PRUEBAS DIAGNOSTICAS EN BRUCELOSIS BOVINA.

M.V. Miguel Acosta Andrade.

1
M.V. M.C. Martn Ortiz Morera
2
La brucelosis es una enfermedad infecto-contagiosa de distribucin mundial que sigue
siendo una de las rinciales zoonosis or su reercusin en la economa ecuaria!
debido a la resencia de abortos! artos rematuros! cras d"biles! infertilidad temoral!
# merma en la roduccin de lec$e. %n Am"rica latina! esta considerada como una
zoonosis imortante or su morbilidad # re&alencia sobre todo en ganado lec$ero.
'esde el unto de &ista de salud (blica # bioseguridad debemos se)alar que los casos
$umanos en nuestro medio se resentan con cierta frecuencia! sobretodo en ondas
cclicas or que el $ombre no es reser&orio natural del agente etiolgico! sino mas bien
es un $u"sed accidental del g"nero *rucella siendo la de ma#or atogenicidad la
* ru c e ll a m e lit e n s i s.
El diagnstico definitio de la enfe!"edad es "ediante el aisla"iento
#acte!iolgico del germen or medios de culti&o # rocedimientos eseciales+ as
mismo como toda infeccin durante el desarrollo de la enfermedad se forman
anticueros cu#a resencia son detectables
mediante ruebas serolgicas in&itro. ,abemos
que los anticueros transe(ntes est-n ligados a
fracciones s"ricas que son las inmunoglobulinas!
de ellas la .gM llamadas tambi"n macroglobulina
1/, #0o madres 1que son las m-s esadas de las
globulinas del gruo gamma2 que est-n resentes
en los eriodos iniciales de la infeccin # las .g3
o microglobulinas del gruo 4, las que aarecen
osteriormente! otras inmunoglobulinas del tio A # '! siguen siendo estudiadas en
*rucelosis! ,in embargo merecen atencin las inmunoglobulinas del gruo 12, que se
$an encontrado en lec$e de &acas infectadas
%l conocimiento sobre la indeendencia de la roduccin de anticueros como son5 las
aglutininas! fi6adores del comlemento! reciitinas! bloqueadores incomletos
neutralizantes! etc. as como las roiedades fsicas de las diferentes inmunoglobulinas
son de imortancia &ital ara "l diagnostico de la infeccin brucelar.
CRITERIOS PARA ESTABLECER EL DIAGNOSTICO
Los rocedimientos # m"todos utilizados ara establecer "l diagnostico de la brucelosis
&aran de acuerdo a los ob6eti&os! metas! # disonibilidad de recursos $umanos #
econmicos.
1
Consultor 7acional # e8 rofesor rincial a dedicacin e8clusi&a Laboratorio de Microbiologa #
9atologa Clnica! :acultad de Medicina Veterinaria - ;.7.M.,.M. Lima - 9er(.
2
9rofesional resonsable del Laboratorio de *acteriologa < Centro de 'iagnstico de ,anidad Animal -
,%7A,A 9er(
7o e8iste ninguna rueba serolgica que alicada aisladamente ueda descubrir la
totalidad de casos en brucelosis! or eso es imrescindible que los rogramas de control
# erradicacin se basen en el criterio de diagnstico de $ato. Cuando se alican &arios
criterios en el diagnstico indi&idual se obtienen me6ores resultados #a que su
interretacin debe $acerse en con6unto. Actualmente de disone de rocedimientos
serolgicos con &alor diagnstico como son5 rueba r-ida de laca! rueba de tubo! 2
mercatoetanol! rosa de bengala #0o tar6eta # fi6acin del comlemento! consideradas
fundamentales en los rogramas de brucelosis animal.
La rueba del anillo en lec$e se alica e8itosamente en la &igilancia eidemiolgica de
-reas controladas # libres de infeccin! as como ara descubrir $atos o establos
resuntamente infectados # ara la tasa de de infeccin de una cuenca lec$era.
%n los animales de carne # los orcinos se recomienda tomar las muestras de sangre
ara el e8amen serolgico en las ferias! camales # remates utilizando or su sencillez la
rueba de rosa de bengala - card test ara los bo&inos # las ruebas reciitacin or el
ri&anol en suero calentado a =>?C # 2 mercatoetanol ara orcinos
PRUEBAS USADAS EN EL DIAGNOSTICO
P!$e#a de Agl$tinacin lenta o en T$#o- %s la m-s antigua ara "l diagnostico
serolgico de la *rucelosis 1@rig$t # ,mit$! 1A/42 # siegue siendo una de las me6ores
siemre que se realice en condiciones normalizadas. %l antgeno debe ser elaborado con
ceas en fase lisa que son los que tienen las caractersticas aglutinog"nicas estables.
