DNA

El DNA es una macromolcula de cido

nucleico polimrico constituida por cinco
carbonos, la desoxirribosa; una base que
contiene nitrgeno y un grupo fosfato. Las
bases son de dos tipos purinas y
pirimidinas, en el DNA hay dos bases de
purina, adenina (A) y guanina (G), y dos
bases de pirimidina, timina(T) y citosina(C).
Los nucletidos estn constituido por una
base, un grupo fosfato y un azcar, y se
polimerizan en cadenas largas de
polinucleotidos debido a los en laces 5-
3fosfodister que se forman entre las
unidades adyacentes de desoxirribosa. En
el genoma humano, estas cadenas de
polinucletidos (que forman una doble
hlice) estn constituido por millones de
nucletidos y su tamao oscila entre
aproximadamente 50 (el cromosoma ms
pequeo, el 21) y 250 millones de pares de
bases (el cromosoma ms grande, el 1). La estructura anatmica del DNA transporta la
informacin qumica que permite la transmisin exacta de la informacin
Gentica. Desde una clula hasta sus clulas hijas, y de una generacin a la siguiente. al
mismo tiempo, la estructura primaria del DNA especifica la secuencia de aminocidos de
las cadenas de polipptidos de las protenas. La configuracin original del DNA, descrita
por James Watson y Francis Crick, es la de doble hlice. Esta estructura helicoidal tiene
un cierto parecido con una escalera en
espiral de direccin en el sentido en el
sentido de las ajugas del reloj, en las que
las dos cadenas de polinucletidos siguen
direcciones opuestas y se mantiene unidas
por los enlaces de hidrogeno existentes
entre los pares de bases: la A de una de las
cadenas se una a la T de la otra, y la G se
une a la C.
La naturaleza especfica de la informacin
gentica codificada en el genoma humano
se corresponde a la secuencia de CGAT
existentes en las dos cadenas de la doble
hlice que se disponen en cada uno de los cromosomas, tanto en el ncleo celular como
en las mitocondrias.

Fig. 1 Las cuatro bases del DNA y la estructura general de
un nuclesido. Cada una de las cuatro bases establece
enlaces con la desoxirribosa a travs del nitrgeno y con un
grupo fosfato, formando los nucletidos correspondientes.
Figura 2 Modelo de doble hlice, propuesto por Watson y
Crick


Extraccin de DNA
La extraccin y purificacin de cidos nucleicos constituye la primera etapa de la mayora
de los estudios de biologa molecular y de todas las tcnicas de recombinacin de ADN.
En este caso, los mtodos de extraccin permiten obtener cidos nucleicos purificados a
partir de diversas fuentes para despus realizar anlisis especficos de modificaciones
genticas mediante la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). La calidad y la pureza
de los cidos nucleicos son dos de los elementos ms importantes en ese tipo de anlisis.
Si se desea obtener cidos nucleicos muy purificados, que no contengan contaminantes
inhibidores, es preciso aplicar mtodos de extraccin adecuados.

Etapas en la extraccin de ADN
Los pasos necesarios para una correcta extraccin y purificacin del ADN mediante un
procedimiento qumico son:

1. Lisis de las clulas o virus. Las sales caotrpicas ayudan a romper la estructura
tridimensional de macromolculas como las protenas o los cidos nucleicos consiguiendo
su desnaturalizacin. La adicin de un detergente como el SDS es necesaria a menudo
para eliminar las membranas.

2. Degradacin de la fraccin proteica asociada al ADN. Se consigue mediante la adicin
de una proteasa. La fraccin proteica puede precipitarse mejor con la ayuda de sales
como el acetato de amonio o el acetato sdico.

3. Purificacin. Consta de 3 fases:

Precipitacin del ADN. El ADN es insoluble en alcohol, por lo que se puede precipitar
etanol fro o isopropanol y recuperar mediante una centrifugacin. El alcohol del
sobrenadante se llevar las sales aadidas previamente.

