Universidad Nacional del Nordeste

Trabajo Prctico N 4
FACULTAD DE AGROINDUSTRIAS
Medios de cultivo
Microbiologa General- Carrera Farmacia
Ao 2006

Lpez Tvez, Leonor; Torres, Carola
Trabajo Prctico N 4
Medios de Cultivo

MEDIOS DE CULTIVO

Un medio de cultivo es un sustrato o una solucin de nutrientes que permite el des
arrollo de
microorganismos. En las condiciones de laboratorio para realizar un cultivo, se
debe sembrar sobre el medio
de cultivo elegido las muestras en las que los microorganismos van a crecer y mu
ltiplicarse para dar
colonias.

Los microorganismos son los seres ms abundantes de la tierra, pueden vivir en con
diciones extremas de pH,
temperatura y tensin de oxgeno, colonizando una amplia diversidad de nichos ecolgic
os. Entre los
requerimientos ms importantes para su desarrollo estn el carbono, el oxgeno, nitrgen
o, dixido de
carbono e hidrgeno. Muchas bacterias sin embargo necesitan del aporte extra de fa
ctores de crecimiento
especficos en forma de suero, sangre y extracto de levadura entre otros.

Clasificacin de los medios de cultivo

Segn su origen:

a) NATURALES: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen anim
al o vegetal como ser
extractos de tejidos o infusiones y cuya composicin qumica no se conoce exactament
e.
b) SINTTICOS: son los medios que contienen una composicin qumica definida cuali y
cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles.
c) SEMISINTTICOS son los sintticos a los que se les aaden factores de crecimiento
bajo una forma
de un extracto orgnico complejo, como por ejemplo extracto de levadura.

Segn su consistencia

a) LQUIDOS: se denominan caldos y contienen los nutrientes en solucin acuosa.
b) SLIDOS: se preparan aadiendo un agar a un medio lquido (caldo) a razn de 15g/litr
o. El agar es
una sustancia inerte polisacrida (hidrato de carbono) que se extrae de las algas.
Como esta sustancia no
es digerida por las bacterias no constituye ningn elemento nutritivo. Este conjun
to convenientemente
esterilizado puede ser vertido en placas de Petri o en tubos de ensayo y present
an la posibilidad de aislar
y diferenciar bacterias, "procesos que antes no eran posibles en medio lquido".
c) SEMISLIDOS: contienen 7,5 g de agar /litro de caldo. Se utilizan para determin
ar la motilidad de las
especies en estudio.
Actualmente se encuentran disponibles comercialmente con el agregado de agar.

Segn su composicin: A causa de los requerimientos qumicos del mundo microbiano, a v
eces es necesario
agregar o eliminar componentes qumicos del medio.

a) COMUNES O UNIVERSALES: su finalidad es el crecimiento de la mayor parte de lo
s
microorganismos poco existentes. Es el medio ms frecuentemente utilizado para man
tener colonias
microbianas. Por ejemlo: agar comn o caldo comn.
b) ENRIQUECIDOS: estn compuestos de un medio base como apoyo del crecimiento al c
ual se le puede
agregar un gran exceso de nutrientes como suplementos nutritivos, por ejemplo: s
angre, suero, lquido
asctico, etc. Se utiliza para microorganismos que tienen grandes exigencias nutri
cionales.
c) SELECTIVOS: son slidos en los que la selectividad se consigue alterando las co
ndiciones fsicas del
medio o aadiendo o suprimiendo componentes qumicos especficos con el fin de inhibir
el crecimiento
de especies qumicas cuyo crecimiento no interesa. Este tipo de medio slo permite e
l crecimiento de un
grupo de microorganismos e inhibiendo el de otros. Se utiliza para seleccionar
y aislar microorganismos
a partir de poblaciones mixtas. Por ejemplo Agar salado-manitol o Chapman (permi
te el crecimiento de
ciertos estafilococos).
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Entre los factores selectivos que alteran las condiciones del medio tenemos:
Cambio de pH: por ejemplo agregando cido actico para favorecer el crecimiento de
Lactobacillus (pH
final: 5,4 que es hostil par la mayora de las especies que crecen entre 6,5 y 7,2
). Los hongos crecen entre
pH 4 y 6 y S. faecalis a pH 9,6.
Cambio de temperatura: la mayora de las bacterias crece ptimamente entre 20 C y 40
C. Los
cultivos tpicos de S. Faecalis requieren 60 C de temperatura y los de Listeria son
capaces de
desarrollarse y crecer a 4 C.
Alteraciones osmticas: se acrecientan las propiedades osmticas un medio con el a
gregado de cloruro
de sodio. Estos medios intensifican la seleccin de bacterias halfilas como Staphyl
ococcus spp. (7,5%).
Ajuste en la tensin de oxgeno: es importante en la seleccin de aerobios y anaerobi
os.
Ajuste en la tensin de anhdrido carbnico: muchos patgenos importantes pueden ser cu
ltivados a
menos que se eleve la tensin ms all de la atmosfrica.

