal de 10 mL y un 1mL, graduadas respectivamente
en divisiones de 0,5 mL y 0,1mL.
6.2.10 Placas Petri, estriles de 15 x 100 mm de dimetro.

6.3 Precauciones de seguridad
Con el fin de salvaguardar la salud del personal del laboratorio, es esencial que las pruebas para
detectar Salmonella se realicen solo en laboratorios equipados adecuadamente, bajo el control
de un microbilogo calificado, y que se tome sumo cuidado en la disposicin de todos los
materiales usados e incubados.

6.4 Preparacin de las muestras, porcin de ensayo y suspensin inicial

6.4.1 Para la preparacin de la suspensin inicial, aadir 25 g mL de la muestra a 225 mL del medio
de pre-enriquecimiento.
6.4.2 Para reducir la cantidad de ensayos cuando existe ms de una porcin de muestra de 25 gramos
de un lote de alimentos que tiene que ser examinado y cuando existe la posibilidad de
compositar (mezclar porciones de unidades de muestras de un lote) sin afectar el resultado para
el alimento particular, las muestras a analizar pueden ser compositadas, por ejemplo: si 10
porciones de prueba de 25 gramos van a ser examinadas, combinar las 10 unidades para formar
un compsito de muestra de 250 g y agregar 2.25 Litros de caldo de pre-enriquecimiento.
Tambin se compositaran los inculos del caldo de pre-enriquecimiento a inocular en los medios
de enriquecimiento selectivo (caldo RV y MKTTn) de manera que se use 100 mL de medio
selectivo.
6.4.3 El mximo nmero de unidades analticas de 25 gramos que pueden ser compositadas es 15,
resultando en un peso de composito de 375 g. Incrementar el nmero de unidades de composito
ms de 15 puede resultar en un decrecimiento de la sensibilidad.
6.4.4 Tener cuidado con alimentos de baja humedad como leche en polvo no instantnea, leche en
polvo entera y harina de soya; en estos casos, 25 g. de unidades analticas no deben ser
compositadas, deben analizarse individualmente.

6.5 Pre-enriquecimiento no-selectivo

6.5.1 Incubar la suspensin inicial a 37 C 1C, por 18 2 horas.


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6.6 Enriquecimiento selectivo

6.6.1 De la suspensin inicial obtenida en 6.5, transferir 0,1mL a un tubo que contenga 10 mL de caldo
Rappaport Vassiliadis (RV) y 1 mL a un tubo conteniendo 10 mL del caldo MKTTn.

6.6.2 Incubar el caldo Rappaport Vassiliadis (RV) a 41.5 C 1C por 24h 3h y el caldo MKTTn a
37C 1C por 24h 3h.Tener cuidado de la temperatura mxima de incubacin permitida, no
debe exceder de 42.5C.

6.7 Plaqueado e identificacin

6.7.1 Del cultivo obtenido del medio RV, luego de la incubacin por 24h, inocular por medio de un asa,
en la superficie de una placa Petri conteniendo el primer medio selectivo (agar XLD) de manera
que se puedan obtener colonias bien diferenciadas.

6.7.2 Proceder de la misma manera con el segundo medio selectivo agar verde brillante rojo de fenol.
6.7.3 Del cultivo obtenido en el caldo MKTTn, repetir el procedimiento descrito en 6.7.1 y 6.7.2, con los 2
medios selectivos.
6.7.4 Invertir las placas obtenidas en 6.7.1, 6.7.2 y en 6.7.3 e incubarlas a 37C para el primer medio
selectivo. Se deben seguir las instrucciones del fabricante para el segundo medio selectivo.
6.7.5 Despus de la incubacin por 24 h 3h, examine las placas y observe la presencia de colonias
tpicas de Salmonella y colonias atpicas que podran ser Salmonella (ver nota). Marcar su
posicin en la base de la placa.
Las colonias tpicas de Salmonella en agar XLD tienen un centro negro y una zona ligeramente
transparente debido al cambio de color del indicador.

Nota: Las colonias de Salmonella, con hidrogeno sulfurado H2S negativas en XLD (e.g S. Paratyphi A) son rosadas con un
centro rosado oscuro. Salmonella Lactosa-positivas en XLD son amarillas con o sin centro negro.

