EXTRACCION DE ADN CASERO BIOLOGIA

MOLECULAR





















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INTRODUCCIN
Todos los seres vivos estn formados por clulas, en el interior de las mismas se
encuentra el material hereditario que son las instrucciones de las que depende
cualquier ser vivo. La totalidad del material hereditario de un individuo se
denomina genoma, que esta formada por una molcula denominada ADN. Los
cambios en el ADN dan lugar a variaciones en las instrucciones y, por lo tanto, en
ocasiones, a la prdida o adquisicin de propiedades en el individuo que ha
sufrido dichos cambios. Estos cambios se dan constantemente de forma
espontnea en la Naturaleza con la aparicin de mutaciones espontaneas o el
cruce sexual. Aunque tambin existen tcnicas artificiales que permiten llevar a
cabo modificaciones genticas realizadas por la mano del hombre.
Los cientficos, entre 1961 y 1966, relacionaron el lenguaje de 4 letras de los
nucletidos del ADN, A-T, C-G, con el de los 20 aminocidos con los que se
construyen las protenas, creando as el cdigo gentico.
La extraccin y purificacin de cidos nucleicos constituye la primera etapa de la
mayora de los estudios de biologa molecular y de todas las tcnicas de
recombinacin de ADN. En este caso, los mtodos de extraccin permiten obtener
cidos nucleicos purificados a partir de diversas fuentes para despus realizar
anlisis especficos de modificaciones genticas mediante la reaccin en cadena
de la polimerasa (PCR).
La tcnica utilizada en esta actividad experimental, se basa por un lado, en el
principio de que el componente fundamental de las membrana plasmtica y
nuclear, son los lpidos, por lo cual se utiliza un detergente (surfactante) para
romper estas estructuras y permitir la salida del ADN. Por otro lado, el ADN de
vegetales y animales se encuentra asociado a protena de tipo histona, por lo
tanto, al agregarle alcohol se precipitan las protenas y de esta forma se obtiene el
ADN como una estructura ms pura

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I. OBJETIVOS:
Realizar la extraccin de ADN en vegetales y reflexionar sobre la simpleza
de su composicin con sencillas tecnicas.
Observar la estructura fibrilar del ADN.
Establecer la relacin entre el proceso de extraccin y propiedades
quimico-fisicas del ADN.


II. FUNDAMENTO TEORICO:

1. EL ADN
El ADN es el cido DesoxirriboNucleico. Es el tipo de molcula ms compleja que
se conoce, ya que su secuencia de nucletidos contiene la informacin necesaria
para poder controlar el metabolismo un ser vivo. El ADN es el lugar donde reside
la informacin gentica de un ser vivo.
El DNA podra ser la molcula gentica fundamental que surgi de manera
inesperada producto de los estudios de bacterias causantes de neumonas. En
1928, el microbilogo ingls Frederick Griffith realiz el descubrimiento asombroso
de que las capas no virulentas de las bacterias se tornaban virulentas cuando se
las mezclaba con sus contrapartidas patgenas muertas por el calor.
La investigacin posterior confirm esta interpretacin gentica. La patogenicidad
refleja la accin de un gen capsular, que codifica una enzima fundamental para la
sntesis de la cpsula (con contenido carbohidratos) que rodea la mayor parte de
las bacterias causantes de neumona. Varios aos despus de la observacin
original de Griffith se comprob que extractos de las bacterias muertas eran
capaces de inducir transformaciones hereditarias y se dio as la bsqueda de la
identidad qumica del agente transformador. En esa poca se crea que los genes
eran protenas.
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Estructura Primaria.- El ADN est compuesto por una secuencia de
nucletidos formados por desoxirribosa. Las bases nitrogenadas que se
hallan formando los nucletidos de ADN son Adenina, Guanina, Citosina y
Timina. No aparece Uracilo. Los nucletidos se unen entre s mediante el
grupo fosfato del segundo nucletido, que sirve de puente de unin entre el
carbono 5' del primer nucletido y el carbono 3' de siguiente nucletido.
Como el primer nucletido tiene libre el carbono 5' y el siguiente nucletido
tiene libre el carbono 3', se dice que la secuencia de nucletidos se ordena
desde 5' a 3' (5' 3').