Entre los factores que inhiben el crecimiento de bacterias indeseables tenemos:
Antispticos: sustancias antibacterianas inespecficas que pueden actuar como inhib
idores. Por ejemplo:
el medio de cultivo comercial S - S (Salmonella - Shigella) que contiene verde b
rillante (inhibe las
bacterias grampositivas) y sales biliares (que inhiben un gran nmero de gramnegat
ivas menos
enterobacterias). Otro ejemplo es el medio de Mc Conkey que contiene cristal vio
leta (inhibe las
grampositivas pero no las enterobacterias)
Antibiticos: sustancias antibacterianas especficas que impiden el crecimiento de
aquellos
microorganismos que no nos interesa que crezcan en ese medio. Un ejemplo es el m
edio de Thayer -
Martin con VCN (vancomicina, colistina y nistatina) que se utiliza para el aisla
miento de gonococos. La
penicilina en una concentracin de 5,50 unidades/ ml inhibe la mayora de las grampo
sitivas. Otro
ejemplo es el medio de Sabourand - cloranfenicol para el aislamiento de Cndida al
bicans.

d) DIFERENCIALES: son medios de cultivos que nos permiten distinguir entre vario
s gneros y especies
de microorganismos. Por ejemplo si al medio se le ha aadido un carbohidrato y un
indicador y la
bacteria que se cultiva es capaz de fermentar dicho carbohidrato, se produce una
acidificacin del medio
con el consiguiente viraje de color del indicador por el cambio de pH. El citrat
o de Simmons es un medio
cuya nica fuente de carbono es el citrato sdico, entonces en l solo crecern las bact
erias capaces de
desarrollarse utilizando como nica fuente de carbono ese componente. A menudo la
separacin se basa
en la diferencia de color de las colonias aisladas, como en el agar con azul de
metileno - eosina que
permite diferenciar E. coli (colonias oscuras y de brillo metlico) de Enterobacte
r aerogenes (colonias
rosadas de centro azul sin brillo). Estos dos microorganismos en agar nutritivo
producen colonias de
color gris blancuzco.

Suelen ser a la vez selectivos, por lo tanto solo crecern determinadas bacterias
(pueden ser dos o ms tipos)
que al actuar sobre alguno de los componentes especficos del medio, demuestran al
gunas de sus propiedades
o caractersticas y nos permite diferenciar entre ambos tipos.
e)DE ENRIQUECIMIENTO: son medios lquidos que contienen un agente que inhibe las e
species no
deseadas pero que favorece el crecimiento irrestricto del agente infeccioso. El
medio de Muller - Kauffman,
permite el crecimiento de Salmonella inhibiendo a su vez el de numerosos colifor
mes. Esto es de gran
importancia ya que en ciertas muestras, por ejemplo fecales, el agente infeccios
o (Salmonella) es frgil y
puede ser superado en nmero por agente bacterianos indgenas como E. coli; por lo t
anto antes de realizar
las pruebas de laboratorio es necesario aumentar su nmero con respecto a sta en un
caldo de
enriquecimiento. Ejemplo de este tipo son los caldo de tetrationato y selenito.
El agua de peptona alcalina se
utiliza para Vibrio cholerae.
El enriquecimiento es una tcnica que utiliza un medio selectivo lquido para permit
ir el desarrollo de un
microorganismo a partir de una muestra que contiene una gran variedad de microor
ganismos. As, aquellos
microorganismos para los que el ambiente sea ms favorable crecern ms que los otros
y finalmente sern
predominantes

f)DE TRANSPORTE: son utilizados para asegurar la viabilidad de la bacteria sin m
ultiplicacin
significativa de los microorganismos desde el momento de su extraccin hasta su po
sterior estudio. Se
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utilizan generalmente cuando las muestras deben ser enviadas de un laboratorio a
otro. Se recomienda un
lmite de dos horas desde la recoleccin de las muestras y su estudio en el laborato
rio, pero este lmite de
tiempo es superado (frecuentemente cuando se trata de muestras tomadas en un con
sultorio). Esta demora
hace necesario el uso de medios de transporte adecuados. Los medios de transport
e ms frecuentemente
utilizados son los de Stuart, Amies y Carey - Blair. Existe una unidad descartab
le de cultivo de transporte
llamada Culterette que consiste en un tapn estril de poliestireno y un ampolla en
la parte inferior que se
rompe cuando se ejerce presin liberando el medio de transporte de Stuart alrededo
r del extremo del tapn
impregnado en la muestra.

Hasta hace algunos aos los componentes orgnicos mencionados deban ser obtenidos por
el microbilogo
y el medio de cultivo se preparaba en el laboratorio. Actualmente se dispone com
ercialmente de la mayor
parte de los medios e incluso de sus componentes adicionales.