Nota: En el agar verde brillante rojo fenol, las colonias tpicas de Salmonella, lactosa negativa son de color rosa plido,
transparente con halo rojo.
6.7 Confirmacin
6.7.1 General
Pueden utilizarse kits disponibles comercialmente para la identificacin bioqumica de Salmonella. Estos
deben usarse siguiendo las indicaciones del fabricante.

6.7.2 Seleccin de colonias para su confirmacin
Para la confirmacin, tomar cinco colonias consideradas tpicas o sospechosas de cada placa de medio
selectivo (ver 6.7.5),
Si en una placa existen menos de 5 colonias tpicas o sospechosas, confirmar todas las colonias.
Estriar las colonias seleccionadas sobre la superficie de las placas de Agar nutritivo presecado, de
manera que permita el desarrollo de colonias bien aisladas. Incubar las placas inoculadas a 37C 1 h
por 24 h 3h.
Utilizar cultivos puros para la confirmacin bioqumica y serolgica.

6.7.3 Confirmacin bioqumica

Inocular en los medios especificados 6.7.3.1 a 6.7.3.6 cada uno de los cultivos obtenidos de las colonias
seleccionadas (6.8.2).

6.7.3.1 Agar TSI

Estriar en la superficie del agar, luego en la columna por puntura. Incubar a 37C 1 h por 24 h 3h.

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Interpretar los cambios del medio de cultivo como se seala a continuacin:

a) Columna

- Amarillo : glucosa positiva (fermentacin de la glucosa)
- Rojo o sin cambio : glucosa negativa (no fermenta la glucosa)
- Negro : formacin de hidrgeno sulfurado
- Burbujas o rotura : formacin de gas a partir de la glucosa

b) Superficie inclinada

- Amarillo : lactosa y/o sacarosa positiva. (uso de lactosa
y/o sacarosa).
- Rojo o sin cambio de color : lactosa y/o sacarosa negativa. (uso de lactosa
y/o sacarosa).

Los cultivos tpicos de Salmonella presentan alcalinidad (rojo) en la superficie inclinada con formacin de
gas y cido (amarillo) en la columna (en 90% de los casos) con formacin de hidrgeno sulfurado
(ennegrecimiento del agar).

Cuando una Salmonella lactosa-positiva es aislada, la superficie inclinada del TSI es amarilla. Por lo
tanto, la confirmacin preliminar de los cultivos de Salmonella no deber basarse solamente en los
resultados de los ensayos del agar TSI.

6.7.3.2 Agar Urea

Estriar en la superficie del agar. Incubar a 37C 1 C por 24 h 3h y examinarlo en intervalos.
Si la reaccin es positiva, se hidroliza la urea liberando amoniaco, lo que cambia el color de rojo fenol a
rosa-rosado luego a un cereza intenso. La reaccin es frecuentemente aparente despus de las 2 h a 4
horas.

6.7.3.3 Medio L-Lisina descarboxilasa (LIA)

Estriar en la superficie e incubar a 37C 1 h por 24 h 3h. Un color prpura luego de la incubacin,
indica una reaccin positiva. Un color amarillo indica una reaccin negativa.

6.7.3.4 Deteccin de -Galactosidasa

Suspender una asada de la colonia sospechosa en un tubo que contenga 0,25 mL de solucin salina.
Aada 1 gota de Tolueno y agitar el tubo. Coloque el tubo en bao de agua a 37C y dejar durante varios
minutos (aproximadamente 5 minutos). Aada 0,25 mL del reactivo para la deteccin de -galactosidasa
y mezclar.

Colocar nuevamente el tubo en bao de agua a 37C 1 h por 24 h 3h. Examinar el tubo en
intervalos.
Un color amarillo indica una reaccin positiva. La reaccin aparece frecuentemente luego de 20 minutos.
Si se utiliza discos de papel, siga las instrucciones del fabricante.

6.7.3.5 Medio para la reaccin de Voges-Proskauer

Suspender con un asa una colonia sospechosa en un tubo estril que contenga 3 mL del medio Voges-
Proskauer. Incubar a 37C 1 h por 24 h 3h.
Despus de la incubacin, aada 2 gotas de solucin de creatina, 3 gotas de solucin etanlica de 1-
naftol (VP1) y luego 2 gotas de hidrxido de potasio (VP2), agitar despus de aadir cada reactivo.

