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Licence SV Biochimie 2 : Cintique enzymatique

Introduction la cintique enzymatique
1. INTRODUCTION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
2. BREFS RAPPELS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
2.1. LA RACTION CHIMIQUE ..........................................................................................................1
2.1.1. Degr d'avancement...........................................................................................................1
2.1.2. Vitesse de la raction .........................................................................................................1
2.1.3. Ordre d'une raction..........................................................................................................2
2.1.4. Cas particulier des ractions lmentaires .............................................................................2
2.2. LA CATALYSE .........................................................................................................................5
3. CINTIQUE ENZYMATIQUE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
3.1. LA CATALYSE ENZYMATIQUE...................................................................................................6
3.2. LE MODLE DE BASE DE LA CINTIQUE ENZYMATIQUE...............................................................8
3.2.1. Modle de Michalis-Menten...............................................................................................9
3.2.2. Modle de Briggs-Haldane................................................................................................ 10
4. LES CONSTANTES CINTIQUES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
4.1. LA SIGNIFICATION DES CONSTANTES CINTIQUES.................................................................... 11
4.1.1. Vitesse maximale............................................................................................................. 11
4.1.2. Constante catalytique....................................................................................................... 12
4.1.3. Constante de Michalis, constante de dissociation ................................................................. 12
4.1.4. Constante de spcificit .................................................................................................... 13
4.1.5. Quelques valeurs de constantes catalytique, de Michalis, de spcificit .................................... 13
4.2. LA DTERMINATION DES CONSTANTES CINTIQUES ................................................................. 14
4.2.1. Mesure de la vitesse initiale............................................................................................... 14
4.2.2. Reprsentation hyperbolique (Michalis-Menten) .................................................................. 15
4.2.3. Reprsentation de Lineweaver-Burk.................................................................................... 15
4.2.4. Reprsentation Eadie-Hofstee............................................................................................ 16
4.2.5. Reprsentation de Hanes-Woolf ......................................................................................... 16
4.2.6. Reprsentation de Eisenthal et Cornish-Bowden (graphe linaire direct) ................................... 17
4.2.7. Quelques commentaires sur ces reprsentations .................................................................... 18
5. DOSAGE ENZYMATIQUE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
5.1. ACTIVIT ENZYMATIQUE ....................................................................................................... 19
5.1.1. Activit enzymatique (ou catalytique) .................................................................................. 19
5.1.2. Activit enzymatique (ou catalytique) spcifique.................................................................... 20
6. CE QUI N'A PAS T DIT. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
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Introduction la cintique enzymatique
1
1
1
.
.
.


I
I
I
n
n
n
t
t
t
r
r
r
o
o
o
d
d
d
u
u
u
c
c
c
t
t
t
i
i
i
o
o
o
n
n
n
Presque toutes les ractions chimiques qui ont lieu dans les systmes biologiques sont
catalyses par des enzymes qui constituent la classe de protines la fois la plus vaste et la
plus spcialise. Ils reprsentent l'instrument primaire direct de l'expression de l'action du
gne puisqu'ils catalysent les milliers de ractions chimiques qui constituent le mtabolisme
intermdiaire des cellules. Dans ce chapitre introductif, nous aborderons uniquement les
paramtres cintiques des mcanismes enzymatiques les plus simples.
2
2
2
.
.
.


B
B
B
r
r
r
e
e
e
f
f
f
s
s
s


r
r
r
a
a
a
p
p
p
p
p
p
e
e
e
l
l
l
s
s
s
Voici un bref rappel de notions, dfinitions que vous avez vues dans les cours de chimie.
2.1. La raction chimique
Soit la raction chimique suivante en phase homogne :

1 2 3 1 2 3
C + C + C + ... C + C + C + ...
1 2 3 1 2 3

o C et reprsentent respectivement le compos et le coefficient stchiomtrique. Les
composs C et C
i i
sont respectivement appels les ractifs (ou ractants) et les produits.
2.1.1. Degr d'avancement
Au cours de cette transformation, le nombre de moles des diffrents constituants ne peuvent
varier indpendamment. Ncessairement, nous avons :
dn
=
dn
= ... = -
dn
= -
dn
= ... = d
1
1
2
2
1
1
2
2

(I)
o est le degr d'avancement de la raction et o les dn reprsentent les variations du
nombre de moles du constituant considr.
2.1.2. Vitesse de la raction
La vitesse de la raction est dfinie par la vitesse d'accroissement de l'avancement rapporte
l'unit de volume : v =
1
V

d
dt

. La vitesse peut tre aussi exprime par rapport aux

variations de concentrations des composs en utilisant l'quation (I) :
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1

1
1
2
2
1
1
2
2
dn
Vdt
=
1 dn
Vdt
= ... = -
1 dn
Vdt
= -
1 dn
Vdt
= ... =
1
V
d
dt
(II)
Le rapport
1
V
dn
dt
reprsente la variation de la concentration en fonction du temps. L'quation
(II) peut s'crire aussi :
1

1
1
2
2
1
1
2
2
d[C
dt
=
1 d[C
dt
= ... = -
1 d[C
dt
= -
1 d[C
dt
= ... =
1
V
d
dt
] ] ] ]
(III)
o les [C] reprsentent les concentrations des diffrents composs.
Notons que la vitesse d'une raction a la dimension d'une concentration par unit de
temps (mole/litre) temps
-1
[ ]
(M s
-1
).
2.1.3. Ordre d'une raction
Dans le cas le plus gnral, la loi de vitesse caractristique d'une raction chimique ne peut
pas tre tablie priori, mais seulement partir de l'exprience. Phnomnologiquement, la
vitesse peut s'crire : v = k[A] [B] [C] ...

