PRCTICA 3

TECNICAS CROMATOGRAFICAS PARA

SEPARACION Y/O IDENTIFICACION DE
BIOMOLECULAS
La cromatografa es una tcnica muy empleada para separar e identificar
los componentes de una mezcla. La separacin se basa en la diferente
interaccin de cualquier soluto con dos fases, una conocida como fase
estacionaria, generalmente slida, y otra denominada fase mvil, que
puede ser lquida o gaseosa. Debido a procesos como adsorcin en la
fase slida, solubilizacin y arrastre por la fase mvil etc., cada soluto se
distribuye entre las dos fases con un coeficiente de reparto caracterstico.
Este coeficiente depende de la naturaleza de las fases y de los solutos, o
componentes de la mezcla a separar.
A. CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA (TLC)
Es una de las ms sencillas. Se denomina as porque la fase estacionaria
es una capa fina de una sustancia hidroflica (slice, almina o acetato de
celulosa) colocada sobre un soporte inerte. La fase mvil es una mezcla
de disolventes en diferentes proporciones que migra por la fase
estacionaria en base a capilaridad dentro de una cubeta cerrada y que se
encuentra saturada de vapor de la fase mvil.
En este tipo de cromatografa se utiliza un parmetro relacionado con el
coeficiente de reparto, que se denomina Rf. Se define como la relacin
entre la distancia recorrida por la sustancia y la distancia recorrida por la
fase mvil. En el caso de esta prctica, es directamente proporcional con
la solubilidad de la sustancia en la fase mvil. Sus valores oscilan entre 0,
para las sustancias insolubles, y 1 para las sustancias muy solubles en la
fase mvil y que no interacciona con la fase estacionaria.
En esta prctica, la cromatografa en capa fina se utiliza para separar e
identificar aminocidos. Estos se revelarn en la placa mediante reaccin
con ninhidrina, de acuerdo con la reaccin descrita en la Prctica 2.

MATERIAL
Placa fina (Ac. de celulosa)

Micropipetas y cnulas

Estufa a 105C

Cubeta de cromatografa

Lapiz y regla

Secador

Cubeta de revelado y pinzas

REACTIVOS
*Fase mvil (n-butanol/acetona/actico/agua, 35/35/20/10 en volumen).
*Ninhidrina 1 mg/ml en acetona.
*Asp 0.5%

*Leu 0.5%

*Lis 0.5%

*Ala 0.5%

*Aminocido o mezcla de aminocidos problema.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
IMPORTANTE: Tomar la placa solamente por los bordes, y no poner los
dedos sobre su superficie, para evitar manchas debido a los aminocidos
y/o protenas presentes en la piel.
1. Colocar aprox. 25 ml de la fase mvil en la cubeta, que debe
permanecer cerrada para saturar su atmsfera en esos disolventes.
2. Utilizando el lpiz, sin presionar para no rascar el acetato de celulosa,
trazar dbilmente una lnea a 1 cm del extremo inferior de la placa, tal
como indica la figura. Marcar en esta lnea 5 puntos equidistantes y
aplicar en cada uno de ellos 5 l gota de cada aminocido, teniendo
cuidado de que la gota se extienda lo menos posible, con la ayuda del
secador.
3. Colocar la placa en la cubeta, con los puntos de aplicacin en el borde
superior y en contacto con la fase mvil. El nivel no debe cubrir la lnea
trazada. Cerrar y esperar una aproximadamente una hora, vigilando que el
frente de la fase mvil no llegue al extremo superior de la placa. Realizar
en ese tiempo el otro apartado de la prctica.
4. Sacar la placa y cerrar la cubeta. Marcar rascando un borde el extremo
superior donde lleg la fase mvil. Secar la placa 1 minuto en la estufa e
introducirla en la cubeta de revelado con ninhidrina hasta que se
impregne. Sacarla y meter en la estufa durante 3-5 min a 105C.
5. Observar las manchas aparecidas, su forma, intensidad y color.

CUESTIONES
1. Calcular el Rf de cada aminocido patrn y del problema.
2. Identificar el aminocido(s) problema(s)
3. Que entiende por cromatografa en placa fina bidimensional?
4. Como afectara al Rf de los aminocidos la sustitucin de n-butanol por
etanol en la fase mvil?