Estructura Secundaria.- La estructura secundaria del ADN fue propuesta
por James Watson y Francis Crick, y la llamaron el modelo de doble hlice
de ADN. Este modelo est formado por dos hebras de nucletidos. Estas
dos hebras se sitan de forma antiparalela, es decir, una orientada en
sentido 5' 3' y la otra de 3' 5'. Las dos estn paralelas, formando
puentes de Hidrgeno entre las bases nitrogenadas enfrentadas.
Cuando en una hebra encontramos Adenina, en la otra hebra hallamos
Timina. Cuando en una hebra encontramos Guanina, en la otra hallamos
Citosina. Estas bases enfrentadas son las que constituyen los puentes de
Hidrgeno. Adenina forma dos puentes de Hidrgeno con Timina. Guanina
forma tres puentes de Hidrgeno con la Citosina.
Las dos hebras estn enrolladas en torno a un eje imaginario, que gira en
contra del sentido de las agujas de un reloj. Las vueltas de estas hlices se
estabilizan mediante puentes de Hidrgeno. Esta estructura permite que las
hebras que se formen por duplicacin de ADN sean copia complementaria
de cada una de las hebras existentes.

Estructura Terciaria.- El ADN es una molcula muy larga en algunas
especies y, sin embargo, en las clulas eucariotas se encuentra alojado
dentro del minsculo ncleo. Cuando el ADN se une a protenas bsicas, la
estructura se compacta mucho. Las protenas bsicas son Histonas o
Protaminas. La unin con Histonas genera la estructura denominada
nucleosoma. Cada nucleosoma est compuesto por una estructura
voluminosa, denominada core, seguida por un eslabn o "Linker". El core
est compuesto por un octmero de protenas, Histonas, denominadas
H2A, H2B, H3 y H4. Cada tipo de histona se presenta en nmero par. Esta
estructura est rodeada por un tramo de ADN que da una vuelta y 3/4 en
torno al octmero. El Linker est formado por un tramo de ADN que une un
nucleosoma con otro y una histona H1.
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El conjunto de la estructura se denomina fibra de cromatina de 100. Tiene
un aspecto repetitivo en forma de collar de perlas, donde las perlas seran
los nucleosomas, unidos por los linker.
El ADN debe encontrarse ms compacto en el ncleo de los
espermatozoides. En este caso, el ADN se une a protenas de carcter ms
bsico, denominadas Protaminas. El ADN se enrolla sobre estas protenas,
formando una estructura muy compacta, denominada estructura cristalina
del ADN. Nucleosomas vistos al microscopio electrnico, formando un
"collar de perlas".

Estructura Cuaternaria.- La cromatina en el ncleo tiene un grosor de
300. La fibra de cromatina de 100 se empaqueta formando una fibra de
cromatina de 300. El enrollamiento que sufre el conjunto de nucleosomas
recibe el nombre de solenoide.
Los solenoides se enrollan formando la cromatina del ncleo interfsico de
la clula eucariota. Cuando la clula entra en divisin, el ADN se compacta
ms, formando los cromosomas.

2. DNA DE VEGETALES
Las clulas de las plantas tienen tres juegos diferentes de ADN: por un lado la
clula tiene su propio genoma en su ncleo, por otro las mitocondrias tienen su
propio genoma y por otro los cloroplastos tienen su propio genoma.
Las mitocondrias y los cloroplastos se reproducen dentro de la clula, y cuando la
clula que los alberga se divide, algunos se van para una de las hijas y otros para
la otra, de forma que nunca quede una clula sin mitocondrias ni cloroplastos.
El ncleo de las clulas de las plantas contiene genoma de tipo eucariota: al igual
que en los animales, el ADN est ordenado en cromosomas, cada cromosoma es
una sola molcula de ADN lineal, empaquetada. En cambio, las mitocondrias y los
cloroplastos tienen genoma de tipo bacteriano: poseen una molcula de
ADN circular por plstido, al igual que sus ancestros que eran bacterias.
El tamao del ADN es mucho mayor en el ncleo que en los orgnulos: en el
ncleo es tan grande que se mide en "mega bases", en las mitocondrias en
cambio, es de unas 200 a 2.500 kilo bases, en los cloroplastos es de unas 130 a
160 kbases (una kbases es igual a mil bases, o mil "peldaos de la escalera").
La forma de heredar el ADN tambin difiere en el ncleo y los orgnulos: mientras
que el ADN ncleo se hereda de forma biparental (como el ADN del ncleo de los
animales), el ADN de las mitocondrias y el de los cloroplastos se hereda por parte
de uno solo de los padres, en general por parte de la madre (al igual que las
mitocondrias de los animales). Esto es debido a que en general los orgnulos que
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sern transmitidas a la generacin siguiente son las que estn albergadas en el
vulo.
III. METODOS:
EXTRACCION DE DNA CASERO
La extraccin de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de que los
iones salinos son atrados hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su
disolucin y posterior extraccin de la clula. Se empieza por lisar (romper la
membrana plasmtica) las clulas mediante un detergente, vacindose su
contenido molecular en una disolucin tampn en la que se disuelve el ADN. En
ese momento, el tampn contiene ADN y todo un surtido de restos moleculares:
ARN, carbohidratos, protenas y otras sustancias en menor proporcin. Las
protenas asociadas al ADN, de gran longitud, se habrn fraccionado en cadena
ms pequea y separado de l por accin del detergente. Slo queda, por tanto,
extraer el ADN de esa mezcla de tampn y detergente, para lo cual se utiliza
alcohol etlico.
PASOS EN LA EXTRACCIN DE ADN:

Los pasos necesarios para una correcta extraccin y purificacin del ADN
mediante un procedimiento qumico son:

1. Maceramiento de la muestra.
2. Lisis celular: Las sales caotrpicas ayudan a romper la estructura
tridimensional de macromolculas como las protenas o los cidos
nucleicos consiguiendo su desnaturalizacin. La adicin de un detergente
como el SDS es necesaria a menudo para eliminar las membranas.

3. Precipitacin de protenas: Se lograra la precipitacin atraves de alcohol
(etanol 100%), fenol, cloroformo, alcohol isoanilico.

4. Precipitacin de Acidos Nucleicos: Fase de visualizacin (Acetato de
amonio 10M).

5. Resuspensin: El sedimento se puede resuspender en agua o tampn Tris
tras ser secado completamente (TE 20:5 , agua bidestilada)

En una extraccin de ADN casera se empieza por romper las clulas mediante un
detergente, vacindose su contenido molecular en una disolucin tampn en la
que se disuelve el ADN. En ese momento, el tampn contiene ADN y todo un
surtido de restos moleculares. Las protenas asociadas al ADN, de gran longitud,
se habrn fraccionado en cadenas ms pequeas y separadas de l por accin
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del detergente. Slo queda, por tanto, extraer el ADN de esa mezcla de tampn y
detergente, para lo cual se utiliza alcohol isoamlico
IV. MATERIALES:

Licuadora o mortero estril
Cucharita plstica 5 ml
Cuchara sopera plstica (10 ml)
Tubo de ensayo
Pipeta Pasteur plstica
Varilla de vidrio pequea
Mechero
2 Vasos de precipitacin o vasos plsticos de 200 ml
Filtro cnico de caf n 2 o varias capas de gasa para hacer filtro

Champ o lavalozas
Sal de mesa
Agua destilada
Etanol 95 helado
Frutas: pltano; verduras: cebolla


V. PROCEDIMIENTO:
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1. Preparar una mezcla homogenea
de platano pelado (10 gr) con agua
destilada (50 ml)
2. Mezclar 2 ml de solucin de
lavavajilla lquida al 20% con 50 ml
de NaCl2 2M. Sin producir espuma.
3. Mezclar las soluciones 1 y 2 por
10 minutos sin producir espuma.
4. Centrifugar a 2000 rpm
por 5-10 minutos.
5. Pasa el sobrenadante a un
beaker de 200 ml.
6. Aadir 50ml de alcohol
helado por las paredes del vaso.
7. Se forman dos capas, en la
interfase precipita el ADN.
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1. Preparar una mezcla homogenea
de cebolla con agua destilada (50
ml)
2. Mezclar 2 ml de solucin de
lavavajilla lquida al 20% con 50 ml
de NaCl2 2M. Sin producir espuma.
3. Mezclar las soluciones 1 y 2 por
10 minutos sin producir espuma.
4. Centrifugar a 2000 rpm
por 5-10 minutos.
5. Pasa el sobrenadante a un
beaker de 200 ml.
6. Aadir 50ml de alcohol
helado por las paredes del vaso.
7. Se forman dos capas, en la
interfase precipita el ADN.
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VI. RESULTADOS:
El resultado obtenido en la experimentacin es positivo ya que se logr cumplir
con el objetivo de extraccin y visualizacin de ADN en vegetales con una
apariencia de sustancia mucosa blanca y filamentosa. A pesar de haber realizado
una centrifugacin el producto obtenido de la extraccin no es ADN puro, ya que,
entremezclado con l, hay fragmentos de ARN. Una extraccin profesional se
realiza aadiendo enzimas que fragmentan las molculas de ARN y que impiden
que se unan al ADN.





VII. CONCLUSIONES
Tras haber realizado la experiencia de obtener un ADN casero la cual fue
realizada con total xito ya que hemos podido visualizar, llegamos a la conclusin:
Que el ADN es la molcula de la vida ya que todos los organismos la contienen
por lo que se encarga de hacernos diferentes. Distintos organismos presentan
diferente nmero de cromosomas, es decir, diferente informacin gentica; lo que
se traduce en diferentes caractersticas morfolgicas.