o les A,B, C .. sont les ractifs et les produits
intervenant dans la raction chimique.
- k est appele constante de vitesse (c'est une constante pour les paramtres
thermodynamiques : temprature, pression, concentrations initiales dtermines). Sa
dimension est dpendante de la loi de vitesse.
, , sont appels les ordres partiels de raction par rapport l'espce chimique pour
laquelle ils sont exposants. Dans le cas le plus gnral, ils ne sont pas gaux aux coefficients
stchiomtriques des ractifs et des produits.
- n = + + + .. n est appel l'ordre (global) de la raction
L'tude exprimentale des diffrentes courbes v= f([A]), .. permet de dterminer les ordres
partiels de la raction.
2.1.4. Cas particulier des ractions lmentaires
Les ractions lmentaires sont des ractions ou processus qui
- ne peuvent tre dcompose en tapes plus simples
- refltent un vnement molculaire, une collision ractive telle que celle modlise dans le
cadre de la thorie des collisions (M. Trautz, W.C.McC Lewis et Jean Perrin dans les annes
1910-1920), complte par Lindemann, puis par Henry Eyring.
Toute raction lmentaire est caractrise par les proprits suivantes:
1 - son ordre global est aussi sa molcularit. Il indique le nombre de molcules actuellement
impliques dans le processus molculaire dont la raction en est la manifestation
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2 - l'ordre d'une raction lmentaire est toujours entier
3 - la vitesse d'une raction lmentaire ne dpend jamais de la concentration d'un produit,
mais uniquement des ractifs
4 - l'ordre partiel par rapport un ractif A est gal au coefficient stchiomtrique (entier) de
A
5 - une raction lmentaire n'a pas d'intermdiaire stable
6- sa constante de vitesse satisfait la loi d'Arrhnius (voir cours de Chimie)
Nous supposerons dans la suite que pour toutes les tudes cintiques, ce sont des ractions
lmentaires qui interviennent dans les diffrents schmas ractionnels.
Raction d'ordre zro (ou nul)
Soit une raction lmentaire : A P
Si la raction est d'ordre zro, la vitesse de raction ne dpend pas des concentrations des
produits intervenant dans la raction : v = k = -
d[A]
dt
, d'o en intgrant :
[A] = [A] - kt
0
, o [A]
0
est la concentration de A l'instant t
0
= 0
La concentration des ractifs diminue linairement en fonction du temps, et videmment celle
des produits augmente linairement en fonction du temps.
Une reprsentation de [A] = f(t) est une droite de pente k.
Pour une raction d'ordre zro, la constante de vitesse k a les dimensions de
(mole/litre) temps
-1
[ ]
(M s
-1
).
Raction du premier ordre (ou d'ordre 1)
Soit une raction lmentaire : A P
Si la raction est d'ordre 1 par rapport A, la vitesse de raction s'crit :
v = -
d[A]
dt
= k[A] , d'o
d[A]
[A]
= - kdt et en intgrant :
Ln
[A]
[A]
= - kt
0

ou encore [A] =[A] e

0
-kt
, ou encore Ln [A] = - kt + Ln [A]
0
( ) ( )
o [A]
0
est la concentration de A l'instant t
0
= 0.
La concentration des ractifs diminue exponentiellement en fonction du temps, et
videmment celle des produits augmente exponentiellement en fonction du temps.
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On a l'habitude de dfinir pour une raction d'ordre 1 le temps de demi-vie (appel aussi
temps de demi-raction) : temps ncessaire pour consommer la moiti de la concentration du
ractif.
t =
Ln(2)
k
=
0,693
k
1/2
Une reprsentation de Ln([A]) = f(t) est une droite de pente -k
Pour une raction d'ordre un, la constante de vitesse k a les dimensions de temps
-1
[ ]
(s
-1
)
Raction du second ordre (ou d'ordre 2)
Soit une raction lmentaire : A + A P
Si la raction est d'ordre 2 par rapport A, la vitesse de raction s'crit :
v = -
d[A]
dt
= k[A]
2
, d'o
d[A]
[A]
= - kdt
2
et en intgrant :
1
[A]
= kt +
1
[A]
0
, o [A]
0
est la concentration de A l'instant t
0
= 0.
La concentration des ractifs diminue hyperboliquement en fonction du temps, et
videmment celle des produits augmente hyperboliquement en fonction du temps.
Une reprsentation de 1/[A] = f(t) est une droite de pente k
Pour une raction d'ordre deux, la constante de vitesse k a les dimensions de
(litre/mole) temps
-1
[ ]
(M
-1
s
-1
).
Dtermination de l'ordre d'une raction (mthode diffrentielle)
Dans les paragraphes prcdents, pour chaque ordre de raction, nous avons dtermin une
reprsentation particulire f[A]=g(t) qui est linaire et permet de dterminer la constante de
vitesse. Si nous avons non pas des mesures exprimentales ([A], t) mais des mesures (v, [A])
o v est la vitesse de la raction, la relation tudier est v = -
d[A]
dt
= k[A]
n
o n est l'ordre
de la raction :
v = k[A] Ln(v) = Ln(k) + nLn([A])
n
,
Une reprsentation de Ln(v) en fonction de Ln([A]) est une droite de pente n (ordre de la
raction) et d'ordonne l'origine Ln(k).
Remarque : si la place des logarithmes npriens, nous avions utilis les logarithmes
dcimaux (Log), la relation aurait t identique.
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2.2. La catalyse
Ds 1835, Jns Jacob Berzelius appela catalyse l'augmentation de la vitesse d'une raction
due la prsence de substances particulires qui sont inchanges la fin de la raction.
En 1895 Wilhelm Ostwald dfinit un catalyseur comme :
- une substance qui modifie la vitesse d'une raction sans modifier le bilan nergtique
global
- et ajouta en 1902 : une substance que l'on retrouve inchange la fin de la raction.
On dit que la catalyse est homogne si le catalyseur fait partie de la mme phase que le
systme ractionnel, et dans le cas contraire on parle de catalyse htrogne.
Un catalyseur est une substance :
1) que l'on retrouve inchange la fin de la raction
2) qui modifie la vitesse des ractions thermodynamiquement possibles (voir cours de
thermodynamique chimique : nergie libre de Gibbs ou enthalpie libre) puisqu'il ne
modifie pas l'nergie du systme ractionnel
3) qui modifie de la mme manire la vitesse de deux ractions opposes selon la rgle de
rversibilit, et permet d'atteindre plus rapidement un quilibre chimique.
3
3
3
.
.
.


