ADN recombinante y mutagnesis in vitro

Mutagnesis sitio dirigida

Sustitucin de bases
inserciones
deleciones
Con plsmidos y/o PCR
Ingenier Ingenier a gen a gen tica en sistemas tica en sistemas
animales animales
Cultivo primario de clulas
animales
Cultivo de fibroblastos 3, 5 7 das
Frascos de Roux
Primeros
tiempos:
No haba
vectores ni
marcadores
selectivos
Metodos de expresin gnica en lneas
celulares:
Mucho de lo que sabemos sobre la regulacin
de la expresin gnica en eucariotas
superiores, especialmente en mamferos,
proviene de estudios utilizando lneas
celulares inmortalizadas. Varios tipos de
clulas cancerosas tienen una capacidad
ilimitada de proliferar en medio que contiene
suero. El trmino inmortalizadas se refiere a
su capacidad ilimitada de proliferar en
condiciones de cultivo celular, mientras que
las funciones transformantes se refieren a la
habilidad de las lneas inmortalizadas de
formar tumores en animales.
Retrovirus
Adenovirus o virus
asociados (AAV)
Herpetovirus
Vectores virales
Fosfato clcico
Policationes
Lpidos
Liposomas
Membranas derivadas de
eritrocitos
Mtodos
qumicos
Microinyeccin
Electroporacin
Microproyectiles
Mtodos fsicos
Transfeccin de ADN
Los mtodos qumicos se basan en el uso de molculas-carrier cargadas
positivamente.
Se mezclan con el ADN in Vitro y se aplican al cultivo.
Los complejos carrier-ADN se asocian a membranas y facilitan la
incorporacin del ADN.
Los tres mtodos ms comunes usan: fosfato de cacio, DEAE dextrano y
liposomas
Los mtodos fsicos usan la fuerza bruta.
Son esencialmente lnea-independiente
Electroporacin (se ponen a punto para distintos
organismos y/o tipos celulares)
Biolstica (gene gun)
Microinyeccin.
Los mtodos biolgicos emplean virus
eucariotas recombinantes para incorporar el ADN
a las clulas.
Los ms communes se basan en retrovirus y
adenovirus
Transient Transfection Assays
Ensayos transiento transitorios?
En general se usan genes reporteros
Medicin de actividad 24-48 hrs despus, compatible con tiempo de
divisin celular y por ello son transient
No requieren integracin del ADN
No requieren seleccin
La incorporacin el ADN se lleva a cabo en forma similar a los ensayos transient.
Pero hay integracin del ADN al genoma (evento poco frecuente)
Se selecciona el evento con un marcador de seleccin
Transfeccin estable
Los transgenes suelen integrarse como copias mltiples en tndem
Sistemas regulados de expresi Sistemas regulados de expresi n n
Tet-Off Tet-On
LacZ
GAPDH
Dox - + - +
Sistema Tet-off/on
Usa el represor del opern de resistencia a tetraciclina del Tn10
El promotor regulado contiene sitios de unin del represor de tetraciclina (TetR), junto a un promotor
mnimo
TetR se encuentra unido al VP16
Slo cuatro cambios de aa invierten el tipo de regulacin (pasa de tet-off a tet-on)
Primeros mtodos: coprecipitacin con fosfato de Ca
Solucin de
fosfato
Coprecipitado
Liposomas Liposomas
Transfeccin mediada por liposomas
Mezcla de lpidos policatinicos y neutros que forma
liposomas con carga neta positiva (por los grupos
amino)
Mtodo de eleccin cuando se usan Carriersen
transfecciones de rutina por su simplicidad,
reproducibilidad y alta eficiencia
Electroporaci Electroporaci n n
Electroporacin
Mtodo verstil porque sirve para un gran nmero de tipos celulares:
Cultivos primarios, aislamientos de tejidos, protoplastos de plantas,
bacterias, levaduras.