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Despus de 15 minutos, observar la formacin de un color rosado a rojo brillante, indica reaccin
positiva.

6.7.3.6 Medio para la reaccin de indol

Inocular un tubo con 5 mL de medio Triptona / Triptfano con la colonia sospechosa.
Incubar a 37C 1 h por 24 h 3h. Despus de la incubacin, aada 1 mL del reactivo de Kovacs.
La formacin de un anillo rojo indica una reaccin positiva. La formacin de un anillo amarillo-marrn
indica una reaccin negativa.

6.7.3.7 Interpretacin de las pruebas bioqumicas

Generalmente Salmonella presenta las siguientes reacciones ver Tabla 1.

Tabla 1

Prueba
Cepas de Salmonella
S. Typhi S. Paratyphi A S. Paratyphi B S. Paratyphi C Otros cepas
Reaccin %
a
Reaccin %
a
Reaccin %
b
Reaccin %

b
Reaccin %
a

TSI acido de glucosa
+
100
+
100
+

+

+
100
TSI gas de glucosa
-
0
+
100
+

+

+
92
TSI acido de lactosa - 2 - 100 - - - 1
TSI acido de sacarosa
-
0
-
0
-

-

-
1
TSI produccin de H2S + 97 - 10 + + + 92
Hidrlisis de urea
-
0
-
0
-

-

-
1
Descarboxilacin de lisina + 98 - 0 + + + 95
Reaccin de -
Galactosidasa
-
0
-
0
-

-

-
2
Reaccin de Voges-
Proskauer
-
0
-
0
-

-

-
0
Produccin de indol - 0 - 0 - - - 1
a Estos porcentajes indican que no todos los serotipos aislados de Salmonella muestran las reacciones marcadas + o -. Estos
porcentajes pueden variar entre serotipos de pas a pas y de producto a producto.
b Los porcentajes no estn disponibles en alguna literatura.
c Salmonella Typhi es anaerognica.
d La Salmonella entrica subespecie arizonae da una reaccin positiva o negativa pero siempre es -galactosidasa positiva. Para el
estudio de las cepas, puede ser til para llevar a cabo pruebas complementarias.


6.7.4 Confirmacin serolgica

La deteccin de la presencia de antgenos de Salmonella, O, Vi y H son examinadas mediante la
aglutinacin en lmina con los sueros apropiados y provenientes de colonias puras y luego que las cepas
auto-aglutinables han sido eliminadas.

6.7.4.1 Eliminacin de las cepas auto-aglutinables

Colocar una gota de solucin salina en un porta objeto cuidadosamente limpiado. Dispersar en esta gota
una parte de la colonia a examinarse, para obtener una suspensin homognea y turbia.
Mueva la lmina suavemente de 30 60 segundos.

Observe el resultado contra un fondo oscuro, preferible con ayuda de una luna de aumento. Si las
bacterias se han aglutinado en unidades ms o menos distintas, la cepa es considerada auto-aglutinable
y no debe ser sometida a las siguientes pruebas, ya que la deteccin de antgenos es imposible.

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6.7.4.2 Examen con Antgenos-O
Utilizar una colonia pura reconocida como no auto-aglutinable, proceda de acuerdo a lo acordado en
6.8.4.1, pero utilizando una gota del suero anti-O en lugar de la solucin salina.
Si ocurre aglutinacin, la reaccin es considerada positiva. Utilizar los sueros poli y monovalente uno
luego del otro.

6.7.4.3 Examen con Antgenos-Vi

Proceder de acuerdo en 6.7.4.1, pero utilizando una gota del suero anti-Vi en lugar de solucin salina.
Si ocurre aglutinacin, la reaccin es considerada positiva.

6.7.4.4 Examen con Antgenos-H

Inocular el agar nutritivo semi-slido con una colonia pura no auto-aglutinable. Incubar el medio a 37C
1C por 24 h 3h Utilice este cultivo para la prueba de antgenos H, procediendo de acuerdo a 6.8.4.1,
pero utilizando una gota de suero anti-H en lugar de solucin salina.
Si ocurre aglutinacin, la reaccin es considerada positiva.