C
C
C
i
i
i
n
n
n

t
t
t
i
i
i
q
q
q
u
u
u
e
e
e


e
e
e
n
n
n
z
z
z
y
y
y
m
m
m
a
a
a
t
t
t
i
i
i
q
q
q
u
u
u
e
e
e
En 1752, Ren-Antoine Ferchault de Raumur observe que des aliments solides taient
convertis en une matire fluide par l'effet d'un "ferment" scrt par l'estomac, observation
confirme par Lazzaro Spallanzani. En 1833, Anselme Payen et Jean-Franois Persoz
montrent qu'aprs un traitement l'thanol du malt, l'extrait aqueux a la capacit d'hydrolyser
l'amidon : cet extrait qui catalysait le passage d'un tat insoluble un tat soluble fut
dnomm diastase (du grec = sparation). En 1836 Theodor Schawnn dmontrait
la prsence dans un extrait d'estomac d'un ferment protolytique, qu'il appela pepsine.
De nombreuses tudes sur la fermentation par des levures furent menes par Louis Pasteur,
Justus von Liebig, Georg Ernst Stahl, Marcelin Berthelot. En 1878 Wilhelm Kunhe proposa
le nom d'enzyme pour qualifier ces ferments et en 1898 Duclaux proposa le suffixe "ase".
En 1897, Gabriel Bertrand observa que certains enzymes requirent des facteurs dialysables
pour leur activit : il les nomma "coenzymes".
Le dbut du XXme sicle voit une dbauche de travaux de purification des enzymes qui
permettent l'lucidation de nombreuses voies mtaboliques et confirment que les enzymes
sont des protines : expriences de cristallisation de l'urase par James Summer en 1926, de
la pepsine et de la chymotrypsine par John Northrop en 1933, de la ribonuclase A par Moses
Kunitz en 1940. Enfin en 1965, David Phillips et son quipe publient la premire structure
tridimensionnelle d'un enzyme, le lysozyme (purifi partir du blanc d'uf).
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3.1. La catalyse enzymatique
En 1893, Wilhelm Ostwald montra que les enzymes sont des catalyseurs et en 1894 Emil
Fisher posa l'acte fondateur de la notion de strospcificit dans le phnomne de catalyse
enzymatique sous l'image d'une cl qui ouvre une serrure et une seule.
Les mcanismes molculaires de la catalyse enzymatique ne posent pas de problmes
diffrents de ceux de la ractivit chimique. Soit la raction lmentaire catalyse :
E + S E + P
o E est l'enzyme (catalyseur protique que l'on retrouve dans le bilan des produits), S est le
substrat et P le produit. Les proprits importantes de l'enzyme sont :
1) il est retrouv inchang la fin de la raction
2) il modifie la vitesse des ractions thermodynamiquement possibles (il ne modifie pas
l'nergie du systme ractionnel)
3) il est strospcifique du substrat ( la diffrence de nombreux catalyseurs chimiques)
4) notons que certains enzymes n'ont d'activit catalytique qu'en prsence de leur cofacteur,
compos non protique
Le facteur d'accroissement de la vitesse de la raction par un enzyme peut aller jusqu' la
valeur de 10
17
fois (cas de la phosphatase alcaline). Vous avez vu en chimie ou vous verrez
dans la suite (3
me
anne de licence) le modle de l'tat de transition de Henry Eyring qui rend
compte de l'accroissement de la vitesse d'une raction par un catalyseur..
Enzyme Facteur d'accroissement
Chymotrypsine
10
7
Lysozyme
2 10
8
Urase
10
14
Phosphatase alcaline
10
17
La strospcificit des enzymes vis vis de leurs substrats ainsi que le nombre de ces
derniers dans les mtabolismes des cellules, impliquent une grande diversit des catalyseurs
enzymatiques. Les enzymes ont des noms courants qui tmoignent plus des circonstances de
leurs dcouvertes que d'une classification logique.
Pour remdier cela, la Commission des Enzymes de l'Union Internationale de Biochimie a
propos une nomenclature, ajoute au nom courant, qui tient compte des types de raction
que l'enzyme catalyse : elle s'crit sous la forme E.C.X.X.X.X (E.C. abrviation de "Enzyme
Commission").
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Le premier X indique le type de raction catalyse, c'est la classe de l'enzyme :
N Classe de l'enzyme
X=1 Oxydorductases (transfert d'lectrons : oxydorduction)
X=2 Transfrases (transfert d'un groupe fonctionnel d'une molcule une autre)
X=3 Hydrolases (coupure de liaisons par hydrolyse)
X=4 Lyases (coupure de liaison par limination)
X=5 Isomrases (changement dans la configuration de la molcule de substrat)
X=6 Ligases (condensation de deux molcules)
Le deuxime X indique la nature du substrat, prenons la classe des hydrolases (3) :
3.1 Acting on ester bonds
3.2 Glycosylases
...
...
3.11 Acting on Carbon-Phosphorus Bonds
3.12 Acting on Sulfur-Sulfur Bonds
3.12 Acting on Carbon-Sulfur Bonds
Dans les hydrolases agisssant sur des liaisons ester (3.1) :
3.1.1 Carboxylic Ester Hydrolases
3.1.2 Thiolester Hydrolases
3.1.3 Phosphoric Monoester Hydrolases
...
...
3.1.30 Endoribonucleases Active with either Ribo- or Deoxyribonucleic Acids and
Producing 5'-Phosphomonoesters
3.1.31 Endoribonucleases Active with either Ribo- or Deoxyribonucleic Acids and
Producing 3'-Phosphomonoesters
Dans les carboxyl ester hydrolases (3.1.1) :
3.1.1.1 carboxylesterase
3.1.1.2 arylesterase
3.1.1.3 triacylglycerol lipase
3.1.1.78 polyneuridine-aldehyde esterase
3.1.1.79 hormone-sensitive lipase
Exemple : la lipase pancratique qui hydrolyse les triglycrides a comme nomenclature :
E.C.3.1.1.3
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3.2. Le modle de base de la cintique enzymatique
En 1902, Victor Henri et Adrian Brown suggrrent indpendamment que dans la raction
enzymatique, l'hypothse de la formation d'un complexe enzyme-substrat tait ncessaire
pour interprter la forme hyperbolique des courbes vitesse initiale de la raction en fonction
de la concentration initiale de substrat, les autres paramtres tant constants (concentration
enzyme, temprature, pH, pression ..). La raction tait d'ordre zro par rapport au substrat
au-dessus d'une certaine concentration.