Se pone a punto variando la fuerza del campo elctrico y el tiempo
Es factible ponerlo a punto para prcticamente cualquier tipo celular
Vectores virales Vectores virales
Los vectores virales proveen un
mtodo eficiente de transferencia
de material gentico para expresar
genes clonados en las clulas
husped apropiadas. Stocks
virales que no replican se pueden
crear transfectando lneas
celulares empaquetadoras
(packaging cell lines) usando
liposomas. Pueden emplearse
para transfecciones transientes y
estables
El origen de replicacin del SV40
(un poliomavirus) promueve su
replicacin cuando la clula entra
en fase S. El antgeno T (TAg) es
quien promueve que la maquinaria
celular replique el genoma del
virus. Podemos lograr que un
plsmido que lleve el origen del
SV40 sea replicado en clulas que
expresan el TAg (porque fueron
transfectadas previamente en
forma estable)
Generacin de mamferos transgnicos
(consideraciones generales)
El transgn se expresar con un patrn espacial y temporal que depender de
los elementos en cis que contiene.
Debe contener los elementos apropiados para la regulacin transcripcional,
post-transcripcional y traduccional que deben ser reconocidos apropiadamente
por la maquinaria del husped.
Es deseable incorporar una estrategia para diferenciar el gen endgeno del
agregado.
Si la integracin es al azar (Random):
No podemos controlar el sitio de integracin
No podemos conrolar el nmero de copias del transgn
Pueden ocurrir deleciones y/o rearreglos en el sitio de insercin
Pueden interrumpirse genes endgenos
Pueden haber efectos de posicin, segn el sitio de integracin.
Puede haber activacin ectpica si se integra cerca de un enhancer fuerte.
Generacin de mamferos transgnicos
(transgnesis de la lnea germinal)
Hay varios mtodos:
Microinyeccin directa en proncleos de huevos fertilizados
(con una sola clula) y en otros casos vulos
Infeccin in Vitro de embriones con retrovirus
Por manipulacin in Vitro de clulas troncales pluripotentes
Transferencia nuclear
Molecular Molecular
pharming pharming: :
Tambo Tambo
farmac farmac utico utico
Ovejas transgnicas
promotor de la Beta lactoglobulina
Activo en tejido mamario
Microinyeccin en el vulo
Transplantar y testear por PCR
Altos niveles del producto del transgn
en la leche
Transferencia
nuclear
Transgnesis por manipulacin in Vitro de clulas madre embrionarias pluripotentes
Se pueden crear mutaciones especficas para analizar
la funcin gnica:
mutantes nulos - knockout
de prdida de funcin (puede ser parcial y por lo tanto no knockout)
ganancia de funcin
para humanizar (reemplazar genes de ratn con genes humanos, por
ejemplo, los codificantes para anticuerpos)
Ratones knockout
Knockouts en ratones:
Crear el targeting vector
con la mutacin.
Recombinacin homloga
en clulas en cultivo
Seleccionar
recombinantes/knockouts:
G418 (Neo) elimina
clulas sin insercin, el
ganciclovir elimina clulas
con integracin ectpica
(que contienen el gen tk).
Generacin de ratones knockout
Uso de Clulas madre (troncales) embrionarias pluripotentes
(ES) para la reingeniera del genoma de mamferos.
Son clulas derivadas del ectodermo del blastocisto del ratn
Tienen un cariotipo normal y pueden contribuir a la lnea germinal
Pueden originar tanto vulos como espermatozoides
El ADN puede introducirse en clulas ES
Clulas ES genticamente alteradas pueden reintroducirse en un blastocisto y
contribuyen al normal desarrollo de un ratn quimrico.
Si dichas clulas se incorporan a la lnea germinal, la siguiente generacin
llevar el transgn en heterocigosis
Con los vectores especficos se puede introducir el transgn en el sitio apropiado
del genoma, que contiene las regiones homlogas al vector.
Es un evento raro, por lo cual debe ser seleccionado con mtodos adecuados.
El vector tendr marcadores para seleccin positiva y negativa.
Seleccin positiva: resistencia a G418 (neoR) bajo el promotor pgk.
Seleccin negativa: gen de la timidina quinasa del HSV bajo el
promotor pgk; las clulas que expresan la TH del HSV mueren en
presencia de ganciclovir.
El vector se construye de forma tal que el gen pgk-neo se encuentra
flanqueado por secuencias homlogas a las que queremos
reemplazar. Contrariamente, el gen pgk-TK se coloca por afuera de las
mismas. Las clulas que adquirieron el transgn por recombinacin
NO-homloga tendern a llevar tambin el gen pgk-tk y morirn en
presencia de ganciclovir. Las clulas que adquirieron el transgn por
recombinacin homloga perdern el gen pgk-tk y sobrevivirn al
ganciclovir.