'eber- contener B.BC= D de c"lulas susendidas en solucin salina fisiolgica fenicada
al B.= D! cualquier &ariacin o modificacin en el contenido celular del antgeno influ#e
considerablemente en la sensibilidad del mismo.
Los antgenos mu# diluidos son $iersensibles # dan generalmente falsos ositi&os!
mientras que un antgeno de alto contenido celular roduce el efecto contrario
%n ciertas ocasiones # or necesidad # dentro de ciertos lmites se ueden usar
antgenos mas o menos sensibles con resecto el standard siemre que los resultados se
e8resen en ;nidades .nternacionales 1;.2. 9ara ello se requiere utilizar el suero 9atrn
.nternacional 19.,Ab2 distribuido en amollas de 1 ml conteniendo 1.BBB ;. de
aglutinacin en dilucin con el antgeno standard 1al B.B C=D2 .
%n caso que el antgeno emleado de un ttulo de 10=BB con el suero internacional # que
or otro lado un suero roblema reaccione a ttulo de 101BB con dic$o antgeno se
interreta de la manera siguiente5
%&&& ' %&& ( )&& U.I. * "l
+&&
Lo que indica que el antgeno esta traba6ando al =B D de su caacidad con resecto al
suero atrn 9.,Ab de manera que el ttulo del suero roblema con el antgeno
traba6ado corresonde a un 102BB ;.
Un tit$lo de %,%&& UI es conside!ado significatio de infeccin en ani"ales
ac$nados - de %,)&& UI en ani"ales ac$nados a te".!ana edad. En ot!as
es.ecies ani"ales la .!esencia de %,+& UI esta !elacionada est!ec/a"ente con la
infeccin - es tit$lo de .ositio .a!a 0l diagnostico de !$tina.
%l grado de aglutinacin en cada una de las distintas diluciones uede clasificarse como5
Co".leta 123 formacin de grumos e&identes. Inco".leta 1%3 resencia de grumos
finos. Negatio 143 ausencia de grumos mezcla suero0antgeno $omog"nea.
P!$e#a de Agl$tinacin en .laca! tambi"n llamada r-ida o de
Euddleson quien en 1/2B rear un antgeno concentrado ara usarlos en
ruebas de aglutinacin en lacas! tan es as que el m"todo se $a e8tendido
en todo el mundo! aunque $a# algunos ases de Am"rica que #a &ienen
discontinuando su uso orque sus resultados no son tan constantes como la
rueba de tubo! debido a eque)os errores manuales en la e6ecucin
rutinaria de la rueba.
P!$e#a del Anillo en Lec/e PAL41:eis$auer1/2B2.- Aunque se uede
emlear en distintas esecies de animales es de articular utilidad ara
detectar reba)os bo&inos infectados or ser una rueba resunti&a! se $a
dise)ado ara descubrir la resencia de aglutininas en la lec$e. %ste
antgeno tiene una concentracin celular de CD # un E de C!B!
coloreado con $emato8ilina o en su defecto ueden usarse sales de
Fetrazolio! el antgeno osee una gran sensibilidad or su ba6a
concentracin celular # no tiene caacidad amortiguadora. %l comle6o
antgeno0anticuero se ad$iera a la suerficie de los glbulos de grasa #
ascienden con ellos a la suerficie formando una reaccin. ,i la
muestra no tiene aglutininas no se colorea! formando un anillo de color
blanco. ,i or el contrario la muestra resenta un anillo de color azul!
se considera ositi&a. La rueba ermite un control m-s r-ido! su
costo es considerablemente menor! # su e8actitud radica en mezclas de
lec$es de &arios reba)os 1tanques! cisternas! orongos # en cierto casos
animales indi&iduales2! la e8actitud de la rueba radica en la mezcla de
&arias &acas cuando menos de 2B - 2= animales. %l orcenta6e de grasa de la muestra de
lec$e influ#e sobre los resultados de la rueba de anillo en lec$e! orque la formacin
del anillo de crema deender- del orcenta6e de grasa de la lec$e.
La .!$e#a de igilancia "ediante la PAL! se uede usar ara la recertificacin de
$atos libres # su eficacia deende de la frecuencia con se realicen. ;na (nica rueba
indica la infeccin $asta el >B-4B D de sensibilidad # con una segunda rueba a los /B
das de inter&alo! muestra un /= de efecti&idad ara detectar $atos infectados
,e tiene fidedigna informacin que con tres muestreos consecuti&os de 9AL durante el
a)o dan resultados negati&os a la rueba serolgica.