6.7.4.5 Interpretacin de las pruebas serolgicas

En la Tabla 2 se da interpretacin de las pruebas confirmativas llevadas a cabo en las colonias utilizadas
(6.8.4.1).
Tabla 2

Reacciones
bioqumicas
Auto-
aglutinacin
Reaccin serolgica Interpretacin
Tpica No Antgenos -O, -Vi -H positivo.
Cepas consideradas
como Salmonella
Tpica No Todas las reacciones negativas
Puede ser Salmonella
Tpica Si No hacer la prueba
Reacciones no
tpicas
No/Si Antgenos -O, -Vi -H positivo.
Reacciones no
tpicas
No/Si Todas las reacciones negativas
No son considerados
Salmonella

6.7.5 Confirmacin definitiva.
Las cepas que son consideradas como Salmonella, o aquellas que puedan ser Salmonella, (Ver Tabla
2) enviar al Laboratorio de Salud Ambiental de la DIGESA, adjuntando toda la informacin concerniente
a la cepa.
6.7.6 Expresin de los resultados

De acuerdo a la interpretacin de resultados, se indicar la presencia o ausencia de Salmonella spp. en
una muestra de x 25 g / mL de producto.

6.7.7 Reporte

Transcribir los resultados para cada muestra en el Registro Interno de resultados, estos registros deben
mantenerse archivados.




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6.8 Control de calidad
6.8.1 Deben incluirse controles positivos y negativos de los medios de cultivo. Para verificar la
capacidad del laboratorio para detectar la Salmonella, con los mtodos y medios descritos en este
procedimiento, se inocula el medio de pre- enriquecimiento con una cepa apropiada de Salmonella, y se
procede a travs de todo el protocolo analtico usado para la muestra prueba. Un medio de control
positivo asegura que ninguna sustancia en el medio de cultivo es inhibidor para Salmonella.
Se incluyen adems dos tipos de control negativo. Un medio de control negativo que asegure que el
medio preparado no esta contaminado con Salmonella. El control es preparado colocando un frasco de
medio de cultivo sin inocular a travs de todo el procedimiento realizado para la muestra prueba. Un
segundo control negativo, control del cultivo, para demostrar la aparicin de flora competitiva en varios
medios o mostrar que estas no Salmonella no crecer en los medios selectivos usados para el anlisis.
Este control se prepara inoculando el medio inicial con una cepa no Salmonella y seguir el mismo
procedimiento que para las muestras prueba.
6.8.2 Las placas de agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) deben prepararse el da anterior al
aislamiento ya que las placas recin preparadas pueden inhibir el crecimiento de Salmonella. Las placas
deben ser almacenadas de 4 a 5C y mantenidas a temperatura ambiente antes de su uso para evitar la
condensacin de humedad en la superficie.

6.8.3 El analista debe tener cuidado con las cepas atpicas de Salmonella como por ejemplo
Salmonella arizonae y otros biotipos de Salmonella lactosa/sacarosa positivos que pueden encontrarse
en los medios de cultivo diferenciales. Lactosa y/o sacarosa positiva pueden parecer Coliformes en el
agar Hecktoen, XLD y TSI. Los cultivos de TSI con una reaccin cida en la zona de plano inclinado no
deben ser descartados como no Salmonella solo en base a esta reaccin.

6.8.4 Debe picarse ligeramente el centro de una colonia sospechosa en la placa de agar selectivo para
evitar la transferencia de Salmonella no viable que pueden estar situadas bajo o adyacentes a una
colonia sospechosa de Salmonella.

6.8.5 El agar TSI en plano inclinado debe taparse ligeramente durante la incubacin para mantener
condiciones aerbicas y prevenir reacciones cidas errneas en la zona de plano inclinado y excesiva
produccin de H
2
S en la zona de profunda del tubo. Por definicin / convencin, la produccin de H
2
S
por Salmonella es definida usando el TSI.

6.8.6 Por cada tipo de determinacin bioqumica debe incluirse un tubo de medio sin inocular (control
negativo del medio)

VII FORMULARIOS Y REGISTROS

7.1 Se anota en el Registro de Resultados internos de Salmonella spp.

VIII REFERENCIAS

8.1 ISO 6579: 2002 (E). Microbiology of food and animal feeding stuffs Horizontal method for the
detection of Salmonella spp.