[S]
0
V
0
V
max
Relation entre la vitesse initiale et la concentration initiale du substrat
Le modle de base de la cintique enzymatique s'crit ainsi :

E + S ES E + P
k
1
k
-1
k
2
k
-2
o E est l'enzyme, S le substrat, P le produit de raction et les k
i
sont les constantes de
vitesse des ractions lmentaires :
k
-1
k
1
ES E + S
E + S ES
k
1
E + S ES
k
-1
correspond aux deux
ractions lmentaires
Ce cas correspond aux ractions rversibles ou quilibres.
Nous allons maintenant voir le traitement de ce systme ractionnel en le simplifiant par des
hypothses exprimentales ou ad hoc.
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3.2.1. Modle de Michalis-Menten
En 1913, suite aux travaux de Victor Henri, Maud Menten et Leonor Michalis rsolvrent le
systme ractionnel en posant les hypothses simplificatrices suivantes, suggres par les
tudes exprimentales :
1) les mesures de cintique seront toujours faites pour des concentrations de produit trs
faible : c'est la mesure de la vitesse initiale ( v
i
) pour [P] 0 et [S] [S]
0
o [S]
0
est la
concentration du substrat l'instant initial. Cette hypothse permet de ngliger la raction
lmentaire E + P ES
k
-2
.
2) la concentration totale du substrat [S]
0
est grande (>>) devant celle de l'enzyme [E]
0
.
3) ds l'addition de l'enzyme dans la solution de substrat, il s'tablit un quilibre rapide entre
les formes libres de l'enzyme, du substrat et du complexe (appel complexe de
Michalis), on parle d'hypothse du quasi-quilibre ou pr-quilibre.
Le schma ractionnel s'crit ainsi :
k
2
k
-1
k
1
E + P ES E + S
et pour calculer la vitesse d'apparition du produit, le systme d'quations rsoudre est :
(a) v = k [ES]
(b) K =
[E] [S]
[ES]
, avec K =
k
k
constante de dissociation du complexe ES
(c) [S] = [S] + [ES] + [P]
(d) [E] = [E] + [ES]
2
-1
1
0
0

en remplaant [E] tir de l'quation (d) dans l'quation (b),

en simplifiant l'quation (c) en tenant compte des hypothses (1) et (2) (c) [S] [S]
0
et en
remplaant [S] toujours dans l'quation (b),
nous obtenons une quation simplifie : [ES] =
[E] [S]
K + [S]
0 0
0
d'o, en remplaant [ES] dans l'quation (a), le systme approxim (v est dans ce cas v
i
,
vitesse initiale, hypothse (1)), se rduit :
v =
k [E] [S]
K + [S]
2 0 0
0
, soit V = k [E] et K = K =
k
k
Max 2 0 S
-1
1
, la vitesse s'crit sous la forme :
v =
V [S]
K + [S]