Seleccin de los eventos de recombinacin homloga
Transgnesis inducible y/o sitio especfica
Se usa el sistema Cre
Cre=recombinasa del bacteriofago P1
Reconoce una secuencia de 34 bp llamada loxP
lox =locus de recombinacin
repeticiones invertidas de 13bp flanquean el centro asimtrico de
8bp
Cre se une a los repeats
El centro es el sitio de recombinacin; la asimetra le da
direccionalidad al sitio loxP.
Primero se crea el floxed gene
Delecin
Inversin
Translocacin
(depende del
sentido y
localizacion de
los Lox
Knockouts tejido especficos
Se necesitan dos lneas transgnicas
separadas
CRE bajo un promoter tejido
especfico
El gen endgeno flanqueado por los
loxP
Se combinan por cruzamiento
Generacin de knockouts hipocampo
especficos empleando el promotor CamKIIa
Los knockouts inducibles y tejido
especficos requieren tres modificaciones
genticas
Un promotor especfico de tejido que regula la expresin de rtTa
Cre bajo el promotor TetO
El floxed gene
La TG puede realizarse por tres mtodos distintos:
Ex vivo, cuando la correccin del defecto gentico se realiza en el laboratorio en las
clulas extradas del paciente y que posteriormente son reintegradas dentro del
organismo (por ejemplo, el sndrome de inmunodeficiencia combinada severa producida
por deficiencia de la adenosin desaminasa, ADA, en los llamados nios burbuja)
In situ, cuando la modificacin gentica de las clulas del paciente se realiza
introduciendo el ADN (los genes teraputicos) directamente en el propio rgano
defectuoso del individuo (por ejemplo, en el caso de la fibrosis qustica, la distrofia
muscular de Duchenne o la supresin de tumores por suicidiocelular)
In vivo, cuando se hace llegar en vectores adecuados los genes teraputicos a las
clulas defectuosas a corregir a travs del torrente circulatorio (por ejemplo, por
inyeccin intravenosa). Otra posibilidad sera la de utilizar las clulas de la piel con un
propsito bien distinto: la sntesis y secrecin de protenas que son producidas
normalmente en un tipo de clulas pero que son transportadas en el plasma sanguneo
para uso de otras clulas. As, en principio, implantes de clulas de la piel podran
corregir enfermedades tales como la hemofilia por ejemplo.
Terapia gnica
C C lulas troncales o madre lulas troncales o madre
Terapia Terapia
g g nica nica
con con
c c lulas lulas
troncales troncales
(madre) (madre)
Retrovirus Retrovirus
Vectores Vectores
Retrovirales Retrovirales
Vectores para TG:
Principios bsicos
Pfeifer &Verma (2001). Ann Rev Genomics HumGenet 2:177-211
Actan en cis para
empaquetar el transgn
(genoma)
Evolucin de los vectores retrovirales
Pfeifer &Verma (2001). Ann Rev Genomics HumGenet 2:177-211
Evolucin
Hay integracin
Con envoltura
Vectores adenovirales
No hay envoltura
Respuesta inmune fuerte
No hay integracin
Terapia gnica:
SCID (inmunodeficiencia severa combinada) o nios
de burbujadefecto en la ADA (adenosina deaminasa
sangunea)
Ashanti de Silva
Exitosa terapia contra ceguera
Gracias a un nuevo procedimiento utilizando terapia gentica
cientficos lograron restaurar la visin de pacientes con un grave
trastorno hereditario, la amaurosis congnita de Leber (LCA en sus
siglas en ingls).
Los pacientes mostraron una
mejora en su visin despus
del tratamiento.
Los investigadores inyectaron material gentico en los ojos de pacientes que
sufran el trastorno, que ocasiona prdida severa de visin
Emplearon un AAV (Adeno Associated Virus) como vector
http://www.nei.nih.gov/lca/blindness.asp
Curan el daltonismo en monos por medio de terapia gnica
Los cientficos emplearon un virus benigno para introducir el gen que corrigi el trastorno
J ueves 17 de setiembre de 2009
Samresponde a los ejercicios para los que haba sido entrenado
Andy Coghlan
De New Scientist
LONDRES. Dos monos daltnicos llamados Dalton y Samfueron "curados" con terapia gnica.