Lavado del pellet. Se realiza con alcohol fro volviendo a centrifugarse

Recuperacin. El sedimento se puede resuspender en agua o tampn Tris tras ser
secado completamente.

La confirmacin de la presencia de ADN se lleva a cabo mediante electroforesis en un gel
de agarosa y posterior tincin con bromuro de etidio y observacin con luz UV o
directamente al espectrofotmetro mediante espectro de absorcin de 200 a 350 nm. El
ADN purificado puede cuantificar con un espectrofluormetro mediante el uso de
fluorforos especficos.

PROPIEDADES QUE REQUIERE UN MATERIAL GENETICO.

Control de enzimas. Crecimiento, desarrollo y funcionamiento de la clula.
Replicacin. autocopiarse
Localizacin. En los cromosomas

PCR

INVENCION.
La historia del desarrollo de la PCR es ciertamente curiosa. La tcnica tuvo tanto impacto
en el mundo cientfico, que en 1993 le fue concedido el Premio Nobel de Qumica a su
inventor oficial, Kary B. Mullis, quien describi el proceso en 1985 y 1988. Sin embargo,
catorce aos antes (1971 y 1974), el Dr. Molineux, del grupo de Khorana, describi la
misma tcnica con exquisito detalle, aunque, lamentablemente, consideraron que dicha
metodologa no era funcional. Desde su redescubrimiento oficial en 1985, la PCR se ha
consolidado como la tcnica clave de la biologa molecular actual, como lo demuestra el
nmero creciente de trabajos cientficos que la utilizan.

La amplificacin in vitro del DNA se logra en tres pasos bsicos:

a).-Desnaturalizacin del DNA a copiar (molde o diana). Ello se consigue
incrementando la temperatura para separar las dos cadenas que componen la doble
hlice del DNA.

b).-Hibridacin o apareamiento de los cebadores u oligos al DNA molde. Para ello se
baja la temperatura de reaccin, de forma que pequeas secuencias de DNA de cadena
sencilla (tpicamente, entre 10 y 30 bases o meros) se unan a sus secuencias
complementarias del DNA diana. Cada uno de ellos se une a una de las cadenas del DNA
diana, de forma que sus extremos 3OH apuntan el uno hacia el otro, delimitando la
secuencia a amplificar.

c).-Copia de las cadenas delimitadas por los cebadores. Se consigue elevando la
temperatura de la reaccin a la ptima de la polimerasa de DNA utilizada. Cada uno de
los extremos 3OH de los oligos apareados a las cadenas directa y reversa sern
extendidos, generndose las cadenas hijas correspondientes. El resultado son dos hlices
completas Watson & Crick en la regin delimitada por los oligos. Dicho de otra forma, se
duplica el nmero inicial de molculas de DNA.

Estos tres pasos de desnaturalizacin, hibridacin y polimerizacin se repiten n
veces, duplicndose en cada ciclo el nmero de cadenas delimitadas por los oligos. Se
trata, pues, de una amplificacin exponencial o logartmica, en que las cadenas
previamente sinterizadas pueden servir de molde a futuras amplificaciones. Por tanto, y
mientras los reactivos no se agoten, el nmero de molculas amplificadas responde a la
siguiente frmula:
Nmero de molculas finales por cada molcula inicial = 2n
siendo n el nmero de ciclos. Ello significa que 20 ciclos generaran 106 molculas; 30
ciclos produciran 109 molculas. Una PCR tpica amplifica de 106 a 106 veces.

Extraccin de ADN genmico a partir de muestras embebidas en parafina.