Realizando este proyecto se pudo conocer mejor las caractersticas de ADN y su
importante funcin, as tambin, se pudo observar de manera macroscpica el
ADN de dos organismos los cuales pertenecen al reino vegetal.

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VIII. DISCUSIN:
La extraccin de ADN es quizs el ms desconocido y sobre el que ms control
podemos ejercer. Hay diversas formas de extraccin de ADN, con recetas
particulares y protocolos caseros de laboratorios. Adems, en el mercado, se
encuentran diversos kits de extraccin de ADN, normalmente ms rpido y menos
agresivos que los protocolos tradicionales, y que suelen ofrecer un ptimo
rendimiento. El mtodo casero es ms laborioso y lento, aunque ms econmico.
Sin embargo, ambos ofrecen un rendimiento de trabajo parecido. Por lo tanto,
dependiendo de la naturaleza de la especie, se selecciona el protocolo de
aislamiento de ADN total ms adecuado.
Los pasos necesarios para una correcta extraccin y purificacin del ADN
mediante un procedimiento qumico son:
Lisis de las clulas o virus. Las sales caotrpicas ayudan a romper la estructura
tridimensional de macromolculas como las protenas o los cidos nucleicos
consiguiendo su desnaturalizacin. La adicin de un detergente como el SDS es
necesaria a menudo para eliminar las membranas.
Degradacin de la fraccin proteica asociada al ADN. Se consigue mediante la
adicin de una proteasa. La fraccin proteica puede precipitarse mejor con la
ayuda de sales como el acetato de amonio o el acetato sdico.
Precipitacin del ADN. El ADN es insoluble en alcohol, por lo que se puede
precipitar etanol fro o isopropanol y recuperar mediante una centrifugacin. El
alcohol del sobrenadante se llevar las sales aadidas previamente.
Hay sustancias interfieren con lasADN polimerasas termoestables ya sea
medianteel bloqueo directo total o parcial de su actividad cataltica o mediante la
unin directa alADN de doble cadena. Por ejemplo, algunas sustancias
interaccionan con los iones Mg2+(un cofactor crtico de la actividad cataltica) o
disminuyen sudisponibilidad pudiendo inhibir la PCR.
Otra importante fuente de inhibicin son los propios reactivosque se usan en el
proceso de extraccin de ADN, como porejemplo, el exceso de KCl, NaCl y otras
sales, detergentes inicos,etanol e isopropanol, fenol y otros.
El que exista pared celular implica, un poco demayor resistencia para poder
romper la clula y extraer el ADN. Pero, consultando la bibliografa, como se utiliza
detergente, sta sustancia tiene la facilidad de romper tanto lapared como la
membrana plasmtica en un solo paso.

IX. BIBLIOGRAFIA:
B. Alberts, D. Bray, K. Hopkin, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts y
P. Walter. (2006) Introduccin a la Biologa Celular. 2 Edicin. Editorial
Mdica Panamericana.
Lodish, H, "Biologa Celular y Molecular" (5 ed.), Editorial Mdica
Panamericana, Buenos Aires. 2004
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Pierce BA. Gentica: Un enfoque conceptual. 2 Edicin. 2005. Ed. Mdica
Panamericana.
Watson J., T. Baker, S. Bell, A. Gann, M. Levine y R. Losick. (2006) Biologa
Molecular del Gen. 5 Edicin. Editorial Mdica Panamericana.