Terapia gnica para restaurar
pulmones
Slo un 15% de los pulmones cedidos de forma altruista son aptos para trasplante.
"Utilizamos un adenovirus (un virus al que le retiramos todos los genes) y le insertamos un gen
beneficioso, en este caso el IL-10 o interleukina 10, una sustancia que reduce la inflamacin y
que
frena la respuesta del sistema inmune, lo que disminuye las posibilidades de rechazo
una vez realizado el injerto. Lo inyectamos en los pulmones mediante un broncoscopio", indica
el doctor Keshavjee. Cuando se trasplantaron los pulmones de cerdo a los animales receptores,
aquellos que tenan el gen mostraron mejor funcionamiento. "En el caso de los humanos, los
rganos
no se trasplantaron, una de las limitaciones del estudio. Pero en la mquina ex vivo observamos
que aquellos rganos con el gen IL-10 restituan su funcin y presentaban menos inflamacin,
seala el autor.
FUENTE | El Mundo Digital 29/10/2009
Aplicaciones de la Ingeniera Gentica a la procuccin de vacunas
Vivas
Inactivadas
Atenuacin
Mtodos fsicos/qumicos
Cepas homlogas/
sustitucin gnica
Pasajes en cultivos
celulares
Solventes orgnicos
CTAB
Ultracentrifugacin
Exotoxinas bacterianas
(ttanos)
Tipos de vacunas
Las atenuadas suelen ser ms efectivas, inducen respuesta celular
Desventajas de las vacunas actuales
Produccin
Nivel de bioseguridad elevado
Correcta presentacin del antgeno
Riesgo de atenuacin/inactivacin parcial o incompleta
Reversin de la virulencia/patogenicidad
Conservacin, transporte, validez
Adapted from IAVI Report 2010 International AIDS Vaccine Initiative
Tercera generation
Segunda generacin
Primera generacin
Aplicaciones de la Ingeniera Gentica a la procuccin de vacunas
Nueva generacin de vacunas
Vacunas a DNA
Vacunas a DNA
Genetic Vaccines
Nature Review Genetics
Vacunas a DNA
Limitadas a inmungenos
proteicos (polisacridos)
Requiere altas dosis en su aplicacin
intramuscular
Respuesta inmune de anticuerpos
baja
Puede inducir tolerancia contra el
antgeno
Sin riesgo de infeccin
Presentacin mediante MHC I y II
Respuesta inmune especfica
Fcil desarrollo y produccin
Estables
Bajo costo
No requiere del uso de adyuvantes
Persistencia del inmungeno a largo
plazo
Expresin proteica in vivo
Contras Pros
Su utilizacin en humanos no est aprobada an (clinical trials): Malaria, esclerosis
mltiple
Se utiliza con xito para el WNV equino
Vacunas a subunidades
Produccin recombinante de una protena (subunidad) o de varias
protenas pertenecientes a un agente infeccioso
Sistemas de expresin: E. coli, Pichia pastoris, baculovirus (clulas de insecto)
Eliminacin mediada por clulas B y T
Protelisis por endo y exopeptidasas
Protenas pequeas fcilmente filtradas por los riones
Purificacin
Menor capacidad imunognica
Requiere adyuvantes y dosis mltiples
Limitaciones:
VLP: vi rus vaco
Induce elevada
respuesta inmunolgica
sin riesgo
VLP: vi rus vaco VLP: vi rus vaco
Induce elevada
respuesta inmunolgica
sin riesgo
Produccin recombinante de protenas
de la cpside viral (HBcAg)
VLP
Monmero Capsmer o
VLPs conj ugados
car ri ers de
ant genos
VLP
Monmero Capsmer o
VLP
Monmero Capsmer o
VLPs conj ugados
car ri ers de
ant genos
Ventaj a: generan una elevada inmunogenicidad debido a su capacidad de
proveer una alta densidad de eptopes presentados de forma ordenada
Li mi taci ones de l a t cni ca: tamao de los antgenos insertados
Vacunas
recombinantes
Baculovirus
Sistema de Baculovirus