P!$e#a de Ta!5eta -,o Rosa de Bengala 19ietz!1/>4! 7iole##i! 1/>>! Ga# # Carle#
1/>A! Morgan # Col!1/>A2. Fambi"n llamada del antgeno tamonado or su caacidad
de mantener estable un E determinado+ en
consecuencia es un rocedimiento cualitati&o mas no
cuantitati&o de aglutinacin r-ida! de aglutinacin
macroscica que se realiza en una sola dilucin # que
detecta rincialmente inmunoglobulina del tio 31
igualmente reacciona ante las .gM ero no en su totalidad como tamoco lo $ace con
las .g32! el colorante emleado es el Gosa de *engala a un E H.>= con un &olumen
celular del orden de A D. %l tiene una estabilidad de conser&acin C?C+ ero uede
deteriorase si se e8one reetidamente a cambios de temeratura ambientales. %s mu#
imortante que el antgeno re(na las cualidades necesarias ara la realizacin de la
rueba de lo contrario los resultados ueden ser falseados. Actualmente $a# algunos
ases de Am"rica que #a &ienen discontinuando su uso or darle rioridad a la rueba
del antgeno bufferado en laca.
A L P RI N CI P I O E S T A P RUEB A F U E I D EA D A P AR A ANI M A L E S D E CARN E Y
P O RCIN O S. P O S T ERI O RMEN T E SE MO D IFIC O P AR A H ACER L A EX T EN S I V A
A G ANAD O B O V IN O , E S U N A P R U EB A Q U E SE U SA C O M O T AMI Z O
DE S CAR T E I G UA L M E N T E CO M O CO M P L EME N T AR I A O A L T ER N A T IV A D E
O T RA S P RUE B A S BA S ICA S
P!$e#a de 6i5acin del Co".le"ento.- %sta t"cnica fue alicada al diagnostico de la
brucelosis tanto $umana como animal en tiemos remotos! sin embargo recientemente
se $a e8tendido su uso en esecial ara diferenciar las reacciones dudosas. %n la
actualidad ara detectar animales infectados se considera esta rueba m-s sensible que
las otras ruebas de aglutinacin or que dan menos reacciones inesecficas # or las
introducciones que se &ienen dando en modificar la t"cnica en general! siendo una de las
modificaciones de ,auldin #
Gobinsn 11/=12 que es una
modificacin de la t"cnica de
Colmes basada en la fi6acin al
fri # 1BBD de $emlisis. As
como el uso de t"cnicas
cuantitati&as basadas en el =BD
de $emlisis que se est-n
e8tendiendo cada da m-s. ,e
$a demostrado que la
correlacin entre la infeccin #
la reaccin ositi&a es m-s
estrec$a # coincidente en esta rueba que en la seroaglutinacin. Adem-s que los
anticueros $eteroesecificos roducen menos roblemas que en la aglutinacin.
%n el $ombre se emlea tanto ara el diagnstico de la brucelosis aguda como ara la
crnica # el m"todo de eleccin es la fi6acin en fro a C?C. Las &ariables que tienen
ma#or influencia en la e8actitud # sensibilidad de la rueba es el antgeno # binomio
tiemo0temeratura de fi6acin del comle6o antgeno0anticuero0comlemento en la
rimera fase 1 de la reaccin.
,e $a demostrado que las cabras &acunadas o infectadas e8erimentalmente con
* ru c e ll a m e lit e n s is Ge& 1! la acti&idad fi6adora del comlemento esta restringida a la
fraccin .g3.
) 7e!ca.toetanol 1M Anderson Col. 1/>C2.- %s una rueba selecti&a que detecta las
.g3! se basa en que los anticueros .gM con configuracin de ent-mero se degradan en
= unidades seme6antes or la reduccin de los enlaces disulfuros debido a la accin de
ciertos comuestos que contienen el radical tilo tales como el 2 mercatoetanol! cistena
# el ditiotreitol! estas unidades contienen oseen constantes de sedimentacin 4, # eso
molecular del orden de 1AB!BBB conser&ando sus caractersticas de antigenicidad ero
ierden la acti&idad de anticuero luri&alente # se comortan como anticueros
uni&alentes a(n cuando las subunidades est-n integradas or dos cadenas esadas # dos
li&ianas que al combinarse con el antgeno no originan comle6os comletamente
grandes como ara reciitar o aglutinar. La rueba se usa cmo e&idencia resunti&a
de la resencia de anticueros de .g3. La rueba del 2 Mercatoetanol debe usarse
siemre de manera aralela a la rueba del tubo. La concentracin del antgeno es doble
que la del tubo ara comensar la dilucin que resulta de agregar al suero una solucin
del 2 mercatoetanol or que el antgeno no debe utilizarse fenol. %l mercatoetanol se
reara en frascos color caramelo # debe guardarse como m-8imo or esacio de 4 das
a refrigeracin! orque ierde su caacidad reductora or o8idacin.