Para la realizacin de esta tcnica, nos basamos en los procedimientos descritos
por Wright DK-Manos MM (1990)4 y por el Instituto de Patologa de las Fuerzas
Armadas de los E.U. (1997)*, realizando ligeras modificaciones. Durante todo el
procedimiento se usaron guantes y se tuv la precaucin de limpiar la cuchilla del
microtomo con xileno y etanol al 100% entre cada muestra, para evitar cualquier
contaminacin. Para iniciar la extraccin de ADN, se colocaron en un tubo de
microcentrfuga estril de 1.5 ml, dos cortes de 6 um de grosor o bien cortes de 5-
10 um. Se agreg 1 ml de xileno a cada tubo, se cerraron los tubos y se mezclaron
a temperatura ambiente durante 30 min o a 55C por 15 min, se centrifugaron a
14,000 rpm durante 2 a 5 min, se removi cuidadosamente el xileno con una
pipeta y se repiti el paso anterior. Despus se agregaron 500 ul de etanol
absoluto a cada tubo y se mezclaron por inversin. Se centrifugaron a 14,000 rpm
durante 2 a 5 min, se retir cuidadosamente el etanol con una pipeta y se repiti
nuevamente el paso anterior. La pastilla obtenida se sec al vacio hasta que el
etanol se evapor completamente. Alternativamente, se agreg 1 gota (50 ul) de
acetona a cada tubo. Se dejaron abiertos los tubos y se colocaron en un bloque
caliente (thermomixer) a una temperatura de 50C para facilitar la evaporacin de
la acetona. Despus de la centrifugacin, la pastilla se resuspendi en 100 - 200 ul
de buffer de lisis (NaCI 50 mM, Tris-HC110 mM pH 8.3, EDTA1 mM, Tween 20 al
0.5 %, Nonident P-40 al 0.5%) y 3-6 ul de proteinasa K (10 mg/ml)). La
concentracin final de proteinasa K fue 0.3-0.5 mg/ml. Se incubaron en
thermomixer con agitacin vigorosa a 55 C durante dos das completos para
disminuir actividad de DNAsas, adicionando la misma cantidad de proteinasa K
a los tubos cada da que se mantuvieron en incubacin. Despus de la incubacin
con el buffer de lisis, se centrifugaron los tubos brevemente para remover
cualquier lquido de las paredes y se sigui con la inactivacin de la proteinasa K a
95 C durante 8 a 10 min y despus se centrifugaron a 14,000 rpm durante 2 a 5
min. Se recuper el sobrenadante y se almacen la pastilla que contena los
restos celulares a -20 C. Previo a su almacenamiento de procedi a determinar la
calidad del ADN mediante un gel de agarosa al 0.8% y se extrajeron alcuotas de
2.5 y 5 ul para la PCR.


Extraccin

La extraccin de ADN se bas en la metodologa estandarizada para la extraccin
de ADN de DELLAPORTA modificado:

1. Preparar un bao a 65C y colocar el buffer de extraccin
2. Marcar los tubos ependorf de 1.5 ml (dos juegos iguales)
3. Macerar de 20 a 30 mg de tejido en Nitrgeno Lquido
4. Transferir el tejido a un tubo de 1.5 ml usando una esptula limpia y baada en
etanol
5. Adicionar 800 ul de buffer de extraccin y 55 ul de SDS al 20%
6. Mezclar bien el tejido con el buffer usando vortex o una punta limpia
7. Incubar a 65C por 20 minutos, invirtiendo los tubos peridicamente
8. Adicionar 250 ul de acetato de potasio 5 M fro y mezclar
9. Incubar en hielo 20 min. en agitacin
10. Centrifugar a 12000 rpm por 10 minutos
11. Transferir 800 ul del sobrenadante a un tubo nuevo marcado
12. Adicionar 640 ul de isopropanol fro y mezclar 8- 10 veces
13. Incubar a .20 C por 2 horas
14. Centrifugar a 12000 rpm por 10 minutos
15. Remover el isopropanol y secar las gotas con toalla
16. Adicionar 500 ul de T10E1 e incubar a 65C por 15 minutos, mezclar
17. Adicionar 400 ul de isopropanol y mezclar 8-10 veces
18. Incubar a .20C por 2 horas
19. Centrifugar a 12000 rpm por 10 minutos
20. Remover el isopropanol
21. Dejar secar 1 hora sobre una toalla. Secar las gotas con toalla
22. Resuspender en 80 ul de T10E1 (Tris 10 mM, EDTA 1 mM)
23. Adicionar 1 ul de RNAsa (10 mg/ml), hacer un corto spin 12000 rpm 1 minuto
24. Guardar a 4 C