B. CROMATOGRAFIA DE FILTRACION EN GEL

Este tipo de cromatografa, tambin llamado de tamizado molecular, se
utiliza para separar biomolculas, principalmente protenas, en base al
distinto peso molecular de sus componentes, y no en base a la
hidrofobicidad, como en TLC. Como los aminocidos son semejantes en
tamao, no se pueden separar en este tipo de cromatografa. Las
sustancias de tamao muy diferente s.
La fase estacionaria suele ser un dextrano polimrico denominado
Sephadex, de tamao de poro controlado. Como es un polisacrido, sus
propiedades hidroflicas le permiten un hinchado fcil que le da el
aspecto de un gel con el que se pueden rellenar las columnas de
cromatografa.
Fsicamente, la separacin se produce cuando la mezcla disuelta en la
fase mvil fluye a travs de la fase estacionaria y se encuentra con los
poros del gel. De forma simplista, las molculas ms grandes no pueden
entrar por esos poros y por tanto pasan por la columna a travs del
espacio vaco entre las partculas de gel, que se denomina volumen
muerto de la columna. Las molculas pequeas si pueden entrar por esos
poros, por lo que se adentran en el entramado de microcanales de cada
partcula de gel, recorriendo un camino mayor y retrasndose respecto a
las molculas de tamao mayor. As pues, existe una relacin inversa
entre tamao molecular y volumen de elucin de cada sustancia desde la
columna.

Los parmetros ms importantes para tratar este tipo de cromatografa

desde un punto de vista cuantitativo son:
a) Volumen muerto (Vo): Es el volumen de la columna que no ocupa las
partculas del gel, y por tanto no tiene poder separador. Puede
determinarse experimentalmente con una sustancia que por su gran
tamao sea excluda de todos los poros de las partculas del gel.
b) Volumen total (Vt): Es el volumen total de lecho, es decir el que ocupan
las partculas mas el volumen muerto. Puede calcularse geomtricamente
o bien con una sustancia de peso molecular pequeo, que se introduzca
en todos los poros.
c) Volumen de elucin (Ve): Es el volumen al que eluye una sustancia
desde que se introduce en el gel.
Obviamente, Vo y Vt son constantes de la columna, mientras que Ve
depende de cada sustancia. En funcin de estos parmetros se puede
definir el Kav, que es semejante al coeficiente de reparto de la sustancia,
y cuya expresin matemtica es:
Kav = (Ve - Vo) / (Vt - Vo)
Para cada tipo de Sephadex, existe un rango de peso moleculares donde
la relacin entre Kav y el logaritmo de estos pesos es lineal. Por tanto,
una columna de este tipo puede servir para separar sustancias, y tambin
para determinar su peso molecular si se compara con otras de peso
molecular conocido en ese rango lineal.

MATERIAL Y REACTIVOS
1 Columna de cromatografa BioRad de 1 cm de dimetro y 20 cm de largo
4 probetas de 10 ml
2 pipetas de 1 y 5 ml
2 pipetas Pasteur
NaCl al 0.9% con azida sdica al 0.02% (TOXICO, NO PIPETEAR CON LA
BOCA).
Mezcla de azul dextrano y vitamina B12 para separar.
Micropipeta P200 para aplicacin de muestra (entre 100 y 200 l).

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Colocacin de la muestra y recogida de muestras:
1. Desconectar el tubo capilar que une el eluyente con la columna,
destapando sta.
2. Quitar el tapn inferior de la columna hasta que eluya todo el volumen
encima del lecho. Volver a tapar.
3. Pipetear 0.1 ml de mezcla colocndola suavemente encima del lecho de
gel.
4. Destapar de nuevo la parte inferior de la columna, con una probeta (A)
situada debajo para empezar a medir volmenes. Tapar cuando la muestra
se introduzca en la columna.
5. Llenar de eluyente la parte superior de la columna, suavemente con la
ayuda de una pipeta Pasteur.
6. Conectar el capilar desde el reservorio de eluyente a la columna y
quitar el tapn inferior, siguiendo la recogida en la probeta A hasta que
llegue la primera gota azul.
7. Cambiar a la probeta B, recogiendo todo el eludo azul.
8. Cambiar a la probeta C, recogiendo todo el eludo incoloro hasta la
aparicin de la primera gota rosa.
9. Cambiar a la probeta D, recogiendo todo el eludo de vitamina B12,
hasta nueva aparicin de eluyente incoloro.
10. Tapar la columna en su parte inferior y dejar lista para la cromatografa
siguiente.
Suponiendo que el proceso de elucin da lugar a picos simtricos, el
mximo de concentracin de cada sustancia coloreada se encontrar en
el centro de los volmenes medidos, por lo que los volmenes de elucin
sern:
Ve (Azul Dextrano) = A + B/2
Ve (Vitamina B12) = A + B + C + D/2