IX ANEXOS

N ANEXOS TTULO
1 Diagrama de flujo del procedimiento
2 Composicin y preparacin de los medios de cultivo y reactivos.
3 Mtodo estndar de estriado en placas de agar.


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ANEXO 1: Diagrama de flujo de procedimiento




























25 g o mL de
muestra
225 mL medio de pre-
enriquecimiento (A.P.T.)
Caldo
Rappaport-
Vassiliadis
(10 mL)
Caldo Muller-Kauffmann
tetrationato-novobiocina
(MKTTn)
(10 mL)
Incubar a 37C + 1C por 18 h + 2h
Incubar a 41,5C + 1C por 24 h + 3 h,
junto con los controles (+) y (-)
Incubar a 37C + 1C por 24 h + 3 h,
junto con los controles (+) y (-)

Estriado en medios selectivos
Agar Verde
Brillante/
Rojo Fenol
Agar XLD
Seleccionar 5 colonias caractersticas o sospechosas, de cada placa, y control (+)
Estriar en Agar Nutritivo.
Incubar a 37C + 1C por 24 h + 3 h
CONFIRMACIN
BIOQUMICA
Agar
TSI
Agar
Urea
Deteccin de
-Galactosidasa.
Rx. Voges
Proskauer

Rx.
Indol
Medio
LIA

(+): Forma
cido, gas
y H2S
(-): Mantiene
color del medio
(+): Color
prpura
(-): No vira
a amarillo
(-): No vira a
rosado o
rojo brillante
(-): No
forma anillo
rojo
CONFIRMACIN
SEROLGICA Eliminar cepas autoaglutinables
Examen con Antgeno-H Examen con Antgeno-Vi Examen con Antgeno-O
Rx (+): Aglutinacin
0,1 mL 1 mL
Incubar a 37C + 1C por 24 h + 3 h
Incubar a 37C + 1C por 24 + 3 h.
Considerar tubos
para control (+) y (-)
Considerar placas
para control (+) y (-)

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ANEXO 2: Composicin y preparacin de los medios de cultivos y reactivos.
A.1 Agua Peptonada Bufferada

Composicin
Peptona 10,0 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Fosfato disodico hidrogenado dodecahidratado
(Na
2
HPO
4
.12H
2
O) 9,0 g
Fosfato de potasio dihidrogenado (KH
2
PO
4
)

1,5 g
Agua 1000,0 mL

Preparacin
Disolver los componentes en el agua, calentar si fuese necesario.
Ajustar el pH, si es necesario, de manera que luego de la esterilizacin este sea 7,0 + 0,2 a 25C
Dispensar el medio en frascos de capacidad adecuada para obtener las porciones necesarias
para el ensayo.
Esterilizar en autoclave a 121 C y 15 libras de presin por 20 minutos.

A.2 Medio Rappaport Vassiliadis, con soya (Caldo RVS)


A.2.1 Solucin A

Composicin
Triptona 5,0 g
Cloruro de sodio 8,0 g
Fosfato de potasio dihidrogenado (KH
2
PO
4
) 1,6 g
Agua 1000,0 mL

Preparacin
Disuelva los componentes en agua, por calentamiento a 70C aproximadamente.
La solucin deber ser preparada el da la preparacin del medio RV.

A.2.2 Solucin B

Composicin
Cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl
2
6H
2
O) 400,0 g
Agua 1000,0 mL

Preparacin
Disuelva el cloruro de magnesio en el agua.
Como esta sal es muy hidroscpica, es conveniente disolver el contenido total de MgCl
2
.6H
2
O de
un frasco recientemente abierto, de acuerdo a la frmula. Por ejemplo, 250 g de MgCl
2
.6H
2
O
adicionada 625 mL de agua, resultando en una solucin de volumen total 788 mL y una
concentracin de alrededor de 31,5 g por 100 mL de MgCl
2
.6H
2
O.
La solucin puede ser almacenada en botellas mbar con tapa hermtica a temperatura
ambiental por 2 aos.

A.2.3 Solucin C

Composicin
Oxalato verde de malaquita 0,4 g
Agua 100,0 mL

Preparacin
Disuelva el oxalato verde de malaquita en el agua.