Max 0
S 0
appele l'quation de Michalis-Menten.
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V
Max
est not en abrg V
M
. Le rapport
V
[E]
, ici gal k
M
0
2
est not k
cat
, constante
catalytique de l'enzyme. K, constante de dissociation du complexe enzyme-substrat est
traditionnellement not K
S
.
Note : ce modle est aussi appel modle de Henri-Michalis-Menten.
Attention : l'usage a consacr l'lision de l'indice i pour la vitesse (initiale) qui rappelait la
condition d'approximation et aussi de l'indice 0 pour la concentration initiale de substrat [S]
0
.
Nous garderons l'indice 0 pour la concentration de substrat pour ne pas oublier ces deux
conditions.
3.2.2. Modle de Briggs-Haldane
En 1925, George Briggs et John Haldane ont montr que l'on obtenait une quation similaire
celle de Michalis-Menten avec des hypothses moins restrictives : il n'est pas ncessaire de
poser la condition (3) : tablissement d'un quilibre rapide entre les formes libres de
l'enzyme, du substrat et du complexe pour rsoudre le systme simplement. Il suffit de
supposer que le systme ractionnel est dans un tat stationnaire (ou quasi-stationnaire).
Ceci signifie que la vitesse de disparition du complexe Michalien (ES) est nulle
d[ES]
dt
= 0,
donc sa concentration constante [ES] =Ct.
C'est le cas de la plupart des expriences de cintique, o on peut considrer qu'aprs un tat
pr-stationnaire trs court, l'tat stationnaire est atteint.
Toujours, pour le mme schma ractionnel avec les conditions (1), (2) et de l'tat
stationnaire :

k
2
k
-1
k
1
E + P ES E + S
le systme d'quations rsoudre est :
(a ) v = k [ES]
(b ) 0 =
d[ES]
dt
= k [E][S] - (k +k )[ES]
(c ) [S] = [S] + [ES] + [P]
(d ) [E] = [E] + [ES]
2
1 -1 2
0
0

en utilisant l'quation (d') pour remplacer [E] dans l'quation (b'),

en simplifiant l'quation (c') en tenant compte des hypothses (1) et (2) (c) [S] [S]
0

k [E] - [ES] [S] - (k + k ) [ES] = 0
1 0 0 -1 2
( ) (b'')
_______________________________________________________________________________
Licence SV Biochimie 2 : Cintique enzymatique - 11 -
en calculant [ES] l'aide de (b") et en le remplaant dans (a'), on obtient pour le systme
approxim (v est dans ce cas v
i
, vitesse initiale) :
v =
k [E] [S]
(k +k
k
+ [S]
2 0 0
-1 2
1
0
)
, soit V = k [E] et K =
(k +k
k
M 2 0 M
-1 2
1
)
la vitesse s'crit sous la
forme :
v =
V [S]
K + [S]

M 0
M 0
quation de Briggs-Haldane
Cette quation de Briggs-Haldane est traditionnellement aussi appele quation de
Michalis-Menten, en hommage. La constante K =
(k +k
k
M
-1 2
1
)
est appele constante de
Michalis.
Remarquons que si
k est petit devant k
2 -1
, l'quation de Briggs-Haldane est identique celle
de Michalis-Menten (K = K
M S
).
Pour la plupart de tous les enzymes, k
2
est effectivement petit devant k
-1
.
Le rapport
V
[E]
, ici gal k
M
0
2
est not k
cat
, constante catalytique de l'enzyme (idem
prcdemment).
Attention : l'usage a consacr l'lision de l'indice i pour la vitesse (initiale) qui rappelait la
condition d'approximation et aussi de l'indice 0 pour la concentration initiale de substrat [S]
0
.
Ces deux conditions ne doivent jamais tre oublies lors de l'utilisation de l'quation ci-
dessus.
4
4
4
.
.
.


L
L
L
e
e
e
s
s
s


c
c
c
o
o
o
n
n
n
s
s
s
t
t
t
a
a
a
n
n
n
t
t
t
e
e
e
s
s
s


c
c
c
i
i
i
n
n
n

t
t
t
i
i
i
q
q
q
u
u
u
e
e
e
s
s
s
Les quations de Michalis-Menten ou de Briggs-Haldane ont t obtenues par la rsolution
d'un systme d'quations simplifi par l'introduction d'hypothses :
1) la vitesse mesure doit tre la vitesse initiale de la raction
2) la concentration du substrat doit tre grande devant celle de l'enzyme
3) hypothse du pr-quilibre ou hypothse de l'tat stationnaire
4.1. La signification des constantes cintiques
4.1.1. Vitesse maximale
V = k [E] = k [E]
M 2 0 cat 0
est la vitesse maximale initiale v atteinte pour la concentration
[E]
0
et pour une concentration trs grande de [S]
0
devant K
M
:
v =
V [S]
K + [S]
si [S] v V
M 0
M 0
0 M

_______________________________________________________________________________
Licence SV Biochimie 2 : Cintique enzymatique - 12 -
La vitesse maximale est l'asymptote de la branche hyperbolique reprsentant l'quation de
Michalis-Menten dans le modle de Michalis-Menten ou de Briggs-Haldane.
Exprimentalement, ceci est ralis si [S] >> K v =
V [S]
K + [S]
V
0 M
M 0
M 0
M