Extraccin de ADN genmico: Una porcin del tejido fresco congelado fue
transferida a 600 l de buffer de lisis (10 mM Tris pH 7,8; 5 mM EDTA pH 8,0;
0,5% SDS) y tratado con proteinasa K (500 ug/ml). En el caso del tejido fijado y
embebido en parafina, lminas de 10 m fueron cortadas desde cada bloque,
colocadas en portaobjetos y desparafinadas con 3 cambios de xilol y 3 de alcohol
100%, por 1 minuto cada vez. Este tejido fue microdisecado con una hoja de
bistur y transferido a tubos preparados con buffer de lisis y proteinasa K. Todas
las muestras se incubaron a 65C hasta la completa disolucin del tejido y luego a
95C por 10 minutos para inactivar la enzima. Para la precipitacin de protenas
se emple acetato de amonio 7,5 M pH 7,5. El ADN se precipit con isopropanol,
incubando a 20C toda la noche, se recuper por centrifugacin y se resuspendi
en buffer TE pH 7,4. El ADN obtenido fue cuantificado, separado por electroforesis
en gel de agarosa 1% y visualizado por tincin con bromuro de etidio.


Extraccion De DNA
La cantidad mxima de tejido para lograr aislar DNA vara, dependiendo del tipo de dicho
tejido. En caso de los tejidos animales, la cantidad mxima es de 25 mg. Si se usa bazo, se
reduce a 10 mg porque este tejido es extremadamente denso. Si se usan cultivos
microbiolgicos, deben usarse durante la fase temprana de crecimiento logartmico a una
concentracin no mayor de 2 x 10
9
unidades formadoras de colonias

(cfu) en caso de
bacterias y de 5 x 10
7
cfu en caso de levaduras.




PROCEDIMIENTO:

1. A. Corte y pese 25 mg de tejido (hgado, timo) en pedazos pequeos, depositar en un
tubo de centrifuga de 1.5 ml, y aadir 180 l Buffer ATL.
O, en su lugar:
B. Raspe el epitelio bucal con un palillo de dientes y deposite las clulas sobre papel
para pesar y verifique el peso de la muestra. Eche en microtubo y aada 180 l de
Buffer ATL.
Asegurarse que la cantidad correcta de material se utilize. Para tejidos como el
bazo, con un nmero alto de clulas para una masa determinada de tejido, no utilizar
ms de 10 mg del material.
2. Aadir 20 l de proteinasa K, mezclar por vortex, e incunbar a 55 C hasta que el
tejidoeste completamente lisado. Mezclar por vortex ocasionalmente durante el
periodo de incubacin para dispersar la muestra.
El tiempo de lisis varia dependiendo del tejido que se utilize. Lisis usualmente se
completa de 1 a 3 hrs. Si es ms conveniente, las muestras pueden dejarse lisando
hasta el otro da.
Luego de la incubacin, el lisado puede parecer viscoso pero no debe estar
gelationoso ya que puede tapar la columna "DNeasy spin". Si esto sucede hay que
lisar de nuevo, usando esta vez menos material
3. Opcional: Tratamiento de la muestra con Rnasa. Aadir 4l de RNasa A (100
mg/mL), mezclar por vortex e incubar por 2 minutos a temperatura ambiente.
Tejidos que estan activos transcripcionalmete tal como el hgado y los riones
continen niveles altos de RNA, que copurifican con el DNA genmico. Este
paso es necesario si se requiere DNA libre de RNA . Este paso se puede omitir si el
RNA residual no es de importancia.
4. Vortex por 15 s. Aadir 200 l de Buffer AL a la muestra, mezclar completamente por
vortex e incubar a 70 por 10 min.
Es esencial que la muestra y el Buffer AL sean mezclados inmediatamente y
completamente por vortex o pipeteando para obtener una solucin homognea.
Un precipitado blanco se puede formar cuando se le aada el buffer AL. En la
mayora de los casos este se disuelve durante la incubacin a 70 C. El precipitado
no interfiere con el procedimiento de Dneasy. Algunos tejidos ( baso, pulmones)
podran formar un lisado gelationoso luego de aadir el Buffer AL. En estos casos,
batir vigorosamente o hacer vortex antes de aadir el etanol en el prximo paso.
5. Aadir 200 l de etanol absoluto (96 - 100%) a la muestra, mezclar completamente
con el vortex.
Es muy importante que el Buffer AL, y el etanol sean mezclados hasta obtener una
mezcla homognea.
Un precipitado blanco se puede formar cuando se aada el etanol. Este contiene el
DNA de la muestra. Es esencial que se aada todo el precipitado a la columna
DNeasy spin.
6. Pipetear la mezcla del paso 5 dentro de la columna DNeasy spin que se encuentra en un
tubo de recoleccin de 2 mL. Centrifugar a 6000 x g (8000 rpm) por 1 min. Descartar
lo que pas por la columna y el tubo de recoleccin.
7. Colocar la columna de DNeasy spin en otro tubo de recoleccin de 2 mL, aadir
500l Buffer AW1, y centrifugar por 1 min a 6000 x g (8000 rpm) Descartar lo que
pas por la columna y el tubo de recoleccin.
8. Colocar la columna de DNeasy spin en otro tubo de recoleccin de 2 mL, aadir
500 l de Buffer AW2, y centrifugar por 3 minutos a velocidad mxima para secar la
membrana del Dneasy. Descartar lo que pas por la columna y el tubo de recoleccin.
Esta centrifagacin asegura que no quede nada de etanol residual.
Luego del paso de centrifugacin, remover la columna de Dneasy spin,
cuidadosamente para que esta no tenga contacto con el tubo de recoleccin, ya que
esto causara que se contaminara con etanol. ( Si se contamina, vaciar el tubo de
recoleccin y reusarlo en otro paso de centrifugacin por 1 min a velocidad
mxima.
9. Colocar la columna de DNeasy spin en un tubo de microcentrfuga limpio de 1.5 - 2
mL y pipetear 200 l de Buffer AE directamente a la membrana de Dneasy. Incubar a
temperatura ambiente por 1 min, y luego centrifugar por 1 min a 6000 x g (8000 rmp)
para eluir.
Eluir con 100 l (en vez de 200 l) aumenta la concentracin final de DNA en el
eludo, pero tambin disminuye la cantidad de DNA que se obtiene.
10. Repetir la elucin como descrita en el paso 9.
Un nuevo tubo de microcentrfuga puede ser utilizado para el segundo paso de
elucin para prevenir la dilucin del primer eluido. En la segunda elucin, el tubo
de microcentrfuga del paso 9 puede ser utilizado para combinar los eluidos.

Nota: No deben ser eluidos ms de 200 l a la vez a un tubo de microcentrifuga de 1.5 mL
ya que la minicolumna de DNeasy puede tener contacto con el eluido.

11. Determinar el rendimiento de DNA obtenido.
a. Diluir 20 l de muestra de DNA en 980 l de agua desionizada y esteril
(dilucin 1/50)
b. Medir absorbancia a 260 nm usando cuvetas de 1 ml, que puedan usarse a luz
ultravioleta.
c. La concentracin de DNA a A
260
= 1.0 en una cuveta de 1 cm equivale a 50 g
de DNA por ml de agua. Para calcular la concentracin de la muestra:
[DNA] = 50 g / ml x A
260
x factor de dilucin (50)

[DNA total] = [DNA] x volumen eludo en ml

12. Guardar el DNA obtenido para usar en el siguiente laboratorio.