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La solucin puede ser almacenada en botellas color mbar a temperatura ambiental por lo menos 8
meses.

A.2.4 Medio completo

Composicin
Solucin A (A.2.1) 1000 mL
Solucin B (A.2.2) 100 mL
Solucin C (A.2.3) 10 mL

Preparacin
Adicione a los 1000 mL de la solucin A, 100 mL de la solucin B, y 10 mL de la solucin C.
Ajustar el pH, si es necesario de manera tal que, luego de la esterilizacin sea de 5,2 + 0,2.
Distribuir antes de usar en tubos de ensayo en cantidades de 10 mL.
Esterilice en la autoclave a 115 C por 15 minutos, a 15 libras de presin.
Almacene el medio preparado en refrigeracin A 3C + 2C.Usar el medio el da de su
preparacin.


A.3 Caldo Muller-Kauffmann tetrationato-novobiocina (MKTTn)

A.3.1 Base

Composicin
Extracto de malta 4,3 g
Enzima digestiva de caseina 8,6 g
Cloruro de sodio (NaCl) 2,6 g
Carbonato de calcio (CaCO
3
) 38,7 g
Tiosulfato de sodio pentahidrato (Na
2
S
2
O
3
.5H
2
O)

47,8 g
Bilis de buey para uso bacteriolgico 4,78 g
Verde brillante 9,6 mg
Agua 1 000,0 mL

Preparacin

Disolver los componentes bsicos deshidratados o el medio completo deshidratado en el agua,
llevar a ebullicin por 5 minutos.
Ajuste el pH, si es necesario a 8,2 + 0,2 a 25C.
Completamente mezcle el medio.
El medio base puede estar almacenado por 4 semanas a 3C + 2C.

A.3.2 Solucin de Yoduro-Yodo

Composicin
Yodo 20,0 g
Yoduro de potasio 25,0 g
Agua 100,0 mL

Preparacin
Disolver completamente el yoduro de potasio en 10 mL de agua, entonces aadir el yodo y diluir
a 100 mL con agua estril. No calentar.
La solucin preparada almacenar en oscuridad a temperatura ambiente en un frasco
hermticamente sellado.

A.3.3 Solucin de Novobiocina

Composicin
Sal de sodio novobiocina 0,04 g

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Agua 5,0 mL

Preparacin
Disuelva la sal de sodio novobiocina en el agua y esterilizar por filtracin.
Almacene hasta 4 meses a 3C + 2C.

A.3.4 Medio completo

Composicin
Medio Base (A.3.1) 1000 mL
Solucin de yoduro-yodo (A.3.2) 20 mL
Solucin de novobiocina (A.3.3) 5 mL

Preparacin
Aspticamente aadir 5 mL de la solucin novobiocina (A.3.3) a 1000 mL del medio base (A.3.1).
Mezclar, luego aadir 20 mL de la solucin de yoduro-yodo (A.3.2). Mezclar bien.

A.4 Agar xilosa lisina desoxicolato (Agar XLD)

A.4.1 Medio Base

Composicin
Extracto de levadura en polvo 3,0 g
Cloruro de sodio (NaCl) 5,0 g
Xilosa 3,75 g
Lactosa 7,5 g
Sacarosa

7,5 g
L-Lisina hydrocloride 5,0 g
Tiosulfato de sodio 6,8 g
Citrato de amonio e Hierro (III) 0,8 g
Rojo de fenol 0,08 g
Agar 9 g a 18 g
1)
Agua 1000,0 mL

1)
Dependiendo de la capacidad de gelificacin del agar.

Preparacin

Disolver los componentes deshidratados de la base o la base completa deshidratada en el agua.
Calentar con agitacin frecuente, hasta que el medio empiece a hervir y el agar se disuelva. No
sobre calentar.
Ajustar el pH, si es necesario, de manera que despus de la esterilizacin llegue a 7,4 + 0,2 a
25C.
Verter la base en frascos o tubos de capacidad adecuada.
Calentar con agitacin frecuente, hasta que medio hierva y el agar se disuelva. No sobrecalentar.