ELISA 1En8-"e Lin9ed I""$noso!#ent Assa-3.4 %s una rueba r-ida or la que un
anticuero o antgeno se une a una enzima como medio ara detectar una relacin entre
el anticuero # el antgeno.
%s una rueba que desde el unto de &ista de sensibilidad! $a demostrado que durante la
fase aguda de la infeccin e8iste una resuesta de
anticueros cl-sicos5 aumento de .gM e .g3! que a
lo largo del roceso el titulo de .gM &a
descendiendo. ,in embargo algunos autores indican
todo lo contrario! los anticueros .gM no &uel&en a
ele&arse de forma significati&a en los casos de una
nue&a recada o reinfeccin! la .gM uede
detectarse con ttulos decrecientes durante unos A a
1B meses! en los casos que e&olucionan a la
curacin! la .g3 esecifica uede ser detectada con
ttulos que &an disminu#endo rogresi&amente durante unos HB meses # solo se ele&an
en los casos de reinfeccin o recada. %l roblema de la utilizacin de esta rueba surge
de la oca e8eriencia clnica que e8iste ara correlacionar los resultados con la
e&olucin clnica. Algunos autores $an lanteado desde #a la realizacin de %L.,A
total! es decir .gMI.g3IlgA como rueba diagnstica (nica de gran sensibilidad ara la
b(squeda de anticueros.
Reaccin en Cadena de la Poli"e!asa 1PCR3.4 Actualmente se &iene traba6ando con
dedicacin # esmero en esta rueba! #a que tiene una sensibilidad mu# alta en los
resultados e&aluati&os. La rueba ermite la deteccin de secuencias esecficas del
-cido deso8irribonucleico 1A'72 del agente causal del roceso infeccioso detectando la
resencia de la bacteria en el $u"sed! # no la resencia #0o ausencia de anticueros en
suero de los animales sosec$osos.
'eteccin de roductos bacterianos5 -cidos nucleicos.- %l desarrollo de las t"cnicas de
amlificacin genmica # su alicacin al diagnstico e identificacin microbiana $a
desertado un gran inter"s entre los diferentes gruos que se dedican al estudio e
in&estigacin de la brucelosis. %stas t"cnicas se basan en la reroduccin Jin &itroK del
fenmeno de relicacin del A'7 bacteriano 1t"cnicas 9CG o ol#merase c$ain
reaction # sus deri&adas2. 9ara ello se selecciona el segmento de A'7 a amlificar cu#a
secuencia de nuc1etidos 1normalmente entre 2BB # ABB2 re(na las caractersticas de
esecificidad 1la secuencia slo se encuentra en el A'7 del g"nero o esecie
microbiana ob6eto de estudio2! -mbito 1la secuencia se encuentra en todos los indi&iduos
de ese g"nero o esecie2 # estabilidad 1la regin seleccionada $a de ser mu# estable #
sufrir ocas mutaciones2. ,e a)aden dos secuencias de ocos nucletidos 1denominadas
rimers o iniciadores o cebadores2 que son comlementarias a las secuencias de
nuc1etidos de los e8tremos de la regin de A'7 seleccionada ara su amlificacin.
9or (ltimo! se a)ade una A'7 - olimerasa 1taq olimerasa2 # los cuatro nucletidos! #
siguiendo unas condiciones cclicas mu# estrictas de tiemo # temeratura en un
termocic1ador! se consigue obtener millones de coias de A'7 id"nticos a los de la
regin acotada. ;na &ez obtenidas estas coias 1amlificadas2! se rocede a su
identificacin or diferentes m"todos! de los que el m-s utilizado es la $ibridacin con
sondas A'7 esecficas ara la regin acotada. %n muc$as circunstancias se utiliza
como lantilla ob6eto de la amlificacin una regin de Aro ribosmico! en cu#o caso es
necesario realizar re&iamente una con&ersin del AG7 a A'7 comlementario
1A'7c2 or accin de una transcritaza re&ersa
*.*L.O3GA:LA
1. Acosta A. Miguel. .mortancia de las ruebas bacteriolgicas # serolgicas en el
diagnstico de la brucelosis. ,eminario de eidemiologa de las zoonosis. .nstituto
7acional de ,alud. Ministerio de ,alud. 9er( - Lima. 1/4A.
2. Casas Olascoaga G. 'iagnstico serolgico de la brucelosis. *oletn C%9A7MO
&olumen N.V. 1/4>.
H. ,z#fres *oris. Fa8onomia del genero *rucella. 3aceta &eterinaria - tomo NNN...
1/41.
C. 3arca Carrillo C. OM"todos ara el diagnostico de la brucelosisO. 3aceta &eterinaria
- tomo NNN... 1/4B.
=. Godrguez A. # col. Manual de *rucelosis. 2BB1.