Un gran nmero de medios de cultivo usados en el laboratorio de microbiologa son mi
xtos, es decir que
tienen como finalidad la de varios grupos de los mencionados, por ejemplo, el ag
ar S- S es selectivo (pues
tiene un inhibidor: el verde brillante) y es a la vez un medio diferencial (llev
a lactosa y un indicador) que
permite diferenciar las bacterias fermentadoras o no de dicho polisacrido. El med
io de Thayer y Martin para
Neisseria es un medio enriquecido (contiene plasma) y es selectivo (tiene 3 anti
biticos inhibidores de la
flora bacteriana y fngica: colistina, vancomicina y nistatina).


ACTIVIDADES
1- Prepare el volumen indicado de los medios de cultivo siguiendo la tcnica opera
toria

Tcnica operatoria
Los medios de cultivo comercialmente disponibles se presentan como polvos deshid
ratados, estriles y deben
ser conservados en sus frascos originales con la tapa fuertemente ajustada. Ante
s de preparar cualquier
medio se debe leer cuidadosamente el rtulo del envase y fijarse la fecha de venci
miento.
Deben prepararse empleando material de vidrio limpio y seco. Se calcula la canti
dad de polvo, de acuerdo a
las instrucciones del rtulo del envase y el volumen total que se desee preparar.
Se pesa sobre papel de
aluminio y se vuelca en el recipiente en el que ser preparado (debe ser un recipi
ente graduado, caso
contrario se medir el volumen de lquido en otro recipiente auxiliar limpio y gradu
ado). Se le va agregando
el agua destilada y se agita vigorosamente hasta obtener una suspensin o solucin (
si es caldo) homognea.
Los caldos suelen dar soluciones transparentes que no necesitan calentamiento ni
ninguna otra manipulacin
antes de ser llevados al autoclave. Las soluciones con agar sin embargo, requier
en calentamiento casi hasta
ebullicin con agitacin constante y a fuego suave (o a Bao Mara o microondas) para l
ograr su
solubilizacin completa. Se debe observar con cuidado la solucin durante el calenta
miento ya que una vez
que aparecieron las primeras burbujas tiende a desbordar por ebullicin.
Luego los medios se dosifican teniendo en cuenta el uso que se les dar. Los tubos
que contengan estas
soluciones que sern esterilizadas en autoclave deben contener slo dos terceras par
tes de su volumen total
ocupado por el lquido para evitar desbordes. As preparadas las soluciones deben es
terilizarse en autoclave
(15 minutos a 121 C). Una vez retirados del autoclave, los medios deben dejarse e
nfriar y conservarse as
refrigerados.
Si van a ser utilizados en el momento se colocarn en un bao de agua a 55 C para que
se enfren antes de
verterlos sobre las placas. Si sobre la superficie de una placa recin preparada a
parecieran burbujas, stas
pueden eliminarse al pasar rpidamente la llama del mechero de Bunsen sobre la sup
erficie del agar.

Recomendaciones
Leer cuidadosamente el rtulo del envase. Controlar la fecha de vencimiento.
No introducir ningn tipo de herramientas en el medio (esptulas, varillas, cucharas
, etc.)
Para homogeneizar el medio agitar tomando el envase desde el cuello del erlenmey
er, evitar las
varillas de vidrio.
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Los tubos con tapa a rosca no deben ajustarse completamente cuando se introducen
en el autoclave
para su esterilizacin, la tapa debe quedar con media rosca. Una vez retirados del
autoclave, s
deben ajustarse para minimizar los riesgos de contaminacin.

2- Responda el siguiente cuestionario

1. Segn la concentracin de este medio, clasifquelo de acuerdo a su origen: 5gr. de
glucosa, 1 gr. de
cloruro de amonio, 1 gr. de fosfato dicido de potasio, 0,3 gr. de sulfato de magn
esio, 5 gr. de
extracto de levadura y 1 litro de agua destilada.
2. Calcule cuntos gramos de agar-agar se necesitan para preparar 125 ml de medio
de cultivo slido.
Qu porcentaje P/V se utiliz?
3. Por qu el medio Mc Conkey puede ser considerado un medio selectivo y diferencia
l? Para el
aislamiento de qu tipo de bacterias se lo emplea ? Anote la composicin y diga qu fu
ncin cumple
el rojo neutro.
4. En qu momento se esteriliza un medio de cultivo y por qu?
5. Cual es la fuente de carbono del medio Citrato de Simmons y del agar nutritivo
? Por qu se
considera al primero un medio diferencial y con respecto a qu?
6. Antes del agar-agar se utiliz otro componente para solidificar los medios de c
ultivo de qu
componente se trata y qu inconvenientes presentaba su uso?
7. Cul es el medio de cultivo elegido para el aislamiento de Staphylococcus aureus
? Diga la
composicin y clasifquelo de acuerdo a su origen, composicin y consistencia.
8. Cul es el medio de cultivo que se emplea para el aislamiento de hongos y levadu
ras?