A.4.2 Preparacin de las placas con agar

Inmediatamente transferir al bao de agua de 44C a 47C, agitar y verter en placas. Dejar que
solidifique.
Inmediatamente para usar, secar las placas con agar cuidadosamente (preferentemente con la
tapa arriba y la superficie del agar hacia abajo) en el horno entre 37C (24 horas) 55C (20
minutos) hasta que la superficie del agar este seca. Almacenar las placas vertidas por 5 das a
3C + 2C.

A.5 Agar Nutritivo

Composicin

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Extracto de carne 3 g
Peptona 5 g
Agar 9 g a 18 g
1)

Agua 1 000 mL
1)
Dependiendo de la gelificacin del agar.

Preparacin
Disolver los componentes o el medio completo deshidratado en agua, calentndolo de ser
necesario.
Ajustar el pH, si es necesario de manera que, luego de la esterilizacin sea 7,0 + 0,2 a 25C.
Transfiera el medio de cultivo en tubos o botellas da capacidad apropiada.
Esterilizar en autoclave a 121C por 15 minutos.

Preparacin de las placas con agar nutritivo
Transferir aproximadamente 15 mL del medio licuado a placas Petri pequeas estriles y
proceder como en A.4.2.

A.6. Agar hierro tres azcares (agar TSI)

Composicin
Extracto de carne 3,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Peptona 20,0 g
Cloruro de sodio (NaCl) 5,0 g
Lactosa 10,0 g
Sacarosa 10,0 g
Glucosa 1,0 g
Citrato de hierro (III) 0,3 g
Tiosulfato de sodio 0,3 g
Rojo de fenol

0,024 g
Agar 9 g a 18 g
1)

Agua 1 000,0 mL

1)
Dependiendo de la gelificacin del agar.

Preparacin
Disolver los componentes o el medio completo deshidratado en agua, por calentamiento si fuese
necesario.
Ajustar el pH, si es necesario, para que luego de la esterilizacin sea de 7,4 + 0,2 a 25C.
Dispersar el medio en cantidades de 4 mL en tubos de ensayo.
Esterilizar en autoclave a 121C por 15 minutos.
Colocar en posicin inclinada para dar una columna de 2,5 cm de profundidad.

A.7 Agar Urea (Christensen)

A.7.1 Base

Composicin
Peptona 1,0 g
Glucosa 1,0 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Fosfato de potasio dihidrogenado (KH
2
PO
4
) 2,0 g
Rojo fenol

0,012 g
Agar 12 g a 18 g
1)

Agua 1 000,0 mL

1)
Dependiendo de la gelificacin del agar.


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Preparacin
Disolver los componentes o la base completa deshidratada por calentamiento de ser necesario.
Ajustar el pH, si es necesario, para que luego de la esterilizacin este sea 6,8 + 0,2 a 25C.
Esterilizar en autoclave a 121C por 20 minutos.

A.7.2 Solucin de urea

Composicin
Urea 400 g
Agua, para un volumen final de 1 000 mL

Preparacin
Disolver la urea en agua.
Esterilizar por filtracin y verificar la esterilidad.

(Para conocer ms detalles de la tcnica de esterilizacin por filtracin, consultar bibliografa
adecuada sobre microbiologa).

A.7.3 Medio completo

Composicin
Base (A.7.1) 950 mL
Solucin de urea (A.7.2) 50 mL

Preparacin
Aadir, en condiciones aspticas, la solucin de urea a la base, previamente disuelta y luego
enfriada a 45C 1C.
Dispensar el medio completo en cantidades de 10 mL en tubos estriles.
Mantenerlos en posicin inclinada.

A.8 Medio L-Lisina descarboxilasa

Composicin
L-Lisina monohidrocloruro 5,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Glucosa 1,0 g
Prpura de bromocresol 0,015 g
Agua 1 000,0 mL

Preparacin
Disolver los componentes en agua, por calentamiento si fuese necesario.
Ajustar el pH, si es necesario, para que luego de la esterilizacin sea 6,8 + 0,2 a 25C
Transferir el medio en cantidades de 5 mL a tubos de cultivo.
Esterilizar en autoclave a 121C por 15 minutos.

A.9 Reactivo -Galactosidasa

A.9.1 Solucin Buffer

Composicin
Fosfato de sodio dihidrogenado (NaH
2
PO
4
) 6,9 g
Hidrxido de sodio, solucin 10 mol/L alrededor de 3,0 mL
Agua, a un volumen final de 50,0 mL

Preparacin
Disolver el fosfato de sodio di hidrogenado en aproximadamente 45 mL de agua en un frasco
volumtrico.
Ajustar el pH a 7,0 + 0,2 a 25C con la solucin hidrxido de sodio.