Cette branche hyperbolique v = v = f [S]
i 0
( ) est appele courbe de saturation de l'enzyme
par le substrat.
Note : dans la suite, lorsque nous parlerons de la vitesse de la raction enzymatique, v
dsignera toujours la vitesse initiale, sauf spcification contraire.
4.1.2. Constante catalytique
k
cat
(ou k
2
) est une constante de vitesse du premier ordre (unit s
-1
, c'est une frquence).
k
cat
reprsente la frquence laquelle l'enzyme accomplit l'acte catalytique (en anglais "turn
over") lorsque l'enzyme est satur en substrat ( k =
V
[E]
cat
M
0
).
1
k
cat
est la dure d'un cycle catalytique lorsque l'enzyme est satur en substrat.
La valeur de k
cat
donne la mesure de l'efficacit de la catalyse par l'enzyme sur le substrat.
4.1.3. Constante de Michalis, constante de dissociation
Dans la relation de Briggs-Haldane, la constante de Michalis K =
(k +k
k
M
-1 2
1
)
est gale
k
k
-1
1
dans le cas o k >> k
-1 2
. Si k
-1
est grand devant k = k
2 cat
, cela signifie que le
complexe ES se dissocie en relarguant le substrat libre une vitesse nettement plus
grande qu'il ne subit l'acte catalytique. En ce cas, la valeur de la constante de Michalis est
gale la valeur de la constante de dissociation du complexe ES en S et E, elle traduit
l'affinit du substrat pour l'enzyme : les expressions de la vitesse pour le modle de
Michalis-Menten et de Briggs-Haldane sont identiques. Nous remarquons que dans le
modle de Michalis-Menten l'hypothse d'quilibre rapide entre les formes libres de
l'enzyme, du substrat et du complexe est plus restrictive, elle est un cas particulier du modle
de Briggs-Haldane. L'affinit du substrat pour l'enzyme est d'autant plus grande que la
valeur de la constante de Michalis est petite.
Lorsque la valeur de [S]
0
est gale la valeur de K
M
, la valeur de la vitesse initiale est gale
: v =
V [S]
[S] + [S]
=
V
M 0
0 0
M
2

[S] = K v =
V
2

0 M
M

et ce dans le modle de Michalis-Menten ou de Briggs-Haldane.

_______________________________________________________________________________
Licence SV Biochimie 2 : Cintique enzymatique - 13 -
4.1.4. Constante de spcificit
La constante catalytique k
cat
mesure l'efficacit de la catalyse par l'enzyme sur le substrat et
la constante de Michalis mesure l'affinit de l'enzyme pour le substrat dans les cas o
k >> k
-1 cat
. Un enzyme peut avoir une trs grande affinit mais avec une constante
catalytique faible et inversement. L'un des deux paramtres ne suffit pas caractriser le
couple enzyme/substrat. C'est le rapport r =
k
K
sp
cat
M
qui reflte la spcificit globale d'un
enzyme vis vis d'un substrat, appel constante de spcificit.
r =
k
K
= k
k
k +k
= k
k
k +k
k
sp
cat
M
cat
1
-1 cat
1
cat
-1 cat
1

La limite suprieure de r =
k
K
sp
cat
M
est la constante de vitesse d'association de l'enzyme E et
du substrat S : k
1
. Cette constante a pour limite la vitesse de diffusion des macromolcules
dans le milieu ractionnel qui est de l'ordre de 10 -10 s M
8 9 -1 -1
( )
.
4.1.5. Quelques valeurs de constantes catalytique, de Michalis, de spcificit
Enzyme Substrat
k (s )
cat
-1
K (M)
M
k /K (s M )
cat M
-1 -1
Actylcholine
estrase
Actylcholine 1,4 10
4
9 10
-5
1,6 10
8
Anhydrase
Carbonique II
CO
HCO
2
3
-
1 10
6
4 10
5
1,2 10
-2
2,6 10
-2
8,3 10
7
1,5 10
7
-lactamase
benzylpnicilline 2 10
3
5 10
-5
4 10
7
Catalase
H O
2 2
4 10
7
1,01 4 10
7
Fumarase Fumarate
Malate
8 10
2
9 10
2
5 10
-6
2,5 10
-5
1,6 10
8
3,6 10
7
Penicillinase Benzylpenicilline 2 10
3
5 10
-5
4 10
7
Chymotrypsine Ester thylique
N-actylglycine
Ester thylique
N-actyltyrosine
5,1 10
-2
1,9 10
2
4,4 10
-1
6,6 10
-4
1,2 10
-1
2,9 10
5
Ces quelques valeurs tmoignent
- d'une part, de la diversit des valeurs selon les enzymes
- d'autre part de la spcificit d'un enzyme vis vis d'un de ses substrats
_______________________________________________________________________________
Licence SV Biochimie 2 : Cintique enzymatique - 14 -
4.2. La dtermination des constantes cintiques
Nombreuses sont les techniques physiques ou chimiques qui permettent de suivre les
paramtres d'une cintique, pour en citer quelques-unes :
- spectrophotomtrie
- fluorescence
- titrimtrie
- radioactivit
- dosages immunologiques
Gnralement, les expriences sont tablies pour mesurer la variation de concentration du
substrat ou du produit en fonction du temps et cela pour une concentration donne d'enzyme
et diffrentes valeurs de la concentration en substrat. La connaissance des valeurs de ces
diffrents paramtres nous permet de dterminer les constantes cintiques.
De manire classique, il faut calculer tout d'abord la vitesse initiale ( [P] = 0) et ensuite
utiliser une reprsentation drive de l'quation de Briggs-Haldane.
Nous supposerons que les paramtres (temprature, pH, force ionique, etc..) sont identiques
pour un ensemble de mesures concernant un enzyme et un substrat particuliers.
Il faudra toujours avoir en mmoire que l'quation de Michalis-Menten ou de Briggs-
Haldane ont t calcules dans des conditions particulires :
(1) [P] = 0, (2) [S]
0
>> [E]
0
et (3) soit pr-quilibre soit tat stationnaire.
4.2.1. Mesure de la vitesse initiale
Pour une concentration d'enzyme donne, on calcule la vitesse initiale pour une concentration
de substrat totale donne en traant la courbe [P] = f(t) ou encore ([S]
0
- [S]) = f(t).