CUESTIONARIO:
Compara las preparaciones obtenidas a partir de diferentes frutas o
verduras. Tienen toda la misma cantidad de ADN?
Las especies vegetales contienen ADN en cloroplastos y mitocondrias, el tamao
del ADN mitocondrial vara entre 250 y 2.500 Kpb; El ADN de cloroplastos
(ADNcp) de las clulas de plantas es una molcula doble hlice circular que
posee un tamao que vara entre 120 y 160 Kpb. El nmero de cloroplastos vara
de unas clulas a otras dentro de la misma especie y de unas especies a otras.
Las clulas de hojas de la remolacha contienen en su citoplasma alrededor de 40
cloroplastos, cada cloroplasto posee entre 14 y 18nucleoides y cada nucleoide
puede estar constituido por 4 a 8 molculas de DNcp. Por tanto, una clula de
remolacha puede llegar a contener 40 x 18 x 8 = 5760 molculas de ADNcp doble
hlice circular. En maz se estime que existen entre 20 y 40 mleculas de ADNcp
doble hlice circular por cada cloroplasto.
La cantidad de cromosomas en una cebolla consta de 16 cromosomas divididos
en 8 pares, mientras que el pltano tiene 11 cromosomas con un total de 500 a
600 millones de pares de bases, tratndose de uno de los genomas ms
pequeos de todas las plantas.
Qu habra pasado si antes de de agregar a la solucin de ADN; al alcohol
la hubieras agitado fuertemente? Por qu?
Se habra agregado energa cintica (la energa cintica de un cuerpo es
aquella energa que posee debido a su movimiento) al soluto, produciendo as que
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el solvente se mezcle con este soluto y produjera una solucin homognea (la
visualizacin de la cadena de ADN habra sido difusa y muy complicada porque
solo se observara una solo fase) .Al suceder esto no se hubiera podido distinguir
bien la separacin del ADN.
Cuales son las diferencias entre los detergentes catinicos y anionicos
DETERGENTES ANINICOS DETERGENTES CATINICOS
Los tensioactivos aninicos son
compuestos que al disociarse en
disoluciones acuosas, un in cargado
negativamente aporta las propiedades
de actividad superficial a un in
cargado positivamente.

Se describirn a continuacin los ms
usuales:

JABONES:
Sus propiedades tensioactivas
disminuyen marcadamente cuando la
cadena de hidrocarburos tiene menos
de 10 tomos de carbono y en su
lugar tiende a mostrar propiedades
hidrotrpicas. Los hidrtopos son
sustancias que tienden a aumentar la
solubilidad de sustancias orgnicas,
incluyendo los tensioactivos, en agua.
Los jabones ms normalmente
utilizados son los sdicos, los
potsicos y los amnicos.

SULFATO DE SODIO LAURIL.
Es una mezcla de sulfato de sodio
alquil teniendo como principal
constituyente al lauril de sulfato de
sodio. Es bastante soluble en agua y
sus propiedades humectantes estn
unidas a su proceso de ionizacin.

TER DE LAURIL
DIETILENGLICOL EN
SULFATO DE SODIO.
Este detergente diluido en agua recibe
Los tensioactivos catinicos actan
de igual forma, slo que en este caso,
es el in cargado positivamente el
que aporta las propiedades de
actividad superficial.
Veamos a continuacin los ms
representativos:

SALES DE AMINA
Son sales resultantes de la mezcla de
aminas grasas con cidos. Se suelen
preparar in situ y su principal
aplicacin recae en las formulaciones
de inhibidores de corrosin.

COMPUESTOS DE AMONIO
CUATERNARIO
Este es un grupo genrico en el que
una amina terciaria reacciona con un
agente cuaternario. Dependiendo de
la amina terciara y del agente
cuaternario se obtendrn los
siguientes tipos de sustancias:

DERIVADOS DE
MONOALQUIL DIMETIL
AMINA
El uso de estos preparados es muy
variado y podemos encontrarlos en
bactericidas, agentes antiestticos,
emulsificantes en el cuidado del
cabello, y en formulaciones de
lavandera e industriales.
Los amonios cuaternarios obtenidos
con cloruro de bencilo o haluros de
bencilo poseen unas propiedades
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el nombre de Tergentol y ha sido
ampliamente usado en endodoncia.

ALCOHOL SULFATOS
Son excelentes agentes espumantes,
tienen excelente capacidad
detergente y son buenos agentes
dispersantes. Los cationes ms
comunes son el sodio, amonio,
trietanolamina y magnesio.

ALFA-SULFO METIL
ESTERES
Debido a su buen poder tensioactivo,
su capacidad de dispersar los jabones
de cal y sus propiedades detergentes
puede ser utilizado como sustituto del
LABS. Son ampliamente utilizados en
Japn en polvos de lavandera y
presentan buenos perfiles de
biodegradabilidad.
biocidas importantes y son utilizados
como bactericidas contra las
bacterias Gram positivas.

DERIVADOS DE DIALQUIL
MONOMETILAMINAS
El producto ms importante de esta
clase es el ditallow dimethil
ammonium chloride (DTDMAC)
utilizado principalmente en la
elaboracin de suavizantes
domsticos.

DERIVADOS DE LA
IMIDAZOLINA
Generalmente tambin se emplean
en la elaboracin de suavizantes
textiles.
CLORURO DE
BENZALCONIO:
Tensoactivo muy conocido con
diversos nombres comerciales
(Zephiran, Germitol, Benzal, etc.) Una
solucin al 0.1% tiene un alto poder
bacteriosttico, bajo poder
inflamatorio, con largo tiempo de vida
til y relativamente inocuo.