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Aadir agua para un volumen final de 50 mL

A.9.2 Solucin ONPG

Composicin
-D-galactopiranosido O-Nitrophenil (ONPG) 0,08 g
Agua 15,0 mL

Preparacin
Disolver el ONPG en agua a 50C 1C.
Enfriar la solucin.

A.9.3 Reactivo completo

Composicin
Solucin Buffer (A.9.1)

5,0 mL
Solucin ONPG (A.9.2) 15,0 mL

Preparacin
Aadir la solucin buffer a la solucin ONPG.

A.10 Reactivos para la reaccin de Voges-Proskauer (VP)

A.10.1 Medio VP

Composicin
Peptona 7,0 g
Glucosa 5,0 g
Fosfato di potsico hidrogenado (K
2
HPO
4
)

5,0 g
Agua 1000,0 mL

Preparacin
Disolver los componentes en agua, por calentamiento si es necesario.
Ajustar el pH, si es necesario, para que luego de la esterilizacin sea de 6,9 + 0,2 a 25C
Transferir 3 mL del medio en cada uno de los tubos.
Esterilizar en autoclave a 115C por 15 minutos.

A.10.2 Solucin de creatina (N-amidinosarcosina)

Composicin
Creatina monohidratada 0,5 g
Agua 100,0 mL

Preparacin
Disolver la creatina monohidratada en agua.

A.10.3 Solucin etanlica, 1-Naftol

Composicin
1-Naftol 6,0 g
Etanol, 96 % (v/v) 100,0 mL

Preparacin
Disolver el 1-naftol en el etanol.

A.10.4 Solucin de hidrxido de potasio

Composicin

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Hidrxido de potasio 40,0 g
Agua 100,0 mL
Preparacin
Disolver el hidrxido de potasio en agua.

A.11 Reactivos para la reaccin indol

A.11.1 Medio Triptfano/Triptona

Composicin
Triptona 10,0 g
Cloruro de sodio 5,0 g
DL-Triptofano

1,0 g
Agua 1000 mL

Preparacin
Disolver los componentes en agua a 100C.
Ajustar el pH, si es necesario, para que luego de la esterilizacin sea de 7,5 + 0,2 a 25C
Dispensar 5 mL del medio en cada uno de los tubos.
Esterilizar en autoclave a 121C por 15 minutos.

A.11.2 Reactivo de Kovacs

Composicin
4-Dimetilaminobenzaldehido 5,0 g
Acido hidroclrico, = 1,18 g/mL a 1,19 g/ml 25,0 mL
2-Metilbutano-2-ol

75,0 mL

Preparacin
Mezclar los componentes.

A.12 Agar Nutritivo semi-slido

Composicin
Extracto de carne 3,0 g
Peptona 5,0 g
Agar

4 a 9 g
1)

Agua 1 000,0 mL

1)
Dependiendo de la gelificacin del agar.

Preparacin
Disolver los componentes en agua, por calentamiento si fuese necesario.
Ajustar el pH, si es necesario, para que luego de la esterilizacin sea de 7,0 + 0,2 a 25C
Transferir el medio a frascos de capacidad apropiada.
Esterilizar a 121 C por 15 minutos.

Preparacin de placas con agar
Colocar en placas estriles aproximadamente 15 mL del medio recientemente preparado. Las
placas de agar no debern ser secadas.

A.13 Solucin fisiolgica salina

Composicin
Cloruro de sodio 8,5 g
Agua 1 000,0 mL

Preparacin

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Disolver el cloruro de sodio en el agua, por calentamiento si es necesario.
Ajustar el pH, si es necesario, para que luego de la esterilizacin sea de 7,0 + 0,2 a 25C.
Dispensar cantidades de la solucin en frascos o tubos que contengan 90 mL a 100 mL luego de
la esterilizacin.
Esterilizar en autoclave a 121 C por 15 minutos.



ANEXO 3: Mtodo estndar de estriado en placas de agar



Primera placa Segunda Placa








Estriado principal