[P]
temps
tangente la courbe [P]=f(t)
au point t=0 : d[P]
Evolution de la concentration du produit en fonction du temps
dt
vitesse initiale
La vitesse initiale est la tangente
d[P]
dt
la courbe [P] = f(t) au point t=0.
_______________________________________________________________________________
Licence SV Biochimie 2 : Cintique enzymatique - 15 -
La dimension de la vitesse est une concentration par unit de temps, l'unit est (M s
-1
),
toutefois les biochimistes ont l'habitude de prendre comme unit des mole/litre par
minute (M min
-1
).
4.2.2. Reprsentation hyperbolique (Michalis-Menten)
A partir des rsulats exprimentaux, mesure des vitesses initiales pour chaque concentration
totale de substrat [S]
0
, pour une concentration donne d'enzyme, nous pouvons tracer
v=f( [S]
0
) qui est une hyperbole.

V
M
v
[S]
0
V
M
2
K
M
L'asymptote horizontale de l'hyperbole pour les grandes valeurs de [S]
0
permet d'avoir la
valeur de V
M
et la valeur de K
M
qui est la valeur de [S]
0
pour v=
V
2
M
4.2.3. Reprsentation de Lineweaver-Burk
C'est la reprsentation la plus utilise qui ft publie en 1935 par Hans Lineweaver et Dean
Burk :
1
v
= f
1
[S]
0

.

1 / [S]
0
1 / v
1 / V
M
-1 / K
M
_______________________________________________________________________________
Licence SV Biochimie 2 : Cintique enzymatique - 16 -
v =
V [S]
K + [S]

1
v
=
K + [S]
V [S]

1
v
=
K
V
1
[S]
+
1
V
M 0
M 0
M 0
M 0
M
M 0 M

Cette reprsentation est une droite qui coupe l'axe des

1
v
au point
1
V
M
et l'axe des
1
[S]
0
au
point
-1
K
M
.
4.2.4. Reprsentation Eadie-Hofstee
Cette reprsentation ft publie par George Eadie en 1942 et Baren Hofstee en 1959 :
v = f
v
[S]
0

v
v / [S]
0
V
M
pente -K
M
v =
V [S]
K + [S]
v K +[S] = V [S] v = -K
v
[S]
+V
M 0
M 0
M 0 M 0 M
0
M
( )

Cette reprsentation est une droite de pente -K

M
et qui coupe l'axe des v au point V
M
.
4.2.5. Reprsentation de Hanes-Woolf
Cette reprsentation ft publie par Charles Hanes et Barnet Woolf en 1932 :
[S]
v
= f [S]
0
0
( )
_______________________________________________________________________________
Licence SV Biochimie 2 : Cintique enzymatique - 17 -

[S] / v
0
[S]
0
pente : 1 / V
M
M
- K
v =
V [S]
K + [S]
v K +[S] = V [S] K +[S] = V
[S]
v

[S]
v
=
1
V
[S] +
K
V
M 0
M 0
M 0 M 0 M 0 M
0
0
M
0
M
M
( )
( )
Cette reprsentation est une droite de pente
1
V
M
et qui coupe l'axe des [S]
0
au point -K
M
( ).
4.2.6. Reprsentation de Eisenthal et Cornish-Bowden (graphe linaire direct)
Cette reprsentation ft publie par Robert Eisenthal et Athelstan Cornish-Bowden en 1974.
Pour chaque couple de vitesse initiale et concentration initiale de substrat v , [S] , j
j 0
( )
, la
droite, dfinie par le couple (j) de points [(-[S] , j
0
, 0) : (0, v
j
)], est trace dans le repre
cartsien (v, [S]).
L'quation gnrique est :
v = a [S] + b , avec pour chaque droite : b = v et a =
v
[S]
v =
v
[S]
[S] + v
j j j
j
0, j
j
0, j
j

pour chacune de ces droites, calculons la valeur de v pour la valeur de [S] gale K
M
, en
utilisant la relation de Briggs-Haldane : v =
V [S]
K + [S]

j
M 0, j
M 0, j
v =
v
[S]
K + v = v 1+
K
[S]
, en utilisant la relation de Briggs - Haldane :
j
0, j
M j j
M
0, j

_______________________________________________________________________________
Licence SV Biochimie 2 : Cintique enzymatique - 18 -
v =
V [S]
K + [S]
[S] + K
[S]
= V
M 0, j
M 0, j
0, j M
0, j
M

En thorie En pratique
v
v
[S]
[S]
V
M
V
M
K
M
K
M
o
o
v
1
[S]
0,1
Thoriquement, nous avons un faisceau de droites concourantes en un mme point de
coordonnes : K , V
M M
( ). Pratiquement les droites concourent dans un petit rectangle et on
prend le milieu des cts pour dterminer K , V
M M
( ).
4.2.7. Quelques commentaires sur ces reprsentations
Les calculs et programmes informatiques permettent d'utiliser directement les points
exprimentaux et de calculer une vitesse initiale pour chaque concentration de substrat et
ensuite de tracer l'hyperbole de saturation, de calculer son asymptote et d'en dduire les
valeurs de V
M
et K
M
ainsi que la valeur de la constante catalytique si on connat la
concentration de l'enzyme et par suite la constante de spcificit.
Dans le cas o nous procdons avec une calculette et une feuille de papier millimtr, nous
allons calculer la vitesse initiale (pente de la tangente la courbe [P]=f(t)) et ensuite utiliser
une des reprsentations linaires pour calculer les valeurs de V
M
et K
M
.
Les reprsentations de Lineweaver-Burk et Eadie-Hofstee ont une coordonne en 1/ [S]
0
,
cela signifie que les mesures les plus prcises seront concentres dans la mme rgion
(voisines de l'axe vertical) et peu de mesures avec une erreur relativement grande existeront
pour des faibles valeurs de concentration de substrat : le trac la rgle de la "meilleure"
droite sera entach d'erreur.
La reprsentation de Hanes-Woolf amliorera la dtermination des valeurs exprimentales
par une distribution plus quilibre des points exprimentaux. Celle de Eisenthal et Cornish-
Bowden donnera les meilleures estimations des valeurs de V
M
et K
M
. Toutefois, malgr ses
_______________________________________________________________________________
Licence SV Biochimie 2 : Cintique enzymatique - 19 -
imprcisions sur les estimations des valeurs des constantes cintiques, la reprsentation de
Lineweaver-Burk est la plus utilise.
5
5
5
.
.
.


D
D
D
o
o
o
s
s
s
a
a
a
g
g
g
e
e
e


e
e
e
n
n
n
z
z
z
y
y
y
m
m
m
a
a
a
t
t
t
i
i
i
q
q
q
u
u
u
e
e
e
Nous avons vu prcdemment la relation entre la vitesse maximum, la constante catalytique
et la concentration totale de l'enzyme : V = k [E]
M cat 0
.
Si nous nous plaons dans des conditions exprimentales o [S] >> [E] et [S] >> K
0 0 0 M
la vitesse mesure est la vitesse maximum et elle est proportionnelle la concentration
totale d'enzyme. C'est donc une mthode qui peut tre utilise pour doser la concentration et
par suite la quantit d'enzyme prsente dans la solution.

[E]
0
pente de la droite k
cat
v
5.1. Activit enzymatique
5.1.1. Activit enzymatique (ou catalytique)
Cette unit a t dfinie pour estimer la quantit de l'activit catalytique d'une prparation ou
d'un chantillon d'enzyme lorsque l'enzyme ne peut tre dfini que par rapport son activit
catalytique.
Une unit d'activit enzymatique (abrviation U.I. ou U.E.) est dfinie comme la quantit
d'enzyme qui produit la transformation d'une micromole de substrat par minute 25C
(mole min
- 1
). La mesure de l ' act i vi t dans des condi t i ons o
[S] >> [E] et [S] >> K
0 0 0 M
permet de doser les quantits d'enzyme prsentes dans des
chantillons.
Remarque : dans le systme international (S.I.), l'unit officielle est le katal (kat) : quantit
d'enzyme qui catalyse la transformation de 1 mole de substrat par seconde. Les biochimistes
prfrent utiliser les units internationales (U.I. ou U.E.)
1 U.I = 1 U.E. = 0,0166 kat = 16,6 nkat
_______________________________________________________________________________
Licence SV Biochimie 2 : Cintique enzymatique - 20 -
5.1.2. Activit enzymatique (ou catalytique) spcifique
C'est l'activit d'un prparation d'enzyme, normalise par unit de masse exprime
classiquement en mg : micromole de substrat par minute par milligramme de l'chantillon
(mole min
-1
mg-
1
).
Dans le cas d'un chantillon pur, et si la quantit d'enzyme est exprime en mole, on
retrouve la constante catalytique, exprime dans ce cas en (min
-1
) (voir 4.1.2).
6
6
6
.
.
.


C
C
C
e
e
e


q
q
q
u
u
u
i
i
i


n
n
n
'
'
'
a
a
a


p
p
p
a
a
a
s
s
s

t
t
t

d
d
d
i
i
i
t
t
t
C'est la fin de cette introduction la cintique enzymatique, les points suivants n'ont pas t
abords, certains ont t vus en chimie, d'autres seront traits dans les annes suivantes :
1) le modle des collisions et du complexe activ pour l'interprtation des phnomnes de
catalyse. Le modle des collisions cintiques a t dvelopp par M. Trautz, W.C.McC
Lewis et Jean Perrin dans les annes 1910-1920), complte par Lindemann, et le modle
du complexe activ publi en 1935 par Henry Eyring
2) des schmas ractionnels non Michaeliens : les enzymes n'obissent pas tous au modle
de base dcrit ici
3) les diagrammes d'tat des enzymes, c'est dire l'tude de l'influence de la temprature, du
pH, de la force ionique, etc.. sur les constantes cintiques des enzymes
4) la dpendance vis vis de la prsence de coenzymes ou cofacteurs pour certains enzymes
5) la rgulation de l'activit enzymatique par des phnomnes de cooprativit positive ou
ngative (le plus connu tant le modle allostrique cooprativit positive), la rgulation
par des effecteurs
6) des modles de schma ractionnel pour des catalyses enzymatiques en prsence
d'inhibiteurs, ou des catalyses plusieurs substrats
7) les mcanismes molculaires qui interviennent dans la catalyse enzymatique.